DE4411588C1 - Buffer, contg. betaine, for RNA- and DNA-polymerase reactions - Google Patents

Buffer, contg. betaine, for RNA- and DNA-polymerase reactions

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DE4411588C1
DE4411588C1 DE19944411588 DE4411588A DE4411588C1 DE 4411588 C1 DE4411588 C1 DE 4411588C1 DE 19944411588 DE19944411588 DE 19944411588 DE 4411588 A DE4411588 A DE 4411588A DE 4411588 C1 DE4411588 C1 DE 4411588C1
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    • C12Q1/686Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

Buffer for RNA and DNA-polymerase reactions, which contains betaine, is new.

Description

Die Erfindung betrifft einen Puffer für DNA- und RNA- Polymerase-Reaktionen, der Betain enthält, und die Ver wendung von Betain in DNA- und RNA-Polymerase-Reaktio nen, insbesondere in der spezifischen Polymerase-Ket ten-Reaktion und in der reversen Transkription von RNA in cDNA (RT). The invention relates to a buffer for DNA and RNA polymerase reactions containing betaine and the Ver application of betaine in DNA and RNA polymerase Reaktio NEN, especially in the specific polymerase Ket ten-reaction and in the reverse transcription of RNA into cDNA (RT).

Es ist bekannt, daß die in der Polymerase-Ketten-Reak tion verwendeten Puffer Tris-HCL, Tricin, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid beinhalten. It is known that the buffer used in the polymerase chain reac tion Tris-HCl, Tricine, potassium chloride and magnesium chloride include. Auch wurde der Zusatz von DMSO (Winship, PR et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17, 1266) oder nicht-ionischen Detergenzien (Bachmann, B. et. al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 1309) vorge schlagen, um die DNA-Sequenzierungsreaktion zu verbes sern und Basenmißpaarungen zu vermeiden. The addition of DMSO (Winship, PR et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17, 1266) or non-ionic detergents (Bachmann, B. et. Al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 1309 ) proposed to prevent the DNA sequencing reaction to verbes fibers and Basenmißpaarungen.

Hung et. Hung et. al. al. beschreiben in Nucl. describe in Nucl. Acids Res. Vol. 18, No. Acids Res. Vol. 18, No. 16, 4953 (1990) den Zusatz von Tetrameythylammoni umchlorid zu den üblichen PCR-Puffern, um die Spezifi tät der PCR zu erhöhen. 16, 4953 (1990) the addition of Tetrameythylammoni monium chloride to conventional PCR buffers to the specifi ty of PCR to increase.

Um DNA-Moleküle mit mehr als 6 kbp zu amplifizieren, wird von MR Ponce et. To amplify DNA molecules with more than 6 kbp, is of MR Ponce et. al. al. in Nucl. Nucl. Acids Res. Vol. 20, No. Acids Res. Vol. 20, No. 3, 623 (1992) der Zusatz von Beta-Mercaptoetha nol, Gelatine und Thesit beschrieben. 3, 623 (1992), the addition of Beta-Mercaptoetha nol, gelatin and Thesit described.

Alle genannten PCR-Puffer weisen jedoch den Nachteil auf, daß durch die vorhandene Salzkonzentration die Am plifikation bestimmter DNA-Moleküle negativ beeinflußt werden kann. However, all of said PCR buffer have the disadvantage that the Am plifikation certain DNA molecules may be negatively affected by the presence of salt concentration. Daneben sind Dimethylsulfoxid und Tetramethylammoniumchlorid toxisch. In addition, dimethyl sulfoxide and tetramethylammonium chloride are toxic.

Es wurde nun gefunden, daß Puffer, die N, N, N-Trime thylglycin (Betain) und keine Kalium-, Ammonium- oder Tetraalkylammoniumionen enthalten, sehr gut für spezifische Polymerase-Ketten-Reaktionen geeignet sind. It has now been found that buffer, the N, N, N-trimethyl thylglycin (betaine) and no potassium, ammonium or tetraalkylammonium ions contained are very suitable for specific polymerase chain reactions.

