DE4241659C1 - New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis - Google Patents

New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis

Info

Publication number
DE4241659C1
DE4241659C1 DE19924241659 DE4241659A DE4241659C1 DE 4241659 C1 DE4241659 C1 DE 4241659C1 DE 19924241659 DE19924241659 DE 19924241659 DE 4241659 A DE4241659 A DE 4241659A DE 4241659 C1 DE4241659 C1 DE 4241659C1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
thrombin
amino acid
cdna
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE19924241659
Other languages
German (de)
Inventor
Christiane Dr Noeske-Jungblut
Wolf-Dieter Dr Schleuning
Alagon Alejandro
Possani Lourival
Peter Dr Donner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE19924241659 priority Critical patent/DE4241659C1/en
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Priority to DK94900764.5T priority patent/DK0677107T3/en
Priority to ES94900764T priority patent/ES2107790T3/en
Priority to RU95114530/13A priority patent/RU2183214C2/en
Priority to AU55603/94A priority patent/AU680643B2/en
Priority to CA002150909A priority patent/CA2150909A1/en
Priority to JP51365794A priority patent/JP3490444B2/en
Priority to PCT/DE1993/001172 priority patent/WO1994013807A1/en
Priority to EP94900764A priority patent/EP0677107B1/en
Priority to US08/448,438 priority patent/US5876971A/en
Priority to KR1019950702267A priority patent/KR100311883B1/en
Priority to DE59307091T priority patent/DE59307091D1/en
Priority to AT94900764T priority patent/ATE156519T1/en
Priority to HU9501626A priority patent/HU220301B/en
Application granted granted Critical
Publication of DE4241659C1 publication Critical patent/DE4241659C1/en
Priority to FI952712A priority patent/FI110669B/en
Priority to NO952215A priority patent/NO952215L/en
Priority to GR970402660T priority patent/GR3025015T3/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A protein which as an active protein has (a) a mol. wt. of 18000 +/- 3000 D, (b) an isoelectric point of pH 4.5-5.2, the protein being purified via a Superose 12 HR column and a CH-activated Sepharose column including coupled thrombin and being applied to a gel for isoelectric focusing in the range of pH 3-9 and (c) the N-terminal sequence of Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe. Also claimed is (i) a cDNA or DNA encoding a thrombin inhibitor with features (a)-(c) above or modifications thereof with one or two amino acid substitutions, insertions or deletions without impairing its function, (ii) a vector encoding the DNA of (i), (iii) a host cell transformed with the vector of (ii), and (iv) methods for the prodn. and purificn. of the protein. The protein is found in the saliva of Triatoma pallidipennis (Tpal.) from where it can be isolated. USE - The protein is used as pharmaceutically effective agent (claimed), i.e. as a thrombin inhibitor. It can be used in a medicament for the treatment of thrombosis, instable angina or arteriosclerosis.

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein, das ein Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern ist.The invention relates to a protein comprising a salivary thrombin inhibitor Protostomes is.

Stand der TechnikState of the art

Thrombin hat eine Schlüsselfunktion bei der Thrombusbildung in Blutgefäßen. Es katalysiert die Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin. Es führt zur Bildung von Blutgerinnseln. Weiterhin induziert es die Aggregation von Blutplättchen. Das Enzym ist in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, wie z. B. arteriel­ ler und venöser Thrombose oder Arteriosklerose, involviert.Thrombin has a key role in thrombus formation in blood vessels. It catalyzes the cleavage of fibrinogen to fibrin. It leads to the formation of Blood clots. Furthermore, it induces the aggregation of platelets. The enzyme is in the pathogenesis of various diseases, such. B. arterial liver and venous thrombosis or arteriosclerosis.

Deshalb ist der Einsatz eines Thrombininhibitors zur Therapie von Thrombosen erfolgversprechend. Die wichtigsten bisher bekannten Thrombininhibitoren sind Antithrombin III-Heparin und Hirudin. Antithrombin III ist ein im Plasma vorkommendes Protein mit einem Molekulargewicht von 58 kDa. Antithrombin III bindet zuerst an Heparin, das ein Polysaccharid ist. Dann bindet der Antithrombin III-Heparin-Komplex an Thrombin und inhibiert dieses Throm­ bin. Es entsteht ein sehr stabiler Komplex aus Thrombin und Antithrombin III und Antithrombin III wird von Thrombin gespalten. Neben Thrombin hemmt Antithrombin III auch andere Serinproteasen wie z. B. Faktor Xa (Pratt, C.W. und Church, F.C. (1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminars in Hematology 28: 3-9).Therefore, the use of a thrombin inhibitor for the therapy of thrombosis promising. The most important thrombin inhibitors known hitherto are antithrombin III heparin and hirudin. Antithrombin III is one in the plasma occurring protein with a molecular weight of 58 kDa. antithrombin III first binds to heparin, which is a polysaccharide. Then tie the Antithrombin III-heparin complex to thrombin and inhibits this throm am. The result is a very stable complex of thrombin and antithrombin III and antithrombin III is cleaved by thrombin. In addition to thrombin inhibits Antithrombin III also other serine proteases such. B. Factor Xa (Pratt, C.W. Church, F.C. (1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminars in Hematology 28: 3-9).

Aus dem Blutegel Hirudo medicinalis wurde das Protein Hirudin isoliert. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 7 kDa und bindet über ionische Wechselwirkung am Thrombin. Es ist spezifisch für Thrombin (Johnson, P.H. et al. (1989) "Biochemistry and Genetic engineering of hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 302-315). From the leech Hirudo medicinalis the protein hirudin was isolated. It has a molecular weight of about 7 kDa and binds via ionic interaction at thrombin. It is specific for thrombin (Johnson, P.H. et al. (1989) "Biochemistry and genetic engineering of hirudin", seminars in thrombosis and Hemostasis 15: 302-315).  

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Neben den zuvor erwähnten Thrombininhibitoren, die zum Stand der Technik zählen, sind weitere Inhibitoren notwendig, die einen anderen Wirkmechanis­ mus oder eine gesteigerte Aktivität besitzen.In addition to the previously mentioned thrombin inhibitors, the state of the art count, further inhibitors are necessary, which have a different mechanism of action or have an increased activity.

Die Erfindung liefert ein Protein, das als aktives ProteinThe invention provides a protein that acts as an active protein

  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt,a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da,
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
    wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird,    b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
    wherein the protein purified by a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9,
  • c) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: c) has an N-terminal sequence as follows:

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Protein, das als aktives ProteinFurthermore, the invention includes a protein that acts as an active protein

  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt,a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da,
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
    wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird,    b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
    wherein the protein purified by a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9,
  • c) (i) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oderc) (i) has an N-terminal sequence as follows: or
  • c) (ii) allelische Modifikationen der zuvor genannten N-terminalen Aminosäure- Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne da­ bei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen,
    oder    c) (ii) having allelic modifications of the aforementioned N-terminal amino acid sequence, wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein,
    or
  • c) (iii) posttranslationale Modifikationen der N-terminalen Sequenzen unter (i) und (ii) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.c) (iii) post-translational modifications of the N-terminal sequences under (i) and (ii), which does not significantly affect the activity of the active Affect protein.

Das erfindungsgemäße Protein kann natürlichen Ursprungs sein. Das Protein wird gewonnen, indem der Speichel gereinigt wird. Ebenfalls ist möglich, das Protein aus den Speicheldrüsen zu isolieren oder die das Protein synthetisie­ renden Zellen aus der Speicheldrüse zu nehmen und in Kultur zu halten. Die von dieser Zellkultur produzierten Überstände werden geerntet und aufgearbei­ tet. Der Zellüberstand wird gereinigt und das erfindungsgemäße Protein iso­ liert und angereichert. Alle Anreicherungsstufen der Isolierung und der Reini­ gung sind Teil der Erfindung. Bevorzugt sind die Anreicherungsstufen der Iso­ lierung und Reinigung, bei denen das erfindungsgemäße Protein zu pharma­ zeutischen Zwecken verwendet werden kann. So werden Reinigungen von 50% des Thrombininhibitors bezogen auf das Gesamtprotein erzielt, bevorzugt sind 85%, mehr bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 99% des Throm­ bininhibitors bezogen auf das Gesamtprotein.The protein of the invention may be of natural origin. The protein is obtained by cleaning the saliva. It is also possible that Isolate protein from the salivary glands or synthesize the protein cells from the salivary gland and keep them in culture. The Supernatants produced by this cell culture are harvested and processed tet. The cell supernatant is purified and the protein according to the invention iso liert and enriched. All stages of enrichment of the insulation and the cleaning tion are part of the invention. The enrichment stages of iso are preferred lation and purification, in which the protein of the invention to pharma can be used for civic purposes. How to get 50% cleans achieved thrombin inhibitor based on the total protein, preferably are 85%, more preferably 95%, and most preferably 99% of the thrombin bininhibitors based on the total protein.

