DE4309394A1 - Neue Farbkuppler zum Nachweis von H¶2¶0¶2¶ - Google Patents

Neue Farbkuppler zum Nachweis von H¶2¶0¶2¶

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestim­ mung von H2O2 in einer Probeflüssigkeit durch eine Indikator­ reaktion, worin ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase gebildet wird, wobei man als Chromogene ein Phenolderivat und ein mit dem Phenolderivat kupplungsfähiges Material verwendet, und ein Reagenz zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
Es sind Oxidoreduktasen bekannt, die eine Redoxreaktion unter Verwendung von O2 als Elektronenakzeptor katalysieren, wobei während der Oxidation der spezifischen Enzymsubstrate H2O2 erzeugt wird.
Zum Nachweis dieses H2O2 gibt es hochsensitive und genaue colorimetrische Tests, insbesondere solche, die auf einer Trinderreaktion (P. Trinder, Ann.Clin.Biochem. 6 (1969), 24- 27) beruhen, worin in Anwesenheit von H2O2 ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase (EC 1.11.1.7) gebildet wird.
Die Trinderreaktion wird insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Chemie in weitem Umfang verwendet und dient zur photometrischen Bestimmung einer Anzahl diagnostisch bedeu­ tender Metaboliten in Körperflüssigkeiten auf technisch ein­ fache Weise unter Verwendung spezifischer H2O2 bildender Oxidasereaktionen, die mit entsprechenden chromogenen Indika­ torsystemen gekoppelt sind.
In der Technik ist bekannt, den Nachweis des durch eine Oxi­ doreduktase gebildeten H2O2 mit einem chromogenen System durchzuführen, das aus Phenol und einem mit Phenol kupplungs­ fähigen Material (z. B. 4-Aminoantipyrin) besteht. Dieses System wird heute beispielsweise kommerziell zum Nachweis von Cholesterin, Glucose oder Triglyceriden in Körperflüssigkei­ ten verwendet. Neben Phenol ist auch die Verwendung von Mono- oder Dichlorphenolen (z. B. 4-Chlorphenol, 3,4-Dichlor­ phenol) bekannt.
Ein Nachteil dieses aus Phenol oder einem chlorierten Phenol und einem damit kupplungsfähigen Material bestehenden Farbsy­ stems ist jedoch, daß bei Proben, die den nachzuweisenden Analyten in Konzentrationen oberhalb der Linearitätsgrenze enthalten, der durch die oxidative Kupplung gebildete Farb­ stoff (z. B. 4- (Benzochinon-monoimino) -phenazon) aufgrund einer Sauerstoffverarmung in der Probelösung in Anwesenheit der Oxidoreduktase zu einem farblosen Produkt reduziert wird. Durch dieses "Ausbleichen" der entstandenen Farbe wird das Meßsignal mit steigenden Analytenkonzentrationen wieder rück­ läufig, was zu ganz erheblichen Meßfehlern führen kann. Daher war es bisher in der Praxis erforderlich, daß die Lineari­ tätsgrenze mit Rücksicht auf sehr hohe Analytenkonzentratio­ nen niedrig angesetzt werden muß.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand somit darin, ein Verfahren zur Bestimmung von H2O2 durch die Trinderreak­ tion bereitzustellen, bei dem das Ausbleichen des Farbstoffes vermindert oder/und vollständig vermieden werden kann.
Diese erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Bestimmung von H2O2 in einer Probeflüssigkeit durch eine Indikatorreaktion gelöst, worin ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase gebildet wird, wobei man als Chromogene ein Phenolderivat und ein mit dem Phenolderivat kupplungsfähiges Material verwen­ det, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Phenolderivat mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II) ist,
worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel -(CH2)n-COZ ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und Z NR3R4 oder OR3 bedeutet, worin R3 oder/und R4 unabhängig voneinander Wasser­ stoff oder/und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein können, R2 einen oder mehrere Reste bedeutet, die unab­ hängig voneinander H, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder/und CN sein können, wobei R2 in der Formel (I) die Po­ sitionen 2, 5 oder/und 6, in Formel (II) die Positionen 3, 5 oder/und 6 besetzen kann.