Die Konzentration von Betain im erfindungsgemäßen Puf fer kann 200 bis 1000 mM betragen. The concentration of betaine in the inventive Puf fer can be 200 to 1000 mm. So hat sich zum Bei spiel bei der spezifischen PCR von HLA-Antigenen ge zeigt, daß eine Zusammensetzung des Puffers aus 500 bis 800 mM Betain und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid optimal ist. So has become the case of playing in the specific PCR of HLA antigens ge shows that a composition of the buffer from 500 to 800 mM betaine and 1 to 6 mM magnesium chloride is optimal. Insbesondere enthält der Puffer zur spezifischen Amplifikation von HLA-B-Allelen 500 bis 800 mM Betain, 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid, 8 bis 12 mM N-Tris(hydro xymethyl)methylglycin mit pH 8,3 und 93 bis 106 µg/ml BSA V. Dabei wird die PCR eines Fragmentes des HLA-B-Gens enthaltend Sequenzen von Exon 2 bis Exon 3 wie zum Beispiel von B 27, B27-Subtypen, B 12, B 44, B 45, B 7, BW 22, B 13, B 14, B 18, B 73, B 41, B * 4001 oder B 42 mit 2 Allel-spezifischen Oligo desoxynukleotid-Primern durchgeführt, die am 3′-Ende in den drei letzten Nukleotiden mit der gesuchten Allelsequenz übereinstimmen und in der übrigen Sequenz zu mindestens 80% mit der Allelsequenz homolog sind. In particular, the buffer for specific amplification of HLA-B alleles 500 and 800 mM betaine, 1 to 6 mM magnesium chloride, 8 to 12 mM N-Tris (hydro xymethyl) contains methylglycine, pH 8.3, and 93 to 106 ug / ml BSA V. Here, the PCR a fragment of the HLA-B gene containing sequences from exon 2 to exon 3 such as, for example, B 27, B27 subtypes, B 12, B 44, B 45, B 7, BW 22, B 13 , B 14, B 18, B 73, B 41, B * 4001 or B 42 2 allele-specific oligo deoxynucleotide primer performed, the match at the 3 'end in the last three nucleotides of the desired allele sequence and remaining in the sequence is at least 80% identical to the allele sequence are homologous.

Überraschend wurde auch gefunden, daß Betain-enthal tende Puffer für die reverse Transkription von RNA in cDNA sehr gut geeignet sind. Surprisingly, it has also been found that betaine contained tend buffer for reverse transcription of RNA into cDNA are well suited. Ein positiver Einfluß auf die reverse Transkription von sekundärstrukturreicher RNA wurde festgestellt. A positive influence on the secondary structure of reverse transcription-rich RNA was detected.

Insbesondere können die erfindungsgemäßen Puffer für die reverse Transkription von RNA in cDNA unter Verwen dung eines Oligo-dT-Primers und von M-MLV reverser Transkriptase bis zu 3 M Betain und ggf. auch Kaliumchlorid enthalten. In particular, the buffer of the present invention for the reverse transcription of RNA into cDNA may USAGE under extension of an oligo dT primer and reverse transcriptase of M-MLV up to 3 M betaine and optionally also contain potassium chloride. Die Aktivität der reversen Transkriptase wird, wie auch die Aktivität der Taq- Polymerase, durch Betain nicht merklich beeinträchtigt. The activity of reverse transcriptase, as well as the activity of Taq polymerase by betaine not noticeably impaired.

Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßer Puffer zur reversen Transkription von RNA in cDNA zum Beispiel un ter Verwendung von Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18 ) und M-MLV reverser Transkriptase 1 bis 3 M Betain, 60 bis 75 mM Kaliumchlorid und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid. Preferably, an inventive buffer for reverse transcription of RNA into cDNA contains, for example, un ter use of Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18) and M-MLV reverse transcriptase from 1 to 3 M betaine, 60 to 75 mM potassium chloride and 1 to 6 mM magnesium chloride ,

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Puffer zur reversen Transkription von RNA in cDNA auch 1 bis 3 M Betain, 20 bis 75 mM Kalium- oder Ammoniumionen und 1 bis 10 mM Magnesiumionen enthalten. In another preferred embodiment, the buffer for reverse transcription of RNA into cDNA may also be 1 to 3 M betaine, contain from 20 to 75 mM potassium or ammonium ions and 1 to 10 mM magnesium ions.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß Betain eine Reihe von Vorteilen herkömmlicher, bisher in der PCR- und reversen Transkription verwendeten Kosolventien kombiniert: In summary, it should be noted that betaine combines a number of advantages of conventional, previously used in the PCR and reverse transcription cosolvents:
Es ist chemisch inert und nicht-ionisch, dh es kann mit einer Anzahl anderer Kosolvenzien und Salzen kombiniert werden, um optimale Reaktionsbedingungen für die jeweiligen Primer und Template zu schaffen. It is chemically inert and non-ionic, which means it can be combined with a number of other co-solvents and salts to create optimal reaction conditions for each primer and template.

Daneben erleichtert es die Transkription GC-reicher Domänen. In addition, it facilitates the transcription of GC-rich domains. Da nur GC-Basenpaare destabilisiert werden, können Primer so gewählt werden, daß ihre Hybridi sierung mit der Zielsequenz möglichst wenig beeinträchtigt wird. Since only GC base pairs are destabilized, primers can be selected so that their hybridized capitalization as little as possible to the target sequence.

Allgemeine Destabilisierung von dsDNA, z. General destabilization of dsDNA, z. B. durch Glycerin, Dimethylsulfoxid oder Formamid setzt auch die Hybridisierungstemperatur der Primer herab und hat damit sowohl positive wie negative Auswirkungen auf die Ausbeute von DNA-Polymerase-Reaktionen. Example by glycerol, dimethylsulfoxide or formamide also lowers the hybridization temperature of the primer and thus has both positive and negative effects on the yield of DNA polymerase reactions. Betain ist unter den nicht-ionischen Kosolvenzien einzigartig in seiner Eigenschaft, AT-Basenpaare zu binden und dadurch zu stabilisieren. Betaine is among non-ionic cosolvents unique in its capacity to bind to AT base pairs and thereby stabilize. Da nicht-ionische Kosolvenzien allgemein dsDNA destabilisieren, erfolgt in Anwesenheit von Betain insgesamt eine spezifische Destabilisierung GC-reicher Domänen in DNA und RNA. As non-ionic cosolvents dsDNA destabilize generally carried out in the presence of betaine total specific destabilization of GC-rich domains in DNA and RNA. Betain ist jedoch erheblich billiger als Deoxyguanidin-Analoge wie sie zu diesem Zweck in Sequenzierung und PCR erfolgreich ein gesetzt wurden und kann außerdem auch in der RT verwendet werden. However betaine is considerably cheaper than Deoxyguanidin analogs as one were in sequencing and PCR successfully set for this purpose and can also be used in RT. AT-reiche Primer wie z. AT-rich primer such. B. (dT) 12-18 in der RT werden jedoch weniger beeinflußt als GC- reiche Domänen im Templat. B. (dT) 12-18 in the RT, however, less affected than GC-rich domains in the template.

Magnesiumchlorid ist ein essentieller Kofaktor für DNA- Polymerasen, jedoch hängt die optimale Konzentration in der PCR stark von den jeweiligen Primern oder Templaten ab. Magnesium chloride is an essential cofactor for DNA polymerases, however, the optimum concentration depends greatly in the PCR from the respective primers or templates from. In Gegenwart von Betain erweitert sich dieser optimale Bereich, wodurch sich die Optimierung, insbesondere von Koamplifikationen ("Multiplex-PCR"), vereinfacht. In the presence of betaine, this optimum range, whereby the optimization, in particular Koamplifikationen ( "Multiplex-PCR") is simplified, enlarged.

