DE4306085A1

DE4306085A1 - Method and device for mixing liquids in microtiter plates

Info

Publication number: DE4306085A1
Application number: DE4306085A
Authority: DE
Inventors: Gunter Siegfried Dipl Fischer; Gerhard Peter Wilhel Kuellertz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1993-02-26
Publication date: 1994-09-01
Also published as: WO1994019097A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum berührungsfreien Durchmischen von Lösungen in den Kavitäten von Mikrotiterplatten.The invention relates to a method for non-contact Mixing of solutions in the cavities of Microtiter plates.

Homogene Lösungen in Mikrotiterplatten sind nötig, wenn chemische Reaktionen mit Messungen der optischen Dichte in den einzelnen Kavitäten einer Mikrotiterplatte definiert ablaufen müssen.Homogeneous solutions in microtiter plates are necessary if chemical reactions with measurements of optical density in the individual cavities of a microtiter plate run in a defined manner have to.

Diese Messungen werden in großem Umfang für diagnostische Verfahren benutzt. In solchen Fällen kann ein verbessertes Mischverfahren von Bedeutung sein.These measurements are widely used for diagnostic Procedure used. In such cases, an improved one Mixing processes are important.

Verfahren zum berührungsfreien Mischen von Flüssigkeiten sind in umfangreichem Maße bekannt. Die angewendeten Verfahren stützen sich zum einen auf die Übertragung von Schwingungen auf die Flüssigkeit enthaltenden Gefäße oder nutzen strömende Flüssigkeiten oder Gase, um durch Verwirbelung ein Vermischen zu erreichen. Verfahren zur Herstellung homogener Lösungen in Mikrotiterplatten gründen sich auf die mechanische Übertragung von beschleunigten Bewegungen auf die Mikrotiterplatte.Methods for non-contact mixing of liquids are known to a large extent. The procedures used are based on the one hand on the transmission of vibrations the liquid-containing vessels or use flowing ones Liquids or gases to mix by swirling to reach. Process for the preparation of homogeneous solutions in Microtiter plates are based on mechanical transmission of accelerated movements on the microtiter plate.

Dabei werden zwei Grundprinzipien genutzt:Two basic principles are used:

A. Linear accelerated movements

Die Mikrotiterplatte wird durch einen Schwingungsgeber in rüttelnde Bewegungen versetzt. Durch Ausnutzen der Trägheit der Flüssigkeit wird bei geeigneter Schüttelfrequenz eine solche Bewegung in der Flüssigkeit erreicht, die ein Durchmischen zur Folge hat. Schwingungsgeber ist üblicherweise eine Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird, oder auch eine extra als "Mikroplattenschüttler" vertriebene Vorrichtung. Schwingungsgeber kann aber auch ein sich über eine Steuerung zielgerichtet linear bewegender Wagen sein, auf den die Mikrotiterplatte gestellt wird, wie dies beispielsweise im Mikrotiterplatten-Auswertesystem (MR 7000) der Firma Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA) realisiert wird.The microtiter plate is inserted into a vibrator shaking movements offset. By taking advantage of the inertia of the Liquid becomes such at a suitable shaking frequency Movement in the liquid is achieved, which leads to mixing Consequence. Vibration generator is usually one Shaker, as used in chemical laboratories the mixing of larger amounts of liquid is used, or also a specially sold as "microplate shaker" Contraption. Vibration transmitter can also be a Controlled linear moving wagons on the the microtiter plate is placed, such as in Microtiter plate evaluation system (MR 7000) from Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA) becomes.

B. Circular accelerated motion

Die Mikrotiterplatte wird kreisförmig so beschleunigt, daß die Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten auf Grund ihrer Trägheit in kreisende Bewegung versetzt wird. Durch diese kreisende Bewegung soll ein Durchmischen erreicht werden. Bewegungsgeber ist üblicherweise eine Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird.The microtiter plate is accelerated in a circle so that the Liquid in the individual cavities due to their inertia is set in a circular motion. Through this circling Mixing should be achieved during movement. Motion sensor is usually a shaker, as used in chemical Laboratories also for mixing larger ones Amounts of liquid is used.

