DE4325850A1

DE4325850A1 - Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren

Info

Publication number: DE4325850A1
Application number: DE4325850A
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Pressler; Friedhelm Dr Balkenhohl; Bernhard Dr Hauer; Wolfgang Dr Ladner; Ursula Dr Mueller; Horst Ralf Dr Staudenmaier
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1993-07-05
Filing date: 1993-07-31
Publication date: 1995-04-27
Also published as: DE59406846D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Her stellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren.

Hochfunktionalisierte Alkohole, Aldehyde und Carbonsäuren sind interessante und gesuchte Produkte für die Herstellung von Phar maka, Polymeren, Feinchemikalien usw., die oft durch Oxidation entsprechender Vorstufen synthetisiert werden.

Chemische Oxidationen zeigen in der Regel geringe Regio spezifitäten. Außerdem werden für die Oxidation oft toxische und/oder schwer handhabbare Reagenzien benötigt.

Von Bakterien ist die Fähigkeit zur Oxidation von Methylgruppen prinzipiell bekannt.

So beschreiben Raymond et al (Appl. Microbiol. 15, 857-865 (1967)) die Oxidation von Methylgruppen durch Cooxidation mit n-Paraffinen bei der Gattung Nocardia.

Von der Gattung Pseudomonas ist bekannt, daß sie p-Cymen in drei Schritten über den Alkohol und Aldehyd zur p-Isopropylbenzoesäure oxidiert (J. Bacteriol. 129, 1356-1364 und 1365-1374 (1977) und ebenda 171, 5155-5161 (1989)).

Neben dieser Oxidation benzylischer Methylgruppen ist auch die Oxidation allylischer Methylgruppen mit Hilfe einer Reihe von Mikroorganismen bekannt.

So beschreiben Noma et al. die Oxidation von Limonen durch Aspergillus cellulosae (Phytochemistry, 31, 2725-2727 (1992)) u. a. zu Perillaalkohol.

Pseudomonas incognita oxidiert Linalool u. a. zu 8-Hydroxylinalool (J. Bacteriol. 171, 5155-5161 (1989)).

Bhattacharyya et al. haben in einer ganzen Reihe von Arbeiten (Indian. J. Biochem. 5, 79-91 und 92-101 (1968), Indian. J. Biochem. 3, 144-157 (1966) und Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, No. 3, 275-279 (1967)) die Oxidation von Terpenen (z. B. Li monen, α- und β-Pinen) durch Pseudomonas PL-Stämme untersucht. Diese PL-Stämme oxidieren auch p-Cymen zur Cuminsäure (Indian. J. Biochem. 5, 161-167 (1968)). Die angeführten Arbeiten zeigen jedoch, daß neben den gewünschten Methylgruppenoxidationen in benzylischer und allylischer Position durch die Mikroorganismen eine ganze Reihe zusätzlicher Oxidationen an den eingesetzten Edukten (wie Limonen, p-Cymen etc.) passieren.

Die in CH-PS 677 791 und Tetrahedron 48, 6681-6688 (1992)) be schriebene Oxidation einer allylischen Methylgruppe von Terpenen mit Mikroorganismen der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Absidia, Rhizopus, Streptomyces, Mycobacterium, Cunninghamella, Nocardia etc. ist ebenfalls mit dem Problem von Nebenreaktionen behaftet.

Die beschriebenen Reaktionen sind deshalb technisch nicht anwend bar.

EP-OS 442 430, EP-OS 466 042 und EP-OS 477 828 beschreiben tech nisch nutzbare Methylgruppenoxidationen Nachteil dieser Umsetzungen ist jedoch die Induktion der Mikroorganismen durch z. B. p-Xylol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Außer dem sind die beschriebenen Reaktionen auf 5- und 6gliedrige He terozyklen beschränkt.

Technische Verfahren, mit Mikroorganismen, die sowohl benzylische als auch allylische Methylgruppenpositionen bei einer breiten Palette von aromatischen, heteroaromatischen und aliphatischen Substanzen selektiv oxidieren, sind bisher nicht bekannt.