Desweiteren ist bekannt, daß sowohl NaCl als auch Heparin als Verunreinigungen in DNA-Proben auftreten können. Furthermore, it is known that both NaCl and heparin may occur as impurities in DNA samples. So hat Heparin in Konzentrationen zwischen 2,5 · 10 -4 - 10 -3 U/µl ähnliche Effekte wie NaCl. Thus, heparin in concentrations between 2.5 × 10 -4 - 10 -3 U / ul similar effects as NaCl. Im Stand der Technik wurde deshalb Heparinase-Verdau oder Vorbehandlung Heparin-enthaltender DNA mit Chelex 100 vorgeschlagen (Francesca Poli, Rosa Catteano, Loretta Crespiatico, Angelea Nocco und Girolamo Sirchia, PCR Methods and Applications, 1993, 2, 356-358). In the prior art, therefore, heparinase digestion or pre-heparin-containing DNA was proposed with Chelex 100 (Francesca Poli, Pink Catteano, Loretta Crespiatico, Angelea Nocco and Girolamo Sirchia, PCR Methods and Applications, 1993, 2, 356-358).

Es wurde nun gefunden, daß die PCR-Ausbeuten, insbesondere von HLA-B, bei Heparin-enthaltenden DNA- Proben in Gegenwart von Betain deutlich verbessert werden können. It has now been found that the PCR yields, especially HLA-B in heparin-containing DNA samples can be significantly improved in the presence of betaine. Vorzugsweise zeigen sich diese Befunde bei Betainkonzentrationen von 500-800 mM. Preferably, these findings show for Betainkonzentrationen of 500-800 mM. In Gegenwart von 0,8 M Betain werden bis zu 10fach höhere Heparin konzentrationen toleriert. In the presence of 0.8 M betaine higher heparin concentrations are tolerated up to 10 times.

Betain macht also die Aufreinigung von Salz- oder Heparin-enthaltenden DNA-Proben weitgehend überflüssig, was vor allem in der routinemäßigen Untersuchung klinischer und forensischer Proben von Vorteil ist. So betaine makes the purification of saline or heparin-containing DNA samples largely superfluous, which is particularly important in the routine examination of clinical and forensic samples advantage.

Daneben ist Betain ist im Gegensatz zu den Kosolvenzien DMSO, Formamid und Methyl-Quecksilberhydroxid ungiftig und ein natürlicher Schutz, den Zellen im Laufe der Evolution gegen thermische und ionische Denaturierung ihrer Proteine entwickelt haben. Next to it is betaine is in contrast to the co-solvents DMSO, formamide and methyl Quecksilberhydroxid non-toxic and natural protection, the cells have developed during evolution to thermal and ionic denaturing their proteins.

Die Aktivität der Taq-Polymerase und der reversen Transkriptase wird durch Betain nicht merklich beeinträchtigt. The activity of the Taq polymerase, and reverse transcriptase is not noticeably affected by betaine.

Die Erfindung soll nachstehend durch Ausführungsbei spiele näher erläutert werden: The invention will be described in greater detail by Ausführungsbei play:

Ausführungsbeispiele embodiments 1. Polymerase-Ketten-Reaktion von HLA-B-Allelen 1. Polymerase chain reaction of HLA-B alleles a) Reaktionsansatz a) reaction

Die Amplifikationen werden in DNA-Thermocyclern (z. B. dem DNA-Thermocycler 480 der Firma Perkin-Elmer-Cetus) in 500 µl"Eppendorf"-Reaktionsgefäßen durchgeführt. The amplifications are carried out (480 Perkin-Elmer-Cetus z. B. the DNA Thermal Cycler) in 500 ul "eppendorf" -Reaktionsgefäßen in DNA thermocyclers. DNA wird durch Verdauung von zu untersuchenden Proben mit Proteinase K und nachfolgende Phenol/Chloroform- Extraktion gewonnen. DNA is obtained by digesting to be examined samples with proteinase K and subsequent phenol / chloroform extraction. Zur Reaktion werden Mengen von 50 bis 1000 ng in einem 20 µl Reaktionsvolumen eingesetzt. To the reaction amounts of 50 to 1000 ng are used in a 20 ul reaction volume.