Überraschenderweise wird durch das erfindungsgemäße Verfah­ ren, bei dem Phenol durch ein Phenolderivat der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II) ersetzt wird, durch die oxidative Kupplung mit einem mit dem Phenolderivat kupplungsfähigen Material ein Farbstoff erzeugt, der durch eine Oxidoreduktase auch bei einem Mangel oder bei Abwesenheit von Sauerstoff in der Testlösung nicht reduziert werden kann und somit stabil ist. Dadurch kann die Linearitätsgrenze der Messung erheblich zuverlässiger und höher angegeben werden und überdies können Analytenkonzentrationen sogar über dieser Linearitätsgrenze mit konstantem Meßsignal nachgewiesen werden.
Bei den Verbindungen der Formeln (I) und (II) ist es bevor­ zugt, daß R3 oder/und R4 Wasserstoff bedeuten und daß n im Rest R1 mit der Formel -(CH2)n-COZ 0, 1 oder 2 ist. Weiterhin ist bevorzugt, daß Z im Rest R1 eine OH-Gruppe ist, so daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Phenolderivat vorzugsweise um eine Carbonsäure handelt. In den Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und (II) kann Halogen F, Cl, Br und I bedeuten, vorzugsweise bedeutet Halogen Cl, Br oder I.
Besonders bevorzugt ist, wenn R2 einen oder mehrere Reste bedeutet, die unabhängig voneinander H, Cl, Br oder/und CH3 sein können. Spezifische Beispiele für geeignete Phenolderi­ vate der allgemeinen Formeln (I) und (II) sind 3-Hydroxyben­ zoesäure, 3-Hydroxy-4-methylbenzoesäure, 3-Hydroxyphenyles­ sigsäure, 2,4-Dibrom-3-hydroxyphenylessigsäure, 2,4-Dichlor- 3-hydroxyphenylessigsäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure und 3- Hydroxyphenylpropionsäure. Von den für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Phenolderivaten sind die Verbindungen der Formel (I) generell bevorzugt.
Bei dem mit dem Phenolderivat kupplungsfähigen Material kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die in der Lage ist, durch oxidative Kupplung mit einem Phenolderivat der Formeln (I) oder/und (II) einen gegen Ausbleichen stabilen Farbstoff zu bilden. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für ein derartiges Material ist 4-Aminoantipyrin.
Einige der für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Phenolderivate der allgemeinen Formeln (I) und (II) (z. B. 3- Hydroxybenzoesäure, 3-Hydroxymethylbenzoesäure, 2-Hydroxyphe­ nylessigsäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure) sind geläufige kommerziell erhältliche Verbindungen. Die Herstellung von 2,4-Dibrom-3-hydroxybenzoesäure und 2,4-Dichlor-3-hydroxyben­ zoesäure ist in EP-A 0 108 526 beschrieben. Die Herstellung von 2,4-Dibrom-3-hydroxyphenylessigsäure und 2,4-Dichlor-3- hydroxyphenylessigsäure ist EP-A 0 476 608 beschrieben. Ent­ sprechende Ester und Amide dieser Carbonsäuren können nach üblichen Verfahren, wie sie dem Fachmann geläufig sind, syn­ thetisiert werden. Die Synthese von 3-Hydroxyphenylpropion- Säure durch Hydrierung von 3-Hydroxyzimtsäure ist als Beispiel 1 in der vorliegenden Anmeldung angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein zur Bestimmung von H2O2 in einer beliebigen, vorzugsweise wäßrigen Probe­ flüssigkeit in Gegenwart von Peroxidase verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, wenn H2O2 in der Probeflüssigkeit durch eine enzymatische Reaktion entsteht, die von einer Oxidore­ duktase katalysiert wird und bei der ein spezifisches Sub­ strat der Oxidoreduktase oxidiert wird, wobei die durch Oxidation des Substrats freiwerdenden Elektronen auf O2 (Elektronenakzeptor) unter Bildung von H2O2 (reduzierter Elektronenakzeptor) übertragen werden. Bevorzugte Beispiele für Oxidoreduktasen sind Cholesterinoxidase (EC 1.1.3.6) mit Cholesterin als Substrat, Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) mit Glucose als Substrat oder Glycerinphosphatoxidase mit Gly­ cerin-3-phosphat als Substrat, am meisten bevorzugt ist Glu­ coseoxidase. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Phenolderi­ vate bei einer Anwesenheit dieser Oxidoreduktasen im Reak­ tionsgemisch verhindert das durch eine Sauerstoffverarmung hervorgerufene Ausbleichen des durch die Trinderreaktion gebildeten Farbstoffs.