DE4314611A1 - Alanin Racemase und Methoden zu deren Reinigung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Enzyme Alanin Racemase und Methoden zur Reinigung der Alanin Racemase.

Der Pilz Tolypocladium niveum ist mikrobiologisch in die Klasse der imperfekten Pilze einzuordnen und ist besonders wegen seiner Fähigkeit Cyclosporine zu bilden von biotechnologischem Interesse. Als Cyclosporine wird eine Klasse von zyklischen Undekapeptiden, die aus hydrophoben aliphatischen Aminosäuren aufgebaut sind, bezeichnet. Diese Substanzen zeigen vielfältige biologische Effekte: der Hauptmetabolit Cyclosporin A wird aufgrund seiner immunsuppressiven Wirkung als wichtigstes Medikament zur Verhinderung von Organabstoßungen nach Transplantation eingesetzt.

Die Biosynthese der Cyclosporine erfolgt, wie auch für andere Peptid-Antibiotika beschrieben, nach dem nicht-ribosomalen Thiotemplate-Mechanismus (Kleinkauf und von Döhren, 1990). Bemerkenswert ist, daß die gesamte Biosynthese von einem Multienzym gesteuert wird, welches aus einer einzigen Polypeptidkette besteht und Cyclosporin Synthetase genannt wird. Dieses Enzym wurde biochemisch gereinigt und charakterisiert (Schmidt et al., 1992).

Cyclosporin A enthält drei nicht proteinogene Aminosäuren: D-Alanin in Position 8, α-Aminobuttersäure in Position 3 und die ungewöhnliche Aminosäure (4R)-4-[(E)-2- Butenyl]-4-Methyl-L-Threonin (Bmt) an Position 1. Solche nicht proteinogenen Aminosäuren sind charakteristische Bestandteile von Peptid-Antibiotika. In bezug auf den Einbau von D-Aminosäuren wurde in den bisher untersuchten Peptidsynthetasen festgestellt, daß die L-Aminosäure von Enzym aktiviert, das heißt, als Thioester gebunden, und dann direkt am Enzym epimerisiert wird.

Die Cyclosporin Synthetase besitzt im Gegensatz dazu keine integrale Epimerase-Funktion (Kleinkauf und von Döhren, 1990): sie muß D-Alanin als Baustein für die Biosynthese zugeführt bekommen. Tolypocladium niveum muß daher über eine Alanin Racemase verfügen. Es ist bemerkenswert, daß alle bisher beschriebenen Alanin Racemasen prokaryontischen Ursprungs sind. Die Hauptfunktion der prokaryontischen Alanin Racemasen besteht in der Bereitstellung von D-Alanin für die Zellwandsynthese. Die Hemmung dieser Enzyme als antibiotisches Prinzip wurde daher sehr intensiv untersucht (Thornberry et al., 1987). Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum ist das erste Enzym dieser Klasse, welches aus einem eukaryontischen Organismus isoliert wurde.

Aminosäure Racemasen in isolierter Form oder als Bestandteil immobilisierter Zellen sind für die großtechnische Herstellung von Aminosäuren (in L- oder D-Form) interessant, die unter anderem als Futteradditiva oder für ähnliche Zwecke verwendet werden (z. B. Ishiwata et al., 1990, Takeda 1988). Die häufig breite Substratspezifität dieser Enzyme (Inagaki et al., 1987, Asano and Endo, 1988) ermöglicht dabei vielfältige Anwendungsmöglichkeiten.

Die Erfindung bezieht sich auf die Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum in gereinigter Form, Methoden zur Reinigung der Alanin Racemase und ihre Anwendung zur enzymatischen Herstellung von D-Aminosäuren. Beispiele für Tolypocladium niveum schließen Tolypocladium niveum ATCC 34921 und davon abgeleitete Stämme ein.

Die Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum ist in der Literatur bisher nicht beschrieben worden. Um einen Zugang zu diesem Enzym zu finden, war es daher zunächst erforderlich, einen Aktivitätsnachweis zu entwickeln. Da dieses Enzym den Baustein D-Alanin für die Cyclosporin Biosynthese zuliefert, und diese Aminosäure von der Cyclosporin Synthetase mit sehr hoher Affinität erkannt wird, wurde zum Auffinden des Enzyms zunächst der Diketopiperazin-Assay (DKP-Assay) entwickelt. Cyclosporin Synthetase bildet bei Anwesenheit von D-Alanin, Leucin und AdoMet das Diketopiperazin cyclo(D-Ala-N-MeLeu) (Billich and Zocher 1987). Bei Anwesenheit von L-Alanin wird das entsprechende L-Isomere des DKP gebildet. Allerdings ist die Affinität der Cyclosporin Synthetase gegenüber D-Alanin um so vieles höher als gegenüber L-Alanin, daß schon Spuren von D-Alanin neben L-Alanin ausreichen, um ganz spezifisch das D-isomere DKP zu bilden. Durch diesen Assay (beschrieben in Beispiel 1) war es erstmals möglich, dieses Enzym nachzuweisen. Da die Methode sehr aufwendig in der Durchführung und nicht quantifizierbar ist, außerdem gereinigte Cyclosporin Synthetase benötigt wird, war es notwendig, weitere, einfachere Nachweisverfahren zu entwickeln.