Der Ansatz enthält außerdem: The mixture also contains:

10 mM N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin, pH 8,3 bei 20°C (Tricin) 10 mM N-Tris (hydroxymethyl) methylglycine, pH 8.3 at 20 ° C (Tricine)
100 µg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA V) 100 ug / ml bovine serum albumin (BSA V)
0,2 mM je Nukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.2 mM each nucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
3 ng/µl je Primer 3 ng / ul each primer
0,025 U/µl Taq-Polymerase 0.025 U / ul Taq polymerase

mit TNFβ als Kontrolle: with TNFβ as control:

600 mM N,N,N-Trimethylglycin (Betain) 600 mM N, N, N-trimethylglycine (betaine)
3 mM Magnesiumchlorid 3 mM magnesium chloride

mit Genen XA/XB als Kontrolle: with genes XA / XB as control:

800 mM N,N,N-Trimethylglycin (Betain) 800 mM N, N, N-trimethyl glycine (betaine),
4 mM Magnesiumchlorid 4 mM magnesium chloride

b) Temperaturschritte b) temperature steps

Die PCR-Programme werden in folgenden Temperaturschritten durchgeführt: The PCR programs are carried out under the following temperature steps:

Erfindungsgemäß erweisen sich in Gegenwart von Betain Hybridisierungstemperaturen, die ca. 10°C niedriger liegen als die theoretische Denaturierungstemperatur der Primer, und MgCl₂-Konzentrationen zwischen 3 und 4 mM als vorteilhaft. According to the invention turn out in the presence of betaine hybridization temperatures that are about 10 ° C lower than the theoretical denaturation temperature of the primers, and MgCl₂ concentrations between 3 and 4 mm as advantageous.

c) Detektion c) Detection

Erfolgreiche Amplifikation der internen Kontrolle und gegebenenfalls eines allelspezifischen HLA-B-Fragments wird durch Elektrophorese in einem 1,5%-igen Agarosegel, 0,5x TBE-Puffer geprüft. Successful amplification of the internal control and, optionally, an allele-specific HLA-B fragment is checked by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, 0.5X TBE buffer. DNA-Banden werden durch Anfärbung mit Ethidiumbromid und Fluoreszenz unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht. DNA bands are visualized by staining with ethidium bromide and fluorescence under a UV lamp. Die Länge der erhaltenen PCR-Produkte ist eine Kontrolle für die Spezifität der PCR für HLA-B. The length of the resulting PCR products is a control for the specificity of the PCR for HLA-B.

d) Ergebnisse d) Results

HLA-B27, B 7, B 8, B 41, B 42, B 60, B 61 und B 73 wurden unter obigen Bedingungen erfolgreich amplifiziert. HLA-B27, B 7, B 8, B 41, B 42, B 60, B 61 and B 73 were successfully amplified under the above conditions. Die Spezifität der HLA-B PCR wurde mit Hilfe der folgenden Standard-Zellinien getestet: The specificity of the HLA-B PCR was tested using the following standard cell lines:
Positive Kontrollen waren Positive controls were