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann das er­ findungsgemäße Verfahren in Gegenwart von Peroxidase und einer Oxidoreduktase zur Bestimmung wichtiger klinischer Analyten, wie etwa Cholesterin, Triglyceride oder Glucose in Körperflüssigkeiten wie etwa Serum, Plasma oder Urin verwen­ det werden. Beim Nachweis eines derartigen Analyten in einer Probeflüssigkeit wird Analyt durch die Oxidoreduktase in Gegenwart von O2 und unter Bildung von H2O2 oxidiert und das entstandene H2O2 durch eine oxidative Kupplung zwischen min­ destens einem Phenolderivat der Formeln (I) oder/und (II) und einem damit kupplungsfähigen Material in Gegenwart von Per­ oxidase unter Bildung eines Farbstoffs nachgewiesen. Zur Bestimmung von Glucose wird z. B. die in der Probelösung vor­ handene Glucose in Gegenwart von Sauerstoff durch das Enzym Glucoseoxidase unter Bildung von H2O2 oxidiert und das in dieser Reaktion entstandene H2O2 in einer Trinderreaktion nachgewiesen. Das Testprinzip bei der Bestimmung von Chole­ sterin besteht darin, daß in der Probeflüssigkeit befindliche Cholesterinester zuerst durch Cholesterinesterase zu Chole­ sterin gespalten werden, das auf diese Weise gebildete Chole­ sterin und gegebenenfalls bereits in freier Form vorhandenes Cholesterin in Gegenwart von O2 durch Cholesterinoxidase unter Bildung von H2O2 oxidiert und das entstandene H2O2 in einer Trinderreaktion nachgewiesen wird. Das Testprinzip zur Bestimmung von Triglyceriden besteht darin, daß die Triglyce­ ride durch Lipase in Glycerin und Fettsäuren gespalten wer­ den, das entstandene Glycerin durch Glycerokinase zu Glyce­ rin-3-phosphat phosphoryliert wird und dieses durch Glycerin­ phosphatoxidase in Gegenwart von O2 unter Bildung von H2O2 oxidiert wird, welches anschließend wiederum in der Trinder­ reaktion nachgewiesen wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Reagenz zur Bestimmung von H2O2 durch eine Indikatorreak­ tion, worin ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase gebildet wird, wobei das Reagenz Peroxidase und als Chromogene ein Phenolderivat und ein mit dem Phenolderivat kupplungsfähiges Material ent­ hält, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat minde­ stens eine Verbindung der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II) ist,
worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel -(CH2)n -COZ ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und Z NR3R4 oder OR3 bedeutet, worin R3 oder/und R4 unabhängig voneinander Wasser­ stoff oder/und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein können, R2 einen oder mehrere Reste bedeutet, die unab­ hängig voneinander H, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder/und CN sein können, wobei R2 der Formel (I) die Positio­ nen 2, 5 oder/und 6, in Formel (II) die Positionen 3, 5 oder/und 6 besetzen kann.
Das mit dem Phenolderivat kupplungsfähige Material ist vor­ zugsweise 4-Aminoantipyrin. Weiterhin ist bevorzugt, daß das Reagenz zusätzlich eine Oxidoreduktase, die zur Übertragung von Elektronen auf O2 unter Bildung von H2O2 in der Lage ist, und gegebenenfalls weitere zum Nachweis bestimmter Analyten in der Probeflüssigkeit notwendige Enzyme (z. B. Lipase, Gly­ cerokinase oder Cholesterinesterase) enthält. Die Oxidase ist vorzugsweise Cholesterinoxidase, Glucoseoxidase oder Glyce­ rinphosphatoxidase.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann weiterhin geeignete Puffer und Hilfsmittel enthalten. Bei der Bestimmung von Triglyceri­ den oder Cholesterin ist die Verwendung von Fettalkoholpoly­ glycolethern und Salzen von Gallensäuren (z. B. Natriumcholat) bevorzugt. Das erfindungsgemäße Reagenz kann in Form einer Lösung oder eines Lyophilisats sein. Das erfindungsgemäße Reagenz kann alle Bestandteile getrennt enthalten. Anderer­ seits kann das Reagenz mehrere oder alle Bestandteile gemein­ sam in einem einzigen Gefäß enthalten.
