DE4406512C1

DE4406512C1 - Integration vectors for producing genes which encode recombinant antibodies

Info

Publication number: DE4406512C1
Application number: DE19944406512
Authority: DE
Inventors: Ralph Dr Mocikat
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2014-03-01

Abstract

The invention relates to integration vectors for producing genes which encode recombinant antibodies, to vectors for producing recombinant antibodies using these vectors, and to kits for producing recombinant antibodies which contain at least one of these vectors.

Description

Die Erfindung betrifft Integrationsvektoren zur Herstellung von Genen, die rekombinante Antikörper codieren, Vektoren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern unter Verwen dung dieser Vektoren, sowie Kits zur Herstellung von rekom binanten Antikörpern, die mindestens einen dieser Vektoren enthalten.The invention relates to integration vectors for production of genes encoding recombinant antibodies, vectors for the production of recombinant antibodies using extension of these vectors, as well as kits for the production of recom binant antibodies that contain at least one of these vectors contain.

Homologe Rekombination zwischen exogenen und chromosomalen DNA-Sequenzen hat Anwendungen in vielen Bereichen der moder nen Biologie erfahren. So ist über homologe Rekombinationen das Genom embryonaler Stammzellen und weiterer Säugerzellty pen spezifisch verändert worden (vgl. z. B. Capecchi, Science 244 (1989), 1288-1292). Durch diese Veränderungen wurde bei spielsweise die Genfunktion zerstört, es wurden Mutationen korrigiert oder geringfügige Änderungen in der Nukleotidse quenz eines Gens vorgenommen (vgl. z. B. Davis et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 2769-2776). Man weiß, daß die exoge nen Nukleinsäuren in Hefe sequenzspezifisch eingebaut werden (Orr-Weaver und Szostak, Microbiol. Rev. 49 (1985), 33-58). In Säugerzellen erfolgt der Einbau hingegen mit geringer Häufigkeit über homologe Rekombination zugunsten einer we sentlich häufigeren zufälligen Integration.Homologous recombination between exogenous and chromosomal DNA sequences has applications in many areas of moder experienced biology. So is about homologous recombinations the genome of embryonic stem cells and other mammalian cells pen have been specifically modified (see e.g. Capecchi, Science 244 (1989), 1288-1292). Because of these changes for example, the gene function destroyed, mutations corrected or minor changes in nucleotide gene sequence (see, e.g., Davis et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 2769-2776). We know that the exoge Nucleic acids in yeast are incorporated sequence-specifically (Orr-Weaver and Szostak, Microbiol. Rev. 49 (1985), 33-58). In mammalian cells, on the other hand, the incorporation is less Frequency via homologous recombination in favor of a we considerably more random integration.

Ausgehend von dieser Erkenntnis ist versucht worden, wirk same Selektions- und Absuchverfahren zu entwickeln, welche die Isolierung von Säugerzellen mit einem gewünschten Rekom binationsereignis ermöglichen. Mansour beispielsweise hat dazu ein positiv-negatives Selektionsverfahren vorgeschlagen (Mansour et al., Nature 336 (1988), 348-352). Man weiß mitt lerweile, daß die Effizienz der homologen Rekombination von der Länge der homologen Sequenzen abhängt (vgl. z. B. Berin stein et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 360-367), wie auch durch die Transkriptionsaktivität der Zielsequenz beeinflußt wird (vgl. z. B. Nicholoff, Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 5311-5318).On the basis of this knowledge, attempts have been made to work to develop the same selection and search procedures, which the isolation of mammalian cells with a desired recome Enable bination event. Mansour, for example a positive-negative selection process was proposed (1988, Mansour et al., Nature 336: 348-352). You know in the middle meanwhile, that the efficiency of homologous recombination of depends on the length of the homologous sequences (see e.g. Berin stein et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 360-367) as well influenced by the transcription activity of the target sequence (see, e.g., Nicholoff, Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 5311-5318).

Für homologe Rekombinationsexperimente stehen zwei im Prin zip unterschiedliche Vektoren zur Verfügung, die als Inte grations- und "Replacementvektoren" bezeichnet werden. Inte grationsvektoren enthalten eine homologe flankierende Se quenz, in die ein Bruch des DNA-Doppelstranges eingefügt wird. Bei dem Rekombinationsereignis wird der gesamte Vektor in das Genom integriert, was zu einer Duplikation eines Teils der Zielsequenz führt. Replacementvektoren dagegen enthalten eine homologe Sequenz, in die ein heterologer Be reich eingefügt ist (beispielsweise ein Gen für einen Selek tionsmarker). Diese Vektorart wird vor der Transfektion am Ende oder außerhalb der homologen Region linearisiert. Das Integrationsmuster von Integrationsvektoren in Hefe- und Säugerzellen kann durch das von Orr-Weaver und Szostak ent wickelte Doppelstrangbruch-Reparaturmodell hinreichend vor hergesagt werden (Orr-Weaver und Szostak, a.a.O., Szostak et al., Cell. 33 (1983), 25-35). Replacementvektoren mit nicht homologen Enden scheinen hingegen einen anderen Integrati onsmechanismus zu verwenden, da ihre freien Strangenden eine weniger wichtige Rolle für die Integrationsart zu spielen scheinen als die von Integrationsvektoren (Hasty et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) , 2464-2474).For homologous recombination experiments, there are two in the print zip different vectors available as inte tion and "replacement vectors" are referred to. Inte Gration vectors contain a homologous flanking Se sequence into which a break in the DNA double strand is inserted becomes. At the recombination event, the entire vector integrated into the genome, resulting in a duplication of one Part of the target sequence leads. Replacement vectors, however contain a homologous sequence into which a heterologous Be is richly inserted (for example a gene for a selek tion marker). This type of vector is on before the transfection Linearized at the end or outside the homologous region. The Integration pattern of integration vectors in yeast and Mammalian cells can be developed by Orr-Weaver and Szostak sufficiently pre-wound double strand break repair model can be predicted (Orr-Weaver and Szostak, op. cit., Szostak et al., Cell. 33: 25-35 (1983). Replacement vectors with not homologous ends, on the other hand, appear to be a different integrati mechanism because their free strand ends are one to play a less important role for the type of integration seem to be that of integration vectors (Hasty et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2464-2474 (1992).

