DE10163333B4 - Modified tridegins, their preparation, and their use as transglutaminase inhibitors and medicines and combination preparations containing them - Google Patents

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Abstract

Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Modifikation enthält, ausgewählt aus einer Substitution mindestens eines Cysteins durch eine andere Aminosäure und/oder einer Substitution mindestens einer der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch eine andere Aminosäure und/oder einer Deletion des N- und C-Terminus, wobei das verbleibende Polypeptid mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID Nr. 47) enthält und aus weniger als 40 Aminosäuren besteht, und/oder einer kovalenten Verknüpfung mit Polyethylenglykol.polypeptide according to SEQ ID NO: 1, characterized in that it has at least one modification contains selected from a substitution of at least one cysteine by another amino acid and / or a substitution of at least one of the following amino acids - Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 - through another amino acid and / or a deletion of the N- and C-terminus, with the remaining Polypeptide at least the amino acid sequence Contains DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID NO: 47) and consists of less than 40 amino acids, and / or a covalent linkage with Polyethylene glycol.

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Tridegine, Polypetide abgeleitet von SEQ ID No.1, wobei die Modifikation darin besteht, dass mindestens ein Cysteinrest und/oder eine der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch eine andere Aminosäure substituiert ist, und/oder N- und C-Terminus deletiert sind, wobei das verbleihende Polypeptid mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID Nr. 47) enthält und aus weniger als 40 Aminosäuren besteht, und/oder eine kovalente Verknüpfung mit Polyethylenglykol besteht gemäß Patentanspruch 1. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind neue Inhibitoren von Transglutaminasen, insbesondere des Faktors XIIIa, des terminalen Enzyms der Blutgerinnungs-Kaskade. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung dieser Inhibitoren, sowie deren Verwendung als Transglutaminase-Inhibitoren und diese enthaltende Arzneimittel und Kombinationspräparate gemäß den Patentansprüchen. The The present invention relates to modified tridegins, polypetides derived from SEQ ID No.1, the modification being that at least one cysteine residue and / or one of the following amino acids - Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 - through another amino acid is substituted, and / or N- and C-terminus are deleted, wherein the attributing polypeptide at least the amino acid sequence Contains DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID NO: 47) and consists of less than 40 amino acids, and / or a covalent linkage with polyethylene glycol according to claim 1. The polypeptides of the invention are new inhibitors of transglutaminases, especially the factor XIIIa, the terminal enzyme of the blood coagulation cascade. The present Invention also relates to processes for the preparation of these inhibitors, and their use as transglutaminase inhibitors and these containing drugs and combination preparations according to the claims.

Transglutaminasen (EC 2.3.2.13) katalysieren die Bildung von Amidbindungen innerhalb einer oder zwischen verschiedenen Polypeptidketten nach dem folgenden Reaktionsschema:

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Transglutaminases (EC 2.3.2.13) catalyze the formation of amide bonds within or between different polypeptide chains according to the following reaction scheme:
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Sie katalysieren also die Quervernetzung von Proteinen, durch Bildung von γ-Glutamyl-ε-Lysin Bindungen zwischen zwei Polypeptidketten, und tragen damit zur Stabilisierung von vielen Proteinaggregaten bei.she thus catalyze the cross-linking of proteins, by education of γ-glutamyl-ε-lysine bonds between two polypeptide chains, thus contributing to stabilization from many protein aggregates.

Eine Transglutaminase mit großer klinischer Bedeutung ist der Faktor XIIIa.A Transglutaminase with large Clinical significance is the factor XIIIa.

Faktor XIIIa ist das terminale Enzym der Blutgerinnungskaskade und vernetzt Fibrinpolymere eines "weichen" Blutthrombus durch Transglutaminierung kovalent. Faktor XIIIa sorgt außerdem für die kovalente Bindung von α2-Antiplasmin durch Transglutaminierung an das Fibrinnetzwerk. Ein derartig quervernetzter und modifizierter Blutthrombus wird als "harter" Blutthrombus bezeichnet und kann von fibrinolytischen Enzymen nicht so schnell aufgelöst werden wie ein "weicher" Blutthrombus aus Fibrinpolymeren ohne kovalente Quervernetzung. Damit trägt der Faktor XIIIa entscheidend zur Stabilisierung eines Blutthrombus bei.Factor XIIIa is the terminal enzyme of the blood clotting cascade and covalently cross-links fibrin polymers of a "soft" blood thrombus by transglutaminating. Factor XIIIa also provides for the covalent attachment of α 2 -antiplasmin to the fibrin network by transglutaminating. Such a cross-linked and modified blood thrombus is termed a "hard" blood thrombus and can not be resolved by fibrinolytic enzymes as rapidly as a "soft" blood thrombus of fibrin polymers without covalent cross-linking. Thus, the factor XIIIa contributes significantly to the stabilization of a blood thrombus.

Inhibitoren des Faktors XIIIa verhindern die Quervernetzungsreaktion zwischen den unterschiedlichen Ketten des Fibrinnetzwerkes und auch die kovalente Bindung von α2-Antiplasmin und erleichtern damit sowohl die präventive Behandlung von thrombotischen Ereignissen, als auch die thrombolytische Behandlung.Inhibitors of Factor XIIIa prevent the cross-linking reaction between the different chains of the fibrin network and also the covalent binding of α 2 -antiplasmin and thus facilitate both the preventive treatment of thrombotic events and the thrombolytic treatment.

Mehrere Inhibitoren von Transglutaminasen sind bereits im Stand der Technik beschrieben (eine Auswahl findet sich in Tabelle 1). Es handelt sich hierbei um

  • • Immunglobuline, die an Transglutaminasen binden,
  • • niedermolekulare chemische Verbindungen, die mit Cysteinen reagieren,
  • • niedermolekulare Amine, die mit natürlichen Substraten kompetitieren und
  • • aktive Fraktionen, gewonnen aus Blutegeln der Spezies Haementeria ghilianii.
Several inhibitors of transglutaminases have already been described in the prior art (a selection can be found in Table 1). It is about
  • Immunoglobulins that bind to transglutaminases,
  • Low molecular weight chemical compounds that react with cysteines,
  • • low molecular weight amines that compete with natural substrates and
  • • active fractions obtained from leeches of the species Haementeria ghilianii.