Als ebenfalls sehr sensitive Methode bot sich die Entwicklung eines Nachweisverfahrens über Derivatisierung der Aminosäuren mit einer chiralen fluoreszierenden Gruppe an. Diese Methode hat gegenüber der DKP-Methode vor allem den Vorteil, daß sie auf praktisch alle Aminosäuren angewendet werden kann und sich daher gut für die Untersuchung von Substratspezifitäten eignet. Die nachzuweisenden Aminosäuren werden mit einem fluoreszierenden, chiralen Reagenz derivatisiert, wobei verschiedene Reagentien in der Literatur beschrieben sind. Durch diese Derivatisierung entstehen diastereomere Verbindungen, die aufgrund ihrer sterischen Verschiedenheit auf einer achiralen stationären Phase getrennt werden können. Bevorzugt werden dafür chromatografische Methoden an Silicagel-Materialien, die sich für einen Betrieb unter Hochdruckbedingungen eignen (HPLC), verwendet. Im speziellen Fall erwies sich die Derivatisierung mit (+)-1-(9-Fluorenyl)ethylchloroformat als besonders geeignet. Die Auftrennung der derivatisierten Aminosäuren erfolgte auf einem Silicagel-Material. Die Methode ist in Beispiel 2 beschrieben. Als Enzymeinheit ist nach IUPAC-Nomenklatur jene Menge Protein definiert, die pro Minute 1 µmol L-Alanin zu D-Alanin epimerisiert.

Eine weitere Methode, die sich die unterschiedliche Stereochemie von L- und D-Enantiomeren zunutze macht, ist die Auftrennung der underivatisierten Aminosäuren an einer achiralen Phase. Dazu kann man z. B. achirale Dünnschichtplatten verwenden, wie sie unter Beispiel 5 beschrieben sind. Ein Nachteil der Methode ist, daß mit radioaktiv markierten Aminosäuren gearbeitet werden muß, um die nötige Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. Ein Vorteil der Methode besteht darin, daß sie wie die HPLC-Methode zur Untersuchung aller Aminosäuren verwendet werden kann.

Eine weitere Methode, mit der ebenfalls die Epimerisierung aller Aminosäuren analysiert werden kann, ist der PHZ-Assay (2,4-dinitrophenylhydrazin), der unter Beispiel 4 beschrieben ist.

Zur Aufreinigung des Enzyms ist es in erster Linie wichtig, einen Assay zur Hand zu haben, der einfach und schnell in der Durchführung ist. Weiters soll er genügend empfindlich sein, das heißt, es soll die Epimerisierung jener Aminosäure getestet werden, auf die das Enzym am spezifischsten reagiert. Im Fall der Racemase aus Tolypocladium niveum ist das die Aminosäure L-Alanin. Der einfachste und zuverlässigste Nachweis der Epimerisierung von L-Alanin kann mit der DAO/LDH-Methode, beschrieben in Beispiel 3, geführt werden.

Als Ausgangsbasis wurde die für prokaryontische Racemasen in der Literatur beschriebene Methode verwendet (Badet et al., 1984, Wang und Walsh, 1978): das gebildete D-Alanin wird nachgewiesen, indem man es mit D-Aminosäureoxidase zu Pyruvat oxidiert; Pyruvat wird wiederum unter NADH-Verbrauch zu Lactat reduziert. Der Verbrauch an NADH ist equimolar zum gebildeten D-Alanin und wird durch die Abnahme der UV-Absorption bei 340 nm bestimmt. In der Literatur ist dieser Assay in seiner "gekoppelten" Form beschrieben, das heißt, alle genannten Reaktionen (Epimerisierung des Alanins, Oxidation zu Pyruvat und Reduktion zu Lactat) werden simultan durchgeführt. Diese Methode hat in nur grob angereicherten Enzymextrakten aus Tolypocladium niveum nur unzuverlässige Meßwerte geliefert. Aus diesem Grund wurden die Reaktionen entkoppelt: im ersten Teilschritt wurde die Epimerisierung des L-Alanins zum D-Alanin durchgeführt, und nach Hitzeinaktivierung der Enzyme wurde das gebildete D-Alanin in einem zweiten Teilschritt zu Pyruvat und Lactat umgesetzt. Diese Entkopplung hat auch den Vorteil, daß die optimalen Bedingungen für die Epimerisierungsreaktion ohne Beeinflussung durch die nachfolgenden Reaktionen ermittelt werden können. Durch sorgfältige Optimierung der Reaktionsparameter (pH-Optimum, T-Optimum, Cofaktor-Bedarf, Oxidationsschutz) im ersten Teilschritt konnte damit eine hochempfindliche Nachweismethode für die Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum etabliert werden, deren Prinzip (Entkopplung der Teilreaktionen) auch auf Alanin Racemasen aus anderen Organismen angewendet werden kann.