Beide unter A und B angeführten Verfahren nutzen die Trägheit der Flüssigkeit bei einer auf sie wirkenden beschleunigten Bewegung aus.Both methods listed under A and B use the inertia of the liquid when accelerated on it Movement out.

Diese Verfahren sind für größere Flüssigkeitsmengen sehr gut geeignet. Infolge der kleinen Volumina der Kavitäten in Mikrotiterplatten und deren Geometrie treten aber hier die Nachteile dieser Verfahren zutage. Da die Trägheit direkt proportional zur Masse ist, muß bei kleinen Flüssigkeitsmengen eine besonders hohe Beschleunigung angewendet werden, um eine solche Flüssigkeitsbewegung zu erreichen, die ein Durchmischen zur Folge hat. Von weiterem Nachteil sind die Adhäsion der Flüssigkeit an der Mikrotiterplatte. In zylindrischen Gefäßen verhalten sich die mit der Flüssigkeit wechselwirkenden Oberflächen umgekehrt proportional zur Flüssigkeitsmenge. Kleinere Flüssigkeitsmengen sind, bezogen auf das Volumen, größeren Adhäsionskräften ausgesetzt als größere Flüssigkeitsvolumina. Ebenso verhält es sich mit der Oberflächenspannung.These methods are very good for larger amounts of liquid suitable. Due to the small volumes of the cavities in Microtiter plates and their geometry occur here Disadvantages of these methods come to light. Because the inertia is direct is proportional to the mass, with small amounts of liquid a particularly high acceleration can be applied to a to achieve such fluid movement that is mixing has the consequence. Another disadvantage is the adhesion of the Liquid on the microtiter plate. In cylindrical vessels behave those interacting with the liquid Surfaces inversely proportional to the amount of liquid. Smaller amounts of liquid are, based on the volume, exposed to greater adhesive forces than larger ones Volume of liquid. It is the same with the Surface tension.

Um dennoch mit dem angewendeten Wirkungsprinzip eine exakte reproduzierbare Durchmischung der Lösungen in allen 96 Kavitäten einer Mikrotiterplatte zu erreichen, müßte eine unpraktikabel hohe Beschleunigung angewendet werden. Diese notwendigen hohen Beschleunigungen können ihrerseits zu Resonanzerscheinungen der Titerplatte führen, in deren Ergebnis es zu Zonen auf der Titerplatte kommen kann, in denen die Durchmischung sehr langsam erfolgt, und zu Bereichen, in denen Flüssigkeit aus den Kavitäten herausspritzt.In order nevertheless with the applied principle of action an exact reproducible mixing of the solutions in all 96 One would have to reach the wells of a microtiter plate impractical high acceleration can be applied. This necessary high accelerations can in turn Signs of resonance in the titer plate lead to the result there may be zones on the titer plate in which the Mixing occurs very slowly, and to areas where Liquid splashes out of the cavities.