Tabelle 1: Auswahl publizierter und patentierter Inhibitoren des Faktors XIIIa

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Table 1: Selection of published and patented inhibitors of factor XIIIa
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Immunglobuline, die gegen den Faktor XIII gerichtet sind, wurden z.B. in US 5,470,957 offenbart. Dort wurden monoklonale Antikörper gegen eine Untereinheit des Faktors XIIIa hergestellt und beobachtet, daß derartige Antikörper die Aktivierung von Faktor XIII durch Thrombin inhibierten. Allerdings sind für einen therapeuthischen Einsatz derartiger Antikörper umfangreiche Veränderungen, wie z.B. die Herstellung von humanen Chimären, normalerweise notwendig.Immunoglobulins directed against factor XIII have been described, for example, in US Pat US 5,470,957 disclosed. There, monoclonal antibodies to a subunit of Factor XIIIa were prepared and it was observed that such antibodies inhibited the activation of Factor XIII by thrombin. However, extensive changes, such as the production of human chimeras, are usually necessary for therapeutic use of such antibodies.

Eine weitere Klasse von Inhibitoren besteht aus niedermolekularen, reaktiven chemischen Verbindungen, die irreversibel an das aktive Zentrum des Faktors XIIIa, einen Cysteinrest, binden. Derartige Verbindungen, offenbart in WO 92/13530, haben allerdings den Nachteil, dass sie sehr reaktiv und in vivo relativ instabil sind. Sie reagieren auch mit Cysteinresten anderer Proteine und sind damit nicht spezifisch für den Faktor XIIIa. Sie finden somit als pharmazeutische Wirkstoffe keine Anwendung.A Another class of inhibitors consists of low molecular weight, reactive chemical compounds that are irreversible to the active site of Factor XIIIa, a cysteine residue. Such compounds, disclosed in WO 92/13530, however, have the disadvantage that they are very reactive and relatively unstable in vivo. They also react with cysteine residues of other proteins and are thus not specific for the Factor XIIIa. You will therefore find no pharmaceutical active ingredients Application.

Weitere Transglutaminase-Inhibitoren sind niedermolekulare Amine, wie in WO 91/10427 offenbart, die als kompetitive Substrate der Transglutaminasereaktion wirken. Sie werden allerdings durch die Transglutaminierungsreaktion verbraucht und verändern die Funktionalität der Proteine, an die sie durch die Transglutaminasereaktion gekoppelt werden, auf nicht vorhersehbare Weise. Außerdem müssen sie in einer relativ hohen Konzentration von etwa 200 μM eingesetzt werden, was ihren therapeutischen Wert beschränkt.Further Transglutaminase inhibitors are low molecular weight amines, as in WO91 / 10427 discloses as competitive substrates the transglutaminase reaction Act. They are, however, by the transglutaminating reaction consumed and changed the functionality the proteins to which they are coupled by the transglutaminase reaction be, in an unpredictable way. Besides, they have to be in a relatively high Concentration of about 200 μM which limits their therapeutic value.

Aus den Speicheldrüsen von Blutegeln der Spezies Haementeria ghilianii wurde eine Fraktion isoliert, die den Faktor XIIIa mit hoher Affinität und Spezifität hemmt (offenbart in US 6,025,330 ). In den aufgereinigten, aktiven Fraktionen befanden sich mindestens zwei verschiedene Proteine, wobei ein Protein mit einer ungefähren Größe von 7–8 kDa den Hauptproteinbestandteil der aktiven Fraktio nen darstellte. Die Primärsequenz dieses 66 Aminosäuren langen Polypeptides wurde durch proteinbiochemische Methoden annährend bestimmt. Dieses Polypeptid wurde Tridegin genannt und es wurde angenommen, dass dieses Polypeptid Transgluaminasen im allgemeinen und insbesondere den Faktor XIIIa inhibiert.From the salivary glands of leeches of the species Haementeria ghilianii a fraction was isolated which inhibits the factor XIIIa with high affinity and specificity (disclosed in US Pat US 6,025,330 ). The purified, active fractions contained at least two different proteins, with a protein of approximately 7-8 kDa representing the major protein component of the active fractions. The primary sequence of this 66 amino acid polypeptide was approximately determined by protein biochemical methods. This polypeptide was called tridegin, and it was believed that this polypeptide inhibited transglutaminases in general, and particularly factor XIIIa.

Es wurde allerdings kein Versuch unternommen, das Tridegin von den anderen, noch in der aktiven Fraktion anwesenden, Proteinen abzutrennen, so dass nicht ausgeschlossen ist, dass es diese Proteine sind, die den Faktor XIIIa inhibieren (siehe insbesondere Finney et al., (Finney et al., Biochem. Journal 324, 797-805 (1997), 2, Spur 3). Es wurde nicht einmal ermittelt, ob die den Faktor XIIIa inhibierende Aktivität peptidischer Natur ist. Folglich könnten andere, in den aktiven Fraktionen vorliegende, Biopolymere die eigentliche, den Faktor XIIIa inhibierende, Aktivität darstellen, sofern sie bei der Analyse auf einem SDS-Gel nicht auffallen, wie komplexe Zucker oder Lipide oder Glykolipide. Somit wurde in diesen Publikationen nicht gezeigt, dass Tridegin den Faktor XIIIa inhibiert.However, no attempt has been made to separate tridegin from the other proteins still present in the active fraction, so it is not excluded that it is these proteins that inhibit factor XIIIa (see, in particular, Finney et al., (Finney et al., Biochem. Journal 324, 797-805 (1997), 2 , Lane 3). It has not even been determined whether the factor XIIIa-inhibiting activity is peptidic in nature. Thus, other biopolymers present in the active fractions could be the actual Factor XIIIa-inhibiting activity, as long as they are not apparent in the analysis on an SDS gel, such as complex sugars or lipids or glycolipids. Thus, it has not been shown in these publications that tridegin inhibits factor XIIIa.