Von besonderer Wichtigkeit für eine hohe Anzahl homologer Rekombinationsereignisse ist die Verwendung isogener DNA (vgl. z. B. Deng und Capecchi, Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 3365-3371), da Basenfalschpaarungen innerhalb der homologen Region die Rekombinationshäufigkeit drastisch herabsetzen. Sofern isogene homologe Sequenzen verwendet werden, sind In tegrations- und Replacementvektoren ähnlich wirksam. Werden allerdings nicht-isogene Sequenzen benutzt, so werden mit Replacementvektoren weniger gewünschte Rekombinationsereig nisse erzielt. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Inte gration von Replacementvektoren zwei Rekombinationsereig nisse erfordert. Bei Basenfehlpaarungen kommt es dadurch we niger häufig zu einer erfolgreichen homologen Rekombination als bei Integrationsvektoren, die nur ein Rekombinationser eignis benötigen (Deng und Capecchi, a.a.O.).Of particular importance for a large number of homologous Recombination events is the use of isogenic DNA (see e.g. Deng and Capecchi, Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 3365-3371) because base mismatches within the homologous Region drastically reduce the recombination frequency. If isogenic homologous sequences are used, In tegration and replacement vectors similarly effective. Become however non-isogenic sequences are used, so with Replacement vectors less desired recombination event nisse achieved. This is due to the fact that the Inte replacement vectors two recombination events nisse requires. This leads to base mismatches often successful homologous recombination than with integration vectors, which are only one recombination events (Deng and Capecchi, op. cit.).

Die homologe Rekombinationstechnik hat man sich auch für die Konstruktion chimärer Antikörper zunutze gemacht. Eine Viel zahl von monoclonalen Maus-Antikörpern mit therapeutisch interessanten Spezifitäten sind nämlich für die Therapie im Menschen wertlos, da ihre Applikation die Induktion von gegen sie gerichtete Antikörper hervorruft. Dies führt zu einer Neutralisierung der Antikörper und damit des thera peutischen Effektes. Daneben können unerwünschte Nebenwir kungen hervorrufen werden. Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8507-8511 haben die variable Region der schweren Kette eines Maus-Antikörpers über homologe Rekombi nation unter Verwendung eines Integrationsvektors mit der menschlichen C_γ₁-Region verknüpft. Sie haben dabei ein Kon strukt verwendet, das die Maus J_H4-Region, einen Teil des Cµ-Introns mit dem Cµ-Enhancer, verbunden mit den menschli chen C_γ₁-Exons sowie einen Selektionsmarker enthielt. Mit diesem Konstrukt haben Fell et al. eine Häufigkeit von einer funktionellen genomischen Rekombination in 200 Transfektan ten erhalten. Eine derartige Häufigkeit an homologen Rekom binationsereignissen macht ein relativ aufwendiges Absuch verfahren nach den gewünschten Klonen noch immer erforder lich.The homologous recombination technique has also been used for the construction of chimeric antibodies. A large number of mouse monoclonal antibodies with therapeutically interesting specificities are namely worthless for therapy in humans, since their application causes the induction of antibodies directed against them. This leads to a neutralization of the antibodies and thus the therapeutic effect. In addition, undesirable side effects can be caused. Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8507-8511 have linked the variable region of the heavy chain of a mouse antibody via homologous recombination using an integration vector with the human C _γ 1 region. They used a construct that contained the mouse J _H 4 region, part of the Cµ intron with the Cµ enhancer, linked to the human C _γ ₁ exons and a selection marker. With this construct, Fell et al. obtained a frequency from functional genomic recombination in 200 transfectants. Such a frequency of homologous recom- bination events still makes a relatively complex search for the desired clones necessary.

Andererseits sind menschliche Zellinien verfügbar, die Anti körper bestimmter Spezifität sezernieren. Auch hier wäre wünschenswert, wenn diese Antikörper auf einfache Weise mit anderen Spezifitäten, die beispielsweise aus der Maus stam men oder synthetischen Ursprungs sein können, versehen wer den könnten. Bislang sind solche rekombinanten Antikörper im wesentlichen durch die rekombinante DNA-Technologie in nicht-produzierenden Zellinien mit sehr geringer Ausbeute hergestellt worden. Dies ist ein aufwendiges Verfahren, das zum raschen Austausch von Antikörperspezifitäten ungeeignet ist.On the other hand, human cell lines are available that are anti secrete bodies of specific specificity. Would be here too desirable when using these antibodies in a simple manner other specificities, for example stemming from the mouse men or synthetic origin, who provided could. So far, such recombinant antibodies are in the essentially through the recombinant DNA technology in non-producing cell lines with very low yield been made. This is an elaborate process that unsuitable for the rapid exchange of antibody specificities is.

Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zugrunde, Vektoren bereitzustellen, mit denen sich eine große Häufigkeit homologer Rekombinationen in Immunglobulin loci erzielen läßt, wodurch mit größerer Häufigkeit als mit den im Stand der Technik bekannten Vektoren funktionelle rekombinante Antikörper bereitgestellt werden können. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die in den An sprüchen dargestellten Ausführungsformen erzielt.The present invention therefore had the technical problem to provide vectors with which a high frequency of homologous recombinations in immunoglobulin loci can be achieved, which means with greater frequency than with functional vectors known in the art recombinant antibodies can be provided. The This technical problem is solved by the methods described in An achieved embodiments achieved.

Somit betrifft die Erfindung einen Integrationsvektor zur Herstellung von Genen, die rekombinante Antikörper codieren, der die folgenden Elemente enthält:The invention thus relates to an integration vector for Production of genes encoding recombinant antibodies, which contains the following elements:

(a) a region of at least 1.5 kb which is homologous to a region of the μ intron or k intron which contains no or no functional C μ or C k enhancer;
(b) at least one DNA sequence which is a domain of an An body or a part thereof; and
(c) a marker which can be selected in eukaryotic antibody-producing cells and which has no functional enhancer region, the expression of this marker being controlled after integration by the cellular C μ or C k enhancer.

Der erfindungsgemäße Vektor kann einen zu einem Intron-Be reich homologen Bereich von mindestens 1,5 kb aufweisen, in den der Ig-Enhancer natürlicherweise nicht vorkommt oder aus den er deletiert wurde oder in dem er inaktiviert wurde. The vector according to the invention can be an intron Be have a rich homologous range of at least 1.5 kb, in which the Ig enhancer does not naturally occur or does not exist which it has been deleted or in which it has been inactivated.

Die DNA-Sequenz kann beispielsweise ein oder mehrere Exons umfassen, solange eine funktionelle Domäne eines Antikörpers oder ein funktioneller Teil davon codiert wird. Ist der funktionelle Teil der Domäne Teil einer V-Domäne, so muß diese zur Bindung an das Zielantigen fähig sein oder dazu beitragen. Handelt es sich um einen Teil einer C-Domäne, so muß diese mindestens einen Teil der Effektorfunktionen aus üben können.The DNA sequence can be, for example, one or more exons include as long as a functional domain of an antibody or a functional part of it is encoded. Is the functional part of the domain part of a V domain, so must they are capable of binding to the target antigen or are able to do so contribute. If it is part of a C domain, so this must include at least part of the effector functions can practice.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Bereich des µ- oder k-Introns von mindestens 1,5 kb den Bereich, in dem der C_µ- oder C_k-Enhancer lokalisiert ist, wobei dieser Be reich keinen funktionellen C_µ- oder C_k-Enhancer mehr ent hält.In a preferred embodiment, the region of the μ or k intron of at least 1.5 kb comprises the region in which the C _μ or C _k enhancer is located, this region not having any functional C _μ or C _k Enhancer contains more.