Die oben angeführte Möglichkeit, durch strömendes Gas eine Durchmischung zu erreichen, wird beim Mischen von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten bisher nicht angewendet, da sie in der bisher beschriebenen Art das nachfolgende lichtoptische Meßverfahren durch Einbringen von Gasblasen stören würde. So wurde beispielsweise in der DE-OS 28 37 002 eine Technik beschrieben, in der ein Propeller Luft auf eine Flüssigkeitsoberfläche in der Art bläst, daß die Flüssigkeit gemischt wird und Gasblasen in die Flüssigkeit eingetragen werden. Dieses Einbringen von Gasblasen wurde auch in den DE-OS 30 07 842 und 33 13 382 beschrieben, die ebenfalls Gas zum Vermischen nutzen. Gemäß der DE-OS 32 46 791 wird zum Umrühren von Flüssigkeiten unter Vakuum, insbesondere von viskosen Zuckerrohprodukten, Luft kontinuierlich oder impulsartig in den die Flüssigkeit enthaltenden Behälter eingeblasen, der in seiner Behälterwand oder seinem Innenraum eine oder mehrere Injektordüsen aufweist. Aber auch in dieser Anwendungsart werden Gasblasen in die Flüssigkeit eingebracht, die die Anwendung in Mikrotiterplatten verbieten.The above-mentioned possibility of a flowing gas Mixing is achieved when mixing liquids So far not used in microtiter plates because they are used in the the type described so far the following light-optical Measurement method would interfere with the introduction of gas bubbles. So was for example a technique in DE-OS 28 37 002 described in which a propeller air on a Liquid surface in the way that blows the liquid is mixed and gas bubbles are introduced into the liquid become. This introduction of gas bubbles was also in the DE-OS 30 07 842 and 33 13 382 described, which are also gas use for mixing. According to DE-OS 32 46 791 Stirring liquids under vacuum, especially from viscous raw sugar products, air continuously or in a pulse into the container containing the liquid blown into its container wall or its interior has one or more injector nozzles. But also in this Gas bubbles are introduced into the liquid, which prohibit the use in microtiter plates.

Aus den angeführten Gründen ist es mit den genannten Methoden nur schwer möglich, innerhalb weniger Sekunden eine Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu erreichen, die das in Mikrotiterplatten angewandte spezielle lichtoptische Meßverfahren nicht nachteilig beeinflussen.For the reasons given, it is with the methods mentioned difficult to achieve within a few seconds Mixing of liquids in microtiter plates achieve the special applied in microtiter plates Do not adversely affect light-optical measuring methods.

Übliche Mischungen mit Hilfe eines Magnetrührers können nicht durchgeführt werden, da der Lichtstrahl durch den Rührer gestört werden kann.Usual mixtures with the help of a magnetic stirrer cannot be carried out because the light beam through the stirrer can be disturbed.

Ziel der Erfindung ist die schnelle Durchmischung von Flüssigkeitsmengen in Mikrotiterplatten mit einer berührungsfreien Methode, welche sich insbesondere für die nachfolgende, auch zeitabhängige lichtoptische Konzentrationsbestimmung in den Flüssigkeiten eignet.The aim of the invention is the rapid mixing of Amounts of liquid in microtiter plates with a non - contact method, which is particularly suitable for the subsequent, also time-dependent, optical optics Determination of the concentration in the liquids is suitable.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren sowie eine Vorrichtung zur schnellen berührungsfreien Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu schaffen.The object of the invention is a novel method as well a device for quick contact-free mixing creating liquids in microtiter plates.

Überraschend wurde gefunden, daß ein periodisch intermittierend auf eine Flüssigkeitsmenge in einer Mikrotiterplattenkavität geblasener Gasstrom bei geeigneter Gasart, Frequenz, Stärke, Richtung und geeignetem Querschnitt ein schnelles Durchmischen der Flüssigkeit in der Mikrotiterplattenkavität verursacht, ohne daß es zur Blasenbildung in der Flüssigkeit kommt, die das nachfolgende lichtoptische Konzentrationsmeßverfahren stören könnte.Surprisingly, it was found that a periodic intermittent for a quantity of liquid in a microtiter plate cavity blown gas flow with suitable gas type, frequency, strength, Direction and suitable cross-section a quick mixing which causes liquid in the microtiter plate cavity, without the formation of bubbles in the liquid subsequent light-optical concentration measurement procedures interfere could.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gasstrom so auf die Flüssigkeitsoberfläche gelenkt, daß nur ein Teil der Flüssigkeitsoberfläche von dem Gasstrom getroffen wird. Dadurch wird die Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt wird verdrängt. Läßt der Gasdruck nach, kann die Flüssigkeit wieder zurückströmen. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorganges wird die Flüssigkeit in der Mikrotiterplatte in der gewünschten Art und Weise durchmischt.In the method according to the invention, a gas stream is thus generated the liquid surface directed that only part of the Liquid surface is hit by the gas stream. Thereby becomes the liquid that is exposed to the gas flow repressed. If the gas pressure drops, the liquid can again flow back. By repeating this process several times the liquid in the microtiter plate is in the desired Way mixed up.