Das Protein der Erfindung kann aus der Raubwanze Triatoma pallidipennis isoliert werden.The protein of the invention may be derived from the predator bug Triatoma pallidipennis be isolated.

Ebenso ist es möglich, das erfindungsgemäße Protein synthetisch herzustellen. Dazu zählt die Proteinsynthese nach J.M. SEWART and J.D. YOUNG, San Franzisco, 1969 and J. MEIENHOFER, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 und E. SCHODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965. Zu den synthetisch her­ gestellten Proteinen zählen auch die rekombinanten Proteine, die nach bekann­ ten Verfahren hergestellt werden. Je nach Wirtsorganismus kann das erfin­ dungsgemäße Protein glykosyliert oder, wenn es in Prokaryonten synthetisiert wird, unglykosyliert sein.It is likewise possible to synthesize the protein according to the invention. This includes protein synthesis according to J.M. SEWART and J.D. YOUNG, San Franzisco, 1969 and J. MEIENHOFER, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 and E. SCHODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965. Among the synthetically produced Proteins also include the recombinant proteins that are known th methods are produced. Depending on the host organism that can invent The protein according to the invention is glycosylated or, if synthesized in prokaryotes will be unglycosylated.

Die Funktion des Inhibitors ist in verschiedenen Testsystemen zu ermitteln. In den Beispielen 2 bis 4 und 9 sind gängige Testverfahren beschrieben.The function of the inhibitor is to be determined in different test systems. In Examples 2 to 4 and 9 common test methods are described.

Das erfindungsgemäße Protein ist in dem Speichel von dem Insekt Triatoma pallidipennis festzustellen. Dieses Protein wird von Zellen der Speicheldrüsen synthetisiert. Daher kann das Protein aus dem Speichel isoliert werden. Das erfindungsgemäße Protein ist nicht auf diese Herstellungsweise und Isolierung beschränkt. Vielmehr sind alle synthetisch hergestellten, erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren mitumfaßt, die sich in dem Speichel nachweisen und daraus isolieren lassen.The protein of the invention is in the saliva of the insect Triatoma to determine pallidipennis. This protein is made by cells of the salivary glands synthesized. Therefore, the protein can be isolated from the saliva. The  Protein of the invention is not limited to this method of preparation and isolation limited. Rather, all are synthetically produced, inventive Thrombininhibitoren included, which are detected in the saliva and isolate from it.

Das erfindungsgemäße Protein kann ein natürliches oder synthetisch herstellbares Protein, das ein Thrombininhibitor ist und aus dem Speichel von Triatoma pallidipennis isolierbar ist, sein.The protein of the invention may be natural or synthetic producible protein which is a thrombin inhibitor and from the saliva of Triatoma pallidipennis is isolable.

Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Protein, das ein rekombinan­ tes Protein ist. Dabei kann das Protein glykosyliert sein.Most preferred is a protein of the invention which is a recombinant protein is. The protein may be glycosylated.

Das erfindungsgemäße Protein umfaßt das reife Protein und ein Vorläufer- Protein, welches sich aus einer "Signal-Sequence" (Signal-Sequenz) und der Sequenz des reifen Proteins zusammensetzt. Dabei geht die "Signal-Sequenz" der Sequenz des reifen Proteins voraus. Das reife Protein beginnt mit der zu­ vor genannten N-terminalen Sequenz. Die "Signal-Sequenz" ist für die Durch­ dringung des endoplasmatischen Retikulums erforderlich.The protein of the invention comprises the mature protein and a precursor Protein, which consists of a "signal sequence" (signal sequence) and the Sequence of the mature protein composed. It goes the "signal sequence" preceded by the sequence of the mature protein. The mature protein begins with the before said N-terminal sequence. The "signal sequence" is for through penetration of the endoplasmic reticulum.

Es ist möglich Bindungsmoleküle, Einzelketten-Proteine (Single Chain Proteins), Antikörper oder Fragmente der Antikörper, die Domänen auf dem reifen, erfindungsgemäßen Protein spezifisch erkennen, herzustellen. Wenn das gereinigte erfindungsgemäße Protein vorliegt, ist es für den Fachmann leicht möglich, monoklonale Antikörper herzustellen. Dabei wird die bekannte Methode von Koehler und Milstein und deren Weiterführungen angewendet. Dabei wird im einzelnen in konventioneller Methode eine Maus mit dem gerei­ nigten Protein mehrfach immunisiert, die Milzzellen entnommen und mit geeig­ neten Tumorzellen fusioniert. Die Hybride werden anschließend selektioniert.It is possible to use binding molecules, single-chain proteins, Antibodies or fragments of the antibodies, the domains on the mature, specifically recognize protein of the invention. If that If the purified protein according to the invention is present, it is easy for the person skilled in the art possible to produce monoclonal antibodies. This is the well-known Method used by Koehler and Milstein and their continuations. In detail, a mouse is used in the conventional method Immunized protein several times, the spleen cells removed and with appro- Neten tumor cells fused. The hybrids are then selected.

Das Protein der Erfindung kann aus dem Speichel der Raubwanze Triatoma pallidipennis isoliert werden. Die Reinigung erfolgt durch eine Gelfiltration und eine anschließende Affinitätschromatographie an Thrombin-Sepharose (siehe Beispiel 1). Das Protein hat die zuvor beschriebene N-terminale Aminosäure- Sequenz. Es hat ein Molekulargewicht von ca. 18000±3000 Da. Der isoelektrische Punkt liegt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2, wenn die im Beispiel 8 beschriebene Methode angewendet wird. The protein of the invention may be derived from the saliva of the predator bug Triatoma pallidipennis be isolated. The purification is carried out by a gel filtration and a subsequent affinity chromatography on thrombin-Sepharose (see Example 1). The protein has the previously described N-terminal amino acid Sequence. It has a molecular weight of about 18000 ± 3000 Da. The isoelectric point is in the range of pH 4.5 to 5.2, when in Example 8 method described is applied.  

Das Protein der Erfindung hemmt die Wirkung von Thrombin bei der Blutgerin­ nung und bei der Aktivierung von Plättchen und im amidolytischen Test. Die Test-Systeme sind in den Beispielen 2, 3, 4 und 9 beschrieben. Das Protein hemmt die Gerinnung in einer Konzentration von 8 nmol/l bei einer Thrombin­ konzentration von 1,27 nmol/l. Es hemmt die Thrombin-induzierte Plättchen- Aggregation zu 100% in einer Konzentration von 15 ng/ml. Diese Konzentra­ tion entspricht bei einer eingesetzten Thrombinkonzentration von 0,06 IU/ml = 0,812 pmol/ml (IU = Internationale Einheiten) einem molaren Verhältnis von Thrombin zum Protein der Erfindung von etwa 1 : 1. Dagegen hemmt das Protein der Erfindung die Aktivität von Thrombin im amidolytischen Test bei ei­ nem Verhältnis von Thrombin zum Protein der Erfindung von 1 : 87 nur zu etwa 50%. Das Protein der Erfindung verlängert in einer Konzentration von 35 nmol/l die Thrombin-Zeit (1 IU/ml) um das 5fache.The protein of the invention inhibits the action of thrombin on the blood clot tion and in the activation of platelets and in the amidolytic test. The Test systems are described in Examples 2, 3, 4 and 9. The protein Inhibits coagulation in a concentration of 8 nmol / l in a thrombin concentration of 1.27 nmol / l. It inhibits the thrombin-induced platelet 100% aggregation at a concentration of 15 ng / ml. This concentra tion corresponds to a thrombin concentration of 0.06 IU / ml = 0.812 pmol / ml (IU = International Units) a molar ratio of Thrombin to the protein of the invention of about 1: 1 Protein of the invention, the activity of thrombin in the amidolytic test at ei The ratio of thrombin to protein of the invention of 1:87 is only about 50%. The protein of the invention prolongs at a concentration of 35 nmol / l the thrombin time (1 IU / ml) by 5 times.