Der Enhancer kann in dieser Ausführungsform entweder dele tiert oder inaktiviert sein. Eine solche Inaktivierung kann z. B. durch Mutagenese nach im Stand der Technik bekannten Verfahren herbeigeführt werden.In this embodiment, the enhancer can either be dele be deactivated or deactivated. Such inactivation can e.g. B. by mutagenesis according to known in the art Procedure can be brought about.

Bei dem in eukaryontischen Antikörper-produzierenden Zellen selektierbaren Marker ist der Enhancer vorzugsweise dele tiert oder inaktiviert worden. In einer anderen Ausführungs form weist der Marker keinen natürlichen Enhancer auf.The one in eukaryotic antibody-producing cells selectable marker, the enhancer is preferably dele been deactivated or inactivated. In another execution form, the marker has no natural enhancer.

Mit dem erfindungsgemäßen Integrationsvektor lassen sich vorteilhafterweise verschiedene V-Gene oder verschiedene Isotypen in ein funktionell rearrangiertes Antikörpergen einrekombinieren. Der Integrationsvektor muß im Gegensatz zu einem entsprechenden Replacementvektor lediglich eine zur genomischen Sequenz homologe Sequenz aufweisen. Damit muß keine der jeweiligen endogenen konstanten Region homologe Sequenz, wie bei den im Stand der Technik bekannten Replace mentvektoren, in den Vektor eingebaut werden. Sofern darüber hinaus das verwendete Hybridom nicht-isogen zu der Vektorse quenz ist, läßt sich mit dem Integrationsvektor eine höhere Ausbeute erzielen als mit einem Replacementvektor, d. h. ein und derselbe Integrationsvektor läßt sich auf Hybridome un terschiedlicher Mausstämme anwenden.With the integration vector according to the invention advantageously different V genes or different Isotypes in a functionally rearranged antibody gene recombine. The integration vector must be contrary to a corresponding replacement vector only one for genomic sequence have homologous sequence. So that must none homologous to the respective endogenous constant region Sequence as in the replace known in the prior art ment vectors into which the vector is built. If so In addition, the hybridoma used is non-isogenic to the vector is a higher, can be a higher with the integration vector Achieve yield than with a replacement vector, i.e. H. a and the same integration vector can be applied to hybridomas use different mouse strains.

Die im Vektor enthaltene homologe Sequenz muß eine Länge von mindestens 1,5 kb aufweisen, um ein homologes Rekombinati onsereignis überhaupt erzielen zu können. Diese DNA-Sequenz von mindestens 1,5 kb kann aus verschiedenen Bereichen des C_µ- oder C_k-Introns gewählt werden. Der Enhancer selbst ist erfindungsgemäß nicht im Konstrukt enthalten oder aus der Homologieflanke deletiert bzw. darin inaktiviert worden. Bei der Integration des Vektors in die homologe Sequenz eines funktionell rearrangierten Antikörpergens wird die Expres sion des rekombinanten Gens unter die Kontrolle des endoge nen Enhancers gestellt. Werden Exons, die konstante Regionen codieren, einrekombiniert, so stehen diese ferner unter der Kontrolle des endogenen V-Promotors. Der Enhancer reguliert darüber hinaus die Expression des selektierbaren Markers. Dadurch wird sichergestellt, daß der Selektionsmarker nur dann aktiv wird, wenn er in der Nähe eines starken Enhancers integriert wird. Durch die verwendete Homologieflanke wird eine homologe Rekombination mit dem Immunglobulinlocus be günstigt, wodurch der selektierbare Marker unter die Kon trolle des endogenen C_µ- oder C_k-Enhancers gestellt wird.The homologous sequence contained in the vector must have a length of at least 1.5 kb in order to be able to achieve a homologous recombination event. This DNA sequence of at least 1.5 kb can be selected from different areas of the C _µ or C _k intron. According to the invention, the enhancer itself is not contained in the construct or has been deleted from the homology flank or has been inactivated therein. When the vector is integrated into the homologous sequence of a functionally rearranged antibody gene, the expression of the recombinant gene is placed under the control of the endogenous enhancer. If exons encoding constant regions are recombined, these are also under the control of the endogenous V promoter. The enhancer also regulates the expression of the selectable marker. This ensures that the selection marker only becomes active if it is integrated in the vicinity of a strong enhancer. A homologous recombination with the immunoglobulin locus is favored by the homology edge used, as a result of which the selectable marker is placed under the control of the endogenous C _μ or C _k enhancer.

Der Begriff "rekombinante Antikörper", wie hier verwendet, bezeichnet jeden nicht natürlicherweise vorkommenden Anti körper. Dabei können die im Integrationsvektor eingefügten DNA-Sequenzen natürlichen, synthetischen oder semi-syntheti schen Ursprungs sein. Wie natürliche Antikörper codierende Sequenzen kloniert werden bzw. wie synthetische oder semi synthetische DNA-Sequenzen hergestellt werden, ist dem Fach mann aus dem Stand der Technik bekannt; vgl. z. B. Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, sowie Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA.The term "recombinant antibody" as used herein denotes any non-naturally occurring anti body. The ones inserted in the integration vector can be used DNA sequences natural, synthetic or semi-synthetic origin. Like coding natural antibodies Sequences are cloned or like synthetic or semi synthetic DNA sequences are made is the subject known from the prior art; see. e.g. B. Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, as well as Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Integrationsvektors codiert die DNA-Sequenz eine V-Domäne oder einen Teil davon. Vorzugsweise ist die die V-Domäne co dierende Sequenz ein V_k-Gen, wenn das Integrationsereignis in einem endogenen k-Gen stattfinden soll. Sofern das Rekom binationsereignis in einem schwere Kette-Gen erfolgen soll, ist die die V-Domäne codierende Sequenz vorzugsweise ein V_H- Gen. Die V-Region kann jede mögliche Antigenspezifität auf weisen. In dieser Ausführungsform ist der Selektionsmarker 5′ von der die V-Domäne codierenden Sequenz angeordnet, wäh rend der Intron-Bereich 3′ davon positioniert ist.In a preferred embodiment of the integration vector according to the invention, the DNA sequence encodes a V domain or a part thereof. Preferably, the sequence encoding the V domain is a V _k gene if the integration event is to take place in an endogenous k gene. If the recombination event is to take place in a heavy chain gene, the sequence encoding the V domain is preferably a V _H gene. The V region can have any possible antigen specificity. In this embodiment, the selection marker 5 'is arranged from the sequence coding the V domain, while the intron region 3' is positioned therefrom.