Die Endkonzentration der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und (II) im Test beträgt vorzugsweise 1 bis 25 mmol/l, besonders bevorzugt 2 bis 15 mmol/l. Die Endkonzentration des mit dem Phenolderivat kupplungsfähigen Materials beträgt vorzugsweise 0,1 mmol/l bis 2,5 mmol/l, besonders bevorzugt 0,2 mmol/l bis 1,5 mmol/l. Das Molverhältnis zwischen Phenol­ derivat und kupplungsfähigem Material beträgt vorzugsweise 5 : 1 bis 15 : 1, besonders bevorzugt ca. 10 : 1.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Phenolderivaten der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II) als Chromogene in einem Verfahren zur Bestimmung von H2O2 durch eine Indikatorreaktion.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung zusammen mit den Fig. 1 bis 7 veranschaulichen.
Es zeigen:
Fig. 1 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von Phenol als Chromogen,
Fig. 2 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von 3-Hydroxy­ phenylpropionsäure als Chromogen,
Fig. 3 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von 3-Hydroxy­ benzoesäure als Chromogen,
Fig. 4 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von 3-Hydroxy- 4-methylbenzoesäure als Chromogen,
Fig. 5 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestiminung unter Verwendung von 3-Hydroxy­ phenylessigsäure als Chromogen,
Fig. 6 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von 2-Hydroxy­ phenylessigsäure als Chromogen,
Fig. 7 die Abhängigkeit der Extinktion von der Reaktionszeit bei einer Glucosebestimmung unter Verwendung von 2,4-Dibrom- 3-hydroxyphenylessigsäure als Chromogen.
Beispiel 1 Synthese von 3-Hydroxyphenylpropionsäure
15 g (entsprechend 91 mmol) 3-Hydroxyzimtsäure werden in einem Gemisch aus 15 ml Wasser und 150 ml Ethanol gelöst und mit Palladiumschwarz als Katalysator bei Normaldruck hy­ driert. Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Anschließend wird das Produkt im Vakuum bei 50°C getrocknet. Das Produkt zeigt auf einer Dünn­ schichtchromatographie an Kieselgel mit Essigsäureethyl­ ester/Petrolether 2 : 1 + 0,05% Essigsäure als Laufmittel einen Rf-Wert von 0,49.
Beispiel 2 Durchführung des GOD-PAP-Tests mit den erfindungsgemäßen Phenolderivaten
In eine Makroküvette (1 cm Schichtdicke) werden 2,5 ml Rea­ genzlösung pipettiert und auf 37°C temperiert. Nach Erreichen dieser Temperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 25 µl Probelösung gestartet. Gemessen wird der zeitliche Verlauf der Extinktion an einem Spektralphotometer (UVIKON 930, Kon­ tron Instruments) bei 505 nm und einer Meßtemperatur von 37°C.
Reagenzlösung: 100 mmol/l Natriumphosphat, pH 7,00
0,1% Natriumazid
0,77 mmol/l 4-Aminoantipyrin
11 mmol/l Phenol (Fig. 1)
bzw. 6 mmol/l Phenolderivat (Fig. 2 bis 7)
2 U/ml Peroxidase
50 U/ml Glucoseoxidase
Probelösungen: 1 Glucose wäßrig 200 mg/dl
2 Glucose wäßrig 400 mg/dl
3 Glucose wäßrig 800 mg/dl
4 Glucose wäßrig 1000 mg/dl.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß bei Glucosekonzentrationen von 800 und 1000 mg/dl (Probelösungen 3 und 4) ein Abfall des Meßsignals mit steigender Reaktionszeit gefunden wird. Dieser Abfall ist auf ein Ausbleichen des entstandenen Farbstoffs zurückzuführen, da bedingt durch eine Sauerstoffverarmung im Reagenz der durch Reaktion von Phenol und 4-Aminoantipyrin gebildete Farbstoff in Anwesenheit von Glucoseoxidase anstel­ le von Sauerstoff zu einem farblosen Produkt reduziert werden kann.