Folglich ist es völlig unklar, ob ein rekombinant hergestelltes, z.B. im Prokaryonten Escherichia coli exprimiertes Tridegin als Inhibitor für den Faktor XIIIa funktionell wäre. Sowohl in US 6,025,330 (4, 12–18) als auch im entsprechenden wissenschaftlichen Artikel (Finney et al., Biochem. Journal 324, 797-805 (1997)), wurde beobachtet, daß das aus Blutegeln der Spezies Haementeria ghilianii aufgereinigte Tridegin post-translational modifiziert war (Finney et al., Biochem. Journal (1997) 324, 800, rechte Spalte, letzter Satz). Obwohl bekannt ist, daß derartige Modifikationen gerade bei sekretierten Proteinen, zu denen auch das Tridegin zählt, für die Funktion oft notwendig sind (z.B. beschrieben in Kemball-Cook et al., Gene, 139(2): 275-279 (1994) oder Pang et al., Endocrinology 140(11): 5102-5111 (1999)), wurde in diesen beiden Publikationen nicht darauf eingegangen, inwieweit posttranslationale Modifikationen für die angenommene Funktion von Tridegin nötig sind. Derartige Modifikationen fehlen aber in Proteinen, die rekombinant in Escherichia coli hergestellt wurden. Darum sind gerade Proteine, die normalerweise extrazellulär lokalisiert sind, oft inaktiv, wenn sie in einem heterologen System exprimiert werden.Consequently, it is completely unclear whether a recombinantly produced tridegin expressed as an example in prokaryote Escherichia coli would be functional as an inhibitor of factor XIIIa. As well in US 6,025,330 (4, 12-18) and in the corresponding scientific article (Finney et al., Biochem. Journal 324, 797-805 (1997)), it was observed that tridegin purified from leeches of the species Haementeria ghilianii was post-translationally modified (Finney et al., Biochem. Journal (1997) 324, 800, right column, last sentence). Although it is known that such modifications are often necessary for the function of secreted proteins, including tridegin (eg described in Kemball-Cook et al., Gene, 139 (2): 275-279 (1994) or US Pat Pang et al., Endocrinology 140 (11): 5102-5111 (1999)), these two publications did not address the extent to which post-translational modifications are needed for the putative function of tridegin. However, such modifications are lacking in proteins produced recombinantly in Escherichia coli. Therefore, especially proteins that are normally located extracellularly are often inactive when expressed in a heterologous system.

WO 49039 beschreibt eine neue Technik zur Aufreinigung von Fusionsproteinen und offenbart dabei eine synthetische DNA-Sequenz, die für Tridegin kodiert. Außerdem wurde Tridegin als Fusionsprotein mit Glukosedehydrogenase exprimiert und aufgereinigt, die Aktivität des Fusionsproteins als Inhibitor des Faktor XIIIa wurde allerdings nicht getestet.WHERE 49039 describes a new technique for the purification of fusion proteins and discloses a synthetic DNA sequence coding for tridegin coded. Furthermore Tridegin was expressed as a fusion protein with glucose dehydrogenase and purified, the activity However, the fusion protein as an inhibitor of the factor XIIIa was not tested.

Die Erfindung hat daher die Aufgabe, neue Polypeptid-Inhibitoren von Transglutaminasen rekombinant oder synthetisch in ausreichenden Mengen und in reiner Form bereitzustellen.The invention therefore has the object of recombining new polypeptide inhibitors of transglutaminases nant or synthetically in sufficient quantities and in pure form.

Überraschenderweise stellte sich das in einem heterologen Systen, z.B. in Escherichia coli, exprimierte und aufgereinigte Tridegin Polypeptid als effektiver Transglutaminaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Faktor XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa, heraus. Damit wurde erstmals gezeigt, dass das Tridegin Polypeptid tatsächlich ein Transglutaminaseinhibitor, insbesondere ein Inhibitor von Faktor XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa, ist. Überraschenderweise zeigten auch Tridegin Polypeptide mit einer oder mehreren Modifikationen eine Aktivität als Transglutaminaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Faktor XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa.Surprisingly this turned out to be in a heterologous system, e.g. in Escherichia coli, expressed and purified tridegin polypeptide as effective Transglutaminase inhibitor, especially as an inhibitor of factor XIIIa, especially of human factor XIIIa. This was the first time demonstrated that the tridegin polypeptide is actually a transglutaminase inhibitor, in particular an inhibitor of factor XIIIa, especially of human Factor XIIIa, is. Surprisingly Tridegin also displayed polypeptides with one or more modifications an activity as a transglutaminase inhibitor, in particular as an inhibitor of factor XIIIa, especially of human factor XIIIa.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein modifiziertes Tridegin Polypeptid abgeleitet von SEQ ID No.1 mit einer oder mehreren Modifikationen und weniger als 40 Aminosäuren.object The present invention is therefore a modified tridegin Polypeptide derived from SEQ ID No.1 with one or more modifications and less than 40 amino acids.

Unter einem Polypeptid versteht man im Sinne dieser Erfindung Peptide mit mehr als 15 Aminosäuren (AS) und weniger als 400 Aminosäuren insbesondere Peptide mit mehr als 19 AS und weniger als 40 AS.Under For the purposes of this invention, a polypeptide is understood as meaning peptides with more than 15 amino acids (AS) and less than 400 amino acids in particular peptides with more than 19 AS and less than 40 AS.

Unter einer Modifikation versteht man im Sinne dieser Erfindung eine Veränderung des Wildtyp Tridegin Polypeptides durch die Substitution mindestens eines Cysteinrestes durch eine andere Aminosäure und/oder die Substitution mindestens einer der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch eine andere Aminosäure und/oder eine Deletion des N- und C-Terminus, und/oder eine kovalente Verknüpfung mit Polyethylenglykol.Under a modification is understood in the sense of this invention a change of the wild-type tridegin polypeptide by substitution at least a cysteine residue by another amino acid and / or the substitution at least one of the following amino acids - Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 - through another amino acid and / or a deletion of the N- and C-terminus, and / or a covalent linkage with Polyethylene glycol.

Unter einer Substitution versteht man im Sinne dieser Erfindung das Ersetzen einer Aminosäure an einer bestimmten Stelle der Aminosäuresequenz eines Polypeptides durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise durch eine der anderen 19 natürlichen Aminosäuren.Under Substitution is understood in the sense of this invention as replacement an amino acid at a particular site of the amino acid sequence of a polypeptide by another amino acid, preferably by one of the other 19 natural amino acids.

Unter einer Deletion versteht man im Sinne dieser Erfindung das Entfernen von N- und C-terminalen Bereichen der Aminosäuresequenz des Tridegins Polypeptides, wobei das verbleibende Polypeptid noch mindestens die Aminosäuresequenz DDIYGRPVEFPNLPLK enthält.Under For the purposes of this invention, a deletion is understood as removal N- and C-terminal regions of the amino acid sequence of the tridegin polypeptide, wherein the remaining polypeptide still at least the amino acid sequence DDIYGRPVEFPNLPLK contains.

Überraschenderweise zeigten die modifizierten Tridegin Polypeptide im Vergleich zum in Escherichia coli exprimierten Wildtyp Tridegin Polypeptid folgende vorteilhafte Eigenschaften.Surprisingly showed the modified tridegin polypeptides compared to in Escherichia coli, wild-type tridegin polypeptide expressed as follows advantageous properties.