Codiert die DNA-Sequenz nur einen Teil einer V-Domäne, so muß diese zur Antigenbindung geeignet sein.If the DNA sequence encodes only part of a V domain, see above this must be suitable for antigen binding.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist der Inte grationsvektor eine DNA-Sequenz auf, die eine konstante Re gion oder einen Teil davon codiert. Diese Sequenz kann ent weder für die schwere oder die leichte Kette eines Antikör pers codieren. Dem Fachmann ist bekannt, daß bei allen Iso typen mehrere Exons für die schwere Kette codieren. Sofern nur ein C_H-Exon für die schwere Kette im Konstrukt vorhanden ist, ist dies vorzugsweise das C_H1-Exon. Mit einem derarti gen Konstrukt können rekombinante Antikörper hergestellt werden, die die Funktionalität von Fab- oder F(ab)₂-Fragmen ten aufweisen. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße In tegrationsvektor jedoch sämtliche Exons eines schwere Kette- Isotyps, wodurch eine vollständige schwere Kette exprimiert werden kann. In dieser Ausführungsform sind die Elemente (a), (b) und (c) in dieser Reihenfolge aufeinanderfolgend in 5′-3′ Richtung angeordnet.In another preferred embodiment, the integration vector has a DNA sequence which encodes a constant region or a part thereof. This sequence can encode either the heavy or light chain of an antibody. The person skilled in the art is aware that for all iso types, several exons code for the heavy chain. If there is only one C _H exon for the heavy chain in the construct, this is preferably the C _H1 exon. With such a construct, recombinant antibodies can be produced which have the functionality of Fab or F (ab) ₂ fragments. However, the integration vector according to the invention preferably contains all exons of a heavy chain isotype, as a result of which a complete heavy chain can be expressed. In this embodiment, the elements (a), (b) and (c) are arranged in this order in succession in the 5'-3 'direction.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Integrationsvektors weist der zum µ- oder k-Intron homologe Bereich eine Länge von 1,9 kb auf. In another preferred embodiment of the Invention according to the integration vector points to the µ or k intron homologous area has a length of 1.9 kb.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Integrationsvektors weist dieser zum µ- oder k- Intron homologe Bereich eine Länge von 2,0 kb auf.In a further preferred embodiment of the invented integration vector according to the invention has the µ- or k- Intron homologous area has a length of 2.0 kb.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Integrationsvektor eine Bakterien-kompati ble Regulationseinheit. Eine derartige Bakterien-kompatible Regulationseinheit ermöglicht die Klonierung und Amplifizie rung des Vektors in bakteriellen Systemen, beispielsweise in E. coli. Bakterien-kompatible Regulationssysteme sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt; vgl. Sambrook et al., a.a.O. Ein Beispiel für eine derartige Bakterien kompatible Regulationseinheit ist die Regulationseinheit aus dem Plasmid pBR322.In a further preferred embodiment, the integration vector according to the invention is a bacteria-compatible ble regulation unit. Such a bacteria-compatible Regulation unit enables cloning and amplification tion of the vector in bacterial systems, for example in E. coli. Bacteria-compatible regulatory systems are that Known expert from the prior art; see. Sambrook et al., op. cit. An example of such a bacteria compatible regulation unit is the regulation unit the plasmid pBR322.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dient der Inte grationsvektor zur Herstellung eines rekombinanten Antikör pers, der ein chimärer Antikörper ist. Unter "chimärer Anti körper" wird hier ein Antikörper verstanden, der die V- und C-Regionen aus verschiedenen Spezies kombiniert. Beispiels weise kann ein V-Gen aus der Maus mit den C-Exons eines menschlichen Isotyps kombiniert werden.In another preferred embodiment, the inte serves Group vector for the production of a recombinant antibody pers, which is a chimeric antibody. Under "chimeric anti body "here means an antibody that detects the V and C regions from different species combined. Example a mouse V gene with the C exons of a human isotype can be combined.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Vektors codiert die DNA-Sequenz Domänen einer menschlichen Antikörperkette. Diese Domänen können sowohl V- als auch C-Domänen oder Teile davon sein.In another preferred embodiment of the Invention According to the vector, the DNA sequence encodes domains human antibody chain. These domains can both V- as well as C domains or parts of them.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Vektors codiert die DNA-Sequenz Domänen, die aus der Maus, Ratte, Ziege, aus dem Pferd oder Schaf stam men. Vorzugsweise stammen sämtliche DNA-Sequenzen für entwe der die V- oder die C-Regionen aus einer dieser Tierarten. Die Erfindung umfaßt jedoch auch solche Ausführungsformen, in denen die die C-Regionen codierenden Sequenzen aus ver schiedenen Tierarten entnommen wurden. In a further preferred embodiment of the invented The vector according to the invention encodes the DNA sequence domains that from the mouse, rat, goat, from the horse or sheep men. All DNA sequences are preferably derived from either the the V or the C regions from one of these animal species. However, the invention also includes such embodiments in which the sequences coding the C regions from ver different animal species were taken.