Es wurde nun ein technisch brauchbares Verfahren mikrobiellen Herstellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren gefunden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I

worin
R¹ ein Wasserstoffatom, eine C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe ist
R² ein Wasserstoffatom, eine C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe dar stellt oder
R¹ und R² zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind a) einen 6-Ring darstellen, der 1 oder 2 weitere Doppelbindungen enthalten und/oder durch 1, 2 oder 3 Halogenatome, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, C_1-4-Acyl-, C_1-4-Alkoxygruppen und/oder 1 oder 2 Cyano-, Amino-, C_1-4-Alkylamino- oder Di-C_1-4-alkylaminogruppen und/oder eine Nitrogruppe substituiert sein kann und/oder an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer 6-Ring zu einem Ringsystem ankondensiert sein kann, das durch ein bis vier C_1-4-Alkoxy-, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, C_1-4-Alkoxy- carbonyl-, Amino-, C_1-4-Alkylamino-, Di-C_1-4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoyl gruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann, oder b) einen heterocyclischen 5-Ring dar stellen, der 1, 2 oder 3 Heteroatome enthält und/oder eine weitere Doppelbindungen enthalten kann und an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer Ring ankondensiert sein kann, der durch ein bis vier C_1-4-Alkoxy-, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro- Carboxyl-, C_1-4-Alkoxycarbonyl-, Amino-, C_1-4-Alkyl- amino-, Di-C_1-4-alkylamino- und/oder eine gegebenen falls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann,
R³ ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine C_1-4-Alkyl- oder C_2-4-Alkenylgruppe, oder eine gegebenenfalls halogensubstituierte Aryloxy- oder Benzoylgruppe dar stellt und
R⁴ eine -CH₂OH-, oder -CHO- oder -COOH-Gruppe bedeutet,
welches darin besteht, daß man eine Verbindung der Formel II

worin R¹-R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit Hilfe eines Mikroorganismus selektiv oxidiert.

Als Alkylreste seien für R¹ und R² genannt: Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 1-Methylethyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methyl propyl- und 1,1-Dimethylethylgruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und Propylreste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 2-Methyl-1-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-1-propenyl-, 1-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-1-propenyl-Rest.

Ist R¹ eine substituierte Arylgruppe, so trägt diese vorzugsweise C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- und/oder Halogenreste. Als Alkylreste seien genannt: Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 1-Methylethyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl- und 1,1-Dimethylethyl gruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und n-Propyl reste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 2-Methyl-1-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-1-propenyl-, 1-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-1-propenyl-Rest. Als Halogenatome sind Fluor, Chlor oder Brom zu nennen. Bevorzugt ist Chlor. Die Zahl der Substituenten am Arylrest beträgt normaler weise 1-3. Bevorzugt sind 1 oder 2 Reste.

Als Arylreste seien für R¹ besonders der Phenyl- und Naphthylrest genannt.

Ist R² eine substituierte Arylgruppe, so trägt diese vorzugsweise C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- und/oder Halogenreste. Als Alkylreste seien genannt: Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 1-Methylethyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl- und 1,1-Dimethylethyl gruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und Propylre ste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 2-Methyl-1-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-1-propenyl-, 1-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-1-propenyl-Rest. Als Halogenatome sind Fluor, Chlor oder Brom zu nennen. Bevorzugt ist Chlor. Die Zahl der Sub stituenten am Arylrest beträgt normalerweise 1-3. Bevorzugt sind 1 oder 2 Reste.

Bevorzugte Reste für R² sind: Phenyl, Methyl, p-Methoxyphenyl, 1,3-Dioxanyl und 5,5-Dimethyl-1,3-dioxanyl.

Als Arylreste seien für R² besonders der Phenyl- und Naphthylrest genannt.

Sind R¹ und R² Teil eines Ringes bzw. Ringsystems, so sind fol gende als bevorzugt zu nennen: Phenyl, Benzoyl, Naphthyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Benzofuryl und Benzoxazyl.