Die Reinigung des Enzyms erfolgt nach üblichen Verfahren. Der Zellaufschluß kann aus feuchten oder lyophilisierten Zellen durchgeführt werden. Liegen die Zellen feucht vor, kann ein Druckaufschluß, z. B. mit einer Manton Gaulin Apparatur oder mit einer French Press, oder ein Aufschluß mit einer Glaskugelmühle durchgeführt werden. Lyophilisierte Zellen werden dagegen zweckmäßigerweise durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Im Fall der Alanin Racemase lag das Mycel in lyophilisiertem Zustand vor, so daß ein Aufschluß des Mycels durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff am zweckmäßigsten war.

Dem Aufschluß folgt eine grobe Klärung des Rohextrakts durch mitteltourige Zentrifugation (um 10 000 g).

Die Alanin Racemase kann aus einem derart geklärten Rohextrakt durch die üblichen Methoden der Proteinreinigung angereichert werden. Es können alle üblichen Proteinfällungsmethoden (z. B. Aussalzen mit Ammoniumsulfat) und alle üblichen chromatografischen Verfahren zur Reinigung der Alanin Racemase herangezogen werden, wie z. B. Ionenaustausch-Chromatografie, Gelpermeations-Chromatografie, hydrophobe Interaktions-Chromatografie, Pseudoaffinitäts-Chromatografie an Farbstoff-Sepharosen, Chromatografie an anorganischen Trägermaterialien, wie z. B. Hydroxylapatit, und andere. Bei der Alanin Racemase wurde die Reinigung in folgenden Stufen durchgeführt: Ionenaustausch-Chromatografie an QAE-Sepharose, gefolgt von hydrophober Interaktions-Chromatografie an Phenyl-Sepharose, Gelfiltration an Superdex ^TM200 und Kationenaustausch-Chromatografie an Cellulose-Phosphat. Als letzter Schritt erwies sich eine Anionenaustausch-Chromatografie an Mono-Q als besonders günstig, da an dieser Säule eine hohe Auflösung der Proteine erzielt werden kann. Nach dieser Stufe war die spezifische Racemase-Aktivität gegenüber dem Rohextrakt etwa 6000fach angereichert und betrug etwa 50 units/mg.

Man trifft eine Zuordnung der Proteinbande zur Aktivität, in dem man den Verlauf der Enzymaktivität in den nacheinander von Mono-Q eluierenden Fraktionen mit dem Auftreten der einzelnen Proteinbanden in einem SDS-PAGE korreliert. Im Fall der Alanin Racemase konnte unter denaturierenden Bedingungen (SDS) eine Proteinbande mit M_r ca. 39 000 zugeordnet werden. Anfärbung der Proteine im SDS-PAGE mit Coomassie Blue ergab, daß die Alanin Racemase nach dem in Beispiel 6 durchgeführten Reinigungsprotokoll eine homogene Präparation darstellt.

Zur weiteren Charakterisierung der Alanin Racemase wurde die relative Molmasse des nativen Enzyms ermittelt. Durch Gelpermeations-Chromatografie wurde eine M_r um 100 000 ermittelt. Die durch solche Analysen erhaltenen Werte dürfen bekannterweise nur als Richtwerte betrachtet werden, da das Verhalten eines Proteins auf einem Molekularsieb nicht nur von seiner Größe, sondern auch von seiner (nicht bekannten) Gestalt, von seiner Hydrophobizität und von unspezifischen Wechselwirkungen mit der Gelmatrix abhängt. In Kombination mit der M_r des denaturierten Proteins von 39 000 ist es sehr wahrscheinlich, daß die Alanin Racemase als Homodimeres vorliegt, wie auch für eine Reihe anderer Racemasen beschrieben wurde (Inagaki et al., 1986, Inagaki et al., 1987, Wang und Walsh, 1978).