Wie auch die in einer anderen Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Vektors verwendeten menschliche Domänen codie renden DNA-Sequenzen können diese Domänen codierende DNA- Sequenzen für die homologe Rekombination mit der entspre chenden Sequenz aus einer anderen Säugerart eingesetzt wer den.Like that in another embodiment of the inventions The vector according to the invention used human domains codie DNA sequences encoding these domains can Sequences for homologous recombination with the equivalent sequence from another mammal species the.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Vektors codiert die DNA-Sequenz sämtliche C-Domänen eines sekretorischen Antikörpers.In another preferred embodiment of the Invention According to the vector, the DNA sequence encodes all C domains of a secretory antibody.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Integrationsvektors codiert die DNA-Sequenz sämtliche C-Domänen eines membrangebundenen Antikörpers.In a further preferred embodiment of the invented Integration vector according to the invention encodes the DNA sequence all C-domains of a membrane-bound antibody.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Vektors enthält eine DNA-Sequenz, die C-Domänen eines Antikörpers codiert, der ein IgM-, IgG1-, IgG2a-, IgG2b-, IgG3-, IgG4-, IgA-, IgD- oder IgE-Antikörper ist. Dem Fach mann ist bekannt, daß manche dieser Isotypen nicht in allen Säugerspezies vorkommen. So enthält das menschliche Genom beispielsweise C-Gene, die IgG4-Isotype, nicht aber IgG2a- oder IgG2b-Isotype codieren. Dagegen enthält das Maus-Genom C-Gene, die den IgG2a- und den IgG2b-Isotyp, nicht aber den IgG4-Isotyp codieren.Another preferred embodiment of the invention ß vector contains a DNA sequence, the C domains one Antibody encoding an IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgD or IgE antibodies. The subject It is known that some of these isotypes are not in all Mammal species occur. So contains the human genome for example C genes, the IgG4 isotypes, but not IgG2a- or encode IgG2b isotype. In contrast, the mouse genome contains C genes that are the IgG2a and the IgG2b isotype, but not the Coding the IgG4 isotype.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vek tors sind die rekombinanten Antikörper-produzierenden Zellen menschliche Zellen oder Mauszellen oder Hybride davon. Maus zellen werden dann bevorzugt, wenn der Integrationsvektor ein menschliches C-Gen/menschliche C-Gene enthält, das/die stromabwärts von der V-Region eines rearrangierten Maus -An tikörpergens einrekombiniert werden soll. Der so exprimierte Antikörper kann beispielsweise für diagnostische und vor zugsweise für therapeutische Verfahren verwendet werden. Weiterhin werden für therapeutische Verfahren einzusetzende Antikörper vorzugsweise in menschlichen Zellen hergestellt. In a further embodiment of the Vek according to the invention tors are the recombinant antibody-producing cells human cells or mouse cells or hybrids thereof. Mouse cells are preferred when the integration vector contains a human C gene (s) that downstream of the V region of a rearranged mouse -An antibody gene is to be recombined. The one who expressed it Antibodies can be used, for example, for diagnostic and pre preferably used for therapeutic procedures. Furthermore, are used for therapeutic procedures Antibodies are preferably produced in human cells.

So können z. B. V-Gene aus der Maus mit gewünschten Spezifi täten in ein funktionelles menschliches Immunglobulin-Gen, vorzugsweise ein IgG1- oder IgG3-Gen einrekombiniert werden. Ferner hat die Verwendung menschlicher Zellen den Vorteil, daß die Antikörper mit einem menschlichen Glykosilierungs muster versehen werden, das bei therapeutischer Applikation keine unerwünschten Nebenwirkungen hervorruft.So z. B. V genes from the mouse with desired specifi into a functional human immunoglobulin gene, preferably an IgG1 or IgG3 gene can be recombined. Furthermore, the use of human cells has the advantage that the antibodies with a human glycosylation be provided pattern that with therapeutic application does not cause any undesirable side effects.

Dem Fachmann ist bekannt, wie er Hybride aus menschlichen Zellen und Mauszellen herstellen kann. Solche Hybride lassen sich beispielsweise durch Fusion von Maus-B-Lymphoplasten mit menschlichen Myelomzellen herstellen.The person skilled in the art knows how to make hybrids from human Can produce cells and mouse cells. Let such hybrids by, for example, fusion of mouse B lymphoplasts with human myeloma cells.

In all diese Zellen können mit dem erfindungsgemäßen Inte grationsvektor ferner synthetische V-Gene einrekombiniert werden. Ist die endogene C-Region eine menschliche C-Region, so lassen sich damit humanisierte Antikörper herstellen.The Inte Grationsvektor also recombined synthetic V genes become. If the endogenous C region is a human C region, it can be used to produce humanized antibodies.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Integrationsvektors ist der selektierbare Mar ker gpt, neo oder codiert für Hygromycin-Resistenz. Der Fachmann ist mit der Züchtung von Zellen unter Selektionsbe dingungen, die diese Marker erfordern, vertraut (vgl. z. B. Sambrook et al., a.a.O.). Er ist darüber hinaus in der Lage, weitere Selektionsmarker auszuwählen, die im erfindungsgemä ßen Vektor verwendet werden können.In a further preferred embodiment of the invented Integration vector according to the invention is the selectable Mar ker gpt, neo or encoded for hygromycin resistance. Of the A specialist is in the cultivation of cells under selection familiar with the conditions that these markers require (see e.g. Sambrook et al., Op. Cit.). He is also able select further selection markers, which in the invention ß vector can be used.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform trägt der er findungsgemäße Integrationsvektor die Bezeichnung pSV232Agpt-huγ₁-X5. Seine Konstruktion ist in Beispiel 1 beschrieben.In a particularly preferred embodiment, he wears integration vector according to the invention pSV232Agpt-huγ₁-X5. Its construction is in Example 1 described.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern, bei denen man die folgenden Schritte durchführt:The invention further relates to a method of manufacture of recombinant antibodies, in which the following Performs steps:

(a) Transfection of antibody-producing cells with the vector according to the invention;
(b) selection of stable transformants; and
(c) Identification of the desired antibody product cells.

Die Transfektion Antikörper-produzierender Zellen gilt als Standardverfahren der modernen Immunologie. Dem Fachmann ist bekannt, daß die Transfektionsbedingungen für jede verwen dete Zellinie eingestellt werden müssen. Ein Leitfaden zur Errichtung solcher Transfektionsbedingungen ist beispiels weise in Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986), 703-706 sowie in der Beschreibung zum Biorad "Genepulser" gegeben. Für die Mausmyelomlinie NS-1 (ATCC TIB 18) beispielsweise sind geeignete Transfektionsbedingungen in Mocikat et al., Gene 136 (1993), 349-353 beschrieben. Die Selektion von sta bilen Transformanten erfolgt durch Züchtung der Transforman ten für mindestens 7 Tage in einem geeigneten Selektionsme dium. Die Selektion stabiler Transformanten ist notwendig, um Zellen abzutöten, die das Plasmid nicht aufgenommen haben. Die Wahl des Selektionsmediums richtet sich selbst verständlich nach dem verwendeten Selektionsmarker. Die Her stellung geeigneter Selektionsmedien ist im Stand der Tech nik bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O. nachlesbar.The transfection of antibody-producing cells is considered Standard procedures in modern immunology. The specialist is known to use the transfection conditions for everyone dete cell line must be set. A guide to Establishment of such transfection conditions is an example Weise in Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986), 703-706 as well as in the description of the "Genepulser" biorad. For the mouse myeloma line NS-1 (ATCC TIB 18) for example are suitable transfection conditions in Mocikat et al., Gene 136 (1993), 349-353. The selection of sta Bile transformants are made by breeding the transformants for at least 7 days in a suitable selection meter dium. The selection of stable transformants is necessary to kill cells that did not take up the plasmid to have. The selection of the selection medium is self-determined understandable according to the selection marker used. The Her The provision of suitable selection media is in the state of the art nik known and for example in Sambrook et al., op. cit. readable.