Als Gasart sind alle Gase oder Gasgemische geeignet, die keine unerwünschten Wechselwirkungen mit der in der Mikrotiterplatte vorhandenen Flüssigkeit zeigen. Als besonders geeignet für wäßrige Lösungen erwies sich Luft, aber auch Stickstoff und Argon.Any gas or gas mixture is suitable as a gas type, but none undesirable interactions with that in the microtiter plate show existing liquid. As particularly suitable for aqueous solutions turned out to be air, but also nitrogen and Argon.

Die Frequenz des intermittierenden oder pulsierenden Gasstroms muß so klein sein, daß zumindest ein Teil der verdrängten Flüssigkeit zurückfließen kann. Dies ist abhängig von der Viskosität der Flüssigkeit. Die Frequenz muß andererseits so groß sein, daß das Mischen der Flüssigkeiten in den Mikrotiterplatten in einer für den Anwender ausreichend schnellen Zeit erfolgt und wird vorzugsweise zu etwa 6 Stößen je Sekunde gewählt. Allgemein kann man aber sagen, daß eine Frequenz von 1 bis 10 geeignet ist.The frequency of the intermittent or pulsating gas flow must be so small that at least part of the displaced Liquid can flow back. This depends on the Viscosity of the liquid. On the other hand, the frequency must be like this be great that mixing the liquids in the Microtiter plates in one sufficient for the user rapid time and is preferably about 6 bumps selected per second. In general, however, one can say that a Frequency from 1 to 10 is suitable.

Die Stärke des pulsierenden Gasstroms muß so gewählt werden, daß er stark genug ist, um einen Teil der Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt ist, zu verdrängen. Er darf aber nicht so stark sein, daß Flüssigkeit aus der einzelnen Mikrotiterplattenkavität herausgedrückt wird. Die Stärke muß weiterhin so gewählt werden, daß es auf Grund sich ausbildender Turbulenzen an der dem Gasstrahl ausgesetzten Flüssigkeitsoberfläche nicht zur Bildung von Gasblasen kommt.The strength of the pulsating gas flow must be chosen so that it is strong enough to remove some of the liquid Gas flow is exposed to displace. But he cannot be strong that liquid from the individual Microtiter plate cavity is pressed out. The strength must continue to be chosen so that it is based on training Turbulence on the gas jet exposed Liquid surface does not form gas bubbles.

Die Richtung des Gasstrahls ist vorzugsweise senkrecht auf die Flüssigkeitsoberfläche gerichtet. Diese Verfahrensweise führt zu einem pulsierenden Mischungsverhalten der Flüssigkeit. Es kann aber auch von Vorteil sein, den Gasstrahl schräg auf die Flüssigkeitsoberfläche zu richten. Bei geeigneter schräger Anordnung des pulsierenden Gasstrahls auf die Randzone der Flüssigkeitsoberfläche kann es zu kreisenden Bewegungen der Flüssigkeit kommen und eine Durchmischung erreicht werden. Der Winkel mit dem der Gasstrahl bei einer nicht senkrechten Anordnung auf die Flüssigkeitsoberfläche trifft, muß so gewählt werden, daß keine Flüssigkeit aus der einzelnen Mikrotiterplattenkavität durch den Gasstrom herausgerissen wird.The direction of the gas jet is preferably perpendicular to the Liquid surface directed. This procedure leads to a pulsating mixing behavior of the liquid. It but can also be advantageous to the gas jet at an angle Liquid surface. With a suitable slant Arrangement of the pulsating gas jet on the edge zone of the Liquid surface can cause circular movements of the Liquid come and a thorough mixing can be achieved. Of the Angle at which the gas jet at a non-vertical Arrangement that meets the liquid surface must be chosen in this way be that no liquid from the individual Microtiter plate cavity torn out by the gas flow becomes.