Die biochemische Charakterisierung der homogenen Enzympräparation ergab für das Enzym folgende Kenndaten: pH-Optimum für die Epimerisierung von L-Alanin ist pH 8,8. In vitro liegt das T-Optimum bei 47°C, was für eine hohe Temperaturstabilität des Enzyms spricht. Durch diese Eigenschaft ist zu erwarten, daß das Enzym robust genug ist, um zur Herstellung eines Biokatalysators verwendet werden zu können. Für optimale Aktivität benötigt das Enzym Zusätze von DTT (20 mM) sowie von Pyridoxalphosphat (50 µM); letztere Substanz entspricht dem natürlichen Cofaktor von Aminosäure Racemasen.

Die Anwendbarkeit einer Aminosäure Racemase wird durch ihre Substrat-Spezifitäten festgelegt. Besonders solche Enzyme sind für großtechnische Anwendungen interessant, die ein breites Substrat-Spektrum aufweisen, also eher unspezifisch sind. Die Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum kann praktisch jede angebotene Aminosäure epimerisieren, allerdings in unterschiedlichem Ausmaß. Da jedoch alle Versuche unter Bedingungen durchgeführt wurden, die für die Epimerisierung von L- zu D-Alanin optimiert wurden, kann man berechtigt annehmen, daß die Epimerisierungsausbeute für bestimmte Aminosäuren durch Optimierung der Reaktionsparameter erhöht werden kann. So liegt z. B. der optimale pH-Bereich für die Epimerisierung von D- zu L-Alanin bei pH 9,5 anstatt bei pH 8,8 (Steigerung der Umsatzrate um 100%).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1 Bestimmung der Alanin Racemase-Aktivität mit dem Diketopiperazin (DKP)-Assay

Diese Methode kann nur für den Nachweis der Racemisierung von L- zu D-Alanin verwendet werden. Das Prinzip der Methode beruht darauf, daß auch geringe Mengen D-Alanin für die Cyclosporin Synthetase ein wesentlich besseres Substrat darstellen als das im Überschuß vorhandene Racemisierungs-Substrat L-Alanin. Der Nachweis des gebildeten D-Alanins erfolgt über seinen Einbau in das Diketopiperazin cyclo(D-Ala-MeLeu), katalysiert von der Cyclosporin Synthetase.

1. Stufe

Durchführung der Racemase Reaktion

2. Stufe

Nachweis des gebildeten D-Alanins über die Synthese von DKP

Aufarbeitung

Die Reaktion wird durch Zugabe von je 2 ml H₂O gestoppt; das gebildete DKP wird mit 2 ml H₂O-gesättigtem Ethylacetat extrahiert und nach dem Abdampfen der EtOAc-Phase auf Dünnschicht nachgewiesen.

Dünnschicht-Chromatografie

Die eingedampften Proben werden in je 10 µl EtOAc aufgenommen und chromatografiert.
Platten: HPLC KG 60 ohne F₂₅₄ (Merck Nr. 5641)
Laufmittel: EtOAc+MeOH+H₂O=100+5+1
Laufstrecke: 18 cm

Auswertung

Die Dünnschichtplatten werden nach dem Trocknen entweder direkt oder nach dem Besprühen mit einem Enhancer ("Amplify" von Amersham; Cat.code RPN. 16) autoradiografiert. Dauer: ca. 2-3 Tage ohne und über Nacht mit Amplifizierung. Die Zuordnung von D- bzw. L-DKP erfolgt durch simultane Chromatogafie von "heißen" DKP-Markern. Zur Quantifizierung werden die DC-Platten in einem Radioaktivitäts-Scanner ausgewertet. Die R_f-Werte von D-DKP bzw. L-DKP liegen bei 0,33 bzw. 0,18.

Die Herstellung der DKP-Marker erfolgt nach dem gleichen Pipettierschema wie die DKP-Synthese aus dem Racemase-Ansatz, nur daß statt dem Inkubat der Racemase-Reaktion D-Alanin bzw. L-Alanin in einer Endkonzentration von 700 µM zugesetzt wird.

Beispiel 2 Bestimmung der Racemase-Aktivität mit dem HPLC-Assay

Diese Methode kann für den Nachweis der Racemisierung jeder beliebigen Aminosäure verwendet werden. Das Nachweisprinzip beruht auf der Derivatisierung der Aminosäure zu einer fluoreszierenden Verbindung, was einen sehr empfindlichen Nachweis nach Auftrennung an einer reversed phase-Säule ermöglicht.