Die Identifizierung der den gewünschten Antikörper-produzie renden Zellen kann beispielsweise durch für die konstante Region spezifische Antikörper erfolgen, wenn die DNA-Sequenz im Integrationsvektor ein C-Gen oder eine Domäne davon co diert. Wird hingegen ein V-Gen durch den Integrationsvektor in ein funktionell rearrangiertes endogenes Antikörpergen einrekombiniert, so kann die Expression des gewünschten An tikörpers durch anti-idiotypische Antikörper bestimmt wer den. Als Testverfahren eignen sich beispielsweise RIAs oder ELISAs. Auch diese Verfahren gehören zum Standardrepertoire des Durchschnittsfachmanns. Darüber hinaus kann die Integra tion der transferierten Domäne(n) mit dem im Stand der Tech nik bekannten PCR-Verfahren ermittelt werden. Der Fachmann ist in der Lage, hierzu geeignete Primer und Reaktionsbedin gungen zu bestimmen.Identification of the desired antibody product Renden cells can, for example, by for the constant Region specific antibodies are made when the DNA sequence a C gene or a domain thereof in the integration vector co dated. In contrast, becomes a V gene through the integration vector into a functionally rearranged endogenous antibody gene recombined, the expression of the desired An antibody determined by anti-idiotypic antibodies the. RIAs or are suitable as test methods, for example ELISAs. These procedures are also part of the standard repertoire of the average specialist. Integra tion of the transferred domain (s) with the in the state of the Tech Known PCR methods can be determined. The expert is able to use suitable primers and reaction conditions conditions to determine.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Transfektion durch Elektroporation, Calcium-Kopräzipitation, Lipofektion, die DEAE-Dextran-Tech nik oder retroviralen Gentransfer. All diese Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt. Der Fachmann weiß daher, wie er die Bedingungen für die einzelnen Transfektionsver fahren im erfindungsgemäßen Verfahren einzustellen hat.In a preferred embodiment of the invention The procedure is transfection by electroporation, Calcium coprecipitation, lipofection, the DEAE-Dextran-Tech nik or retroviral gene transfer. All of these procedures are well known in the art. The expert therefore knows how he met the conditions for each transfection ver drive in the method according to the invention.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens erfolgt die Selektion in einem Medium, das als Selektionsmittel Mykophenolsäure, G418, oder Hygro mycin enthält. Wie bereits vorstehend erwähnt, sind diese Selektionsmittel im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Wahl hängt vom verwendeten Selektionsmarker ab, während ihre Do sierung aus Standardwerken der Molekularbiologie hergeleitet werden kann; vgl. z. B. Sambrook et al., a.a.O.In another preferred embodiment of the Invention according to the method, the selection is carried out in a medium, that as a selection agent mycophenolic acid, G418, or hygro contains mycin. As mentioned above, these are Selection means well known in the art. your choice depends on the selection marker used, while your Do sation derived from standard works in molecular biology can be; see. e.g. B. Sambrook et al., Loc. Cit.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens codiert die DNA-Sequenz konstante Domänen des γ₁-, γ_2a-, γ_2b-, γ₃-, γ₄-, µ-, α-, δ oder ε-Isotyps.In another preferred embodiment of the method according to the invention, the DNA sequence encodes constant domains of the γ₁-, γ _2a -, γ _2b -, γ₃-, γ₄-, µ-, α-, δ or ε-isotype.

Schließlich betrifft die Erfindung Kits zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern, die mindestens einen erfindungs gemäßen Vektor enthalten. Diese Kits können zur leichten Herstellung von Antikörpern mit gewünschten Spezifitäten oder gewünschten Isotypen verwendet werden. Sie bieten dem Fachmann ein Mittel, mit relativ wenig Aufwand gewünschte rekombinante Antikörper zu isolieren. Die erfindungsgemäßen Kits enthalten entweder einen oder mehrere erfindungsgemäße Vektoren. Sie können darüber hinaus weitere Komponenten, wie beispielsweise geeignete Selektionsmittel enthalten. Finally, the invention relates to kits for the production of recombinant antibodies that at least one invention included in accordance with vector. These kits can be used for easy Production of antibodies with desired specificities or desired isotypes can be used. You offer that Expert a means desired with relatively little effort isolate recombinant antibodies. The invention Kits contain either one or more of the invention Vectors. You can also add other components, such as contain suitable selection agents, for example.

Die Figuren zeigen:The figures show:

Fig. 1 schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Integrationsvektors, mit dem in ein funk tionell rearrangiertes Maus γ_2a-Gen die C-Exons für das menschliche γ₁-Gen eingefügt werden. Der Vektor wird vor der Transfektion in eine geeignete Maus-Hybridomzellinie mit dem Restriktionsenzym XbaI linearisiert. Nach der Transfektion integriert der Vektor an der durch X gekennzeichneten Stelle. Durch die Integration werden Teile des Maus-Genoms dupliziert. Das so erhaltene Rekombinationsprodukt ist eben falls schematisch dargestellt. Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of the integration vector according to the invention, with which the C-exons for the human γ₁ gene are inserted into a functionally rearranged mouse γ _2a gene. The vector is linearized with the restriction enzyme XbaI prior to transfection into a suitable mouse hybridoma cell line. After transfection, the vector integrates at the point marked by X. Through the integration, parts of the mouse genome are duplicated. The recombination product thus obtained is also shown schematically if.

Fig. 2 Schematische Darstellung der Konstruktion des Vek tors pSV232Agpt-huγ1-X5. Die einzelnen Konstruktionsschritte sind genauer in Beispiel 1 beschrieben. Fig. 2 Schematic representation of the construction of the vector pSV232Agpt-huγ1-X5. The individual construction steps are described in more detail in Example 1.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