Der Gasstrom sollte so beschaffen sein, daß etwa 30-60% der Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom ausgesetzt werden. Es kann aber auch von Vorteil sein, mehr als 60% oder aber weniger als 30% der Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom auszusetzen. Wird der Querschnitt zu klein gewählt, kann es neben einer Verminderung der Mischgeschwindigkeit zu unerwünschter Blasenbildung kommen. Der Querschnitt des Gasstrahls soll vorzugsweise kreisförmig sein. Starke Abweichungen von dieser Kreisförmigkeit können ebenfalls zum Einschluß von Gasblasen in das Flüssigkeitsmedium führen.The gas flow should be such that about 30-60% of the Liquid surface are exposed to the gas flow. It can but also be advantageous, more than 60% or less than Expose 30% of the liquid surface to the gas flow. Becomes the cross section chosen too small, it can be next to one Reduction of mixing speed to undesirable Blistering come. The cross section of the gas jet should preferably circular. Strong deviations from this Circularity can also include gas bubbles in guide the liquid medium.

Legenden zu den Figuren:Legends for the figures:

Fig. 1 Schema der Mischvorrichtung für Mikrotiterplatten Fig. 1 scheme of the mixing device for microtiter plates

Fig. 2 Einfluß des Mischvorgangs auf die Extinktion einer Lösung von 10 µl Haemoglobinlösung, die mit 200 µl Puffer versetzt wurde, gemäß Beispiel 1.
Ordinate jeder einzelnen Kavität: 1.2-2.2 E bei 405 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 10-753 Sekunden (Zeit, nach Zugabe der Pufferlösung)
Die Kavitäten von Spalte A1 bis H1 ohne Verwendung der Mischeinrichtung.
Die Kavitäten von Spalte A2 bis H2 unter Verwendung der Mischeinrichtung.
Mischzeit: 2 Sekunden nach Zugabe der Pufferlösung. Fig. 2 Influence of the mixing process on the absorbance of a solution of 10 ul hemoglobin solution, which was mixed with 200 ul buffer, according to Example 1.
Ordinate of each individual cavity: 1.2-2.2 E at 405 nm abscissa of each individual cavity: 10-753 seconds (time after adding the buffer solution)
The cavities from column A1 to H1 without using the mixing device.
The cavities from column A2 to H2 using the mixing device.
Mixing time: 2 seconds after adding the buffer solution.

Fig. 3 Einfluß des Mischvorgangs auf die Geschwindigkeit der durch die Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase katalysierten Reaktion gemäß Beispiel 2.
Ordinate jeder einzelnen Kavität: 0.73-0.9 E bei 390 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 81-637 Sekunden. Die Kavitäten der Zeilen A1 bis A12, B1 bis B12 und C1 bis C12 unter Verwendung der Mischeinrichtung.
Die Kavitäten der Zeile D1 bis D12 waren leer.
Die Kavitäten der Zeilen E1 bis E12, F1 bis F12, G1 bis G12 und H1 bis H12 wurden nicht gemischt.
Gemischt wurde unmittelbar nach Zugabe der letzten Lösung durch den eingebauten automatischen Dosierer des Dynatechgerätes. Die Mischzeit betrug 7 Sekunden. Fig. 3 Influence of the mixing process on the rate of reaction catalyzed by the peptidyl prolyl cis / trans isomerase reaction according to Example 2.
Ordinate of each individual cavity: 0.73-0.9 E at 390 nm abscissa of each individual cavity: 81-637 seconds. The cavities of rows A1 to A12, B1 to B12 and C1 to C12 using the mixing device.
The cavities in rows D1 to D12 were empty.
The cavities of rows E1 to E12, F1 to F12, G1 to G12 and H1 to H12 were not mixed.
Mixing was carried out immediately after the last solution had been added by the built-in automatic dosing device of the Dynatech device. The mixing time was 7 seconds.

