DE4320597A1

DE4320597A1 - Use of polyphosphates for antiviral therapy and as immunomodulators

Info

Publication number: DE4320597A1
Application number: DE19934320597
Authority: DE
Inventors: Heinz C Prof Dr Dr Schroeder; Igor S Prof Dr Kulaev; Werner E G Prof Dr Mueller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1995-01-05

Abstract

It is reported that polyphosphates have antiviral and immunomodulating properties. The invention relates to the use of polyphosphates with a chain length of more than 3 phosphate units as antiviral agents with immunomodulating activity specifically for the treatment of AIDS and ARC, and the patent claims relate to this.

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS bzw. ARC mit Hilfe von Polyphosphaten aufzuzeigen.The invention is based on the object, a promising way to fight AIDS or ARC To show the help of polyphosphates.

AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), auch genannt Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV), verursacht. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS sich am schwersten in Form des Kaposi-Sarcoms (KS) oder des ARC klinisch manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nichtmöglich.AIDS is caused by the Human Immunodeficiency Virus (HIV), too called Human T-Cell Leukemia / Lymphotropic Virus Type III (HTLV-III) or Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV), caused. HIV belongs to the type of RNA virus. The virus attack is the main cause of a spectrum of immunological Disorders, of which AIDS is most difficult in the form of Kaposi sarcoma (KS) or the ARC clinically manifested. A effective therapeutic treatment of AIDS or ARC was up not possible yet.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten zur Bekämpfung von AIDS oder des ARC sehr geeignet sind. Basis dieser Erfindung ist der Nachweis, daß Polyphosphate (1) einen anti-HIV Effekt und (2) einen immunmodulierenden Einfluß bewirken.Surprisingly, it has now been found that polyphosphates with a chain length of greater than 3 phosphate units Combating AIDS or ARC are very suitable. Base This invention is the proof that polyphosphates (1) a anti-HIV effect and (2) an immunomodulatory effect effect.

Die erfindungsmäßig zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und systemisch also oral, rektal oder parenteral (intramuskulär, intravenös und subkutan), verabreicht werden können.The erfindungsmäßig coming to be used compounds generally processed into pharmaceutical agents, as Dose units and systemically so oral, rectal or parenteral (intramuscular, intravenous and subcutaneous), can be administered.

Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung oder Verbesserung von AIDS oder ARC wirksame oder immundefekt-beseitigende Menge wenigstens einer Verbindung aus der Klasse der Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen Träger. The funds include a treatment, elimination, Alleviation or improvement of AIDS or ARC effective or immunodeficiency-eliminating amount of at least one compound the class of polyphosphates with a chain length of greater as 3 phosphate units, optionally together with one pharmaceutically acceptable carriers and excipients. For example, such pharmaceutical agents contain 0.5 to 98 wt .-% of at least one compound of the invention together with a pharmaceutical carrier.

Wenn das Mittel in Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung.If the agent is in the form of a unit dose contains these preferably 50 to 500 mg of the invention for Application coming connection.

Die pharmazeutischen Mittel können zur oralen Verabreichung in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, oder in flüssiger Form, beispielsweise als wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Lösung oder mit Flüssigkeit gefüllte Kapseln vorliegen.The pharmaceutical agents may be for oral administration in solid form, for example as tablets, lozenges, capsules, Powder, or in liquid form, for example as aqueous or oily suspension, syrup, elixir, solution or liquid filled capsules are present.

Bevorzugte orale Mittel liegen in Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Träger, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kartoffelstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol oder Siliciumoxid), Disintegrationsmittel (z. B. Stärke) und Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), enthalten.Preferred oral agents are in the form of tablets or Capsules before and can conventional carriers, such as binders (eg. Syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or Polyvinylpyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar, Corn starch, potato starch, calcium phosphate, sorbitol or Glycine), lubricants (e.g., magnesium stearate, talc, Polyethylene glycol or silica), disintegrating agents (eg starch) and wetting agents (eg sodium lauryl sulphate), contain.

Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.Means for parenteral administration are generally in Form of a solution or suspension of the invention for Application coming connection together with usual pharmaceutical carriers, for example in the form of a aqueous solution for intravenous injection or oily Suspension for intramuscular injection. For parenteral Administration of suitable agents is obtained by adding 0.1 to 10 Wt .-% of the compound of the invention in water or a Support made of an aliphatic polyhydric alcohol, such as glycerol, Propylene glycol or polyethylene glycols or a mixture consists of dissolves. The polyethylene glycols consist of a Mixture of non-volatile, usually liquid Polyethylene glycols, both in water and in organic liquids are soluble and their Molecular weights ranging from 200 to 1500.

Pharmazeutische Mittel zur rektalen Verabreichung liegen in Form von Suppositorien vor, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen einer geeigneten Suppositoriengrundlage, wie Kakaobutter, gehärtete Fette, Polywachse oder Polyethylenglykole, in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% einverleibt sind.Pharmaceutical agents for rectal administration are in Form of suppositories, wherein the inventive Compounds of a suitable suppository base, such as Cocoa butter, hydrogenated fats, poly waxes or Polyethylene glycols, in an amount of 1 to 10% by weight are incorporated.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Tablettieren, Einverleiben der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in eine Suppositoriengrundlage, Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Bezylalkohol oder Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH.The preparation of the pharmaceutical agent is based on conventional method, for example by tableting, Incorporation of the present invention used Compounds in a suppository base, sterile filtration and filling in ampoules or dropper bottles of a solution of in accordance with the invention for use in compounds Injection water together with usual additives, such as Sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, disodium EDTA (Ethylenediaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Bezylalkohol or Sodium hydroxide to adjust the pH.

Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch (antiviral oder immunomodulierenden oder prophylaktisch) wirksamen Menge an Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten an Patienten, die dieser Behandlung bedürfen.The method of treating AIDS or ARC includes Administration of a therapeutic (antiviral or immunomodulatory or prophylactically) effective amount Polyphosphates with a chain length greater than 3 Phosphate units in patients in need of this treatment.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.The dosage depends primarily on the specific Form of administration and the purpose of the therapy. The size of the Single doses as well as the administration schedule are best based on an individual assessment of each Disease case be determined by the doctor, the Age, weight and condition of the recipient, who Route of administration and the nature and severity of the disease must be taken into account. In general, the Daily dose 2-20, preferably 3-10, especially 6-7 mg / kg Body weight.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.The duration of treatment depends on the type and severity of the treatment Illness. It generally extends over several Weeks, for example 4 to 8 weeks.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV) und sie wirken stimulierend auf das Immunsystem, so daß die körpereigenen Abwehrkräfte gegen AIDS, ARC und verwandte Erkrankungen gestärkt werden. Diese Verbindungen sind deshalb zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung der durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.The compounds used according to the invention are effective in many ways against the Human Immunodeficiency Virus (HIV) and they have a stimulating effect on the immune system, so that the body's defenses against AIDS, ARC and relatives Illnesses are strengthened. These connections are therefore for the therapeutic and prophylactic treatment of the AIDS virus caused diseases useful.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden nachfolgend am Beispiel von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von 2 [ab jetzt abgekürzt mit Poly P_n=2], 3 [= Poly P_n=3] bzw. 13-18 Phosphateinheiten [= Poly P_n=13-15] erläutert. Diese Substanzen wurden von der Fa. Sigma Chemie (Deisenhofen; Deutschland) bezogen.The activity of the compounds used according to the invention are described below using the example of polyphosphates having a chain length of 2 [abbreviated to poly P _{n = 2} ], 3 [= poly P _{n = 3} ] or 13-18 phosphate units [= poly P _{n = 13-15} ]. These substances were obtained from Sigma Chemie (Deisenhofen, Germany).

Die Polyphosphate wurden anhand pharmakologischer in vitro- Testsysteme untersucht.The polyphosphates were analyzed by pharmacological in vitro Test systems examined.

Examples: Pharmacological effects of polyphosphates Examples

1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von Polyphosphaten;
2) Nachweis der immunodulierenden Aktivität von Polyphosphaten.1) detection of anti-HIV activity of polyphosphates;
2) Detection of immunomodulating activity of polyphosphates.