Das Protein der Erfindung ist spezifisch für Thrombin. Andere Serinproteasen (z. B. Faktor Xa oder Trypsin) werden auch bei einem 40fachen Überschuß nicht nachweislich gehemmt (s. Beispiel 7).The protein of the invention is specific for thrombin. Other serine proteases (eg, factor Xa or trypsin) will also be at a 40-fold excess not demonstrably inhibited (see Example 7).

cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit einem N-terminalen Ende kodiert,
wobei der ThrombininhibitorcDNA or DNA encoding a thrombin inhibitor having an N-terminal end,
wherein the thrombin inhibitor

  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt,a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da,
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
    wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird, und
    • aa) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA die folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: oder
    • bb) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter aa) kodiert,
      worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.
      cDNA oder DNA nach Anspruch 5,
    • cc) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: oder
    • dd) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter cc) kodiert,
      worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.
    b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
    wherein the protein purified via a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9, and
    • aa) wherein the cDNA or DNA encoding the N-terminal end encodes the following amino acid sequence: or
    • bb) where the cDNA or DNA encodes allelic modifications of the amino acid sequence under aa),
      wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein.
      cDNA or DNA according to claim 5,
    • cc) where the N-terminal end coding cDNA or DNA encodes the following amino acid sequence: or
    • dd) where the cDNA or DNA encodes allelic modifications of the amino acid sequence under cc),
      wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein.

Unter N-terminaler Aminosäure-Sequenz ist diesmal die zuvor beschriebene Sequenz von 21 Aminosäuren zu verstehen.Under N-terminal amino acid sequence this time is the one described above Sequence of 21 amino acids to understand.

Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen passenden Enhancer enthält. Ebenfalls ist auch noch eine "Signal-Sequenz" umfaßt. Vektoren sind ausführlich in den europäischen Publikationen EP 0480651, EP 0462632 und EP 0173177 beschrieben.Another part of the invention is a vector which is a cDNA according to the invention or DNA, furthermore a suitable promoter and optionally one contains appropriate enhancer. There is also a "signal sequence" includes. Vectors are detailed in European publications EP 0480651, EP 0462632 and EP 0173177.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist.Another embodiment of the invention is a eukaryotic or prokaryotic host cell containing a vector of the invention is transformed.

Die zuvor genannten allelischen Modifikationen umfassen Änderungen in der Sequenz der Aminosäuren und der Nukleotide. Sie umfassen daher Verände­ rungen im Genotyp und gegebenenfalls im Phänotyp. Wenigstens eine Aminosäure oder ein Nukleotid kann substituiert, deletiert oder insertiert (in der Sequenz eingeschoben) sein.The aforementioned allelic modifications include changes in the art Sequence of amino acids and nucleotides. They therefore include changes in the genotype and, if appropriate, in the phenotype. At least one  Amino acid or a nucleotide can be substituted, deleted or inserted (in the Sequence inserted).

Die meisten Deletionen, Insertionen und Substituierungen scheinen keine durchgreifende Änderung in der Charakteristik des Proteins der Erfindung zur Folge zu haben. Da es schwer ist, den genauen Effekt einer Substituierung, einer Deletion oder einer Insertion im voraus anzugeben, muß die Funktion des veränderten Proteins mit der Funktion des erfindungsgemäßen Proteins ver­ glichen werden. Die hierfür zu verwendenden Methoden sind zum Beispiel in den Beispielen 2 bis 4 und 9 angegeben. Als Standard dient das Protein, das nach Beispiel 1 gereinigt wird, und auch die Reinigungsmethode des Beispiels 1 für das Vergleichsprotein.Most deletions, insertions and substitutions do not seem to be sweeping change in the characteristics of the protein of the invention To have consequences. Since it is hard to know the exact effect of a substitution, deletion or insertion in advance, the function of the altered protein with the function of the protein according to the invention ver be the same. The methods to be used for this purpose are, for example, in Examples 2 to 4 and 9 indicated. The standard protein is the is purified according to Example 1, and also the cleaning method of Example 1 for the comparison protein.

Der genetische Code ist degeneriert, das bedeutet, daß die meisten Amino­ säuren von mehr als einem Codon aus drei Nukleotiden kodiert werden. Da­ her führen einige allelische Modifikationen auf der Ebene der Nukleotide nicht zu einer Änderung der Aminosäure-Sequenz. Daher ereignen sich allelische Modifikationen vornehmlich auf der Ebene der DNA und können sich sekundär auf die Aminosäure-Sequenz auswirken.The genetic code is degenerate, which means that most amino acids of more than one codon of three nucleotides are encoded. because Heretofore, some allelic modifications at the nucleotide level do not result to a change in the amino acid sequence. Therefore allelic happen Modifications primarily at the level of DNA and can become secondary affect the amino acid sequence.

Die cDNA- oder DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Protein kodiert, kann gemäß konventioneller Techniken modifiziert werden, um Varianten des erfin­ dungsgemäßen Proteins herzustellen, die im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das beschriebene und charakterisierte Protein der Erfindung besitzen. Dabei wird die Aktivität so gemessen, wie es in den Beispielen 2 bis 4 und 9 be­ schrieben ist.The cDNA or DNA sequence encoding the protein of the invention can modified according to conventional techniques to variants of the inventions To produce the protein according to the invention, which has substantially the same activity as the described and characterized protein of the invention possess. The activity is measured as described in Examples 2 to 4 and 9 be is written.

Aminosäuren können wie in der Tabelle 1 dargestellt substituiert werden, ohne dabei die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinflussen. In jedem einzel­ nen Fall ist durch den Aktivitätstest zu entscheiden, welchen Einfluß die Verän­ derung auf die Funktion des Proteins hat.
Amino acids can be substituted as shown in Table 1 without significantly affecting the function of the protein. In each individual case, the activity test is to decide what influence the change has on the function of the protein.

Übliche Substituierung von Aminosäuren in einem ProteinUsual substitution of amino acids in a protein Ursprüngliche AminosäureOriginal amino acid Beispielsweise vorgenommene SubstituierungFor example, made substitution AlaAla Gly, SerGly, Ser Argbad LysLys AsnAsn Gln, HisGln, His AspAsp GluGlu CysCys SerSer GlnGln AsnAsn GluGlu AspAsp GlyGly Ala, ProAla, Pro HisHis Asn, GlnAsn, Gln IleIle Leu, ValLeu, Val LeuLeu Ile, ValIle, Val LysLys Arg, Gln, GluArg, Gln, Glu Metmead Leu, Tyr, IleLeu, Tyr, Ile PhePhe Met, Leu, TyrMet, Leu, Tyr SerSer ThrThr ThrThr SerSer TrpTrp TyrTyr TyrTyr Trp, PheTrp, Phe ValVal Ile, LeuIle, Leu

Die Funktionen oder die immunologische Identität werden wesentlich verän­ dert, wenn Substituenten gewählt werden, die weniger konservative als die in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuren sind. Derartige wesentlichen Veränderun­ gen lassen sich durch Substituierungen mit Aminosäuren erzielen, die sich mehr in ihrer Struktur und in den funktionellen Gruppen unterscheiden. We­ sentliche Veränderungen wirken sich dahingehend aus, daß die dreidimensio­ nale Struktur verändert wird und/oder daß zum Beispiel die Faltblatt-Struktur oder die helikale Struktur beeinflußt wird. Auch Wechselwirkungen der La­ dungen und der hydrophoben Ketten sind bei den Veränderungen zu beachten.The functions or the immunological identity will change significantly that is, when substituents are chosen, the less conservative than those in Table 1 shown amino acids. Such substantial change can be achieved by substitutions with amino acids that are distinguish more in their structure and functional groups. We Significant changes have the effect that the dreidimensio nale structure is changed and / or that, for example, the leaflet structure or the helical structure is affected. Also interactions of La and the hydrophobic chains are to be considered in the changes.