Example 1: Vector construction

Die humanen konstanten IgG1-Gensegmente werden als 2,9 kb- EcoRI-PvuII-Fragment (Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982), 4071-4079) in den mit EcoRI und BamHI gespaltenen Vektor pSVgpt (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072-2076) kloniert, dessen BamHI-Stelle durch Behandlung mit Klenow-Enzym (2 Einheiten, 30 Min. bei 37°C) mit glatten Enden versehen worden ist. In die EcoRI-Stelle stromaufwärts von den C-Exons wird anschließend über glatte Enden (nach Klenow-Behandlung, 2 Einheiten, 30 Min. bei 37° C) ein 2,3 kb-HindIII-Fragment eingefügt, das einen Teil des Maus-µ-Introns einschließlich des µ-Enhancers sowie das J_H4- Segment enthält (Gough und Bernard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 509-513; Banerji et al., Cell 33 (1983), 729-740). Aus diesem Konstrukt wird mit PvuI und HindIII ein Bereich herausgeschnitten, der Teile des pBR-Vektors, die murine Flanke, die humanen IgGl-C-Exons sowie Teile der gpt- Expressionseinheit ohne den SV40-Enhancer enthält. Dieses Fragment wird mit einem 3,7 kb großen Bereich aus dem Plas mid pSV232Agpt (Kadesch und Berg, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 2593-2601) ligiert, das durch Spaltung mit PvuI und HindIII aus diesem Vektor isoliert worden ist. Dieses Fragment ent hält den SV40-Promotor, sowie einen nicht mehr funktionellen Teil des SV40-Enhancers. Schließlich wird die 0,7 kb lange Sequenz stromabwärts von der EcoRI-Stelle durch Spaltung mit EcoRI und SacI aus dem Vektor eliminiert und durch ein 1,4 kb-Fragment aus dem murinen µ-Intron ersetzt, so daß die ge samte Homologieflanke eine Länge von 3,0 kb aufweist. Aus dieser Flanke wird durch Spaltung mit XbaI, wodurch ein Fragment von 1,0 kb entsteht, und Rezirkularisierung der Be reich des µ-Intron-Enhancers entfernt. Der resultierende Vektor wird mit pSV232Agpt-huγ₁-X5 bezeichnet; vgl. Fig. 2.The human IgG1 constant gene segments are expressed as a 2.9 kb EcoRI-PvuII fragment (Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982), 4071-4079) in the vector pSVgpt digested with EcoRI and BamHI (Mulligan and Berg , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072-2076) whose BamHI site has been blunted by treatment with Klenow enzyme (2 units, 30 min. At 37 ° C). A 2.3 kb HindIII fragment is then inserted into the EcoRI site upstream of the C exons via smooth ends (after Klenow treatment, 2 units, 30 min. At 37 ° C.), which part of the mouse contains µ introns including the µ enhancer and the J _H 4 segment (Gough and Bernard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 509-513; Banerji et al., Cell 33 (1983), 729-740). A region is cut out of this construct with PvuI and HindIII, which contains parts of the pBR vector, the murine flank, the human IgGl-C exons and parts of the gpt expression unit without the SV40 enhancer. This fragment is ligated to a 3.7 kb region from Plas mid pSV232Agpt (Kadesch and Berg, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 2593-2601), which was isolated from this vector by cleavage with PvuI and HindIII is. This fragment contains the SV40 promoter and a non-functional part of the SV40 enhancer. Finally, the 0.7 kb sequence downstream from the EcoRI site is eliminated from the vector by cleavage with EcoRI and SacI and replaced by a 1.4 kb fragment from the murine μ-intron, so that the entire homology flank is one length of 3.0 kb. The flank of the μ-intron enhancer is removed from this flank by cleavage with XbaI, resulting in a fragment of 1.0 kb, and recircularization. The resulting vector is designated pSV232Agpt-huγ₁-X5; see. Fig. 2.

Example 2: Transfection experiment

Zur Transfektion werden 10⁷ exponentiell wachsende Hybri domzellen abzentrifugiert und in 700 µl eiskaltem RPMI 1640 (Gibco, BRL) resuspendiert. 20 µg pSV232Agpt-huγ₁-X5 werden mit XbaI vollständig linearisiert, mit Isopropanol präzipi tiert, in 20 µl H₂O bidest. resuspendiert und zu der Zell suspension gegeben. Die Transfektion erfolgt mittels Elek troporation (Biorad, Typ "Genepulser") mit einem einzelnen Stromimpuls; Feldstärke und Kondensatorkapazität werden für jede Zellinie individuell eingestellt. Der Fachmann ist mit der Einstellung dieser Bedingungen vertraut, die beispiels weise in der Betriebsableitung zum "Genepulser" oder in Toneguzzo et al., a.a.O. detailliert wiedergegeben sind. Die Zellen werden 10 Minuten auf Eis gehalten und dann in einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Kavität auf 24-Loch-Platten in RPMI 1640, supplementiert mit 10% foetalem Kälberserum (Gibco, BRL) und 2mM Glutamin (Gibco, BRL) verteilt. For transfection 10⁷ exponentially growing hybri centrifuged dome cells and in 700 µl ice-cold RPMI 1640 (Gibco, BRL) resuspended. 20 µg pSV232Agpt-huγ₁-X5 be Fully linearized with XbaI, precipitated with isopropanol animals, in 20 µl H₂O bidest. resuspended and to the cell suspension given. The transfection takes place by means of elec troporation (Biorad, type "Genepulser") with a single Current pulse; Field strength and capacitor capacity are used for each cell line set individually. The specialist is with familiar with the setting of these conditions, for example as in the operational derivation to the "Genepulser" or in Toneguzzo et al., Op. Cit. are reproduced in detail. The Cells are kept on ice for 10 minutes and then in one Density of 10⁵ cells per cavity on 24-hole plates RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco, BRL) and 2mM glutamine (Gibco, BRL) distributed.

Example 3: Selection of stable transfectants

48 Stunden nach der Transfektion beginnt die Selektion mit steigenden Konzentrationen von Mykophenolsäure bis zu einer Endkonzentration von 2 µg/ml in Gegenwart von 250 µg/ml Xan thin und 15 µg/ml Hypoxanthin. Die Klone werden auf stabiles Wachstum hin im Abstand von 2 Tagen abgesucht. Die Über stände stabil wachsender Klone werden auf ihren Gehalt an humanem IgG1 abgesucht. Dazu wird ein ELISA mit Ziege-anti human-IgGFc-spezifischem Fänger-Antikörper und Peroxidase gekoppeltem Detektions-Antikörper derselben Spezifität ver wendet (vgl. Beispiel 4). Klone, deren Überstand ein positi ves Ergebnis liefert, werden expandiert.The selection begins 48 hours after the transfection increasing concentrations of mycophenolic acid to one Final concentration of 2 µg / ml in the presence of 250 µg / ml Xan thin and 15 µg / ml hypoxanthine. The clones are stable Growth searched every 2 days. The About levels of steadily growing clones will depend on their content human IgG1 searched. An ELISA with goat anti is used human IgGFc-specific capture antibody and peroxidase coupled detection antibody of the same specificity ver applies (see Example 4). Clones whose supernatant is a positive ves result delivers are expanded.

Example 4: Enzyme-bound absorption test

ELISA-Platten (Nunc) werden mit Ziege-anti-human-IgGFc-spe zifischem Fänger-Antikörper (Dianova, Hamburg) beschichtet. Freie Bindungsstellen werden mit 1% Milchpulver blockiert. Anschließend werden die zu testenden Kulturüberstände inku biert und der Test anschließend mit Peroxydase-gekoppeltem Detektions-Antikörper (Dianova) inkubiert. Nach jedem der vorstehenden Schritte werden die Platten mit Phosphat-gepuf ferter Saline ausgiebig gewaschen. Der Test wird mit o-Phe nylendiamin (Sigma) entwickelt. Jede der vorstehend genann ten Reaktionen wird eine Stunde bei Raumtemperatur durchge führt. Die Farbreaktion wird in einem ELISA-Meßgerät (STL- Labinstruments, Typ SF+) bei einer Wellenlänge von 405 nm ge messen.ELISA plates (Nunc) are coated with goat anti-human IgGFc specific catcher antibody (Dianova, Hamburg) coated. Free binding sites are blocked with 1% milk powder. The culture supernatants to be tested are then incu beers and then the test with peroxidase-coupled Detection antibody (Dianova) incubated. After each of the Above steps, the plates are puffed with phosphate Extensively washed saline. The test is carried out with o-Phe nylendiamine (Sigma) developed. Any of the above Reactions are carried out for one hour at room temperature leads. The color reaction is carried out in an ELISA measuring device (STL- Labinstruments, type SF +) at a wavelength of 405 nm measure up.