1. Detection of anti-HIV activity of polyphosphates

Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte OKT4+ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS- Virus der Isolatbezeichnung HIV-IIIB (ehemals HTLV-IIIB genannt) vermehrt (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E.Reed und R.C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).The cell line H9 was used, which was is a cloned OKT4 + T cell line in which the AIDS Virus of the isolate designation HIV-IIIB (formerly HTLV-IIIB called) (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E.Reed and R.C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).

Experimental Procedure

Reinigung von HIV-1 Reverser Transkriptase und Assaybedingungen:Purification of HIV-1 reverse transcriptase and Assay conditions:

Die für die vorliegenden Versuche verwendete HIV-1 Reverse Transkriptase (Herstellung nach dem Verfahren von: P.S. Sarin, y. Taguchi, D. Yun, A. Thornton, R.C. Gallo, B. Oeberg; Biochem. Pharmacol. 34, 4075 4079; 1985) wurde mittels sequentieller Chromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Hydroxylapaptit gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl-aminomethan) (pH 7.5), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% Triton X-100 und 20% Glycerin aufbewahrt. Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgC12 , 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C₈H₁₇-C₆H₄- (OCH₂CH₂)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d.i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)₁₅·(A)_n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H-Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%-igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%-iger TCA- Lösung (5x) und anschließend mit 2 ml 70%-igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationzähler bestimmt.The HIV-1 reverse transcriptase used in the present experiments (prepared by the method of: PS Sarin, Y. Taguchi, D. Yun, A. Thornton, RC Gallo, B. Oeberg, Biochem Pharmacol 34, 4075 4079, 1985 ) was purified by sequential chromatography on DEAE-cellulose, phosphocellulose and hydroxylapaptite. The purified enzyme was stored in 50 mM Tris-HCl (tris (hydroxymethyl-aminomethane) (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% Triton X-100 and 20% glycerol.) The reverse transcriptase experiments were performed in a reaction mixture (50 μl) containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM MgCl 2, 100 mM potassium chloride, 0.01% Triton X-100 (C₈H₁₇-C₆H₄- (OCH₂CH₂) 9- 10-OH) or NP40 (non-ionic detergent Nonidet P 40, product name of the company Sigma, di Octylphenolethylenoxid condensate), 10 ug / ml (dT) ₁₅ · (A) _n (hybrid polymers of the oligo- or polynucleotides Oligodesoxythymidylsäure and polyadenylic acid) as template primer and 3 H-deoxythymidine triphosphate (3 H-dTTP) The reaction mixture was incubated for 1 h at 37 ° C and the reaction was monitored by adding 50 μg of yeast tRNA and 2 ml of a 10% trichloroacetic acid solution (TCA). containing 1 mM sodium pyrophosphate. The samples were filtered through Millipore filters (0.45 μm) fi First washed with 5% TCA solution (5x) and then with 2 ml of 70% ethanol. The filters were dried under a heat lamp, then scintillation fluid was added and the radioactivity determined in a β-scintillation counter.

HIV infection of H9 cells

H9-Zellen (M: Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed, R.C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HIV-IIIB- Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic, vgl. oben) pro 4 × 100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit Arzneimittel behandelter Teil dieser Proben wurde als posivite Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender Verbindung (Polyphosphate) gegeben wurden. Die HIV-IIIB Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben beschrieben analysiert. H9 cells (M: Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed, R. C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) with polybrene (commercially available available hexadimethrine bromide; 2 μg / ml) for 30 min. At 37 ° C treated, polybrenfrei washed and with 200 000 000 HIV-IIIB- Virus particles (isolated from H9 cell cultures according to M. Popovic, see. above) per 4 x 100,000 H9 cells. One not with The drug-treated portion of these samples was considered to be posivite Control sample used, whereas to the test samples different concentrations of compound to be tested (Polyphosphates) were given. The HIV-IIIB reverse Transcriptase activity of these cultures was as above analyzed.