Die Mutationen werden durch die Homologie zweier zum Vergleich anstehender Proteine definiert. Der Ausdruck Homologie umfaßt ähnliche Aminosäuren (zum Beispiel Tabelle 1) und Lücken in den Sequenzen der Aminosäuren (Homologie = similarity). Das erfindungsgemäße Protein hat eine Aminosäure- Sequenz, die eine Homologie von wenigstens 80%, bevorzugt 90%, mehr be­ vorzugt 95% und am meisten bevorzugt 98% der erfindungsgemäßen Struktur besitzt, wie sie durch das N-terminale Ende definiert ist und wie sie weiterhin nach der Reinigung gemäß Beispiel 1 erhalten wird.The mutations become due to the homology of two pending for comparison Defined proteins. The term homology includes similar amino acids (For example, Table 1) and gaps in the sequences of the amino acids (Homology = similarity). The protein according to the invention has an amino acid  Sequence having a homology of at least 80%, preferably 90%, more be preferably 95% and most preferably 98% of the structure according to the invention owns, as defined by the N-terminal end and how it continues obtained after the purification according to Example 1.

Wie zuvor erwähnt umfaßt die Erfindung auch Modifikationen der DNA oder cDNA. Diese modifizierten Sequenzen hybridisieren unter stringenten Bedin­ gungen mit der DNA, die das erfindungsgemäße Protein kodiert. Die cDNA oder DNA hat eine Nukleotid-Sequenz, die eine Homologie von wenigstens 70%, bevorzugt 82%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt von 95% mit der erfindungsgemäßen cDNA- oder DNA-Sequenz besitzt, die sich aus dem gereinigten Protein nach Beispiel 1 ergibt. Die Homologie kann durch eine Hybridisierung gemessen werden, wie sie in R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, 1982, dritte Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York be­ schrieben ist.As mentioned previously, the invention also includes modifications of the DNA or cDNA. These modified sequences hybridize under stringent condition tions with the DNA encoding the protein of the invention. The cDNA or DNA has a nucleotide sequence that has a homology of at least 70%, preferably 82%, more preferably 90% and most preferably 95% having the cDNA or DNA sequence according to the invention, which consists of the purified protein of Example 1. The homology can be through a hybridization can be measured, as described in R. KNIPPERS, Molecular Genetics, 1982, third edition, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York be is written.

Unter den zuvor erwähnten posttranslationalen Modifikationen versteht man Veränderungen, die während oder nach der Translation auftreten. Hierzu zählen die Glykosylierung, die Ausbildung von Disulfid-Brücken, die chemische Modifikationen der Aminosäuren, so zum Beispiel die Sulfatierung, die im Zu­ sammenhang mit dem Hirudin beschrieben ist. (J.W. FENTON (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 265-268).The aforementioned post-translational modifications are understood Changes that occur during or after translation. For this include glycosylation, the formation of disulfide bridges, the chemical Modifications of the amino acids, such as the sulfation, in the Zu is described in connection with the hirudin. (J.W. FENTON (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 265-268).

Die Glykosylierung ist eine wesentliche Funktion des endoplasmatischen Retikulums und/oder des Golgi-Apparates. Die Sequenz und die Verästelung der Oligosaccharide wird in dem endoplasmatischen Retikulum gebildet und in dem Golgi-Apparat verändert. Die Oligosaccharide können N-verknüpfte Oligosaccharide (Asparagin-verknüpfte) oder O-verknüpfte Oligosaccharide (Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-verknüpfte) sein. Die Form der Glykosy­ lierung ist von dem produzierenden Zelltyp und von der Art abhängig, von der der entsprechende Zelltyp stammt. Das Ausmaß und die Art der Glykosylie­ rung kann durch Substanzen beeinflußt werden, wie es in der Europäischen Publikation EP 0 222 313 beschrieben ist. Die Variierung der Glykosylierung kann die Funktion des Proteins verändern.Glycosylation is an essential function of endoplasmic Reticulum and / or Golgi apparatus. The sequence and the branching the oligosaccharide is formed in the endoplasmic reticulum and in changed the Golgi apparatus. The oligosaccharides can be N-linked Oligosaccharides (asparagine-linked) or O-linked oligosaccharides (Serine, threonine or hydroxylysine-linked). The shape of the glycosy lation is dependent on the producing cell type and the species from which the corresponding cell type is derived. The extent and nature of glycosylia tion can be influenced by substances such as those in the European Union Publication EP 0 222 313 is described. The variation of glycosylation can change the function of the protein.

Proteine bilden häufig kovalente Bindungen innerhalb der Ketten aus. Diese Disulfid-Brücken werden zwischen zwei Cysteinen hergestellt. Dabei wird das Protein spezifisch gefaltet. Die Disulfid-Brücken stabilisieren die dreidimensio­ nale Struktur der Proteine.Proteins often form covalent bonds within the chains. These Disulfide bridges are made between two cysteines. This is the  Protein specifically folded. The disulfide bridges stabilize the dreidimensio nale structure of the proteins.

Weiterhin können die Aminosäuren so verändert werden, wie es in der inter­ nationalen Publikation WO 91/10684 beschrieben ist. Ebenfalls kann das Protein sulfatiert sein. Diese Veränderung ist im Zusammenhang mit Hirudin beschrieben.Furthermore, the amino acids can be changed as it is in the inter National Publication WO 91/10684. Likewise that Protein be sulfated. This change is related to hirudin described.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungs­ gemäßen Proteins mit den folgenden Schritten:
Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA enthält, und
Isolieren und Reinigen des Proteins.The invention further comprises a process for the preparation of a protein according to the invention, comprising the following steps:
Culturing a host cell transformed with a vector containing a cDNA or DNA of the invention, and
Isolate and purify the protein.

Das Protein wird bevorzugt gemäß Beispiel 1 gereinigt. Jedoch sind auch an­ dere Isolierungs- und Reinigungs-Methoden möglich:
Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, ed. Murray P. DEUTSCHER, Academic Press, 1990;
Protein Purification Application - A Practical Approach, ed. E.L.V. HARRIS and S. ANGEL, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Ropert SCOPES, Springer- Verlag 1982; and
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applica­ tions, ed. H.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.The protein is preferably purified according to Example 1. However, other methods of isolation and purification are also possible:
Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, ed. Murray P. GERMAN, Academic Press, 1990;
Protein Purification Application - A Practical Approach, ed. ELV HARRIS and S. ANGEL, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Ropert SCOPES, Springer-Verlag 1982; and
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. H.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.

Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Proteins kann dazu ver­ wendet werden, die entsprechende DNA- oder cDNA-Sequenz in einer Gen- Bank (Gen Library) zu ermitteln. Dadurch lassen sich auch homologe Se­ quenzen ermitteln, die ähnliche inhibitorische Funktionen haben können. Solche Sequenzen lassen sich routinemäßig herstellen und auffinden, zum Beispiel durch DNA-Synthetisierer (DNA Synthesizers) und durch eine Suche in einer Gen-Bank. Siehe internationale Publikation WO 90/07861 vom 26. Juli 1990.The amino acid sequence of the protein according to the invention can ver be used, the corresponding DNA or cDNA sequence in a gene Determine Bank (Gen Library). This also allows homologous Se determine which may have similar inhibitory functions. Such sequences can be routinely produced and found, for Example by DNA Synthesizers (DNA Synthesizers) and by a search in a gene bank. See international publication WO 90/07861 of 26th July 1990th

Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung eines erfindungs­ gemäßen Proteins, wobei das Protein isoliert, über wenigstens eine Säule ge­ reinigt und anschließend eingeengt wird. Bevorzugt sind Chromatographie- Säulen oder Adsorptionschromatographie-Säulen.The invention also includes a method for purifying a fiction, protein, wherein the protein is isolated via at least one column ge  cleans and then concentrated. Preference is given to chromatography Columns or adsorption chromatography columns.

Die Erfindung umfaßt darüber hinaus ein Verfahren zur Reinigung von einem erfindungsgemäßen Protein, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten be­ steht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und
erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.The invention further comprises a process for the purification of a protein according to the invention, the process consisting of the following steps:
Apply the saliva to a "Superose 12 HR column" and elute and
reapplication on a CH-activated Sepharose column to which thrombin was previously coupled and elution.

Die Reinigung ist ausführlich im Beispiel 1 beschrieben.The purification is described in detail in Example 1.