Während das aus Escherichia coli gewonnene, rekombinante Wildtyp Tridegin Polypeptid auch hochmolekulare Aggregate bildete, zeigten diejenigen modifizierten Tridegin Polypeptide, bei denen mindestens ein Cysteinrest, bevorzugt ein bis vier Cysteinreste, besonders bevorzugt drei oder vier Cysteinreste durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise eine kleine Aminosäure wie Valin, Alanin, Glycin oder Serin, besonders bevorzugt durch Alanin oder Serin, vor allem durch Alanin, substituiert war, eine verminderte Aggregatbildung. Dies wurde in vergleichenden, analytischen Gelfiltrationsläufen festgestellt. Für die experimentellen Bedingungen der Gelfiltrationsläufe wird auf das Ausführungsbeispiel 4 verwiesen.While that Escherichia coli derived, recombinant wild-type tridegin polypeptide also formed high molecular weight aggregates showed those modified Tridegin polypeptides in which at least one cysteine residue is preferred one to four cysteine residues, more preferably three or four cysteine residues by another amino acid, preferably a small amino acid such as valine, alanine, glycine or serine, particularly preferred by Alanine or serine, mainly substituted by alanine, was one reduced aggregate formation. This was in comparative, analytical gel filtration detected. For the experimental conditions of the gel filtration runs to the embodiment 4 referenced.

Außerdem zeigen besagte modifizierte Tridegin Polypeptide bei der Lagerung bei 4°C eine langsamere Bildung der hochmolekularen Aggregate als das Wildtyp Tridegin. Dies wird in vergleichenden, analytischen Gelfiltrationsläufen festgestellt. Für die experimentellen Bedingungen der Gelfiltrationsläufe wird auf das Ausführungsbeispiel 4 verwiesen.In addition, show said modified tridegin polypeptides when stored at 4 ° C a slower Formation of high molecular weight aggregates as the wild-type tridegin. This is found in comparative, analytical gel filtration runs. For the experimental conditions of the gel filtration runs on the embodiment 4 referenced.

Diejenigen modifizierten Tridegin Polypeptide, bei denen mindestens eine, bevorzugt eine bis zehn, besonders bevorzugt eine bis sechs, vorallem eine bis drei, insbesondere aber nur eine der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise eine kleine Aminosäure wie Valin, Alanin, Glycin oder Serin, besonders bevorzugt durch Alanin und Glycin, vor allem durch Alanin substituiert wurden, zeigen überraschenderweise eine im Vergleich zum Wildtyp Tridegin verminderte Antigenizität, überraschenderweise bei einer mit dem Wildtyp Tridegin Polypeptid vergleichbaren inhibitorischen Aktivität auf den humanen Faktor XIIIa, was wiederum überraschend war.Those modified tridegin polypeptides in which at least one, is preferred one to ten, more preferably one to six, especially one to three, but especially one of the following amino acids - Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 - through another amino acid, preferably a small amino acid such as valine, alanine, glycine or serine, particularly preferred by Alanine and glycine, especially substituted by alanine, surprisingly show a reduced antigenicity compared to the wild-type tridegin, surprisingly in a comparable with the wild-type tridegin polypeptide inhibitory activity to the human factor XIIIa, which was again surprising.

Bei der Suche nach einer vom Wildtyp Tridegin Polypeptid abgeleiteten minimalen, den Faktor XIIIa inhibierenden Aminosäuresequenz, ergab sich überraschenderweise, dass Polypeptide, die mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK enthielten, eine inhibitorische Wirkung auf den humanen Faktor XIIIa aufwiesen. So inhibierten selbst Polypeptide von nur 20 Aminosäuren Länge, welche die oben genannte Aminosäuresequenz enthielten, den humanen Faktor XIIIa. Kurze Polypeptide, mit weniger als 40, bevorzugt mit weniger als 30, besonders bevorzugt mit weniger als 25 Aminosäuren, die mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK enthalten, haben überdies den Vorteil, dass sie weniger zur Aggregation neigen, chemisch in großen Men gen synthetisiert werden können und, im Vergleich zum Wildtyp Tridegin Polypeptid, eine verminderte Antigenizität aufweisen.In the search for a minimal factor XIIIa-inhibiting amino acid sequence derived from the wild type tridegin polypeptide, it was surprisingly found that polypeptides containing at least the amino acid sequence DDIYQRPVEFPNLPLK had an inhibitory effect on human factor XIIIa. Thus, even polypeptides of only 20 amino acids in length, which contained the above amino acid sequence, inhibited human factor XIIIa. Short polypeptides, less than 40, are preferred moreover, having less than 30, more preferably less than 25, amino acids containing at least the amino acid sequence DDIYQRPVEFPNLPLK has the advantage that they are less prone to aggregation, can be chemically synthesized in large quantities and, compared to the wild-type tridegin polypeptide have reduced antigenicity.

Weitere vorteilhafte, modifizierte Tridegin Polypeptide sind Tridegin Polypeptide, die kovalent mit Polyethylenglykol verknüpft sind. Die Reaktionsbedingungen für die Modifikation mit PEG sind z.B. in Cohen et al., Biochem. J., 357(3): 795-802 (2001) beschrieben. Das in die Mofizierungsreaktion eingesetzte Polyethylenglykol sollte ein Molekulargewicht von 500 Da bis 20000 Da, bevorzugt zwischen 1000 Da und 10000 Da, besonders bevorzugt zwischen 2000 Da und 5000 Da haben. Es sollte in einem molaren Verhältnis Polyethylenglykol : erfindungsgemäßes Polypeptid von zwischen 0,5:1 und 10:1, bevorzugt zwischen 0,8:1 und 4:1, besonders bevorzugt zwischen 1:1 und 2:1 eingesetzt werden. Diese modifizierten Polypeptide haben den Vorteil, nach Injektion in die Blutbahn eines Säugers weniger schnell abgebaut zu werden als das unmodifizierte Polypeptid.Further advantageous modified tridegin polypeptides are tridegin polypeptides, which are covalently linked to polyethylene glycol. The reaction conditions for the Modification with PEG are e.g. in Cohen et al., Biochem. J., 357 (3): 795-802 (2001). The used in the Mofizierungsreaktion Polyethylene glycol should have a molecular weight of 500 Da to 20,000 There, preferably between 1000 Da and 10000 Da, particularly preferred between 2000 Da and 5000 Da. It should be in a molar ratio of polyethylene glycol : polypeptide according to the invention of between 0.5: 1 and 10: 1, preferably between 0.8: 1 and 4: 1, especially preferably between 1: 1 and 2: 1 are used. These modified Polypeptides have the advantage, after injection into the bloodstream of a mammal less rapidly degraded than the unmodified polypeptide.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der vorangehend beschriebenen Polypeptide. So können die erfindungsgemäßen Poylpeptide mit gentechnischen oder peptid-chemischen Verfahren hergestellt werden.One Another object of the invention relates to a process for the preparation the above-described polypeptides. Thus, the invention Poylpeptide produced by genetic engineering or peptide-chemical methods become.