Immunofluorescence assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol:Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HIV-IIIB p17 (Gag-Protein mit MG = 17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG = 24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln ihn den Zellen anzeigen. Die HIV-IIIB infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol- Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0.25% Triton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege-Antimaus IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%-iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss- Fluoreszenzmikroskop bestimmt.The immunofluorescence assays were performed on methanol: acetone (1: 1) - fixed cells using monoclonal antibodies (out the mouse) against HIV-IIIB p17 (Gag protein with MW = 17,000) and p24 (Gag protein with MW = 24,000). These two Proteins are marker proteins that determine the presence of Virus particles indicate it to the cells. The HIV-IIIB infected Cells were started with or without drug treatment Fixed toxoplasmosis slides. After fixation with methanol Acetone (1: 1) for 30 min. At room temperature, were Slides in sealed plastic containers at -20 ° C until the Use kept. The monoclonal antibodies were applied to the Cells, at room temperature in a humidity chamber Incubated for 1 h with PBS (phosphate buffer), the 0.25% Triton X-100 contains, washed for 2 h. The cells were then with for 1 h Fluorescein (FICT) labeled goat anti-mouse IgG (Capell Labs.) treated with PBS buffer containing 0.25% Triton X-100, washed overnight. On the slides was 50% glycerin and the cell fluorescence was measured with a Zeiss Determined fluorescence microscope.

Untersuchungsparaleter 1. cell growth

H9-Zellen sowie mit HIV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml Kultur-medium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4-tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3 × 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HIV-IIIB infizierten H9- Zellen lediglich 0,5 × 1 000 000 Zellen/ml war; diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.H9 cells as well as HIV-IIIB infected H9 cells were in a concentration of 0.2 x 1,000,000 cells / ml culture medium used to inoculate a culture medium. After 4 days Incubation, the density of H9 cells was 1.3 × 1 000 000 Cells / ml, while the density of the HIV-IIIB infected H9 Cells was only 0.5 x 1,000,000 cells / ml; these two Values formed the control values.

Dann wurden Proben von H9-HIV-IIIB-Zellen 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von Polyphosphaten behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Then, samples of H9 HIV-IIIB cells became 0.2 × 1 000 000 Cells / ml 4 days with different concentrations of Treated polyphosphates. There were the following results receive:

Es ist ersichtlich, daß Poly Pn=2 keinen antiviralen (cytoprotektiven) Effekt zeigt. Dagegen steigen die Wachstumsraten von H9-HIV-IIIB-Zellen in Anwesenheit von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten bei Konzentrationen von zwischen 10 und 50 µg/ml auf Werte an, die im Bereich der Kontrolle, nämlich der H9-Zellen ohne HIV-IIIB liegen.It can be seen that poly Pn = 2 is not antiviral (cytoprotective) effect shows. In contrast, the rise Growth rates of H9 HIV-IIIB cells in the presence of Polyphosphates with a chain length greater than 3 Phosphate units at concentrations of between 10 and 50 μg / ml to values within the control range, namely the H9 cells without HIV-IIIB are.

2. Inhibition of the production of reverse transcriptase by H9 HIV IIIB cells treated with polyphosphates

Es wurde untersucht, ob die 4-tägige Zugabe von Polyphosphaten zu H9-HIV-IIIB-Zellen die Produktion von HIV-IIIB-Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt: It was investigated whether the 4-day addition of polyphosphates to H9 HIV-IIIB cells the production of HIV-IIIB viruses established. As a measure of the amount of virus in the culture medium was Reverse transcriptase chosen. So the inhibition of the reverses Transcriptase indicates inhibition of virus production. The Results are summarized in the following table:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HIV-IIIB-Zellen, die nicht mit Polyphosphaten behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von Poly P_n=2 bewirkte keine Änderung. Jedoch Zugaben von Poly P_n=3 und Poly P_n=13-15 bewirkten eine dosisabhängige Verringerung der Reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Bereits bei der Dosis von 10 µg/ml wurde eine beträchtliche Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen, Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten, sind deshalb in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu inhibieren, bei denen verschiedene in vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, praktisch nicht nachteilig beeinflußt werden.It can be seen that there was considerable reverse transcriptase activity in the supernatant of H9-HIV-IIIB cells not treated with polyphosphates. The addition of poly P _{n = 2} caused no change. However, additions of poly P _{n = 3} and poly P _{n = 13-15} caused a dose-dependent reduction in reverse transcriptase activity in the supernatant. Significant inhibition was already observed at the dose of 10 μg / ml. The compounds used according to the invention, polyphosphates having a chain length of greater than 3 phosphate units, are therefore able to inhibit viral replication almost completely at doses in which various in vitro parameters, for example cell growth, are practically not adversely affected.