1. Stufe

Racemase-Reaktion

2. Stufe Nachweis des gebildeten D-Alanins über Derivatisierung und Auftrennung an der HPLC Derivatisierung der Probe

In einen 10 ml-Erlenmeyerkolben werden 0,5 ml Wasser, 0,5 ml Aceton und 0,5 ml Kaliumkarbonatpuffer pH 9,9 vorgelegt, mit 50 µl Inkubationslösung (1. Stufe, enzymatischer Assay) versetzt und nach Zugabe von 0,5 ml (+)-Flec ((+)-1-(9-Fluorenyl)ethylchloroformat, 18 mM in Aceton) die Reaktion gestartet. Nach genau 2 Minuten wird durch Zugabe von 20 µl Eisessig die Derivatisierungsreaktion gestoppt, die Probe 2 mal mit je 2,5 ml Pentan extrahiert, die wäßrige Phase zentrifugiert und der klare Überstand in HPLC-Vials abgefüllt.

Chromatografische Bedingungen

HPLC: Pumpe und Sampler: HP-1050, Spektralfluorometer SFM 23B (Kontron)
Fluß: 1,0 ml/min
Eluent: Phase A: Acetatpuffer (32 mM, pH 4,35); Phase B: Tetrahydrofuran
Gradient: linear von 15% auf 35% B in 35 Minuten
Injektionsvolumen: 20 µl
Säulentemperatur: 35°C
Säule: 150 * 6,3 * 4,6 mm (Länge * Außendurchmesser * Innendurchmesser), gefüllt mit Nucleosil 100-3, C18, 3 µm
Detektion: Fluoreszenz, Anregungswellenlänge 265 nm, Emissionswellenlänge 340 nm, Empfindlichkeit LOW

Auswertung

Nach Flächenintegration der entsprechenden Peaks erfolgt die Auswertung mit Hilfe der externen Standardmethode.

Beispiel 3 Bestimmung der Alanin Racemase-Aktivität mit dem DAO/LDH-Assay

Diese Methode eignet sich in erster Linie zum Nachweis der Racemisierung von L- zu D-Alanin. Ihr Vorteil liegt in der einfachen und schnellen Handhabung.

1. Stufe

Wie unter Beispiel 2 beschrieben.

2. Stufe

Nachweis des gebildeten D-Alanins durch die Folgereaktionen mit D-Aminosäureoxidase (DAO) und Lactat-Dehydrogenase (LDH)

Die Ansätze werden in 500 µl Quarz-Küvetten (Quarzglas Suprasil Mikroküvetten von Hellma, Nr. 104.002-QS) überführt, und der durch den NADH-Verbrauch bewirkte Extinktionsabfall wird 20-30 Minuten bei 340 nm gemessen.
Auswertung: Unter der berechtigten Annahme, daß nahezu alles gebildete D-Alanin von DAO und LDH umgesetzt wird (wurde überprüft), und daß weiters pro Mol gebildetem D-Alanin ein Mol NADH verbraucht wird, läßt sich die Umsatzrate von L-Ala zu D-Ala direkt aus dem NADH-Abfall berechnen.

Beispiel 4 Bestimmung der Racemase-Aktivität mit dem Phenylhydrazin-Assay

Eignet sich allgemein zum Nachweis von D-Aminosäuren (Nagata et al., 1985).

1. Stufe

Wie unter Beispiel 2 beschrieben.

2. Stufe Nachweis der D-Aminosäure durch Umsetzung mit PHZ (2,4-dinitrophenylhydrazin)

100 µl der 1. Stufe werden mit 0,75 units DAO und 90 µl Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 4 mM EDTA, 20 mM DTT, 50 µM PLP) gemischt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach werden 100 µl PHZ-Lösung (1 mM in 1 N HCl) zugesetzt, 10 Minuten bei 37°C geschüttelt, danach 700 µl 0,6 N NaOH zugesetzt. Nach 5minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 445 nm gemessen.

Beispiel 5 Bestimmung der Racemase-Aktivität mit dem Chiralplatten-Assay

Diese Methode eignet sich prinzipiell zum Nachweis der Racemisierung aller Aminosäuren.

1. Stufe

Wie unter Beispiel 2 beschrieben.

2. Stufe Aufarbeitung

Stoppen der Reaktion und Fällung der Proteine durch Zugabe von 150 µl Aceton. Nach Zentrifugation wurde der Überstand einrotiert und in 10 µl 0,1 M HCl/Methanol (1 : 1, v/v) aufgenommen. Die gesamte Probe wurde auf eine DC-Chiralplatte aufgetragen.
Platte: Chiralplatte Kieselgel RP mit Cu²⁺ und chiralem Reagenz; Macherey-Nagel Art. Nr. 811057
Laufmittel: Aceton : MeOH : H₂O=10 : 2 : 2
Laufdauer: 2 Stunden

Auswertung

Durch Autoradiografie (einige Tage); zur Quantifizierung mit dem Dünnschicht-Radioaktivitätsscanner.

