DE4334359A1

DE4334359A1 - Epoxy-Derivate von Polyacrylamiden

Info

Publication number: DE4334359A1
Application number: DE19934334359
Authority: DE
Inventors: Egbert Dr Mueller
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-04-03
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1995-04-13

Description

Die Erfindung betrifft aktivierte Trägermaterialien, die epoxysubstituierte Poly(meth)acrylamide enthalten, sowie deren Verwendung.

Aktivierte Trägermaterialien sind wichtige Zwischenprodukte bei der Her stellung von Trägermaterialien für die Affinitätschromatographie und zur Immobilisierung von Enzymen. In polymeranalogen Umsetzungen können außerdem aus aktivierten Trägermaterialien Trennmaterialien für die Ionen austausch-, für die hydrophobe Interaktions-, für die Gelpermeations- und für die Metallchelatchromatographie hergestellt werden.

Aktivierte Trägermaterialien, die sich von Epoxyderivaten von vernetzten Poly(meth)acrylaten herleiten, sind bekannt. Diese besitzen jedoch wegen ihrer rigiden Struktur Nachteile. In der nicht veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 43 10 964 sind unvernetzte Pfropfpolymerisate auf der Grundlage von Epoxy-(meth)acrylaten beschrieben.

Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich unvernetzte Pfropfpolymerisate auf der Grundlage von epoxy-substituierten Poly(meth)acrylamiden bereit.

Gegenstand der Erfindung sind aktivierte Trägermaterialien auf der Grund lage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß

a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
b) die kovalent gebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Träger gebunden sind,
c) die Polymeren Monomereinheiten der Formel I enthalten,
d) die Monomereinheiten linear verknüpft sind,

worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H oder Alkyl mit 1-5 C-Atomen und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von aktivierten Trägermaterialien auf Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere durch Pfropfpolymerisation kovalent ge bunden werden, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte

a) Acroylisierung eines chlorhydrin-haltigen Alkylamins der Formel II, worin
R⁴ H oder Alkyl mit 1-5 C-Atomen und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten;
b) Pfropfpolymerisation der Monomeren aus Schritt a) auf ein hydroxyl gruppenhaltigen Basisträgerteilchen in Gegenwart von Cer(IV)-Ionen;
c) Umsetzung der Chlorhydrin-Restes zum Epoxid.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungs gemäßen aktivierten Trägermaterials für die Herstellung von chromato graphischen Trennmaterialien und für die Immobilisierung von Enzymen.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von chromato graphischen Trennmaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß Separations effektoren an erfindungsgemäße aktivierte Trägermaterialien gebunden werden, sowie die nach diesen Verfahren hergestellten chromatographischen Trennmaterialien.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von immobili sierten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme an erfindungsge mäße aktivierte Trägermaterialien gebunden werden, sowie die nach diesen Verfahren hergestellten immobilisierten Enzyme.

Die chlorhydrin-haltigen Alkylamine der Formel II sind, soweit sie nicht kommerziell erhältlich sind, dem Fachmann nach gängigen Verfahren zu gänglich. Die Beispiele beschreiben eine Verfahrensvariante.

Für die Acroylisierung der Alkylamine der Formel II geeignete Verfahrens varianten sind dem Fachmann geläufig. Geeignet ist beispielsweise die Reaktion nach Schotten-Baumann und ihre Varianten. Als Acryl- oder Methacrylsäurederivat wird bevorzugt das Säurechlorid eingesetzt. Andere geeignete Derivate sind dem Fachmann geläufig, z. B. die Säureazide oder -anhydride. Es wird bevorzugterweise in Gegenwart eines Polymerisations inhibitors gearbeitet.

Basisträger im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Partikel, aber auch membran- oder fadenförmige, sowie netz- oder gewebeähnliche oder schwammähnliche Materialien, auf die Polymere aufgepfropft werden. Als Basisträger können allgemein übliche poröse oder unporöse Trägerteilchen eingesetzt werden, soweit sie primäre oder sekundäre aliphatische Hydroxyl gruppen an ihrer Oberfläche aufweisen, oder in die nach an sich bekannten Verfahren aliphatische Hydroxylgruppen eingeführt werden können. Ge eignet sind unter anderem Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulosederivate und Polymere auf Dextran-Basis. Bevorzugt sind Poly mere auf Polyvinylalkohol-Basis oder Copolymere aus (Meth)acrylatderi vaten und Comonomeren mit aliphatischen Hydroxylgruppen. Insbesondere sind diolmodifizierte Kieselgele als Basisträger, sowie Mischpolymerisate auf Polyvinylbasis, die aliphatische Hydroxylgruppen enthalten, bevorzugt. Derartige Basisträger sind kommerziell erhältlich; z. B. Fractogel® TSK HW 65 (S) (Fa. E. Merck), ein poröses Mischpolymerisat auf Vinylbasis, das ali phatische Hydroxylgruppen enthält (1 mÄq OH/g), und LiChrospher® DIOL (Fa. E. Merck), ein diolsubstituiertes Kieselgel, ebenfalls mit alipha tischen Hydroxylgruppen.