Verwendung als ArzneimittelUse as a medicine

Die Proteine gemäß der Erfindung besitzen pharmakologische Effekte und sind deshalb als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar. Das Protein kann als ein Arzneimittel eingesetzt werden. Die Erfindung läßt sich bei einer pharmazeutischen Zusammensetzung anwenden, die ein erfindungsgemäßes Protein enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Verbindungen und Trägern. Das Medikament kann als eine pharmazeutische Zusammensetzung eingesetzt werden, die ein pharmazeu­ tisch aktives, erfindungsgemäßes Protein und ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.The proteins according to the invention have pharmacological effects and are therefore useful as pharmaceutical agents. The protein can be considered as a drug can be used. The invention can be at a apply pharmaceutical composition which is an inventive Contains protein in the presence of pharmaceutically acceptable and acceptable compounds and carriers. The drug can act as one be used pharmaceutical composition containing a pharmazeu active protein of the invention and a pharmaceutically acceptable Salt or a pharmaceutically acceptable carrier.

Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Proteine mit dem N-terminalen EndeIn particular, the proteins of the invention with the N-terminal The End

eine Inhibierung der Thrombinaktivität.an inhibition of thrombin activity.

Die Inhibierung der Thrombinaktivität kann im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Blutplättchen-Aggregationstest (siehe Beispiel 3) und im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und durch Messen der Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9) nach­ gewiesen werden. Die Messung der Thrombin-Zeit ist das bevorzugte Test­ system.The inhibition of thrombin activity can be determined in the coagulation test (see Example 2), in the platelet aggregation test (see Example 3) and in the amidolytic assay  (see Example 4) and by measuring the thrombin time (see Example 9) be pointed. The measurement of thrombin time is the preferred test system.

Die N-terminal definierten, erfindungsgemäßen Proteine zeigen eine Verlänge­ rung der Thrombinzeit bei Konzentrationen von 10 bis 60 nmol/l (Thrombinkonzentration 1 IU/ml). Bei einer Konzentration von 58 nmol/l er­ folgt eine 9fache Verlängerung. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit ist das erfindungsgemäße Protein in Konzentrationen von 10 bis 200 nmol/l einsetzbar. Bei diesem Test wird ein Protein eingesetzt, das nach Beispiel 1 gereinigt worden ist. Dieses Protein ist das bevorzugte Protein der Erfindung (siehe Fig. 1).The proteins of the invention which are defined N-terminally show a prolongation of the thrombin time at concentrations of 10 to 60 nmol / l (thrombin concentration 1 IU / ml). At a concentration of 58 nmol / l it follows a 9-fold extension. Higher concentrations are applicable without disturbing the test system. Thus, the protein according to the invention can be used in concentrations of 10 to 200 nmol / l. In this test, a protein is used, which has been purified according to Example 1. This protein is the preferred protein of the invention (see Figure 1).

Die Versuchsergebnisse dieses in vitro Testes zeigen, daß die erfindungsge­ mäßen Proteine als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden können. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in vitro Testsystem auf ein in vivo System übertragen, da es sich bei dem Gerin­ nungstest um eine etablierte Versuchsanordnung handelt. (M. TALBOT (1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A New Prospect in the Treatment of Throm­ bosis" Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 293-301.) Die Proteine der Erfindung können deshalb zur Behandlung und Prävention von Thrombo­ sen, instabiler Angina oder Arteriosklerose oder zur Prävention eines Wieder­ verschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA (Angioplastie mit einem Ballon­ katheter) oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse dienen. Die Proteine der Erfindung können als ein antithrombotisches und/oder anti­ arteriosklerotisches Medikament bei Säugern, insbesondere Menschen, zur Behandlung von thrombotischen und/oder arteriosklerotischen Beschwerden eingesetzt werden. Diese können beim Reißen von arteriosklerotischen Aggregationen (Plaques), bei Zerstörung von Endothelgewebe, wie zum Bei­ spiel bei Sepsis, bei Transplantaten oder bei instabiler Angina, auftreten. Sie können ebenfalls verwendet werden, um erneute Verschlüsse nach der Be­ handlung von myokardialen Infarkten und/oder bei Fibrinolyse oder Angioplastie zu vermeiden. Dabei kann das Protein der Erfindung vor, bei und/oder nach der Einführung des Katheter verabreicht werden.The experimental results of this in vitro test show that the erfindungsge according to which proteins are used as medicaments or for medical treatment can be. These experimental results can be derived from the in vitro Test system transferred to an in vivo system, as it is in the Gerin tion test is an established experimental design. (M. Talbot (1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A New Prospect in the Treatment of Throm Bosis "Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 293-301.) The Proteins The invention therefore can be used for the treatment and prevention of thrombosis sen, unstable angina or atherosclerosis, or to prevent recurrence Closure of vessels after PTCA / PTA (angioplasty with a balloon catheter) or to prevent blood clotting during hemodialysis. The proteins of the invention may be used as an antithrombotic and / or anti atherosclerotic drug in mammals, especially humans, for Treatment of thrombotic and / or arteriosclerotic complaints be used. These can cause tearing of arteriosclerotic Aggregations (plaques), in destruction of endothelial tissue, such as for example play in sepsis, transplants or unstable angina. you can also be used to re-seal after loading treatment of myocardial infarcts and / or fibrinolysis or angioplasty to avoid. In this case, the protein of the invention before, at and / or after the introduction of the catheter.

Das erfindungsgemäße Protein ist geeignet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose oder zur Präven­ tion eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse verwendet zu werden.The protein of the invention is suitable for the preparation of a medicament for the treatment of  Thrombosis, unstable angina or arteriosclerosis or for prevention Reconnection of vessels to PTCA / PTA or to Prevention of blood clotting used in hemodialysis too become.

Das erfindungsgemäße Protein kann in einer pharmazeutischen Zusammen­ setzung zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose oder zur Prävention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder Throm­ bolyse oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse eingesetzt werden, welche Behandlung ein erfindungsgemäßes Protein und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger und Zusatz umfaßt.The protein of the invention may be in a pharmaceutical composition for the treatment of Thrombosis, unstable angina or arteriosclerosis or for prevention Reclosing vessels to PTCA / PTA or Throm bolysis or to prevent blood clotting during hemodialysis be used which treatment a protein according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier and additive.

Für diese therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von dem verwendeten Protein, von dem Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab.Different doses are suitable for this therapeutic effect. you For example, depending on the protein used, the host, the Type of administration and the type and severity of the treatment States off.

Ebenfalls sind zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn das Protein der Erfindung subkutan verabreicht wird. Bevorzugt ist die gezielte Injektion in den Teil des Körpers, in dem sich Thromben gebildet haben.Also, satisfactory results are expected when the protein of the Invention is administered subcutaneously. Preferred is the targeted injection in the Part of the body in which thrombi have formed.

Die erfindungsgemäßen Proteine können auf jedem üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere in Form von Injektionslösungen oder Suspensionen.The proteins of the invention can be administered by any conventional route be, especially in the form of injection solutions or suspensions.

Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die ein erfindungsgemäßes Protein und wenigstens einen pharma­ zeutisch verträglichen Träger oder Zusatz umfassen. Solche Zusammen­ setzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Dabei ist auf Remington′s Pharmaceutical Science, 15th ed Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.The present invention provides pharmaceutical compositions comprising a protein of the invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier or additive. Such compositions can be prepared by known methods. Attention is drawn to Remington's Pharmaceutical Science, 15 th ed Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980).

Die Versuchsergebnisse werden anhand der Figuren verdeutlicht, die im einzel­ nen folgendes zeigen:The test results are illustrated by the figures, which in the individual show the following:

Fig. 1 Verlängerung der Thrombin-Zeit bei Zugabe von erfindungsge­ mäßem Protein aus Triatoma pallidipennis. Fig. 1 Extension of the thrombin time with the addition of erfindungsge protein according to Triatoma pallidipennis.

Fig. 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen Test (Triatoma = Trombininhibitor aus Triatoma pallidipennis) FIG. 2 Inhibition of the thrombin activity in the amidolytic test (Triatoma = trombininhibitor from Triatoma pallidipennis)

Fig. 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Gerinnungstest. Fig. 3 Inhibition of thrombin activity in the coagulation test.