3. Inhibition of HIV-IIIB p15 and p24 expression in H9-HIV IIIB by polyphosphates

Es hat sich gezeigt, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p15 und p24 in infizierten H9-Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem HIV-IIIB- Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung kultiviert wurden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p15 und p24-Proteins. Nach Inkubierung der H9- HIV-IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:It has been shown that polyphosphates having a chain length of greater than 3 phosphate units a strongly inhibiting Effect on the expression of HIV p15 and p24 in infected Owns H9 cells. When the target H9 cells are infected with the HIV IIIB Isolate treated and cultured without the compound to be tested were infected, the H9 cells were infected and it came, as by means Indirect immunofluorescence assays found to Expression of p15 and p24 protein. After incubation of the H9 HIV-IIIB cells with the compounds to be tested became almost complete protective effect observed. There were received the following results:

Es ist ersichtlich, daß Poly P_n=2 keine Änderung im Vergleich zur Kontrolle zeigt. Dagegen bewirken Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten eine signifikante Reduktion der Expression der HIV-IIIB-Proteine p15 und p24.It can be seen that poly P _{n = 2 shows} no change compared to the control. In contrast, polyphosphates with a chain length greater than 3 phosphate units cause a significant reduction in the expression of the HIV IIIB proteins p15 and p24.

2) Detection of the immunodulatory activity of polyphosphates

Kultivierung von menschlichen peripheren Blut Lymphozyten Periphere Blutlymphozyten wurden von gesunden Probanden nach der bekannten Ficoll-Hypaque Methode gewonnen. Nachdem sie gewaschen waren, wurden sie in einer Konzentration von 5 000 000 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum in 1-ml Ansätzen inkubiert (G. Leyhausen et al., Antimicrob. Agents Chemother. 26 : 752, 1984). Cultivation of human peripheral blood lymphocytes Peripheral blood lymphocytes were detected by healthy volunteers won the well-known Ficoll-Hypaque method. After you were washed, they were in a concentration of 5,000,000 cells / ml in RPMI 1640 medium with 10% fetal Calf serum was incubated in 1 ml batches (G. Leyhausen et al., Antimicrob. Agents Chemother. 26: 752, 1984).

Treatment of lymphocytes

Zur Bestimmung des Einflusses von Polyphosphaten auf das Wachstumsverhalten von Lymphozyten wurde der Einfluß dieser Substanzen auf die Inkorporation von radioaktivmarkiertem Thymidin (³H-dThd) in die DNA bestimmt. Die Versuchsbedingungen wurden wie früher beschrieben, durchgeführt (G. Leyhausen et al.; s. o.). Die Hemmkonzentration, durch die die Inkorporationsrate von ³H-dThd auf 50% reduziert wird, wurde durch das Logit-Regressions-Verfahren bestimmt (L. Sachs. Angewandte Statistik; Springer Verlag, Berlin; 1984).To determine the influence of polyphosphates on the Growth behavior of lymphocytes became the influence of these Substances on the incorporation of radioactively labeled Thymidine (3 H-dThd) in the DNA determined. The experimental conditions were carried out as previously described (G. Leyhausen et al .; s. O.). The inhibitory concentration by which the Incorporation rate of ³H-dThd to 50% was reduced determined by the logit regression method (L. Sachs. Applied Statistics; Springer Verlag, Berlin; 1984).