Ein gentechnisches Verfahren zur Herstellung eines der genannten Polypeptide besteht z.B. darin, eine Nukleinsäure, die für eines der beschriebenen Polypeptide kodiert, in geeigneter Weise in prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren zu klonieren (Sambrook et al., "Molecular cloning: a laboratory manual" Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Derartige Expressionsvektoren umfassen mindestens einen Promotor, mindestens ein Translationsinitiationssignal, mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für eines der er findungsgemäßen Polypeptide kodiert, und ein Translationsterminationssignal im Falle von prokaryotischen Expressionsvektoren, im Falle von eukaryotischen Expressionsvektoren zusätzlich ein Transkriptionsterminierungssignal sowie ein Polyadenylierungssignal.One A genetic engineering process for the preparation of one of said polypeptides consists of e.g. therein, a nucleic acid encoding one of the described polypeptides appropriately encoded in prokaryotic or eukaryotic Cloning expression vectors (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual "Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). such Expression vectors comprise at least one promoter, at least a translation initiation signal, at least one nucleic acid sequence, the for one of the inventive polypeptides coded, and a translation termination signal in the case of prokaryotic Expression vectors, in the case of eukaryotic expression vectors in addition Transcription termination signal as well as a polyadenylation signal.

Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Escherichia coli z.B. Expressionsvektoren basierend auf Promotoren, die von der T7 RNA Polymerase erkannt werden, wie in US 4,952,496 beschrieben, für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomuces serevisiae z.B. die Vektoren p426Met25 oder p526GAL1 (Mummberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z.B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z.B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.Examples of prokaryotic expression vectors for expression in Escherichia coli are, for example, expression vectors based on promoters recognized by the T7 RNA polymerase, as in US 4,952,496 for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces serevisiae, for example the vectors p426Met25 or p526GAL1 (Mummberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), for expression in insect cells, for example baculovirus vectors as in EP -B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721, and for expression in mammalian cells, for example, the vectors Rc / CMV and Rc / RSV or SV40 vectors, all of which are commonly available.

Die molekularbiologischen Methoden zur Herstellung dieser Expressionsvektoren sowie die Methoden zum Einbringen der Expressionsvektoren in die Wirtszellen und auch die Bedingungen zur Kultivierung der transformierten Wirtszellen und schließlich die Bedingungen zur Induktion der Expression des gewünschten erfindungsgemäßen Polypeptids in den Wirtszellen sind dem Fachmann vertraut. Beispiele für die gentechnische Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide sind in den Ausführungsbeispielen 1, 2 und 4 angegeben.The molecular biological methods for the production of these expression vectors as well as the methods for introducing the expression vectors into the Host cells and also the conditions for culturing the transformed Host cells and finally the conditions for inducing the expression of the desired polypeptide of the invention in the host cells are familiar to the expert. Examples of the genetic engineering Production of polypeptides according to the invention are in the embodiments 1, 2 and 4 indicated.

Die vorangehend beschriebenen Polypeptide können aber auch durch ein peptidchemisches Verfahren hergestellt werden, wie im Ausführungsbeispiel 3, also z.B. mit der allgemein bekannten Festphasensynthese, wie in Merrifield, J. Am. Che. Soc. 85: 2149 (1962) beschrieben. Techniken zur Synthese und Aufreinigung von Peptiden sind z.B. auch in Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman, San Francisco, 1969) auf den Seiten 27-62 beschrieben, sowie in US 4,269,827 .However, the polypeptides described above can also be prepared by a peptide chemical method, as in Example 3, that is, for example, with the well-known solid-phase synthesis, as described in Merrifield, J. Am. Che. Soc. 85: 2149 (1962). Techniques for synthesizing and purifying peptides are also described, for example, in Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman, San Francisco, 1969) at pages 27-62, and in US Pat US 4,269,827 ,

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines der oben genannten Polypeptide als Inhibitoren von Transglutaminasen, insbesondere von Faktor XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa. Die oben genannten Polypeptide haben die Eigenschaft die vom Faktor XIIIa katalysierte Freisetzung von Ammonium-Ionen, die bei der von Faktor XIIIa katalysierten Reaktion von einem spezifischen Peptidsubstrat mit Glycinethylester freigesetzt werden, wie z.B. im Behrichrom® assay (Fa. Dade Behring GmbH, Marburg), zu inhibieren. Eine derartige inhibitorische Wirkung der oben genannten Polypeptide kann, zum Beispiel, im Behrichrom® assay nachgewiesen werden, wie in den Ausführungsbeispielen 1 bis 4 beschrieben.Another object of the invention is the use of one of the abovementioned polypeptides as inhibitors of transglutaminases, in particular factor XIIIa, especially of human factor XIIIa. The above polypeptides have the property catalyzed by Factor XIIIa release of ammonium ions that are released in the catalyzed by Factor XIIIa reaction of a specific peptide substrate with glycine, as in Behrichrom ® assay (Fa. Dade Behring GmbH, Marburg) example to inhibit. Such an inhibitory effect of the above polypeptides may, for example, be detected in Behrichrom ® assay, as described in the embodiments 1 to. 4

Des weiteren können die erfindungsgemäßen Polypeptide die zum humanen Faktor XIIIa homologen Säugerproteine inhibieren, z.B. das mit dem humanen Faktor XIII homologe Protein aus Rattus norvegicus, bei dem 617 von 732 Aminosäuren identisch sind (84%), und 689 von 732 Aminosäuren verwandt (93%).Of others can the polypeptides of the invention inhibit the mammalian proteins homologous to human factor XIIIa, e.g. the human factor XIII homologous protein from Rattus norvegicus, in the 617 of 732 amino acids are identical (84%), and 689 of 732 amino acids are related (93%).