  • a) für B27 und seine Subtypen: HOM2, JESTHOM, WT24, LS40 sowie die nicht-standartisierten Linien LH, NW, R69 und Wewak, a) for B27 and its subtypes: HOM2, JESTHOM, WT24, LS40 and the non-standardized lines LH, NW, R69 and Wewak,
  • b) für B60 (B * 40012): SLE, MADURA, MT14B, PE117, BRU, RLO, LS40 (B27/B60) b) for B60 (B * 40012): SLE, MADURA, MT14B, PE117, BRU, RLO, LS40 (B27 / B60)
  • c) für B7: HHKB, SAVC, LD2B, R69 (B7/B27) c) for B7: HHKB, SAVC, LD2B, R69 (B7 / B27)
  • d) für B8: VAVY, LH (B8/B27) d) for B8: (vavy, LH B8 / B27)
  • e) für B42: RSH e) for B42: RSH
  • f) für B41: RLO (B38/B41) f) for B41: (RLO B38 / B41)
  • g) für B61 (B * 4002) : SWEIG g) for B61 (B * 4002): Sweig

Als Negativkontrolle dienten außerdem zahlreiche weitere, für die häufigsten HLA-B-Allele repräsentative, Standardlinien oder Linien, deren Allelsequenz zu einem der beiden verwendeten Primern vollständig komplementär war (z. B. B14 und B16 mit B7CREG1 in der B27-PCR). As a negative control also numerous other representative for the most common HLA-B alleles, standard lines or lines whose allele sequence was completely complementary to one of the two primers used were (z. B. B14 and B16 with B7CREG1 in the B27-PCR).

Von 50 sowohl serologisch als auch mit Hilfe der PCR auf HLA-B27 untersuchten Spendern wurde in 43 Fällen positive Übereinstimmung zwischen beiden Tests und in 6 Fällen negative Übereinstimmung gefunden. 50 studied both serologically and by PCR for HLA-B27 positive donors match was found negative correlation between the two tests and in 6 cases in 43 cases. Eine Probe eines Patienten mit Bechterev war serologisch B27- negativ und positiv anhand des PCR-Ergebnisses. A sample of a patient with Bechterev was serologically B27 negative and positive on the basis of the PCR result. Einmal wurde kein PCR-Produkt von einem serologisch positiven gesunden Spender erhalten. Once no PCR product was obtained from a serologically positive healthy donor. Die Spezifität der PCR- Produkte wurde weiterhin durch Gelelektrophorese (Groesse) und in den Amplifikationsprodukten von 22 verschiedenen vollständig HLA-B typisierten B27- heterozygoten Proben durch Verdau mit Restriktionsenzymen bestätigt. The specificity of the PCR products was further confirmed by gel electrophoresis (size) and different in the amplification of 22 fully HLA-B B27 typed heterozygous samples by digestion with restriction enzymes.

Unspezifische (Co-)Amplifikationen wurden unter den obigen Bedingungen nicht beobachtet. Non-specific (co) amplifications were not observed under the above conditions.

Um den Einfluß von Tetramethylammoniumchlorid, Betain und NaCl auf die Amplifikation von B7, B8 und B27 zu untersuchen wurden vier Puffer enthaltend 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂ getestet: zwei handelsübliche (Boehringer Mannheim, Promega) mit Tris sowie zwei eigene mit Tris oder Tricine. To the influence of tetramethylammonium chloride, betaine and NaCl on the amplification of B7, were to investigate B8 and B27 four buffers tested containing 50 mM KCl and 1.5 mM MgCl₂: two commercially available (Boehringer Mannheim, Promega) with Tris and two own with Tris or Tricine.

Es zeigte sich, daß 50 mM KCl sowie geringe Verunreinigungen mit 5-10 mM NaCl (final) die PCR der HLA-B-Allele der internen Kontrollen erst bei 70 mM NaCl-Konzentrationen behindern. It was found that 50 mM KCl and low impurities with 5-10 mM NaCl (final) PCR of the HLA-B alleles of internal controls only at 70 mM impeding NaCl concentrations. Verbesserte Ampli fikation wird jedoch in Gegenwart von 50 mM TMACl erzielt und optimale PCR von HLA-B7, B8 und B27 bei 0,6-1,0 M Betain- und 2,5-4 mM MgCl₂-Konzentrationen. Improved Ampli fication is achieved, however, in the presence of 50 mM TMACl and optimal PCR of HLA-B7, B8 and B27 at 0.6-1.0 M betaine and 2.5-4 mM MgCl₂ concentrations. Oberhalb dieser Grenzen wirkt Betain inhibierend auf eine PCR mit den oben genannten Primern. Above these limits betaine has an inhibitory effect on a PCR with the above primers. Während die Amplifikation der internen Kontrollen in Abwesenheit isostabilisierender Substanzen robuster als die HLA-B PCR ist, kehrt sich dieses Verhältnis in Gegenwart von Betain und TMACl um. While the amplification of the internal control in the absence isostabilisierender substances is more robust than the HLA-B PCR, this relationship is reversed in the presence of betaine and TMACl.