Der Einfluß von Polyphosphaten auf die Produktion von Interferon-gamma (IFN-gamma) wurde wie folgt bestimmt. 1-ml Kulturen wurden für 0-72 Std. in Anwesenheit verschiedener Polyphosphat-Konzentrationen alleine oder zusammen mit dem Mitogen Phytohaemagglutinin A (PHA) inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen abzentrifugiert, der Überstand gesammelt und der IFN-gamma-Titer bestimmt.The influence of polyphosphates on the production of Interferon gamma (IFN-gamma) was determined as follows. 1 ml Cultures were for 0-72 hrs in the presence of various Polyphosphate concentrations alone or together with the Mitogen phytohaemagglutinin A (PHA) incubated. Subsequently the cultures were spun down, the supernatant collected and determines the IFN-gamma titer.

Interferon detection

Die Menge an IFN-gamma wurde nach dem Verfahren von H. Gallati (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20 : 907, 1982) auf der Basis eines Enzyme-Immuno-Assays bestimmt. In Kürze, 96er Kulturplatten wurden mit monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen IFN-gamma, beschichtet. Dann wurden 50 µl Kulturüberstand in die einzelnen Vertiefungen der Kulturplatten gegeben. Anschließend wurde Peroxidase-markiertes anti-Mensch IFN-gamma hinzugegeben: Nach erfolgter Waschung wurde die Menge an gebundener Peroxidase bestimmt. Die Höhe der Peroxidase- Aktivität wurde über eine Eichkurve mit der INF-gamma-Menge korreliert. Die IFN-gamma-Menge wird angegeben in NIH-units/ml Kulturüberstand.The amount of IFN-gamma was determined by the method of H. Gallati Chem. Clin. Biochem., 20: 907, 1982) of an enzyme immunoassay. Coming soon, 96s Culture plates were directed with monoclonal antibodies against IFN-gamma coated. Then, 50 μl of culture supernatant into the individual wells of the culture plates. Subsequently, peroxidase-labeled anti-human IFN-gamma added: After washing, the amount was bound peroxidase determined. The level of peroxidase Activity was over a calibration curve with the amount of INF-gamma correlated. The amount of IFN-gamma is expressed in NIH units / ml Culture supernatant.

Test parameters 1. Influence of polyphosphates on the incorporation rate of 3 H-dThd in lymphocytes

In Abwesenheit von Polyphosphaten wurde in Lymphozyten eine Inkorporationsrate von 1300 Zerfälle pro Minute × 1 000 000 Zellen gemessen. In the absence of polyphosphates, lymphocytes became one Incorporation rate of 1300 decays per minute × 1 000 000 Cells measured.

Die ED₅₀-Werte in den Ansätzen mit Polyphosphaten wurden wie folgt ermittelt:The ED₅₀ values in the polyphosphate approaches were as follows determined:

Polyphosphatepolyphosphates ED₅₀ Wert (µg/ml)ED₅₀ value (μg / ml) Poly P_n=2 Poly P _{n = 2} < 150<150 Poly P_n=3 Poly P _{n = 3} < 150<150 Poly P_n=13-15 Poly P _{n = 13-15} < 150<150

Bei Konzentrationen an Polyphosphaten unterhalb von 150 µg/ml wurden keine Effekte auf die Inkorporationsraten gemessen.At concentrations of polyphosphates below 150 μg / ml No effects on incorporation rates were measured.

Diese Untersuchungsreihe zeigt, daß Polyphosphate erst in sehr hohen Dosen zytostatisch wirken.This series of studies shows that polyphosphates are only in very cytostatic effect of high doses.

2. Induction of IFN-gamma in lymphocyte cultures after Incubation with polyphosphates

Die Kulturen wurden wie folgt mit den Polyphosphaten für 72 Std. behandelt:The cultures were treated with the polyphosphates for 72 as follows Std. Treated:

Aus diesen Befunden wird deutlich, daß Poly P_n=2 keinen Effekt zeigt. Jedoch Poly P_n=3 und Poly P_n=13-15 induzieren in dem sehr niederigen Konzentrationsbereich von 0,05 bis 3 µg/ml signifikante Mengen an IFN-gamma. From these findings, it becomes clear that poly P _{n = 2} shows no effect. However, poly P _{n = 3} and poly P _{n = 13-15} induce significant levels of IFN-gamma in the very low concentration range of 0.05 to 3 μg / ml.