Als Substituenten dieser Ringsysteme sind zu nennen:
Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methyl propyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl (insbesondere Methyl, Ethyl und Propyl); Alkoxy wie Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, 1-Methylethoxy, Butyloxy, 1-Methylpropyloxy, 2-Methylpropyloxy, 1,1-Dimethylethoxy (insbesondere Methoxy und 1-Methylethoxy); Alkenyl wie Vinyl, 1-Methylvinyl, cis-1-Propenyl, trans-1-Propenyl, 2-Propenyl, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1-Methyl-1-propenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 1-Ethylvinyl (insbesondere 2-Methyl-1-propenyl); Halogen wie Fluor, Chlor, Brom und Iod (insbesondere Fluor und Chlor); Alkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propyloxy carbonyl, 1-Methylethoxycarbonyl, Butyloxycarbonyl und 1,1-Dimethylethoxycarbonyl (insbesondere Methoxycarbonyl und 1-Methylethoxycarbonyl).

Die Zahl der Substituenten am Ring beträgt normalerweise 1-3, vorzugsweise 1 oder 2.

Als C_1-4-Alkylreste an der Aminogruppe in den Ringsystemen in R¹ und R² seien genannt: Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl und insbeson dere Methyl.

Für R³ seien folgende Reste speziell genannt: Methyl, Ethyl, n- Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Vinyl, 1-Methylvinyl, cis-1-Propenyl, trans-1-Propenyl, 2-Propenyl, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl, Cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1-Methyl-1-propenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 1-Ethylvinyl, Fluor, Chlor und Brom. Bevorzugt für R³ sind: Methyl, Ethyl, n-Propyl und 2-Methyl-1-propenyl.

Das neue Verfahren eignet sich besonders gut zur Herstellung von Alkoholen und insbesondere Carbonsäuren.

Durch Screening nach der Vorschrift von Drews (Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag, Seite 47 bis 48, 1976) lassen sich aus Bodenproben und Stammsammlungen Bakterien isolie ren bzw. identifizieren, die die erfindungsgemäße Oxidation durchführen.

Für die erfindungsgemäße Reaktion eignen sich beispielsweise Bak terien, die in der Vergangenheit unter den Gattungsnamen Arthro bacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Caseobacter, Gordona, Microoccus, Mycobacterium, Nocardia, Planococcus, Pro actinomyces, Rhodococcus, Staphylococcus, Serratia und Tsukamu rella und speziell unter den Gattungs- und Artnamen Arthrobacter sp., Bacillus rubropertinctus, Bacillus mycoides roseus, Bacillus rubricus, Corynebacterium rubrum, Gordona lentifragmenta, Gordona rubropertinctus, Gordona rubra, Micrococcus roseus, Micrococcus roseus roseofulvus, Micrococcus tetragenus ruber, Micrococcus ru bens, Micrococcus flavoroseus, Micrococcus corallinus, Micrococ cus agilis, Mycobacterium rubropertinctus, Nocardia corallina, Nocardia rubra, Nocardia sp., Nocardia salmonicolor, Nocardia pellegrino, Proactinomyces ruber, Proactinornyces rubropertinctus, Rhodococcus ruber, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythro polis, Rhodococcus rubra, Rhodococcus rubrus, Rhodococcus sp., Rhodococcus roseus, Rhodococcus lentifragmentus, Rhodococcus agi lis, Serratia rubropertincta und Staphylococcus roseus geführt wurden.

Die Vielzahl der für die Reaktion in Frage kommenden Bakterien spiegelt die sehr wechselvolle taxonomische Historie der Familien Mycobacteriaceae, Nocardiaceae und Micrococcaceae mit ihren Gat tungen Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium, Nocardia, Rhodo coccus, Tsukamurella, Micrococcus, Staphylococcus und Planococcus wieder.

Näheres ist The Prokaryotes (ed. Balows A. et al) 1992, Vol II., Bergey′s Manual of Determinating Bacteriology, Eighth Edition (ed. Cowan S. et al) 1974, Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology (ed. Seneath, P.H.A. et al.) 1986, Vol II, ATCC- Catalogue of Bacteria & Bacteriophages 17th Edition 1989, Kocur, M. et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 233-240 (1970), und Tsukamura, M. et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 25, 377-382 (1975) und J. Gen. Microbiol. 68, 15-26 (1971), 80, 553-555 (1974) und 125, 205-208 (1981) zu entnehmen.

Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert werden und bestehende Stämme in neue Gattungen sortiert werden. Innerhalb dieser Gattungen und Arten bestehen enge verwandt schaftliche Beziehungen. Bakterien, die die erfindungsgemäße Re aktion durchführen, sind mit einer guten Wahrscheinlichkeit in den oben genannten Gattungen und Arten zu finden.

Besonders geeignet für die Methylgruppenoxidation sind folgende Stämme:
Rhodococcus ruber (Nocardia pellegrino) DSM 43232, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43250, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43251, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43252, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43335, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43338, Rhodococcus ruber (Nocardia pellegrino) IMET 7308, Rhodococcus ruber IMET 7337, Rhodococcus ruber (Rhodococcus lentifragmentus, Gordona lentifragmenta) IMET 7437 und Rhodococcus ruber (Gordona lentifragmenta) IMET 7477, Rhodococcus ruber (Nocardia rubra) LMG 5366, Micrococcus roseus (Micrococcus roseus roseofulvus, Micro coccus tetragenus ruber) ATCC 178, Micrococcus roseus (Micro coccus rubens, Micrococcus roseus roseofulvus, Micrococcus tetra genus ruber) ATCC 186, Micrococcus roseus (Rhodococcus roseus) ATCC 516, Micrococcus roseus (Rhodococcus ruber) ATCC 534 und Micrococcus roseus ATCC 9815.

Die Angaben in den Klammern geben die frühere Stammbezeichnungen wieder.

Ganz besonders eignet sich für die Oxidation der Stamm Rhodococcus ruber DSM 8316, sowie sich davon ableitende Mutanten.

Dieser Stamm ist durch die in der Anlage ermittelten Daten charakterisiert.

Bei Rhodococcus ruber DSM 8316 handelt es sich um ein Isolat aus Bodenproben.

Die Methylgruppe muß, um zum entsprechenden Alkohol, Aldehyd oder Carbonsäure oxidierbar zu sein, benzyl- oder allylständig sein. Sind mehrere benzyl- oder allylständige Methylgruppen im Edukt vorhanden, so wird in der Regel nur eine Methylgruppe selektiv oxidiert. In seltenen Fällen (< 5%) wird eine weitere Methyl gruppe oxidiert.

Da die Edukte über die Sequenz Alkohol, Aldehyd und Carbonsäure abgebaut werden und den aufgeführten Wildtypstämmen als Kohlen stoff- und Energiequelle dienen, ist es zweckmäßig, zur Gewinnung der gewünschten Produkte mit Blockmutanten der aufgeführten Bak terien zu arbeiten, die die Oxidation nur bis zum Alkohol, oder nur zum Aldehyd oder nur zur Carbonsäure führen.

Zur Erzeugung solcher Blockmutanten können bekannte mikrobiologi sche Techniken eingesetzt werden. Zur Auslösung von Mutationen können alle gängigen Methoden verwendet werden wie die Anwendung von mutagenen Substanzen, z. B. Nitrosognanidine, Ethylmethansul fonat, Natriumnitrit, oder die Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung wie UV-, Gamma- oder Röntgenstrahlung. Eine ent sprechende Vorschrift zur Herstellung von N-Methyl-N′-nitroso guanidin ist Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 788 (1965) zu entnehmen. Weiterhin können zur Mutagenese auch transponierbare genetische Elemente verwendet werden.

Zur Isolierung der Mutanten kann beispielsweise die Eigenschaft, auf den Produkten der Oxidation als einziger C-Quelle nicht mehr zu wachsen, benutzt werden.

Das Arbeiten mit solchen Blockmutanten ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation benzylischer und allylischer Methylgruppen an kondensierten und nichtkondensierten Aromaten, Heteroaromaten sowie Aliphaten wird zweckmäßig derart durchgeführt, daß die Bakterien oder deren Mutanten in einem ge eigneten Medium mit einer geeigneten Kohlenstoff- und Energie quelle in Gegenwart der entsprechenden Edukte kultiviert werden oder die Edukte nach 24 bis 72 h Kultivierung der Nährlösung zu gegeben werden. Schwerlösliche Edukte werden zweckmäßig mit einem handelsüblichen Emulgator (z. B. Tween® 80) als Emulsion dem Nähr medium zugegeben.