Aus den Fig. 2 bis 7 ist ersichtlich, daß bei einem Er­ setzen von Phenol durch die erfindungsgemäßen Phenolderivate 3-Hydroxyphenylpropionsäure, 3-Hydroxybenzoesäure, 3-Hydroxy- 4-methylbenzoesäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure, 2-Hydroxyphe­ nylessigsäure bzw. 2,4-Dibrom-3-hydroxyphenylessigsäure ein derartiges Ausbleichen nicht gefunden wird.

Claims (15)

1. Verfahren zur Bestimmung von H2O2 in einer Probeflüssig­ keit durch eine Indikatorreaktion, worin ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegen­ wart von Peroxidase gebildet wird, wobei man als Chromo­ gene ein Phenolderivat und ein mit dem Phenolderivat kupplungsfähiges Material verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formeln I oder/und II ist, worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel -(CH2)n-COZ ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und Z NR3R4 oder OR3 bedeutet, worin R3 oder/und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff oder/und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein können, R2 einen oder meh­ rere Reste bedeutet, die unabhängig voneinander H, Halo­ gen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder/und CN sein können, wobei R2 in der Formel (I) die Positionen 2, 5 oder/und 6, in Formel (II) die Positionen 3, 5 oder/und 6 beset­ zen kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Phenolderivat kupplungsfähige Material 4-Aminoantipyrin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 oder/und R4 Wasserstoff bedeuten.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Rest R1 n 0, 1 oder 2 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Z eine OH-Gruppe ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R2 einen oder mehrere Reste bedeutet, die unabhängig voneinander H, Cl, Br oder/und CH3 sein können.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phenolderivat 3-Hydroxybenzoesäure, 3-Hydro­ xy-4-methylbenzoesäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure, 2,4- Dibrom-3-hydroxyphenylessigsäure, 2,4-Dichlor-3-hydroxy­ phenylessigsäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure oder/und 3- Hydroxyphenylpropionsäure verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat eine Verbindung der Formel (I) ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß H2O2 in der Probeflüssigkeit durch eine enzymatische Reaktion entsteht, die von einer Oxidoreduktase kataly­ siert wird und bei der ein spezifisches Substrat oxi­ diert wird, wobei die durch Oxidation des Substrats freiwerdenden Elektronen auf O2 unter Bildung von H2O2 übertragen werden.
10. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidoreduktase Cholesterinoxidase, Glucose­ oxidase oder Glycerinphosphatoxidase verwendet.
11. Verwendung von Phenolderivaten der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II), wie in Anspruch 1 definiert, als Chromogen in einem Verfahren zur Bestimmung von H2O2 durch eine Indikatorreaktion.
12. Reagenz zur Bestimmung von H2O2 durch eine Indikator­ reaktion, worin ein Farbstoff durch oxidative Kupplung von zwei Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase gebil­ det wird, wobei das Reagenz Peroxidase und als Chromoge­ ne ein Phenolderivat und ein mit dem Phenolderivat kupplungsfähiges Material enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formeln (I) oder/und (II) ist, worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel -(CH2 )n-COZ ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und Z NR3R4 oder OR3 bedeutet, worin R3 oder/und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff oder/und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein können, R2 einen oder meh­ rere Reste bedeutet, die unabhängig voneinander H, Halo­ gen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder/und CN sein können, wobei R2 der Formel (I) die Positionen 2, 5 oder/und 6, in Formel (II) die Positionen 3, 5 oder/und 6 besetzen kann.
13. Reagenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Phenolderivat kupplungsfähige Material 4-Aminoantipyrin ist.
14. Reagenz nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Oxidoreduktase enthält, die zur Übertragung von Elektronen auf O2 unter Bildung von H2O2 in der Lage ist.
15. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidoreduktase Cholesterinoxidase, Glucoseoxida­ se oder Glycerinphosphatoxidase ist.
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