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Gewinnung des Speichels von Triatoma pallidipennis und Reinigung des Proteins der ErfindungObtaining the saliva of Triatoma pallidipennis and cleaning the Protein of the invention

Die Raubwanzen werden durch mechanische Stimulation ihrer Probszis zur Ab­ sonderung ihres Speichels angeregt. Der Speichel wird auf einer Glasplatte aufgefangen und mit einer silikonisierten, ausgezogenen Pasteurpipette ge­ sammelt.The robber bugs are by mechanical stimulation of their Probszis to Ab of their saliva. The saliva is on a glass plate collected and with a siliconized, extended Pasteur pipette ge collects.

Der Speichel wird gefriergetrocknet und in einer Konzentration von 2,5 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst. 2 ml dieser Lösung werden über eine "Superose 12 HR 16/50"-Säule (Pharmacia) in 10 mmol/l Tris/HCl, pH 7,4, 0,0001% "Pluronic F68" gelfiltriert. Die im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2) aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine CH-aktivierte Sepharose (Pharmacia), an die zuvor Thrombin nach den Angaben des Herstellers gekoppelt wurde, aufgetragen. Das Protein der Erfindung bindet an diese mit Thrombin ver­ sehenen Säule. Zunächst wird die Säule mit Tyrode-Puffer (ohne Serum­ albumin) gewaschen, dann wird erst mit 10 mmol/l Na-Acetat, pH 4,5, und dann mit 10 mmol/l Glycin, pH 2,5, eluiert. In den Eluaten wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Das 10 mmol/l Glycin Eluat enthält das gereinigte Protein der Erfindung. Es ist aktiv im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Plättchen- Aggregationstest (siehe Beispiel 3), im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und verlängert die Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9). Die Präparation enthält keine in der SDS-Gelelektrophorese detektierbare Verunreinigungen.The saliva is freeze-dried and in a concentration of 2.5 mg / ml in dissolved distilled water. 2 ml of this solution are passed over a "Superose 12 HR 16/50 "column (Pharmacia) in 10 mmol / l Tris / HCl, pH 7.4, 0.0001% "Pluronic F68" gel filtered. Those active in the coagulation test (see Example 2) Fractions are pooled and assayed for a CH-activated Sepharose (Pharmacia), to which previously thrombin was coupled according to the manufacturer's instructions, applied. The protein of the invention binds to these with thrombin seen pillar. First, the column with Tyrode buffer (without serum albumin), then with 10 mmol / l Na acetate, pH 4.5, and then eluted with 10 mmol / l glycine, pH 2.5. In the eluates, the pH is set to 7. The 10 mmol / l glycine eluate contains the purified protein of the Invention. It is active in the coagulation test (see Example 2), in the platelet Aggregation test (see Example 3), in the amidolytic assay (see Example 4) and prolongs the thrombin time (see Example 9). The preparation contains no impurities detectable in SDS gel electrophoresis.

Beispiel 2Example 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im GerinnungstestInhibition of thrombin activity in the coagulation test

In eine Mikrotiterplatte, die mit Rinderserumalbumin beschichtet ist (0,1% in 0,1 mol/l NaHCO3, pH 9,5), werden 80 µl 20 mmol/l HEPES, pH 7,4; 0,15 mmol/l NaCl; 20 µl 20 mmol/l CaCl2; 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (5-50 ng) und 20 µl Thrombin (0,03 IU = 0,03 Internationale Einheiten) pipettiert. Nach einer Inkubation 2 Minuten bei 37°C werden 100 µl Fibrinogen (5 mg/ml) zugegeben und 40 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird die Absorption bei 405 nm gemessen. 45 ng (=8 nmol/l) des gereinigten Proteins der Erfindung hemmen die Fibrinogenspaltung vollständig. Unter den gleichen Testbedingungen zeigt Hirudin die gleiche Wirksamkeit (vollständige Hemmung mit 8 nmol/l) (siehe Fig. 3). Into a microtiter plate coated with bovine serum albumin (0.1% in 0.1 M NaHCO 3 , pH 9.5) is added 80 μl of 20 mM HEPES, pH 7.4; 0.15 mmol / l NaCl; 20 μl 20 mmol / l CaCl 2 ; Pipette 100 μl of a diluted solution of the protein of the invention (5-50 ng) and 20 μl of thrombin (0.03 IU = 0.03 International Units). After incubation for 2 minutes at 37 ° C., 100 μl of fibrinogen (5 mg / ml) are added and incubated at 37 ° C. for 40 minutes. Subsequently, the absorbance at 405 nm is measured. 45 ng (= 8 nmol / l) of the purified protein of the invention completely inhibit fibrinogen cleavage. Under the same test conditions, hirudin exhibits the same efficacy (complete inhibition at 8 nmol / L) (see Figure 3).

Beispiel 3Example 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Blutplättchen-AggregationstestInhibition of thrombin activity in the platelet aggregation test

500 µl gelfiltrierte Blutplättchen (300 000/ml) werden mit dem Protein dieser Er­ findung (5-100 ng/ml) für 1 Minute bei 37°C inkubiert. Dann wird die Aggre­ gation mit Thrombin (0,06 IU/ml) induziert und die Aggregation in einem Aggre­ gometer aufgezeichnet. Messungen mit dem gereinigten Protein der Erfin­ dung zeigen, daß bei einer Konzentration von 15 ng/ml die Aggregation zu 100% gehemmt wird.500 μl of gel-filtered platelets (300,000 / ml) are mixed with the protein of this Er (5-100 ng / ml) for 1 minute at 37 ° C incubated. Then the aggre gation with thrombin (0.06 IU / ml) and aggregation in an aggre gometer recorded. Measurements with the purified protein of the invention show that at a concentration of 15 ng / ml the aggregation is 100% is inhibited.

Beispiel 4Example 4 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen TestInhibition of thrombin activity in the amidolytic assay

In einer Mikrotiterplatte werden 80 µl 100 mmol/l Tris/HCL, pH 7,4; 150 mmol/l NaCl und 0,03 IU (1,35 nmol/l) Thrombin und 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (32-630 ng) 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mit 100 µl (50 nmol) des Substrates S2238 (Kabi Vitrum) versetzt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37°C wird die Absorption bei 405 nm ge­ messen. 630 ng (117 nmol/l) hemmen die Aktivität des Thrombins zu ungefähr 50%. Hirudin hemmt in einer Konzentration von 6 nmol/l die Aktivität des Thrombins zu 85% (siehe Fig. 2).In a microtiter plate 80 ul 100 mmol / l Tris / HCl, pH 7.4; 150 mmol / l NaCl and 0.03 IU (1.35 nmol / l) thrombin and 100 μl of a dilute solution of the protein of the invention (32-630 ng) for 10 minutes at 37 ° C and then with 100 ul (50 nmol ) of substrate S2238 (Kabi Vitrum). After incubation for 30 minutes at 37 ° C, absorbance at 405 nm is measured. 630 ng (117 nmol / l) inhibit the activity of thrombin to approximately 50%. Hirudin inhibits the activity of thrombin to 85% at a concentration of 6 nmol / l (see FIG. 2).

Beispiel 5Example 5 Bestimmung der N-terminalen Aminosäure-SequenzDetermination of the N-terminal amino acid sequence

Das gereinigte Protein der Erfindung wurde in einem automatischen Amino­ säuresequenator nach den Instruktionen des Herstel­ lers sequenziert. Die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 21 (vom N-Terminus) ist: Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-Gl-u- Glu-Phe-Phe. "?" bedeutet, nicht mit vollständiger Sicherheit identifizierbar. Bei dieser Aminosäure handelt es sich mit einiger Wahrscheinlichkeit um Lysin.The purified protein of the invention was in an automatic amino Acid sequenator according to instructions of manufacturer lers sequenced. The sequence of amino acids 1 to 21 (from the N-terminus) Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe -? - Pro-Gl-u- Glu-Phe-Phe. "?" means not identifiable with complete certainty. at This amino acid is probably lysine.