Die Fermentation erfolgt kontinuierlich oder diskontinuierlich für 1 bis 14 Tage.

In der Regel wird die Oxidation mit aktiven Bakterien durchge führt, sie gelingt jedoch auch mit ruhenden Bakterien, allerdings mit wesentlich geringerer Geschwindigkeit.

Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoff quellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenelementen und Vitaminen enthalten. Als Stickstoffquellen können anorganische bzw. organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Bierhefe autolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe, Harn stoff und Kartoffelprotein.

Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Zucker wie Glucose, Polyole wie Glycerin oder Fette wie Sojaöl verwendet werden.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion der Salze ist besonders das Phosphation zu nennen.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie z. B. Biotin, Riboflavin und/oder andere Vitamine.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt.

Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Eduktkonzentrationen von etwa 1 bis 100 g/l, bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 3 bis 50 g/l, besonders bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 5 bis 20 g/l.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die best möglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstem peraturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 35°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkuba tionsdauer von 15 bis 120 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produktes im Medium an.

Der Reaktionsumsatz kann leicht durch Probenentnahme und deren Untersuchung durch beispielsweise Gaschromatographie oder mittels HPLC-Analyse verfolgt und kontrolliert werden. Die Isolierung und Reinigung der Produkte aus der Kulturflüssigkeit kann nach bekannten Methoden erfolgen. Zweckmäßigerweise trennt man die feste Biomasse vom Nährmedium ab, extrahiert den Wertstoff z. B. mit einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls nach voraus gegangener Ansäuerung des Mediums, und isoliert den Wertstoff aus der extrahierten Phase. Auch säulenchromatographische Verfahren sind für die Aufarbeitung zweckmäßig.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Für die angeführten Beispiele wurden zwei Medien benutzt:

Medium A (Komplexmedium)
10,0 g/l Hefeextrakt
20,0 g/l Glucose
0,5 g/l Magnesiumsulfat-7-hydrat
1,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
3,6 g/l Dikaliumhydrogenphosphat
2 mg/l Eisen(II)sulfat-1-hydrat
5 mg/l ®Titriplex III
100 µg/l Zink(II)sulfat-4-hydrat
300 µg/l Borsäure
200 µg/l Cobalt (II)chlorid-6-hydrat
10 µg/l Kupfer (II) chlorid-2-hydrat
20 µg/l Nickel(II)chlorid-6-hydrat
30 µg/l Natriummolybdat-2-hydrat

Medium B (Minimalmedium)
5,0 g/l Glucose
2,0 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
0,5 g/l Magnesiumsulfat-7-hydrat
0,2 g/l Calciumchlorid-7-hydrat
2,0 g/l Natriumchlorid
0,5 g/l Harnstoff
2 mg/l Eisen(II)sulfat-1-hydrat
5 mg/l ®Titriplex III
100 µg/l Zink(II)sulfat-4-hydrat
300 µg/l Borsäure
200 µg/l Cobalt(II)chlorid-6-hydrat
10 µg/l Kupfer(II)chlorid-2-hydrat
20 µg/l Nickel(II)chlorid-6-hydrat
30 µg/l Natriummolybdat-2-hydrat
2 µg/l Biotin
2 µg/l Folsäure
200 µg/l p-Aminobenzoesäure
200 µg/l Riboflavin
400 µg/l Ca-Pantothenat
1400 µg/l Nicotinsäure
400 µg/l Pyridoxin/HCl
2000 µg/l Meso-Inosit
400 µg/l Thiamin/HCl.

Der pH-Wert des Mediums wurde mit 5 N Natronlauge bzw. Kalilauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphat wurden jeweils getrennt bei 121°C für 20 min autoklaviert. Harnstoff, Vitamine sowie die entsprechenden Edukte wurden sterilfiltriert. Edukte, die nicht filtrierbar waren, wurden als autosteril angenommen. Das restli che Medium wurde bei 121°C 20 min autoklaviert.