3. Induction of IFN-gamma by polyphosphates in combination with the mitogen PHA

Auch diese Untersuchungen wurden in dem oben beschriebenen Lymphozyten-Ansatz während einer Inkubationsperiode von 72 Std. durchgeführt.These studies were also described in the above Lymphocyte approach during an incubation period of 72 hrs. carried out.

Aus diesen Experimenten muß der Schluß gezogen werden, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten den INF-gamma induzierenden Effekt von PHA potenzieren. From these experiments it must be concluded that Polyphosphates with a chain length greater than 3 Phosphate units the INF-gamma inducing effect of PHA potentiate.

The following examples serve to explain the invention Examples of pharmaceutical agents

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.In the following formulation examples may be used as the active ingredient in each case one of the inventively used Compounds individually or in mixture with another inventive compound can be used.

Example a

Tablettenformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Lactose 18 mg
Kartoffelstärke 38 mg
Gelatine 2 mg
Talkum 2 mg
Magnesiumstearat 0,1 mgTablet formulation:
Active substance 10 mg
Lactose 18 mg
Potato starch 38 mg
Gelatin 2 mg
Talc 2 mg
Magnesium stearate 0.1 mg

Example b

Tablettenformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Kartoffelstärke 40 mg
Polyvinylpyrrolidon 5 mg
Die Tabletten werden mit einer gefärbten Zuckerschicht überzogen.Tablet formulation:
Active substance 10 mg
Potato starch 40 mg
Polyvinylpyrrolidone 5 mg
The tablets are coated with a colored sugar layer.

Example c

Kapselformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Maisstärke 90 mg
Lactose 50 mg
Talkum 2 mg
Diese Mischung wird in Gelatinekapseln gefüllt. Capsule formulation:
Active substance 10 mg
Cornstarch 90 mg
Lactose 50 mg
Talc 2 mg
This mixture is filled in gelatine capsules.

Example d

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2 g
Saccharose 250 g
Glucose 300 g
d-Sorbit 150 g
Agar-agar 0,15 g
Methylparaben 0,5 g
Propylparaben 0,05 g
Geschmacksstoff (Orangengeschmack) 10 g
Tartazin gelb
Gereinigtes Wasser auf 1000 mlLiquid oral formulation:
Active ingredient 2 g
Sucrose 250 g
Glucose 300 g
d-sorbitol 150 g
Agar-agar 0.15 g
Methylparaben 0.5 g
Propylparaben 0.05 g
Flavor (orange flavor) 10 g
Tartazine yellow
Purified water to 1000 ml

Example f

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2 g
Tragacanth 7 g
Glycerin 50 g
Saccharose 400 g
Methylparabren 0,5 g
Propylparabren 0,05 g
Geschmacksstoff (Geschmack von schwarzer Johannisbeere)
Roter Farbstoff Nr. 2C.E.184 0,02 g
Gereinigtes Wasser auf 1000 mlLiquid oral formulation:
Active ingredient 2 g
Tragacanth 7 g
Glycerol 50 g
Sucrose 400 g
Methyl parabens 0.5 g
Propylparabren 0.05 g
Flavor (blackcurrant flavor)
Red Dye No. 2C.E.184 0.02 g
Purified water to 1000 ml

Example g

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2,4 g
Saccharose 400 g
Tinktur von Bitterorangenschalen 20 g
Tinktur von Süßorangenschalen 15 g
Gereinigtes Wasser auf 1000 ml.Liquid oral formulation:
Active ingredient 2.4 g
Sucrose 400 g
Tincture of bitter orange peel 20 g
Tincture of sweet orange peel 15 g
Purified water to 1000 ml.

Claims

1. Use of polyphosphates having a chain length of greater than 3 phosphate units as a drug.

2. Medicines, characterized by a content of Polyphosphates with a chain length greater than 3 Phosphate units.

3. Use of polyphosphates having a chain length of greater than 3 phosphate units for antiviral and / or Immunotherapeutic Treatment of AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) or ARC (AIDS-related Complex).