Neben ihrem inhibitorischen Effekt auf den Faktor XIIIa inhibieren die oben genannten Polypeptide auch weitere Transglutaminasen, z.B. die in den Keratinozyten exprimierte Transglutaminase 1, die an der Bildung der Epidermis beteiligte Transglutaminase 3, die im Samenleiter bei der Quervernetzung von Proteinen und der Konjugation von Polyaminen beteiligte Transglutaminase 4, sowie die bei der Verhornung von Keratinozyten beteiligte Transglutaminase 5, und damit alle sechs bislang beschriebenen Transglutaminasen des menschlichen Proteoms.Next inhibit their inhibitory effect on factor XIIIa above-mentioned polypeptides also other transglutaminases, e.g. the expressed in keratinocytes transglutaminase 1, the the formation of the epidermis involved transglutaminase 3, which in the Vas deferens in the cross-linking of proteins and conjugation Transglutaminase 4, which is involved in polyamines, as well as in the Keratinization of keratinocytes involved transglutaminase 5, and thus all six transglutaminases of the human so far described Proteome.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptides zur Prävention und Therapie von Thrombosen. Indem die erfindungsgemäßen Polypeptiden den Faktor XIIIa inhibieren, inhibieren sie auch die Bildung von Quervernetzungen von Fibrinpolymeren. Damit wird die Bildung von "harten" Blutthromben, die resistent gegen den Abbau durch fibrinolytische Enzyme sind, inhibiert.A another embodiment The invention consists in the use of a polypeptide according to the invention for prevention and therapy of thrombosis. By the polypeptides of the invention inhibit the factor XIIIa, they also inhibit the formation of Crosslinking of fibrin polymers. Thus, the formation of "hard" blood thrombi, the are resistant to degradation by fibrinolytic enzymes inhibited.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide ermöglichten z.B. eine schnellere Lyse von humanen Blutthromben und inhibierten auch das Einsetzen der Blutgerinnung, wie im Ausführungsbeispiel 5 beschrieben. Sie eignen sich somit zur Prävention und Therapie von Thrombosen.The polypeptides of the invention enabled e.g. a faster lysis of human blood thrombi and inhibited also the onset of blood clotting, as in the embodiment 5 described. They are thus suitable for the prevention and therapy of thrombosis.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Arzneimittel enhaltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid und mindestens einen galenischen Hilfsstoff. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind potente Transglutaminase-Inhibitoren, weisen aber nur ein geringes Maß an Toxitität auf und können darum zur Herstellung von Arzneimitteln besonders gut verwendet werden.One Another object of the invention relates to a drug containing a polypeptide according to the invention and at least one galenic adjuvant. The polypeptides of the invention are potent transglutaminase inhibitors, but have only a minor Measure Toxitität on and can therefore especially well used for the production of medicines become.

Der Begriff "galenischer Hilfsstoff" bedeutet erfindungsgemäß jedes inerte, nichttoxische, feste oder flüssige Füll-, Verdünnungs-, oder Verpackungsmaterial, solange es nicht ungebührend nachteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder dem Patienten reagiert. Flüssige galenische Hilfsstoffe sind zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Zuckerlösungen, Ethanol und/oder Öle. Galenische Hilfsstoffe zur Herstellung von Tabletten und Kapseln können zum Beispiel Bindemittel und Füllmaterial enthalten.Of the Term "galenic Excipient "means according to the invention each inert, non-toxic, solid or liquid filling, diluting or packaging materials, as long as it is not undignified disadvantageous with the polypeptide of the invention or the patient responding. liquid galenic adjuvants are for example sterile water, physiological Saline, Sugar solutions, Ethanol and / or oils. Galenic excipients for the production of tablets and capsules can for example, binder and filler contain.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kombinationspräparat enthaltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie mindesten einen pharmazeutischen Wirkstoff.One Another object of the invention is a combination preparation containing a polypeptide according to the invention and at least one pharmaceutical agent.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Kombinationspräparat enthaltend mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide sowie einen weiteren Wirkstoff in Form eines Antikoagulanz. Antikoagulanzien fördern entweder die Lyse von Blutthromben oder inhibieren die Bildung von Blutthromben. Beispiele sind thrombolytische Wirkstoffe, also Wirkstoffe die den Abbau von aktivem Thrombin oder dem Prothrombin fördern, fibrinolytische Wirkstoffe, also Wirkstoffe, die den Abbau von polymerem Fibrin fördern, oder fibrinogenolytische Wirkstoffe, also Wirkstoffe, die den Abbau von Fibrinogen fördern. Be vorzugte Antikoagulanzien sind Aktivatoren von Plasmin oder Plasminogen oder Inhibitoren von Thrombin, Faktor Xa oder Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation.A preferred embodiment The invention consists in a combination preparation containing at least one of the peptides of the invention and another active ingredient in the form of an anticoagulant. anticoagulants promote either the lysis of blood thrombi or inhibit the formation of Blood thrombi. Examples are thrombolytic agents, ie active ingredients which promote the degradation of active thrombin or prothrombin, fibrinolytic Active substances, that is, active substances that inhibit the degradation of polymeric fibrin promote, or fibrinogenolytic agents, ie agents that reduce the degradation of Promote fibrinogen. Preferred anticoagulants are activators of plasmin or plasminogen or inhibitors of thrombin, factor Xa or inhibitors of platelet aggregation.

Besonders bevorzugte Antikoagulanzien, die in Kombinationspräparaten gemeinsam mit den erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden können, sind Acetylsalicylsäure, Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoid, Hirudin, Bivalirudin, Melagatran, Abciximab, Eptifibabide, Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA), Streptokinase, Staphylokinase, Urokinase, Eminase, Hementin und/oder Plasmin.Especially preferred anticoagulants used in combination preparations together with the peptides according to the invention can be used are acetylsalicylic acid, Heparin, low molecular weight heparin, heparinoid, hirudin, bivalirudin, Melagatran, abciximab, eptifibabide, tissue plasminogen activator (tPA), Streptokinase, staphylokinase, urokinase, eminase, hementin and / or Plasmin.