Beispiel 1

Jeweils 20 ml des entsprechenden Mediums wurden in sterile 100 ml Erlenmeyerkolben gefüllt, die mit einem sterilen Watteverschluß versehen waren. Die Kulturbrühe wurde jeweils mit einer Impföse von DSM 8316 angeimpft. Die in der Tabelle 1 aufgeführten Edukte wurden in einer Konzentration von 5 g/l im Medium B eingesetzt. Die Kolben wurden bei 28°C und 150 Umdrehungen pro min (UpM) für drei bis zehn Tage schüttelnd inkubiert.

Anschließend wurden die Kulturbrühen (siehe Tabelle 1 und 3) aufgearbeitet und analysiert (vgl. Beispiel 4). Die Produkte wur den mit GC, GC/MS und 1H-NMR identifiziert. Als Referenz dienten authentische, chemisch synthetisierte Proben.

Biotransformation mit DSM 8316 - Edukte und analysierte Produkte
Edukt
Produkt
4-Isopropyltoluol
4-Isopropylbenzoesäure
2-(4-Methylphenoxy)-propan	4-Isopropoxybenzoesäure
4-Methylanisol	4-Methoxybenzoesäure
4-Methylacetophenon	4-Acetylbenzoesäure
4-Cyantoluol	4-Cyanobenzoesäure
4-Chlortoluol	4-Chlorbenzoesäure
4-Vinyltoluol	4-Vinylbenzoesäure
4-Nitrotoluol	4-Nitrobenzoesäure
2,3-Dimethyl-4-nitrobenzol	2-Methyl-4-nitrobenzoesäure
2-Chlor-4-methylnitrobenzol	2-Chlor-4-nitrobenzoesäure
2,4-Dimethylbenzophenon	2-Methyl-4-benzoylbenzoesäure
2-Methylnaphthalin	2-Naphthoesäure
2,6-Dimethylnaphthalin	6-Methyl-2-naphthoesäure
6-Methylchinolin	6-Chinolincarbonsäure
2,6-Dimethylchinolin	2-Methyl-6-chinolincarbonsäure
6-Methylisochinolin	6-Isochinolincarbonsäure
2-Methylbenzofuran	Benzofuran-2-carbonsäure
4-(Methyl-1-propenyl)-anisol	4-Methoxy-α-methylzimtsäure
Limonen	Perillasäure
2-(2-Methyl-1-propenyl)-5,5-dimethyl-1,3-dioxan	3-Formyl-2-methyl-2-propensäure(2,2-dimethylpropylen)acetal

Das 3-Formyl-2-methyl-2-propensäure(2,2-dimethylpropylen)acetal ist eine neue Verbindung, die sich gut zur Herstellung von Polye nen und Carotinoiden eignet.

Beispiel 2

Analog Beispiel 1 wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Mikroorga nismen in Medium A angezogen. Dem Medium waren jeweils 5 g/l der in Tabelle 3 genannten Edukte zugesetzt worden. Tabelle 3 sind ebenfalls die analog Beispiel 1 nachgewiesenen Produkte zu ent nehmen.

Mikroorganismen
Rhodococcus ruber
DSM 43250, DSM 43251, DSM 43252, DSM 43232, DSM 43335 und DSM 43338
Rhodococcus ruber	IMET 7308, IMET 7337, IMET 7437 und IMET 7477
Rhodococcus ruber	LMG 5366
Micrococcus roseus	ATCC 178, ATCC 186, ATCC 516, ATCC 534 und ATCC 9815

Biotransformation mit unter Tabelle 2 aufgeführten Mikroorganismen - Edukte und analysierte Produkte
Edukt
Produkt
2-(4-Methylphenoxy)-propan
4-Isopropoxybenzoesäure
4-Cyanotoluol	4-Cyanobenzoesäure
4-Chlortoluol	4-Chlorbenzoesäure
2-Methylbenzofuran	Benzofuran-2-carbonsäure
Limonen	Perillasäure
2-(2-Methyl-1-propenyl)-5,5-dimethyl-1,3-dioxan	3-Formyl-2-methyl-2-propensäure-(2,2-dimethylpropylen)-acetal