Beispiel 6Example 6 SDS-Gelelektrophorese und Bestimmung des MolekulargewichtsSDS gel electrophoresis and determination of molecular weight

Das Protein der Erfindung wurde im reduzierten (Reduktion mit Dithiothreit) und im nicht reduzierten Zustand zusammen mit den Molekulargewichtsmarkern Phosporylase b (94 kDa), Albumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carbonic Anhydrase (30 kDa), Trypsin Inhibitor (20,1 kDa) und Lactalbumin (14,4 kDa) auf ein 12,5%iges SDS-Poly­ acrylamidgel aufgetragen und nach der Elektrophorese nach Laemmli (1970, Nature 227, 680-685) mit Coomassie brillant blue gefärbt. Im reduzierten Zu­ stand wandert das Protein der Erfindung während der Elektrophorese nur ge­ ringfügig oberhalb des Trypsin Inhibitors. Das entspricht einem Molekular­ gewicht von etwa 21 000 Da. Im nicht reduzierten Zustand wandert das Protein der Erfindung zwischen dem Trypsin Inhibitor und Lactalbumin, was ei­ nem Molekulargewicht von etwa 18 000 Da entspricht.The protein of the invention was reduced (reduced with dithiothreitol) and in the unreduced state together with the molecular weight markers Phosphorylase b (94 kDa), Albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), trypsin Inhibitor (20.1 kDa) and lactalbumin (14.4 kDa) on a 12.5% SDS poly  acrylamide gel and after the electrophoresis according to Laemmli (1970, Nature 227, 680-685) with Coomassie brilliant blue. In reduced to During the electrophoresis, the protein of the invention only migrates slightly above the trypsin inhibitor. That corresponds to a molecular weight of about 21,000 Da. In the unreduced state that wanders Protein of the invention between the trypsin inhibitor and lactalbumin, which is ei corresponds to a molecular weight of about 18,000 Da.

Beispiel 7Example 7 Das Protein der Erfindung hemmt nicht die Serinproteasen Faktor Xa und TrypsinThe protein of the invention does not inhibit the serine proteases Factor Xa and trypsin

Die Aktivität von Faktor Xa und von Trypsin werden mit dem folgenden Test gemessen. Zu 80 µl 50 mmol/l Tris/HCl pH 8,0, 227 mmol/l NaCl, werden für die Faktor Xa Bestimmung 0,004 IU (0.653 pmol) Faktor Xa und 0,5 µg (28 pmol) des Proteins der Erfindung und für die Tryp­ sin-Bestimmung 0,004 IU (0,019 pmol) Trypsin und 0,016 µg (0.817 pmol) des Proteins der Erfindung gegeben und für 2 Minuten bei 37°C inku­ biert. Nach Zugabe von 0,05 µmol des Substrates S2222 (Kabi Vitrum) wird für 20 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend die Absorption bei 405 nm gemessen. Die Absorption dieser Ansätze ist genauso hoch wie die von An­ sätzen ohne das Protein der Erfindung, d. h. das Protein hemmt weder die Aktivität von Faktor Xa noch die von Trypsin.The activity of factor Xa and trypsin are tested by the following measured. To 80 ul 50 mmol / l Tris / HCl pH 8.0, 227 mmol / l NaCl, be for the factor Xa determination 0.004 IU (0.653 pmol) factor Xa and 0.5 μg (28 pmol) of the protein of the invention and for the Tryp determination of 0.004 IU (0.019 pmol) of trypsin and 0.016 μg (0.817 pmol) of the protein of the invention and incubated for 2 minutes at 37 ° C biert. After adding 0.05 μmol of the substrate S2222 (Kabi Vitrum) incubated for 20 minutes at 37 ° C and then the absorbance at 405 nm measured. The absorption of these approaches is as high as that of An without the protein of the invention, d. H. the protein does not inhibit the Activity of factor Xa nor that of trypsin.

Beispiel 8Example 8 Isoelektrische FokussierungIsoelectric focusing

Das Protein der Erfindung wird auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen und zusammen mit Standard­ proteinen (Calibration Kit pH 3 bis 10) fokussiert. Die Fokussie­ rungsstelle des Proteins der Erfindung lag zwischen der des Sojabohnen- Trypsininhibitors (I.P. = 4,55) und der von β-Lactoglobulin A (I.P. = 5,2).The protein of the invention is applied to a gel for isoelectric focusing in the Range of pH 3 to 9 and applied together with standard proteins (Calibration Kit pH 3 to 10). The focus ration point of the protein of the invention was between that of the soybean Trypsin inhibitors (I.P. = 4.55) and that of β-lactoglobulin A (I.P. = 5.2).

Beispiel 9Example 9 Verlängerung der Thrombin-ZeitExtension of thrombin time

Die Thrombin-Zeit mißt die Aktivität von exogenem Thrombin, das zum Test­ plasma zugesetzt wird. Zu 0,1 ml Plasma werden 50 µl Lösung des Proteins der Erfindung in verschiedenen Verdünnungen (6 bis 58 nmol/l) und 50 µl Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer mit pH 7,6 gegeben und 1 Minute bei 37°C in­ kubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml Thrombin-Lösung (3 IU/ml) wird die Zeit bis zum Gerinnungseintritt gemessen. Das Protein der Erfindung, das in einer Konzentration von 35 nmol/l vorliegt, verlängert die Gerinnungszeit im Vergleich zu einem Kontrollansatz um das 5fache.The thrombin time measures the activity of exogenous thrombin added to the test plasma. To 0.1 ml of plasma, 50 .mu.l of solution of the protein of the invention in various dilutions (6 to 58 nmol / l) and 50 .mu.l of pH 7.6 diethyl barbiturate acetate buffer are added and incubated for 1 minute at 37.degree. After addition of 0.1 ml of thrombin solution ( 3 IU / ml), the time to coagulation is measured. The protein of the invention, which is present at a concentration of 35 nmol / l, increases the clotting time by a factor of 5 compared to a control batch.

Wenn die Sequenz des N-terminalen Endes des erfindungsgemäßen Proteins bekannt ist, läßt sich eine korrespondierende Nukleotidsequenz ermitteln. (siehe WO 90/07861) Diese wird in einer PCR angereichert. (siehe US-Pa­ tent 4,800,159) Mit Hilfe der vermehrten Nukleotid-Sequenzen kann in einer Genbank, die aus mRNA von Speicheldrüsen der Raubwanze Triatoma pallidi­ pennis hergestellt worden ist, ein mit der Nukleotidsequenz hybridisierendes Gen ermittelt werden. (siehe R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, (1982) Stutt­ gart, New York, 3. Auflage). Die hybridisierte DNA wird so ermittelt, wie es in SANGER et al. Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74: 5463-5467 beschrieben ist.If the sequence of the N-terminal end of the protein according to the invention is known, a corresponding nucleotide sequence can be determined. (see WO 90/07861) This is enriched in a PCR. (See US Pat. No. 4,800,159) With the help of the increased nucleotide sequences can be determined in a gene bank, which has been prepared from mRNA of salivary glands of the predatory bug Triatoma pallidi pennis, a hybridizing gene with the nucleotide sequence. (See R. KNIPPERS, Molecular Genetics, (1982) Stuttgart, New York, 3rd Edition). The hybridized DNA is determined as described in SANGER et al. Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74: 5463-5467.

Liegt die DNA-Sequenz vor, so werden ein passender Promotor und gegebe­ nenfalls ein passender Enhancer mit der DNA-Sequenz verbunden, so daß ein brauchbarer Vektor vorliegt. (M. WIRTH, L. SCHUMACHER and H. HAUSER, in h.S. CONRADT (ed) Protein Glycosylation, Cellular Biotechical and Analytical Aspects Vol 15, 49-52, VCH publishers, Weinheim, 1991) Ebenfalls auch J. KATZSCHMAR et al. (1992) Gene 116: 281-284. Die Expression eines solchen Vektors ist je nach Konstruktion desselben in Prokaryonten oder Eu­ karyonten möglich. If the DNA sequence is present, then a suitable promoter and given if appropriate, a suitable enhancer connected to the DNA sequence, so that a usable vector is present. (M. WIRTH, L. SCHUMACHER and H. HAUSER, in h.S. CONRADT (ed) Protein Glycosylation, Cellular Biotechical and Analytical Aspects Vol 15, 49-52, VCH publishers, Weinheim, 1991) Also J. KATZSCHMAR et al. (1992) Gene 116: 281-284. The expression of a of such vector, depending on its construction, is in prokaryotes or Eu karyotes possible.  