Acetylsalicylsäure wirkt u.a. als Inhibitor der Blutplättchen-Aggregation. Heparin ist ein körpereigenes polyanionisches Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 6000 Da bis 30000 Da und erhöht die Wirksamkeit des körpereigenen Antithrombin III. Niedermolekulares Heparin wird durch begrenzten Abbau von Heparin gewonnen und hat ein Molekulargewicht von 4000 Da bis 6000 Da. Hirudin ist z.B. in EP 0347376 und EP 0501821 beschrieben. Mit Hirudin bezeichnet man eine Familie von homolgen Polypeptiden aus Blutegeln, die Thrombin inhibieren und die Blutgerinnung inhibieren. Bivalirudin ist ein Thrombin inhibierendes Peptid (Kelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 6040-6044 (1992). Melagatran ist ein Thrombin inhibierendes Peptid Mimetikum (Thromb Haemost 79(1): 110-118 (1998)). Abciximab ist ein Antikörper und Eptifibabide ein Peptid; beide binden GP IIb/IIIb, das "platelet glycoprotein" IIb/IIIb, und hemmen die Blutplättchen-Aggregation. Hementin ist z.B. beschrieben in WO 91/15576, wird in verschiedenen Blutegeln gefunden, baut Fibrinogen ab und verhindert damit die Blutgerinnung. Ebenso führen Plasmin oder Eminase zum Fibrinabbau, während Streptokinase, Urokinase, Staphylokinase und der Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA) das Plasminogen aktivieren und durch die Generierung von aktiven Plasmin zum Fibrinabbau führen.Acetylsalicylic acid acts inter alia as an inhibitor of platelet aggregation. Heparin is an endogenous polyanionic polysaccharide with a molecular weight of 6000 Da to 30,000 Da and increases the efficacy of the body's own antithrombin III. Low molecular weight heparin is obtained by limited heparin degradation and has a molecular weight of 4000 Da to 6000 Da. Hirudin is in eg EP 0347376 and EP 0501821 described. Hirudin is a family of homologous polypeptides derived from leeches that inhibit thrombin and inhibit blood clotting. Bivalirudin is a thrombin-inhibiting peptide (Kelly et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89, 6040-6044 (1992).) Melagatran is a thrombin-inhibiting peptide mimetic (Thromb Haemost 79 (1): 110-118 (1998 Abciximab is an antibody and Eptifibabide a peptide, both bind GP IIb / IIIb, the "platelet glycoprotein" IIb / IIIb, and inhibit platelet aggregation Hementin is described, for example, in WO 91/15576, found in various leeches In addition, plasmin or eminase lead to fibrin degradation, while streptokinase, urokinase, staphylokinase and tissue plasminogen activator (tPA) activate plasminogen and lead to fibrin degradation by the generation of active plasmin.

Ein besonderer Vorteil der Kombination der erfindungsgemäßen Polypeptide mit den Antikoagulanzien und gegebenenfalls einem weiteren pharmazeutischen Wirkstoff, besteht darin, dass Blutthromben durch die Kombination der Wirkstoffe auf synergistische Weise schneller aufgelöst werden als durch einen Wirkstoff allein. Besonders die Kombination mit fibrinolytischen Agenzien, wie z.B. Urokinase und Gebwebe Plasminogen Aktivator (tPA), bewirkte eine verminderte Stabilität und eine beschleunigte Auflösung von Blutthromben, wie im Ausführungsbeispiel 5 detailliert beschrieben ist.A particular advantage of the combination of the polypeptides according to the invention with the anticoagulants and optionally another pharmaceutical active ingredient, is that blood thrombi are synergistically dissolved more rapidly by the combination of the active ingredients than by an active ingredient alone. In particular, the combination with fibrinolytic agents, such as urokinase and tissue plasminogen activator (tPA), caused a reduced stability and an accelerated dissolution of blood thrombus, as described in detail in Example 5.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.The Invention will now be described below with reference to the figures and examples be further clarified, without the invention being limited thereto.

Beschreibung der Figuren und Sequenzen:Description of the figures and sequences:

1: Karte des Expressionsplasmids pET22b-14 (A) und Angabe der für das Tridegin Polypeptid kodierenden Sequenz (B). Nummerierung der Basen gemäß der Plasmidkarte. 1 : Map of the expression plasmid pET22b-14 (A) and the tridegin polypeptide coding sequence (B). Numbering of the bases according to the plasmid map.

2: Reinigung von rekombinantem wildtyp Tridegin Polypeptid, untersucht mittels SDS-PAGE (10% Gel)
Spur 1 ist E. coli-Totallysat vor Auftrag auf die Ni-NTA-Säule.
Spur 2–7 sind Fraktionen der Elution mit Imidazol. Alle Proben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und 5 min. bei 95° C inkubiert. 2 : Purification of Recombinant Wild Type Tridegin Polypeptide Examined by SDS-PAGE (10% Gel)
Lane 1 is E. coli total lysate prior to loading on the Ni-NTA column.
Lanes 2-7 are fractions of elution with imidazole. All samples were spiked with SDS sample buffer and incubated for 5 min. incubated at 95 ° C.

3: Inhibitorische Wirkung des rekombinanten, gereinigten Tridegin Polypeptides auf den Faktor XIIIa im Berichom®-Assay. 3 : Inhibitory effect of the recombinant purified tridegin polypeptide on factor XIIIa in the Berichom ® assay.

Als Kontroll-Substanz wurde Cerulenin (der Fa. Calbiochem) verwendet.When Control substance was used cerulenin (from Calbiochem).

4: Schematische Darstellung eines Thrombelastogrammes. 4 : Schematic representation of a thrombelastogram.

Die für die beschriebenen Experimente relevanten Parameter sind CT (clotting time, Gerinnungszeit), MCF (maximum clot firmness, maximale Thrombus Festigkeit) und LT (lysis time, Fibrinolyse Zeit).The for the The experiments described relevant parameters are CT (clotting time, clotting time), MCF (maximum clot firmness, maximum thrombus Strength) and LT (lysis time, fibrinolysis time).

5: Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut in Ab- (A, C, E) und Anwesenheit (B, D, F) von rekombinantem Tridegin. 5 : Thrombelastograms of citrated whole blood in Ab- (A, C, E) and presence (B, D, F) of recombinant tridegin.

Alle Ansätze enthalten Citrat-Vollblut (300 μl), Ca2+ (20 μl Starteg-Reagenz) und Thromboplastin-Phospholipid (10 μl Integ-Reagenz).