Beispiel 3

Analog Beispiel 1 wurde DSM 8316 in einen 500 ml Erlenmeyerkolben in 100 ml Medium A gezüchtet. Dem Medium wurde 5 g/l 2-(4-Methyl phenoxy-)propan zugegeben. Nach 24 h und 48 h Inkubation wurden nochmals 2,5 g/l Edukt zugegeben. Nach 120 h Inkubation wurde die Kulturbrühe aufgearbeitet. Als Produkte ließen sich neben 4-Iso propoxybenzoesäure als Hauptprodukt in geringen Mengen 4-Isopro poxybenzaldehyd und 4-Isopropoxybenzylalkohol identifizieren. Die Identifizierung der Produkte erfolgte wie unter Beispiel 1 be schrieben.

Beispiel 4 a) Herstellung von Blockmutanten

Ausgehend von DSM 8316 wurden, wie in Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 788 (1965) beschrieben, Mutanten selektioniert. Dazu wurde DSM 8316 in 20 ml Medium B über Nacht (30°C, 120 Upm, 16 h) gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen geerntet (Zentri fugation: 10 min, 4°C, 5000 g) und zweimal mit 100 mM Tris/HCl- Puffer (pH 7,2) gewaschen. Die so gewonnenen Zellen wurden mit dem Puffer auf eine optische Dichte bei 600 nm von 0,75 einge stellt. 0,5 ml dieser Zellsuspension wurden durch Zugabe von 1% N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin in DMF in Gegenwart von 100 mM Trismaleinsäurepuffer (pH 6,0) mutagenisiert (30 min, Raumtempe ratur, 120 Upm). Das Volumen des Ansatzes betrug 5 ml.

Nach Mutagenese wurden die Zellen zweimal mit 100 mM Tris/HCl- Puffer (pH 7,2) gewaschen und eine Verdünnungsreihe in 10er Schritten bis auf 10^-7 auf Medium B-Agrar (= Medium B + 20 g/l Agar) ausplattiert (= Masterplatten). Nach 4 Tagen Inkubation bei RT wurden die entstandenen Kolonien zur Selektion auf Medium B- Agar-Platten (= "replica-Platten") ohne Glucose mit den entspre chenden Edukten und Produkten als einziger C-Quelle (0,5 g/l), wie in Microbiology, Third Edition, Harper International Edition, 1980 beschrieben, gestempelt. Durch Vergleich der replica-Platten mit den Masterplatten konnten Blockmutanten identifiziert werden. Selektionskriterium für die Blockmutanten war das mangelnde Wachstum auf den Edukten und Produkten als einziger C-Quelle.

Eine der so gewonnenen Blockmutanten (= (4a1) wurde in 100 ml Me dium A in Gegenwart von 5 g/l 2-(4-Methylphenoxy)-propan, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Nach 7 Tagen Inkubation wurden 1000 µl Fermentationsbrühe entnommen und mit 100 µl 1 N HCl und 500 µl MTB (Methyltertiärbutylether) versetzt und 1 min kräftig durchmischt. 400 µl der organischen Phase wurden vorsichtig abge nommen und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 µl MTB aufgenommen und quantitativ in ein Probengläschen für die Gaschromatographie überführt. Zur Probe wurden 50 µl N-Methyl- N-trimethylsilyltrifluoracetamid gegeben. Als einziges Produkt wurde gaschromatographisch 4-Isopropoxybenzoesäure nachgewiesen. Dies wurde durch GC/MS, 1H-NMR und Vergleich mit einer authenti schen Referenzprobe bestätigt.

Wiederholt man die Inkubation mit einer anderen Mutante (4a2), so kann man 4-Isopropoxybenzylalkohol als einziges Produkt nachwei sen.