Die Pfropfpolymerisation der substituierten Acrylamide auf den Basisträger wird mit Cer(IV)-Ionen gestartet, wie es von G.Mino und S.Kaizerman (1958) (J.Polymer Science 31, 242-243) und von G.Mino et al. (1959) (J.Polymer Science 38, 393-401) beschrieben wurde. Die Pfropfpolymeri sation nach Mino und Kaizerman wird nach bekannten Verfahren in rein wäßriger, salpetersaurer Lösung ausgeführt. Deswegen kann diese Reaktion nur mit gut wasserlöslichen Monomeren ausgeführt werden. Es zeigte sich jedoch, daß die Umsetzung mit Cer(IV)-salzen auch möglich ist, wenn als Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, die keine Hydroxylgruppen enthalten, benutzt wird. Besonders bevorzugt sind dabei Dioxan oder Tetrahydrofuran. Der Anteil des organischen Lösungsmittels im Reaktionsansatz beträgt bevorzugt 10-80 Volumen-%, besonders bevorzugt 20-50 Volumen-%.

Die Umsetzung Chlorhydrins zum Epoxid erfolgt nach Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind.

Für die Wechselwirkung zwischen Analyt und chromatographischen Trenn material sind Separationseffektoren notwendig. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Separationseffektoren bekannt, die er entsprechend der chromatographischen Trennmethode auswählt: Beispiele für derartige Trennmethoden sind die Ionenaustauschchromatographie, die Gel permeationschromatographie, die hydrophobe Interaktionschromatographie und die Affinitätschromatographie.

Als Separationseffektoren für die Ionenaustauschchromatographie sind ionische Gruppen wie beispielsweise quaternäre Ammoniumalkylgruppen und die SO₃₋-Gruppe, sowie ionogene Gruppen, die unter bestimmten pH-Bedingungen Ionen bilden, bekannt. Zu der letzten Gruppe gehören beispielsweise die alkylierten Aminogruppen, sowie die Carboxyl- und die Phosphorsäuregruppe.

Für die hydrophobe Interaktionschromatographie sind ungeladene hydro phobe Separationseffektoren üblich, beispielsweise C₁-C₂₀-Alkyl, C₆-C₂₅-Aryl, C₇-C₂₅-Alkylaryl oder C₇-C₂₅-Arylalkyl, die auch einfach oder mehrfach mit Nitril oder C₁-C₅-Alkoxy derivatisiert sein können, wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH-Gruppen durch N ersetzt sein können, oder Polyoxyethylen- oder Polyoxypropylenderivate [(CH₂)_m-O-]_o-R⁹, worin in 2 oder 3, o eine ganze Zahl zwischen 1 und 200 und R⁹ H oder C₁-C₅-Alkyl bedeuten. Bevorzugt werden besonders Reste mit mittlerer oder geringer Hydrophobizität.

Für die Affinitätschromatographie sind dem Fachmann sehr viele Affinitäts liganden bekannt, die jeweils mit dem Analyten eine strukturell gegebene Bindung eingehen, und die als Separationseffektoren geeignet sind, beispielsweise:

Affinitätsligand
Analyt (Beispiel)
Protein A
Immunglobuline
Concanavalin A	Glycoproteine
Biotin	Avidin/Streptavidin
Avidin	Biotin
Streptavidin	Biotin
5′-Adenosinmonophosphat	NAD-abhängige Oxidoreduktasen
2′,5′-Adenosindiphosphat	NADP-abhängige Oxidoreduktasen
Aminoacridin	RNA oder DNA
Boronsäure	Katecholamine
Boronsäure	glykosyliertes Hämoglobin
Iminodiessigsäure	Metalloproteine
"thiophile" Liganden	Immunglobuline
Cibachromblau	monoklonale Antikörper

Die Separationseffektoren lassen sich durch Reaktion mit der aktiven Epoxid-Gruppe des aktivierten Trägermaterials einführen. Somit entsteht ein chromatographisches Trennmaterial für den durch den verwendeten Separa tionseffektor vorgegebenen Verwendungszweck. Geeignete Reaktionen sind grundsätzlich bekannt; dazu gehören beispielsweise:

a) die Reaktion mit schwefliger Säure oder ihren Salzen oder mit pri mären, sekundären oder tertiären Aminen, wobei Ionenaustauscher entstehen;
b) die Reaktion mit Alkoholen, Phenolen oder auch primären Aminen, wobei hydrophobe Trennmaterialien entstehen;
c) die Reaktion mit Iminodiessigsäure oder die Einführung thiophiler Liganden, oder anderer Affinitätsliganden wie Protein A, wobei Träger für die Affinitätschromatographie entstehen.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.