Nach der Transfektion von 10⁷ Hybridomzellen werden 20 Myko phenol-resistente Klone erhalten. Nach statistischer Auswer tung exprimieren davon 5% den menschlichen γ₁-Isotyp. Die Integrität der menschlichen schweren Kette wurde im SDS- PAGE-Gel und im Western-Blot (vgl. Beispiel 5) bestätigt. After transfection of 10⁷ hybridoma cells, 20 myko obtained phenol-resistant clones. According to statistical evaluation Tung express 5% of the human γ₁ isotype. The Integrity of the human heavy chain has been PAGE gel and confirmed in Western blot (see Example 5).

Die Antigen-Bindungsspezifität und die Affinität entsprechen der des parentalen Maus-Antikörpers, wie durch Kompetitions versuche (vgl. Beispiel 6) nachgewiesen wurde.The antigen binding specificity and affinity correspond that of the parental mouse antibody as by competition attempts (see Example 6) has been demonstrated.

Example 5: Western blot

Die rekombinanten Antikörper werden aus dem Kulturüberstand über eine FPLC-Protein-G-Sepharose-Säule (Pharmacia, Frei burg) gereinigt. Mit 2 µg Protein wird eine SDS-PAGE (Gradient von 8-15% Acrylamid) nach Standardverfahren durch geführt. Die Proteine werden durch Elektroblotten auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und durch Ziege-anti-human- IgGFc-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist (Dianova) nachgewiesen. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von 3,3-Diaminobenzidin eingeleitet.The recombinant antibodies are made from the culture supernatant on an FPLC protein G Sepharose column (Pharmacia, Frei castle) cleaned. With 2 µg protein an SDS-PAGE (Gradient of 8-15% acrylamide) by standard methods guided. The proteins are electroblotted onto a Nitrocellulose membrane transferred and passed through goat anti-human IgGFc antibody coupled to horseradish peroxidase (Dianova) proven. The color development is through Addition of 3,3-diaminobenzidine initiated.

Example 6: Competition experiments

Maus-Lymphozytenzellen, die das Zielantigen tragen, werden 30 Min. nach Standardverfahren mit Verdünnungsreihen des rekombinanten Antikörpers und anschließend 10 Min. mit dem parentalen Antikörper, der mit FITC markiert ist, bei 0°C inkubiert. Die Beladung der Zellen mit dem markierten Anti körper wird nach Standardverfahren im FACS gemessen.Mouse lymphocyte cells that carry the target antigen 30 minutes using standard procedures with dilution series of recombinant antibody and then 10 min. with the parental antibody labeled with FITC at 0 ° C incubated. The loading of the cells with the marked anti Body is measured according to standard procedures in the FACS.

Claims

1. Integration vector for the production of genes encoding re combinatorial antibodies, which contains the following elements:

(a) a region of at least 1.5 kb which is homologous to a region of the μ intron or k intron which contains no or no functional C _μ or C _k enhancer;
(b) at least one DNA sequence encoding an antibody domain or part thereof; and
(c) a marker which is selectable in eukaryotic antibody-producing cells and which has no functional enhancer region, the expression of this marker being controlled after integration by the cellular C _μ or C _k enhancer.

2. The vector of claim 1, wherein the region of the µ or k intron comprises the C _µ or C _k enhancer locus and the region of 1.5 kb contains no functional C _µ or C _k enhancer.

3. Vector according to claim 1 or 2, wherein the DNA sequence encodes a V domain or part thereof.

4. Vector according to claim 1 or 2, wherein the DNA sequence encodes a constant region or part thereof.

5. Vector according to one of claims 1 to 4, wherein the loading area, which is homologous to a region comprising the C _µ or C _k enhancer of the µ or k intron, comprises at least 1.9 kb.

6. Vector according to one of claims 1 to 4, wherein the loading area, which is homologous to a region comprising the C _µ or C _k enhancer of the µ or k intron, comprises at least 2.0 kb.

7. Vector according to one of claims 1 to 6, the Bak contains a series-compatible regulation unit.

8. Vector according to one of claims 1 to 7, wherein the right combined antibody is a chimeric antibody.

9. Vector according to one of claims 1 to 8, wherein the DNA Sequence domains of a human antibody chain co dated.

10. Vector according to one of claims 1 to 8, wherein the DNA Sequence domains encoded from the mouse, rat, Goat from which horse or sheep come.

11. Vector according to one of claims 1, 2 and 4 to 10, where in the DNA sequence all C domains of a secreto coded antibody.

12. Vector according to one of claims 1, 2 and 4 to 10, where in the DNA sequence all C domains of a membrane bound antibody encoded.

13. Vector according to one of claims 1, 2 and 4 to 12, where encode the exons C domains of an antibody that an IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, Is IgD or IgE antibody.

14. Vector according to one of claims 1 to 13, wherein the right combined antibody-producing cells human Are cells or mouse cells or hybrids thereof.

15. Vector according to one of claims 1 to 14, wherein the se selectable markers gpt, neo, or a hygromycin resi is a coding marker.

16. Vector according to claim 15, which bears the designation pSV232Agpt-huγ₁-X5 and whose construction is represented by Fig. 2, Fig. 2 being part of this claim.

17. A method for producing recombinant antibodies by performing the following steps:

(a) transfection of antibody-producing cells with a vector according to any one of claims 1 to 16;
(b) selection of stable transformants; and
(c) Identification of the cells producing the desired antibody.

18. The method of claim 17, wherein the transfection by electroporation, calcium phosphate coprecipitation, Lipofection, the DEAE dextran technique, or retrovira len gene transfer takes place.

19. The method according to claim 17 or 18, wherein the selection in a medium that acts as a Myko phenolic acid, G418 or hygromycin.

20. The method according to any one of claims 17 to 19, wherein the exons encode constant domains of the µ-, γ₁-, γ _2a -, γ _2b -, γ₃-, γ₄-, δ-, α- or ε-isotype.

21. Kit for the production of recombinant antibodies, ent holding at least one vector according to one of the claims che 1 to 16.