example 1

Um das Gas erfindungsgemäß auf die Flüssigkeitsoberfläche richten zu können, wurde die in Fig. 1 dargestellte Anordnung gewählt. Aus einer handelsüblichen Druckflasche mit Stickstoff wurde ein Gasstrom mit einem Druck von 5 bar über eine 1 m lange Schlauchleitung (d = 100 mm) zu einer Wälzschlauchpumpe geleitet. Der Pumpenschlauch 5 besitzt einen Innendurchmesser von 80 mm. Der Pumpenschlauch wurde dann direkt zu dem Gasverteiler 1 der in Fig. 1 dargestellten Mischeinrichtung geführt. Der Preßdruck des Pumpenschlauchs an die Pumpenrollbügel und die Fördergeschwindigkeit wurden so eingestellt, daß der Gasstrom stoßweise mit einer Frequenz von etwa 6 Gasstößen je Sekunde aus den 8 Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche auftreffen konnte.In order to be able to direct the gas onto the liquid surface according to the invention, the arrangement shown in FIG. 1 was chosen. A gas stream at a pressure of 5 bar was passed from a commercially available pressure bottle with nitrogen via a 1 m long hose line (d = 100 mm) to a roller hose pump. The pump hose 5 has an inner diameter of 80 mm. The pump hose was then fed directly to the gas distributor 1 of the mixing device shown in FIG. 1. The pressure of the pump hose against the pump roll bracket and the conveying speed were set in such a way that the gas flow could strike the liquid surface intermittently at a frequency of about 6 gas bursts per second from the 8 nozzles 2 .

Mit dieser Anordnung wurden mit den im weiteren beschriebenen Verfahrensweisen und Lösungen die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse erhalten. Folgende Lösungen wurden verwendet:
Pufferlösung: 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6
Stammlösung A: Die Stammlösung A ist eine Lösung von menschlichem Haemoglobin.The results shown in FIG. 2 were obtained with this arrangement using the procedures and solutions described below. The following solutions were used:
Buffer solution: 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6
Stock solution A: Stock solution A is a solution of human hemoglobin.

In 8 Kavitäten 4 einer Mikrotiterplatte 3 wurden 10 µl der Stammlösung A pipettiert. Unmittelbar vor dem Mischen wurden mit einer 8 Kanalpipette 200 µl der Pufferlösung in einem Schritt zu den vorgelegten 10 µl pipettiert. Anschließend wurden die Extinktionen dieser 8 Kavitäten über einen Zeitraum von 600 Sekunden in Intervallen von etwa 10 Sekunden bei 390 nm mit einem handelsüblichen Mikrotiterplattenreader bei 6°C gemessen.10 μl of stock solution A were pipetted into 8 cavities 4 of a microtiter plate 3 . Immediately before mixing, an 8-channel pipette was used to pipette 200 µl of the buffer solution in one step to the 10 µl. The extinctions of these 8 cavities were then measured over a period of 600 seconds at intervals of approximately 10 seconds at 390 nm using a commercially available microtiter plate reader at 6 ° C.

In einem anderen Meßansatz wurde zu Vergleichszwecken die oben angeführte Prozedur mit Ausnahme des Mischens wiederholt. Die in der Fig. 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen zwei Spalten einer Mikrotiterplatte mit den Kavitäten A1 bis H1 (Spalte 1) und A2 bis H2 (Spalte 2). Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 2 wurden unter Einbeziehen eines zwei Sekunden dauernden Mischschrittes erhalten. Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 1 wurden ohne Mischen erhalten. Als Zeit t=0 wurde der Zeitpunkt der Zugabe der Haemoglobin-Stammlösung benutzt.In another measurement approach, the above procedure was repeated with the exception of mixing for comparison purposes. The results summarized in FIG. 2 show two columns of a microtiter plate with the cavities A1 to H1 (column 1) and A2 to H2 (column 2). The absorbance timings in column 2 were obtained using a two-second mixing step. The absorbance timings in column 1 were obtained without mixing. The time of addition of the hemoglobin stock solution was used as time t = 0.