Beispiele Beispiel 1 Synthese eines Chlorhydrinderivates des Acrylamids Stufe 1

60 g trockenes Phtalimidkalium und 120 g 1,3-Dichlorhydrin werden am Rückfluß innerhalb von 6 Stunden auf 200°C erhitzt. Das Reaktions produkt wird anschließend mit Wasser ausgekocht. Anschließend wird das Wasser am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt; der Rückstand wird direkt für die nächste Synthesestufe verwendet.

Stufe 2

30 g des Reaktionsproduktes aus Stufe 1 werden in einer Lösung aus 50% Hydrazinhydrat und 50% Ethanol 2 Stunden auf 60°C erhitzt. Danach werden 100 ml 1 M Salzsäure zugesetzt und anschließend nochmals 2 Stunden auf 60°C erhitzt. Das Phtalsäurehydrazid fällt aus und wird ab filtriert. Das Filtrat wird anschließend am Rotationsverdampfer unter ver mindertem Druck eingeengt. Dann wird das Reaktionsprodukt in 100 ml einer 1 M Natronlauge aufgenommen. Diese Lösung wird für die nächste Synthesestufe verwendet.

Stufe 3

In die Lösung aus Stufe 2 werden unter Eiskühlung und Rühren 20 ml Acrylsäurechlorid eingetropft. Es wird anschließend noch 2 Stunden nach gerührt.

Beispiel 2 Propfpolymerisation eines Chlorhydrinderivates des Acrylamids

Die Lösung aus Stufe 3 von Beispiel 1 wird zu 50 ml wasserfeuchtem Fractogel® TSK HW 65 (S) (Fa. E. Merck) zugegeben. Die Reaktionslösung wird mit 150 U/min gerührt. Danach wird die Starterlösung zugegeben (3 g Ammoniumcer(IV)nitrat + 3 g konzentrierte Salpetersäure in 25 ml Wasser). Die Polymerisation wird nach 3 Stunden abgebrochen und das Gel mit ver dünnter Schwefelsäure und 1 M Natronlauge gewaschen.

Beispiel 3 Polymeranaloge Umsetzung zum Oxiranderivat

Um das Polymere des Chlorhydrinderivates in das entsprechende Oxiran derivat zu überführen, wird das Gel hergestellt nach Beispiel 2 bei 60°C in 1 M Natronlauge 5 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Gel neu tral gewaschen.

Der Oxirangruppengehalt beträgt (nach Perchlorsäuretitration) 0,5 mmol/g Gel.

Claims

1. Aktivierte Trägermaterialien auf der Grundlage von hydroxylgruppen haltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent ge bunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß

2. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Trägermaterialien auf Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Ober flächen Polymere durch Pfropfpolymerisation kovalent gebunden werden, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte

a) Acroylisierung eines chlorhydrin-haltigen Alkylamins der Formel II, worin
R⁴ H oder Alkyl mit 1-5 C-Atomen und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten;
b) Pfropfpolymerisation der Monomeren aus Schritt a) auf ein hydroxylgruppenhaltigen Basisträgerteilchen in Gegenwart von Cer(IV)-Ionen;
c) Umsetzung der Chlorhydrin-Restes zum Epoxid.

3. Verwendung eines aktivierten Trägermaterials nach Anspruch 1 für die Herstellung von chromatographischen Trennmaterialien.

4. Verwendung eines aktivierten Trägermaterials nach Anspruch 1 für die Immobilisierung von Enzymen.

5. Verfahren zur Herstellung von chromatographischen Trennmaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß Separationseffektoren an aktivierte Trägermaterialien nach Anspruch 1 gebunden werden.

6. Chromatographisches Trennmaterial herstellbar nach einem Verfahren nach Anspruch 5.

7. Verfahren zur Immobilisierung eines Enzyms dadurch gekennzeichnet, daß dieses an aktivierte Trägermaterialien nach Anspruch 1 gebunden wird.

8. Immobilisiertes Enzym herstellbar nach einem Verfahren nach Anspruch 7.