2. Reverse Transkription mit M-MLV reverser Transkriptase 2. Reverse transcription with M-MLV reverse transcriptase a) Reaktionsansatz a) reaction

3,0 MN,N,N-Trimethylglycin (Betain) 3.0 MN, N, N-trimethylglycine (betaine)
50 mM Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan (Tris) pH 8,3 bei 20°C 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8.3 at 20 ° C
75 mM KCl 75 mM KCl
3 mM MgCl₂ 3 mM MgCl₂
10 mM 1,4 Dithio-Threitol (DTT) 10 mM 1,4-dithio-threitol (DTT)
400 mM je Nukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 400 mM of each nucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
100 mM Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18 ) 100 mM Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18)
10 U/41 Murine Moloney-Leukaemie-Virus reverse Transkriptase (M-MLV) (Hersteller: GIBCO BRL) 10 U / 41 Murine Moloney leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV) (manufactured by GIBCO BRL)

RNA von ca. 2 × 10⁵ Blutzellen wird durch Guanidin-Iso thiocyanat/Phenolextraktion gewonnen und in destillier tem Wasser gelöst. RNA of about 2 × 10⁵ blood cells is obtained by guanidine thiocyanate Iso / phenol extraction and dissolved in water distilling system.

Vordenaturierung geschieht in Gegenwart von Oligo desoxythymidin für 10 Minuten bei 65°C. Predenaturation happens in the presence of oligo deoxythymidine for 10 minutes at 65 ° C. Dann werden die übrigen Reagenzien zugefügt und für 60 Minuten bei 37°C, 43°C oder 51°C inkubiert. Then, the remaining reagents are added and incubated for 60 minutes at 37 ° C, 43 ° C or 51 ° C.

Die erhaltene cDNA wird durch semiquantitative PCR der T-Zellrezeptorgene V-beta8, V-beta20 und C-alpha geschätzt. The resulting cDNA is estimated by semi-quantitative PCR of the T-cell receptor V-genes beta8, V-beta20 and C-alpha.

Es zeigte sich, daß Betain in Konzentrationen bis zu 3 M keinen sichtbaren Nachteil auf die cDNA-Ausbeute bei den üblichen Reaktionstemperaturen hat, jedoch den Vorteil, daß die erhöhte Temperatur von 51°C von M- MLV-reverser Transkriptase erheblich besser als in her kömmlichen RT-Puffern ohne Betain toleriert wird. It was found that betaine has no visible detriment to the cDNA yield in the usual reaction temperatures in concentrations up to 3 M, but the advantage that the elevated temperature of 51 ° C of M MLV reverse transcriptase significantly better than in her conventional RT-buffering is tolerated without betaine.