Beispiel 6 Reinigung der Alanin Racemase 1. Schritt Ernte und Aufschluß des Mycels

Fermentationsbrei wurde bei 16 000 g, 10 Minuten, abzentrifugiert. Der Brei wurde zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung unter Zusatz von 5 mM EDTA gewaschen und gefriergetrocknet. In dieser Form kann er über mehrere Monate bei -70°C gelagert werden. Zur Extraktion wurde das Myzel unter flüssigem Stickstoff zermörsert und mit 10 ml Puffer A (10 ml/g: 200 mM Tris-HCl, pH 8,5, 300 mM KCl, 4 mM EDTA, 20 mM DTT, 50 µM PLP) 1 Stunde gerührt. Diese und alle folgenden Schritte wurden bei 0-4°C durchgeführt. Um Schwebeteilchen zu entfernen, wurde der Extrakt 30 Minuten zentrifugiert (Beckman M2-21, JA 14-Rotor, 10 000 upm). Der Überstand wurde als Rohextrakt bezeichnet.

2. Schritt Ionenaustausch-Chromatografie an QAE-Sepharose

Der Überstand der Extraktion (250 ml, dialysiert gegen Puffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 4 mM EDTA, 20 mM DTT, 50 µM PLP) wurde auf eine 12×2,5 cm große Säule mit 6 ml/min aufgetragen. Beim Trennmaterial handelte es sich um eine QAE-Sepharose Fast Flow von Pharmacia, vorequilibriert mit 150 ml Puffer B. Nach dem Auftragen wurde mit Puffer B gespült, bis kein Protein mehr eluierte. Die Racemase-Aktivität wurde mit 80 ml Puffer B mit einem Salzgehalt von 150 mM NaCl eluiert. Zur Regeneration wurde die Säule mit 1 M NaCl gewaschen.

3. Schritt Hydrophobe Interaktions Chromatografie (HIC) an Phenylsepharose

Das aktive Eluat der QAE-Sepharose wurde direkt mit 1 ml/min appliziert (Säulendurchmesser 1,3 cm). Beim Säulenmaterial handelte es sich um Phenyl-Sepharose CL-4B von Pharmacia, vorequilibriert mit Puffer B). Pro mg Protein wurden 0,3 ml Phenyl-Sepharose verwendet. Nach dem Auftragen wurde mit Puffer B gewaschen, bis im Durchlauf kein Protein mehr nachweisbar war. Zur Elution wurde ein linearer Gradient von 0 auf 8% Triton X in Puffer B mit einer Laufgeschwindigkeit von 1 ml/min angelegt.

4. Schritt Superdex ^TM200-Gelfiltration

Vor der Gelfiltration wurden die aktivsten Fraktionen der Phenyl-Sepharose-Säule zunächst durch Ultrafiltration mit Centricon 30 (Amicon) auf ein Volumen von maximal 5 ml konzentriert. Für die Chromatografie wurde eine fertiggepackte Superdex ^TM200-Säule (60×1,6 cm, von Pharmacia) benutzt. Unter Berücksichtigung des nachfolgenden Reinigungsschrittes wurde die Trennung in Puffer C (50 mM HEPES pH 8,5, 4 mM EDTA, 20 mM DTT, 50 µM PLP, 50 mM NaCl) durchgeführt. Die Laufgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min, die Fraktionsgröße 2 ml.

5. Schritt Ionenaustausch-Chromatografie an Cellulose-Phosphat

Beim Trennmaterial handelte es sich um P11 Cellulose-Phosphat von Whatman. Die Chromatografie wurde in Puffer D (wie Puffer C, jedoch pH 7,5; + Zusatz von 15% Glyzerin) durchgeführt. Das Trennmaterial wurde vor Verwendung nach den Angaben des Herstellers aktiviert. Das Säulenvolumen betrug 0,5 ml Cellulose-Phosphat pro mg Protein. Die Säule wurde mit Puffer D equilibriert und nach dem Auftragen der Proteinprobe bis zum Absinken der Extinktion gewaschen. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 auf 220 mM in 5 Minuten und von 220 auf 400 mM in 20 Minuten. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Fraktionsgröße 2 ml.

6. Schritt Ionenaustausch-Chromatografie an Mono-Q

Nach 30 Minuten Dialyse der aktiven Fraktionen von Cellulose-Phosphat gegen Puffer B wurden diese auf eine Mono Q HR 5/5 (von Pharmacia, equilibriert in Puffer B) aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer B wurde die Racemase mit einem Gradienten von 0 auf 70 mM NaCl in 10 min und von 70 auf 120 mM NaCl in 60 min bei einer Laufgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 1,8 ml.