Die Endextinktionen der ungemischten Proben erreichen auch nach mehr als 10 Minuten nicht den exakten Endwert. Visuell lassen sich auch nach 20 Minuten noch Inhomogenitäten in den einzelnen Kavitäten beobachten. Alle gemischten Proben weisen nach der Mischzeit gleiche Endextinktionen auf.The final absorbances of the unmixed samples also reach after the exact final value for more than 10 minutes. Let it visually there are still inhomogeneities in the individual after 20 minutes Watch cavities. All mixed samples show according to the Mix time equal end text extinctions.

Example 2

Als Mischgas wurde Druckluft verwendet, die mittels eines handelsüblichen Laborradiallüfters hergestellt wurde. Die Fördermenge betrug 9 m³/h bei einer Druckhöhe von 450 mm Wassersäule. Entsprechend Fig. 1 wird die Druckluft über eine Schlauchzuführung 5 von 100 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 90 mm zu einem Gasverteiler 1 geführt.Compressed air was used as the mixed gas, which was produced using a commercially available laboratory radial fan. The delivery rate was 9 m ³ / h at a pressure head of 450 mm water column. According to FIG. 1, the compressed air is fed to a gas distributor 1 via a hose feed 5 of 100 cm in length with an inner diameter of 90 mm.

Die Taktfrequenz des im Gasverteiler befindlichen motorgetriebenen 12-Kanalventils ist über die Motorgeschwindigkeit steuerbar. Die vom Ventil ausgehende Druckluft wird über Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche der einzelnen Kavitäten 4 gelenkt. Die Düsen 2 waren 30 mm lang und wiesen einen kreisförmigen Querschnitt auf. Die Düsen 2 wiesen Durchmesser von 2 mm am verjüngten Ende und 5 mm an der Lufteintrittsöffnung auf.The cycle frequency of the motor-driven 12-channel valve located in the gas distributor can be controlled via the engine speed. The compressed air coming from the valve is directed via nozzles 2 onto the liquid surface of the individual cavities 4 . The nozzles 2 were 30 mm long and had a circular cross section. The nozzles 2 had a diameter of 2 mm at the tapered end and 5 mm at the air inlet opening.

Die Frequenz des Luftstroms je Einzeldüse wurde zu 3 Luftimpulsen je Sekunde eingestellt. Der Abstand der Düsen 2 der in Fig. 1 abgebildeten Kammer zur Mikrotiterplatte 3 betrug 5 mm.The frequency of the air flow per individual nozzle was set at 3 air pulses per second. The distance between the nozzles 2 of the chamber shown in FIG. 1 and the microtiter plate 3 was 5 mm.

Die nachfolgend beschriebene Messung wurde mit folgenden Lösungen vorgenommen:
Reaktionslösung A:
mg Chymotrypsin gelöst in 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6
Probelösung:
gleiche Konzentrationen von biologischen Rohhomogenaten, die Peptidyl Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität gegenüber dem Substrat Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilid aufwiesen
Reaktionslösung B:
mg/ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanild 0.035 m HEPES: Puffer Ph 7,6 µl DimethylsulfoxidThe measurement described below was carried out with the following solutions:
Reaction solution A:
mg chymotrypsin dissolved in 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6
Trial solution:
same concentrations of raw biological homogenates, the peptidyl prolyl cis / trans isomerase activity compared to the substrate Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide
Reaction solution B:
mg / ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanild 0.035 m HEPES: buffer Ph 7.6 µl dimethyl sulfoxide

Carrying out the measurement

Mit Hilfe einer automatischen Pipettierstation der Firma GILSON/USA wurden jeweils 10 µl der einzelnen Probe in jede einzelne Kavität pipettiert. Die Kavitäten D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11 und D12 wurden nicht mit Probenlösung versehen. Alle weiteren Meß- und Pipettiervorgänge wurden mit Hilfe eines programmierbaren kommerziellen Mikrotiter plattenreaders "MR 7000" der Firma Dynatech/USA mit den oben aufgeführten Lösungen, mit folgenden Einzelschritten vorgenommen:With the help of an automatic pipetting station from the company GILSON / USA added 10 µl of each sample to each single cavity pipetted. The cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11 and D12 were not mixed with sample solution Mistake. All other measuring and pipetting processes were carried out with Using a programmable commercial microtiter plate readers "MR 7000" from Dynatech / USA with the above solutions listed, with the following individual steps performed:

1. With the 8-fold pipetting, each 120 µl Pipette reaction solution A into each well. In the cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11 and D12 no reaction solution pipetted.
2. Within 7 seconds with the 8-fold pipetting automatically pipetted 20 µl substrate solution per cavity. In the cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11 and No substrate solution was pipetted into D12.
3. The microtiter plate is in the "waiting position" for 7 seconds. hazards.
4. During these 7 seconds the microtiter plate is in the mixed above.
5. Then the extinction of all the cavities Microtiter plate 70 times in intervals of approximately 9 seconds measured.

Die erhaltenen Extinktionsänderungen, deren Kurve einer Reaktion erster Ordnung entspricht, lassen sich graphisch darstellen. In Fig. 3 ist das Ergebnis einer solchen Messung abgebildet. Um die Wirkung der Mischeinrichtung einschätzen zu können, wurden nur die ersten drei Reihen in der angegebenen Weise gemischt. Das "Nicht mischen" wurde durch die Unterbrechung der entsprechenden Düsen erreicht.The extinction changes obtained, the curve of which corresponds to a first-order reaction, can be represented graphically. In Fig. 3, the result of such a measurement is illustrated. In order to be able to assess the effect of the mixing device, only the first three rows were mixed in the manner indicated. The "do not mix" was achieved by interrupting the corresponding nozzles.

Die Meßkurven lassen sich wie unter EP 0 360 029 A1 beschrieben, auswerten. Die entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten, die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Geschwindigkeitskonstanten gleicher Enzymkonzentrationen, mit und ohne Mischung, sind in Tab. 1 zusammengefaßt.The measurement curves can be as in EP 0 360 029 A1 described, evaluate. The corresponding Rate constants, the averages and the Standard deviations of the same rate constants Enzyme concentrations, with and without a mixture, are shown in Table 1 summarized.

Tabelle 1 Table 1

Einfluß des Mischvorganges auf die Geschwindigkeitskonstante (k) der Peptidyl Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität(a) Influence of the mixing process on the rate constant (k) of the peptidyl prolyl cis / trans isomerase activity (a)

Statistische Auswertung der in Fig. 3 abgebildeten Meßkurven Statistical evaluation of the measurement curves shown in FIG. 3

Claims

1. Method for non-contact mixing of Liquids in the wells of a microtiter plate, in which a gas stream with a cross-section that is smaller than that clear cross section of the respective cavity, with lower Frequency is blown intermittently into the cavity, such that a partial liquid in the cavity under the pressure of the impinging gas flow displaced bubble-free and by lowering the pressure for the backflow is released again.

2. The method of claim 1, wherein a frequency in Range from 1 to 10 Hz, preferably from 6 Hz is applied.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the Cross section of the gas flow 30 to 60% of the clear cross section the cavity.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, in which the Gas flow aligned perpendicular to the liquid surface is.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, in which the Gas flow aligned at an angle to the liquid surface and on a point directed away from the axis of the cavity becomes.

6. Device for mixing liquids in cavities of a microtiter plate, with a gas distributor ( 1 ) which has a plurality of gas nozzles ( 2 ) corresponding to the number of cavities ( 4 ) of the microtiter plate ( 3 ), each of which is directed onto one of the cavities ( 4 ) are aligned and the nozzle mouth have a smaller diameter than the diameter of the cavities ( 4 ), a compressed air source connected to the gas distributor ( 1 ) and a control assigned to the gas nozzles ( 2 ), with which a with a low clock frequency of 1 to 10 Hz intermittent Gas supply to the gas nozzles ( 2 ) can be controlled.