Claims (15)

  1. 1. Puffer für DNA- und RNA-Polymerase-Reaktionen, ent haltend Betain. 1. Buffer for DNA and RNA polymerase reactions, ent holding betaine.
  2. 2. Puffer nach Anspruch 1 für die spezifische Polyme rase-Ketten-Reaktion (PCR), vorzugsweise für die PCR von Histokompatibilitäts-Antigenen (HLA). 2. Buffer according to claim 1 for the specific polyme rase chain reaction (PCR), preferably for the PCR of histocompatibility antigens (HLA).
  3. 3. Puffer nach Anspruch 1 oder 2 für die spezifische PCR von HLA-B-Allelen unter Verwendung von Taq- Polymerase. 3. Buffer according to claim 1 or 2 for the specific PCR of HLA-B alleles using Taq polymerase.
  4. 4. Puffer nach einem der Ansprüche 2 oder 3, enthaltend 200-1000 mM Betain. 4. Buffer according to one of claims 2 or 3, containing 200-1000 mM betaine.
  5. 5. Puffer nach einem der Ansprüche 2 bis 4, enthaltend 200 bis 1000 mM Betain und 1 bis 6 mM Magnesium chlorid. 5. Buffer according to one of claims 2 to 4, containing from 200 to 1000 mM betaine and 1 to 6 mM magnesium chloride.
  6. 6. Puffer nach einem der Ansprüche 2 bis 5, enthaltend 500 bis 800 mM Betain, 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid, 8 bis 12 mM N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin mit pH 8,3 und 93 bis 106 µg/ml BSA V. 6. Buffer according to one of claims 2 to 5, comprising 500 to 800 mM betaine, 1 to 6 mM magnesium chloride, 8 to 12 mM N-Tris (hydroxymethyl) methylglycine, pH 8.3, and 93 to 106 ug / ml BSA V.
  7. 7. Puffer nach Anspruch 1 für die reverse Transkription von RNA in cDNA, vorzugsweise unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und M-MLV reverser Transkriptase. 7. Buffer according to claim 1 for reverse transcription of RNA into cDNA, preferably using an oligo-dT primer and M-MLV reverse transcriptase.
  8. 8. Puffer nach Anspruch 1 oder 7 für die reverse Transkription von RNA in cDNA unter Verwendung von Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18 ). 8. Buffer according to claim 1 or 7 for the reverse transcription of RNA into cDNA using Oligodesoxythymidin ((dT) 12-18).
  9. 9. Puffer nach Anspruch 7 oder 8, enthaltend bis zu 3 M Betain. 9. Buffer according to claim 7 or 8, containing up to 3 M betaine.
  10. 10. Puffer nach einem der Ansprüche 7 bis 9, enthaltend 1 bis 3 M Betain, 20 bis 75 mM Kalium- oder Ammoniumionen und 1 bis 10 mM Magnesiumionen. 10. Buffer according to one of claims 7 to 9, containing 1 to 3 M betaine, 20 to 75 mM potassium or ammonium ions and 1 to 10 mM magnesium ions.
  11. 11. Puffer nach Anspruch 10, enthaltend 1 bis 3 M Betain, 60 bis 75 mM Kaliumchlorid und 1 bis 6 mM Magnesiumchlorid. 11. Buffer according to claim 10, containing 1 to 3 M betaine, 60 to 75 mM potassium chloride and 1 to 6 mM magnesium chloride.
  12. 12. Verwendung von Betain für DNA- und RNA-Polymerase- Reaktionen. 12. The use of betaine for DNA and RNA polymerase reactions.
  13. 13. Verwendung gemäß Anspruch 12 für die spezifische PCR, vorzugsweise für die PCR von Histokompatibili täts-Antigenen (HLA). 13. Use according to claim 12 for the specific PCR, preferably for PCR of Histokompatibili Taets-antigens (HLA).
  14. 14. Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13 zur Amplifikation eines Fragmentes des HLA-B-Gens enthaltend Sequenzen von Exon 2 bis Exon 3. 14. Use according to claim 12 or 13 for amplifying a fragment of the HLA-B gene containing sequences from exon 2 to exon. 3
  15. 15. Verwendung gemäß Anspruch 12 für die reverse Trans kription von RNA in cDNA, vorzugsweise unter Ver wendung eines Oligo-dT-Primers und M-MLV reverser Transkriptase. 15. Use according to claim 12 for the reverse Trans kription of RNA into cDNA, preferably with reverse Ver use of an oligo-dT primer and M-MLV transcriptase.
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