Claims (15)

1. Ein Protein, das als aktives Protein
  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt,
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
1. A protein that acts as an active protein
  • a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da,
  • b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird,
  • c) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt:
wherein the protein purified by a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9,
  • c) has an N-terminal sequence as follows:
2. Ein Protein, das als aktives Protein
  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
2. A protein that acts as an active protein
  • a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da
  • b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird,
  • c) (i) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oder
  • c) (ii) allelische Modifikationen der zuvor genannten N-terminalen Aminosäure- Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne da­ bei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
  • c) (iii) posttranslationale Modifikationen der N -terminalen Sequenzen unter (i) und (ii) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.
wherein the protein purified by a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9,
  • c) (i) has an N-terminal sequence as follows: or
  • c) (ii) having allelic modifications of the aforementioned N-terminal amino acid sequence, wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein, or
  • c) (iii) has post-translational modifications of the N-terminal sequences under (i) and (ii) that do not significantly affect the activity of the active protein.
3. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei das Protein ein rekombinantes Protein ist.3. A protein according to any one of claims 1 and 2, wherein the protein is a recombinant protein. 4. Ein Protein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Protein glykosyliert ist.4. A protein according to any one of the preceding claims, wherein the protein is glycosylated. 5. Eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit einem N-termina­ len Ende kodiert, wobei der Thrombininhibitor
  • a) ein Molekulargewicht von 18.000 Da±3.000 Da besitzt
  • b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2 besitzt,
5. A cDNA or DNA encoding a thrombin inhibitor having an N-terminal end, wherein the thrombin inhibitor
  • a) has a molecular weight of 18,000 Da ± 3,000 Da
  • b) has an isoelectric point in the range of pH 4.5 to 5.2,
wobei das Protein, welches über eine "Superose 12 HR-Säule" und eine "CH-aktivierte Sepharose-Säule" mit gekoppeltem Thrombin gereinigt ist, auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 aufgetragen wird, und
  • aa) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA die folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: oder
  • bb) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter aa) kodiert,
    worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.
wherein the protein purified via a "Superose 12 HR column" and a "CH activated Sepharose column" with coupled thrombin is applied to an isoelectric focusing gel in the range of pH 3 to 9, and
  • aa) wherein the cDNA or DNA encoding the N-terminal end encodes the following amino acid sequence: or
  • bb) where the cDNA or DNA encodes allelic modifications of the amino acid sequence under aa),
    wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein.
6. Eine cDNA oder DNA nach Anspruch 5,
  • cc) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: oder
  • dd) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter cc) kodiert,
    worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.
6. A cDNA or DNA according to claim 5,
  • cc) where the N-terminal end coding cDNA or DNA encodes the following amino acid sequence: or
  • dd) where the cDNA or DNA encodes allelic modifications of the amino acid sequence under cc),
    wherein one or two amino acids of the N-terminal amino acid sequence are substituted, deleted or inserted without significantly affecting the activity of the active protein.
7. Ein Vektor, der eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 5 und 6, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen passenden Enhancer enthält.7. A vector containing a cDNA or DNA according to any one of claims 5 and 6, furthermore, a suitable promoter and, if appropriate, a suitable promoter Contains enhancer. 8. Eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Vek­ tor nach Anspruch 7 transformiert ist.8. A eukaryotic or prokaryotic host cell infected with a vek Gate is transformed according to claim 7. 9. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit folgenden Schritten:
Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 5 und 6 enthält, und
Isolieren und Reinigen des Proteins.9. A process for producing a protein according to any one of claims 1 to 4, comprising the following steps:
Culturing a host cell transformed with a vector containing a cDNA or DNA according to any one of claims 5 and 6, and
Isolate and purify the protein. 10. Ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein isoliert, über wenigstens eine Säule gereinigt und an­ schließend eingeengt wird.A process for purifying a protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein is isolated, purified via at least one column and attached is then concentrated. 11. Ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und
erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.11. A method for purifying a protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the method consists of the following steps:
Apply the saliva to a "Superose 12 HR column" and elute and
reapplication on a CH-activated Sepharose column to which thrombin was previously coupled and elution. 12. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 9 bis 11 als pharma­ zeutischer Wirkstoff.12. A protein according to any one of claims 1 to 4 and 9 to 11 as pharma ceutical agent.
DE19924241659 1992-12-04 1992-12-04 New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis Expired - Lifetime DE4241659C1 (en)

Priority Applications (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19924241659 DE4241659C1 (en) 1992-12-04 1992-12-04 New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis
KR1019950702267A KR100311883B1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Thrombin inhibitors produced from saliva
RU95114530/13A RU2183214C2 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Natural and recombinant thrombin inhibitors, their preparing and use
AU55603/94A AU680643B2 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Clotting inhibitor made from protostomia saliva
CA002150909A CA2150909A1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Clotting inhibitor made from protostomia saliva
JP51365794A JP3490444B2 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Thrombin inhibitors from insect saliva.
PCT/DE1993/001172 WO1994013807A1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Clotting inhibitor made from protostomia saliva
EP94900764A EP0677107B1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Clotting inhibitor made from protostomia saliva
DK94900764.5T DK0677107T3 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Thrombin inhibitor from protostomy saliva
ES94900764T ES2107790T3 (en) 1992-12-04 1993-12-03 THROMBIN INHIBITOR FROM SALIVA OF PROTOSTOMIES.
DE59307091T DE59307091D1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 THROMBINE INHIBITOR FROM SPIVEL FROM PROTOSTOMERS
AT94900764T ATE156519T1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 THROMBIN INHIBITOR FROM SALIVA OF PROTOSTOMIES
HU9501626A HU220301B (en) 1992-12-04 1993-12-03 Clotting inhibitor made from protostomia saliva
US08/448,438 US5876971A (en) 1992-12-04 1993-12-03 Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia
FI952712A FI110669B (en) 1992-12-04 1995-06-02 Methods for making thrombin inhibitors that can be isolated from nature or synthesized
NO952215A NO952215L (en) 1992-12-04 1995-06-02 Thrombin inhibitor made from saliva from protostomia
GR970402660T GR3025015T3 (en) 1992-12-04 1997-10-14 Clotting inhibitor made from protostomia saliva.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19924241659 DE4241659C1 (en) 1992-12-04 1992-12-04 New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4241659C1 true DE4241659C1 (en) 1994-05-19

Family

ID=6474923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19924241659 Expired - Lifetime DE4241659C1 (en) 1992-12-04 1992-12-04 New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4241659C1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69333724T2 (en) HYBRID HUMAN-PIGISH FACTOR VIII
DE69736068T2 (en) FACTOR VIII FROM THE PIG AND HYBRID THEREOF
JP3051995B2 (en) Oxidation-resistant thrombomodulin analogs
DE60019122T2 (en) CHANGED FACTOR VIII
US5563123A (en) Chimeric proteins
EP0833897A2 (en) Prothrombin derivatives
US20110212900A1 (en) Method for prophylactic and/or therapeutic treatment of pain associated with hematopoietic cell transplantation
US5583111A (en) Thrombin inhibitors
EP0677107B1 (en) Clotting inhibitor made from protostomia saliva
DE3751218T2 (en) Methods and therapeutic preparations for the treatment of coagulation disorders.
AT409822B (en) USE OF ACTIVATED PROTEIN C FOR PRODUCING A PHARMACEUTICAL PREPARATION
EP0705901A2 (en) Method of separating recombinant pro-factor IX from recombinant factor IX
DE4241659C1 (en) New thrombin-inhibiting protein - used in treatment of thrombosis, angina and arteriosclerosis
DE4304731A1 (en) Thrombin inhibitor from the saliva of protostomes
US5204321A (en) Heparin neutralization with platelet factor 4
EP0239644A1 (en) Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity
DE4340798A1 (en) New thrombin inhibitory proteins from saliva of blood sucking insects
DE4328336A1 (en) Thrombin inhibitor from the saliva of protostomes
EP0712934A2 (en) Proteins with fibrinolytic and anticoagulant activity
EP0364942A2 (en) Isohirudine
CA2042399A1 (en) Isolated physiologically active human thrombomodulin polypeptide
EP0418647B1 (en) Method for purifying plasminogen activator inhibitor (PAI-2)
AT404359B (en) Purified multimerase
DE10163333B4 (en) Modified tridegins, their preparation, and their use as transglutaminase inhibitors and medicines and combination preparations containing them
AT404554B (en) Pharmaceutical preparation

Legal Events

Date Code Title Description
8100 Publication of the examined application without publication of unexamined application
D1 Grant (no unexamined application published) patent law 81
8364 No opposition during term of opposition
8330 Complete disclaimer