Beispiel 7 Molekulargewichtsanalyse der Alanin-Racemase

Eine M_r-Analyse wurde für das Enzym sowohl im nativen als auch im denaturierten Zustand durchgeführt.

Bestimmung des Molekulargewichts im nativen Zustand durch Gelfiltration

Die M_r-Analyse wurde an einer TSK-3000-SWG 21,5×600 mm, mit einer TSK-SWG 21,5×75 mm Vorsäule, an einer HPLC-Anlage durchgeführt. Puffer: 0,2 M Tris/HCl pH 7,5; Flußrate: 5 ml/min. Die Kalibrierung der Gelsäule erfolgte mit den Eichproteinen Aldolase (M_r 160 000), IgG (150 000), alkalische Phosphatase (140 000), BSA (68 000), Ovalbumin (45 000), Carboanhydrase (30 000) und Myoglobulin (18 800). Es wurde eine M_r um 100 000 ermittelt.

Bestimmung des Molekulargewichts im denaturierten Zustand durch SDS-PAGE

Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter SDS wurde nach Lämmli (1970) durchgeführt. Es wurde ein 10%iges Gel verwendet und die Elektrophorese 1000 Vh lang durchgeführt (0,75×14×14 cm). Als Referenz wurde ein LMW-Standard von Pharmacia verwendet (low molecular weight standard). Das Molekulargewicht wurde durch Erstellen einer Eichkurve mit ca. 39 000 ermittelt.

Beispiel 8 Biochemische Charakterisierung der Alanin Racemase

Die Kenndaten des Enzyms wurden mit den in den Beispielen 1-5 beschriebenen Nachweismethoden für die Epimerisierung von L- zu D-Alanin ermittelt. Das gereinigte Enzym weist eine spezifische Aktivität von 50 units/mg auf und zeigt seine optimale in vitro-Aktivität bei 47°C, unter Zusatz von 50 µM PLP, 20 mM DTT und bei pH 8,8. Unter diesen Bedingungen beträgt sein K_M-Wert gegenüber L-Alanin 40 mM.

Beispiel 9 Substratspezifität der Racemase

Zur Bestimmung der Substratspezifität wurden sowohl der HPLC-Assay (Beispiel 2) als auch der PHZ-Assay (Beispiel 4) verwendet. Die getesteten Aminosäuren wurden in einer Konzentration von 50 mM angeboten. Die umgesetzte Menge wurde auf den Umsatz an L-Alanin unter identischen Bedingungen bezogen. Dabei ergaben sich folgende Spezifitäten:

Literaturliste

Asano Y. and Endo K.: Amino acid racemase with broad substrate specificity, its properties and use in phenylalanine racemization. Appl Microbiol Biotechnol 29 (1988) 523-527.
Badet B., Roise D. and Walsh C.: Inactivation of the dadB Salmonella typhimurium alanine racemase by D and L isomers of β-substituted alanines: Kinetics, stoichiometry, active site peptide sequencing, and reaction mechanism. Biochemistry 23 (1984) 5188-5194.
Badet B. and Walsh C.: Purification of an alanine racemase from Streptococcus faecalis and analysis of its inactivation by (1-Aminoethyl)phosphonic acid enantiomers. Biochemistry 24 (1985) 1333-1341.
Cannon P. F.: International Commission on the taxonomy of fungi (ICTF): name changes in fungi of microbiological, industrial and medical importance. Part 2. Microbiological Sciences 3, Nr. 9 (1986) 285-287.
Esaki N. and Walsh C.: Biosynthetic alanine racemase of Salmonella typhimurium: Purification and characterization of the enzyme encoded by the alr gene. Biochemistry 25 (1986) 3261-3267.
Galakatos N. G., Daub E., Botstein D. and Walsh C.: Biosynthetic alr alanine racemase from Salmonella typhimurium: DNA and protein sequence determination. Biochemistry 25 (1986) 3255-3260.
Inagaki K., Tanizawa K., Badet B., Walsh C., Tanaka H. and Soda K.: Thermostable alanine racemase from Bacillus stearothermophilis: Molecular cloning of the gene, enzyme purification, and characterization. Biochemistry 25 (1986) 3268-3274.
Inagaki K., Tanizawa K., Tanaka H. and Soda K.: Purification and characterization of amino acid racemase with very broad substrate specificity from Aeromonas caviae. Agric. Biol. Chem. 51 (1987) 173-180.
Ishiwata K., Fukuhara N., Shimada M., Makiguchi N. and Soda K.: Enzymatic production of L-Tryptophan from DL-Serine and Indole by a Coupled Reaction of Tryptophan Synthase and Amino Acid Racemase. Biotechnol. Appl. Biochem. 12 (1990) 141-149.
Kleinkauf H. and v. Döhren H.: Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics. Eur. J. Biochem. 192 (1990) 1-15.
Lämmli U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (1970) 680-685.
Lawen A., Traber R., Geyl D., Zocher R. and Kleinkauf H.: Cell-free biosynthesis of new cyclosporins. J. Antibiotics 42 (1989) 1283-1289.
Lawen A., Dittmann J., Schmidt B., Riesner, D. and Kleinkauf H.: Enzymatic biosynthesis of cyclosporin A and analogues. Biochimie 74 (1992) 511-516.
Lawen A. and Zocher R.: Cyclosporin Synthetase. The most complex peptide synthesizing multienzyme polypeptide so far described. J. Biol. Chem. 265 (1990) 11355-11360.
Nagata Y., Akino T. and Ohno K. Analytical Biochemistry 150 (1981) 238-242.
Roise D., Soda K., Yagi T. and Walsh C.: Inactivation of the Pseudomonas striata broad specificity amino acid racemase by D and L isomers of β-substituted alanines: Kinetics, stoichiometry, active site peptide, and mechanistic studies. Biochemistry 23 (1984) 5195-5201.
Schmidt B., Riesner D., Lawen A. and Kleinkauf H.: Cyclosporin synthetase is a 1.4 MDa multienzyme polypeptide. FEBS Letters 307 (1992) 355-360.
Takeda Chem Ind, European patent application 0,304,021 (1988).
Tanizawa K., Ohshima A., Scheidegger A., Inagaki K., Tanaka H. and Soda K.: Thermostable alanine racemase from Bacillus stearothermophilus: DNA and protein sequence determination and secondary structure prediction. Biochemistry 27 (1988) 1311-1316.
Thornberry N. A., Bull H. G., Taub D., Greenlee W. J., Patchett A. A. and Cordes E. H.: 3-Halovinylglycines. Efficient irreversible inhibitors of E. coli alanine racemase. J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 7543-7544.
Walsh C., Badet R., Daub E., Esaki N. and Galakatos N.: Bacterial alanine racemases: Targets fpr antibacterial agents. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 55 (1985) 193-209.
Wang E. and Walsh C.: Suicide Substrates for the alanine racemase of Escherichia coli B. Biochemistry 17 (1978) 1313-1321.
Wasserman S. A., Daub E., Grisafi P., Botstein D. and Walsh C.: Catabolic alanine racemase from Salmonella typhimurium: DNA sequence, enzyme purification, and characterization. Biochemistry 23 (1984) 5182-5187.

Verwendete Abkürzungen
µCi
Mikrocurie
µg	Mikrogramm
µl	Mikroliter
µm	Mikrometer
µM	Mikromolar
ACV	Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin
AdoMet	S-Adenosyl-Methionin
ATP	Adenosintriphosphat
DAO	D-Aminosäure Oxidase
DTT	Dithiothreitol
EDTA	Aethylendiamintetraessigsäure
FPLC	Fast Performance Liquid Chromatography
g	Gramm
(g/v)%	Gewicht/Volumen in %
gv%	Gewicht/Volumen in %
GBq	Giga-Bequerel
h	Stunden
HEPES	N-2-Hydroxyethyl-piperazine-N-2-propansulfonsäure
HP-RPC	High Pressure - Reversed Phase Chromatography
HPLC	High Pressure Liquid Chromatography
kDa	Kilodalton
l	Liter
LDH	Lactat-Dehydrogenase
MBq	Mega-Bequerel
mg	Milligramm
min	Minuten
ml	Milliliter
mM	Millimolar
MOPS	3-Morpholinopropansulfonsäure
Mr	relative Molmasse
mU	milli-units
NADH	Nicotinamid-adenin-dinukleotid, reduziert
pH	pH-Wert
PLP	Pyridoxylphosphat
SDS	Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE	SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
Tricin	N-tris(hydroxymethyl)methylglycine
Tris	Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Upm	Umdrehungen pro Minute
V	Volumen
(v/v)%	Volumen Prozent

Claims (3)

1. Alanin Racemase aus Tolypocladium niveum in gereinigter Form.

2. Alanin Racemase gemäß Anspruch 1, worin sie aus Tolypocladium niveum ATCC 34921 ist.

3. Alanin Racemase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alanin Racemase eine spezifische Aktivität von zu mindestens 50 units/mg aufweist.