Beispiel 5 b) Herstellung von 4-Isopropoxy-benzoesäure

100 ml Medium A wurden mit einer Impföse der Blockmutante 4a1 an geimpft und 48 h inkubiert. Mit 50 ml dieser Kultur wurde ein La borfermenter mit 1 l Medium A und 5 g 2-(4-Methylphenoxy-)propan als Edukt beimpft. Nach 24 h und 48 h Inkubation wurden nochmals je 2,5 g 2-(4-Methylphenoxy-)propan zugegeben. Nach 168 h Inkuba tion wurde die Fermentation abgebrochen. Zunächst wurde die Bio masse durch Zentrifugation (30 min, 4°C, 10 000 g) entfernt und die restlichen Zellen durch Filtration abgetrennt. Anschließend wurde die Kulturbrühe mit konzentrierter H₂SO₄ auf pH 1,0 einge stellt und zweimal mit je 250 ml MTB extrahiert. Die organische Phase wurde abgenommen und im Rotationsverdampfer eingeengt. In chemisch reiner Form konnten 7,1 g 4-Isopropoxy-benzoesäure iso liert werden. Dies entspricht einer Ausbeute von etwa 60%.

Beschreibung des Mikroorganismus DSM 8316:
Der Stamm DSM 8316 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mi kroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) als Rhodococ cus ruber identifiziert. Das Bestimmungsprotokoll lautet wie folgt:

1. Farbtyp: 70 pastellorange bis reinorange.
2. Peptidoglycan: meso-Diaminopimelinsäure.
3. Mycolsäuren: Kettenlänge von C₃₀-C₅₀.
4. Fettsäuremuster: unverzweigte gesättigte und ungesättigte Fettsäuren plus Tuberculostearinsäure. Dieses Fettsäuremuster ist diagnostisch für Rhodococcen und ihre Verwandten.
5. Menachinone: MK-8 (H₂).
6. Test 35 weiterer Substrate.

Testergebnisse:

DSM 8316 ist ein Rhodococcus ruber Stamm mit einer Willcox Propability von 90%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I worin
R¹ ein Wasserstoffatom, eine C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe ist
R² ein Wasserstoffatom, eine C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe darstellt oder
R¹ und R² zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie ge bunden sind a) einen 6-Ring darstellen, der 1 oder 2 weitere Doppelbindungen enthalten und/oder durch 1, 2 oder 3 Halogenatome, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, C_1-4-Acyl-, C_1-4-Alkoxygruppen und/oder 1 oder 2 Cyano-, Amino-, C_1-4-Alkylamino- oder Di-C_1-4-alkylaminogruppen und/oder eine Nitrogruppe substituiert sein kann und/oder an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer 6-Ring zu einem Ringsystem ankondensiert sein kann, das durch ein bis vier C_1-4-Alkoxy-, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, C_1-4-Alkoxycarbonyl-, Amino-, C_1-4-Alkylamino-, Di-C_1-4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann, oder b) einen heterocyclischen 5-Ring darstellen, der 1, 2 oder 3 Heteroatome enthält und/oder eine weitere Doppel bindungen enthalten kann und an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer Ring ankonden siert sein kann, der durch ein bis vier C_1-4-Alkoxy-, C_1-4-Alkyl-, C_2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, C_1-4-Alkoxycarbonyl-, Amino-, C_1-4-Alkylamino-, Di-C_1-4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann,
R³ ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine C_1-4-Alkyl- oder C_2-4-Alkenylgruppe, oder eine gegebenenfalls halogensubstituierte Aryloxy- oder Benzoylgruppe darstellt und
R⁴ eine -CH₂OH-, oder -CHO- oder -COOH-Gruppe be deutet,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Verbindungen der Formel II worin R¹-R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit Hilfe eines Bakteriums selektiv die Methylgruppe oxidiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacte rium, Corynebacterium, Caseobacter, Gordona, Micrococcus, My cobacterium, Nocardia, Planococcus, Proactinomyces, Rhodococ cus, Staphylococcus, Serratia oder Tsukamurella verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium eines aus der Gattung und der Art Micrococcus roseus oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium eines aus der Gattung und der Art Rhodoccus ru ber oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Rhodococcus ruber DSM 8316 oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.

6. 3-Formyl-2-methyl-2-propensäure(2,2-dimethylpropylen)acetal.