  • B: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No.1 (10 μM)
  • C: + Urokinase (25 E)
  • D: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No.1 (10 μM) und Urokinase (25 E)
  • E: + tPA (40,5 ng)
  • F: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No.1 (10 μM) und tPA (40,5 ng)
All preparations contain citrated whole blood (300 μl), Ca 2+ (20 μl Starteg reagent) and thromboplastin phospholipid (10 μl Integ reagent).
  • B: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID No.1 (10 μM)
  • C: + urokinase (25 E)
  • D: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID No.1 (10 μM) and urokinase (25 E)
  • E: + tPA (40.5 ng)
  • F: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID No.1 (10 μM) and tPA (40.5 ng)

6: Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut in Ab- (A, C, E) und Anwesenheit (B, D, F) von SEQ ID No. 25 6 : Thrombelastograms of citrated whole blood in Ab- (A, C, E) and presence (B, D, F) of SEQ ID no. 25

Alle Ansätze enthalten Citrat-Vollblut (300 μl), Ca2+ (20 μl Starteg-Reagenz) und Thromboplastin-Phospholipid (10 μl Integ-Reagenz).

  • B: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No. 25 (20 μM)
  • C: + Urokinase (25 E) + inaktives Kontroll-Peptid (Acetyl-Adhesin (1025-1044) Amid der Fa. Bachem) (20 μM)
  • D: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No. 25 (20 μM) und Urokinase (25 E)
  • E: + tPA (40,5 ng) + inaktives Kontroll-Peptid (20 μM)
  • F: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No. 25 (20 μM) und tPA (40,5 ng)
All preparations contain citrated whole blood (300 μl), Ca 2+ (20 μl Starteg reagent) and thromboplastin phospholipid (10 μl Integ reagent).
  • B: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID no. 25 (20 μM)
  • C: + urokinase (25 E) + inactive control peptide (acetyl adhesin (1025-1044) amide from Bachem) (20 μM)
  • D: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID no. 25 (20 μM) and urokinase (25 E)
  • E: + tPA (40.5 ng) + inactive control peptide (20 μM)
  • F: + transglutaminase inhibitor of SEQ ID no. 25 (20 μM) and tPA (40.5 ng)

SEQ ID Nr. 1 zeigt das Wildtyp Tridegin Polypeptid.SEQ ID No. 1 shows the wild-type tridegin polypeptide.

SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 26 zeigen je 20 Aminosäure lange Peptide von SEQ ID No. 1.SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 26 each show 20 amino acid peptides of SEQ ID No. 1.

SEQ ID No. 27 bis SEQ ID No. 46 zeigen für die Mutangenese des Tridegin Polypeptides verwendete Oligonukleotide.SEQ ID No. 27 to SEQ ID NO. 46 show for the mutagenesis of tridegin Polypeptides used oligonucleotides.

SEQ ID Nr. 47 zeigt ein 16 Aminosäure langes Peptid von SEQ ID Nr. 1.SEQ ID No. 47 shows a 16 amino acid long peptide of SEQ ID NO: 1.

Ausführungsbeispieleembodiments

Beispiel 1: Expression und Reinigung von rekombinantem Tridegin Polypeptid (SEQ ID NO:1) aus Escherichia coliExample 1: Expression and Purification of Recombinant Tridegin Polypeptide (SEQ ID NO: 1) from Escherichia coli

Das Expressionsplasmid pET22b-14, das die codierende Sequenz für das rekombinante Tridegin Polypeptid enthält, ist in 1 dargestellt. Das Plasmid wurde nach gängigen Verfahren in den Escherichia coli-Expressionsstamm Origami® B (DE3) (der Fa. Novagen, Best. Nr. 70837) transferiert und in LB-Flüssigmedium mit Ampicillin (100 μg/ml), Kanamycin und Tetracyclin (je 5 μg/ml) kultiviert. Der Expressionsstamm BL21(DE3) (der Fa. Novagen) lieferte ähnliche Ergebnisse und kann ebenso für die Expression der modifizierten Tridegin Polypeptide verwendet werden. Die Hauptkultur wurde bei 37°C und 220 rpm geschüttelt, bis eine OD600 von 0,7 erreicht wurde. Bei einer Zelldichte von 0,7–0,9 OD600/ml wurde die Kultur zur Induktion der Genexpression mit 2 mM IPTG/ml versetzt und für weitere 4h bei 37°C bei 200–240 rpm geschüttelt. Die Zellen wurden durch anschliessende Zentrifugation geerntet (15 min, 5825 × g). Das Zellsediment wurde in 1:10 mit Reinst-Wasser verdünntem BugBuster 10 × Protein Extraction Reagent (der Fa. Novagen) resuspendiert und zum Aufschluss mit Benzonase (der Fa. Novagen) und Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete ohne EDTA, der Fa. Roche Diagnostics GmbH) für 10–20 min unter Schütteln bei 4°C inkubiert. Durch anschließende Zentrifugation bei 16,000 × g für 20 min bei 4°C wurde der Überstand gewonnen und mit dem gleichen Volumen an Lysispuffer (50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) versetzt. Die so erhaltene Proteinsuspension wurde bei 4°C über Nacht gelagert. Zur Reinigung wurden 3 ml Nickel-NTA-Agarose (der Fa. Quiagen) in eine Leer-Säule gepackt und mit 5 Säulenvolumina Lysispuffer equilibriert. Die Proteinsuspension wurde auf die Säule aufgetragen (ohne Pumpe, Fluß durch Schwerkraft) und anschließend mit Waschpuffer (50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) gewaschen (10 Säulenvolumina). Die Elution erfolgte mittels Elutionspuffer (2–3 Säulenvolumina) (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imi dazol, pH 8). Fraktionen wurden gesammelt und mit SDS-PAGE auf die Anwesenheit von Transglutaminase-Inhibitor geprüft (siehe 2). Die Ausbeute betrug 20 mg rekombinantes Tridegin Polypeptid pro Liter Expressionskultur bei einer Reinheit von > 90 %. Die Fraktionen, die das rekombinante Tridegin Polypeptid enthielten, wurden vereinigt und extensiv gegen 50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mM NaCl dialysiert (2 × gegen 21). Anschließend wurde die inhibitorische Aktivität des gereinigten Proteins auf Faktor XIIIa getestet. Als Testverfahren wurde der Berichrom®-Assay (der Fa. Dade Behring) verwendet.The expression plasmid pET22b-14, which contains the coding sequence for the recombinant tridegin polypeptide, is described in U.S. Pat 1 shown. The plasmid was transferred by conventional methods in the Escherichia coli expression strain Origami ® B (DE3) (the company. Novagen, Order No. 70837) and in LB liquid medium with ampicillin (100 ug / ml), kanamycin and tetracycline (je 5 μg / ml). The expression strain BL21 (DE3) (from Novagen) gave similar results and can also be used for the expression of the modified tridegin polypeptides. The main culture was shaken at 37 ° C and 220 rpm until an OD600 of 0.7 was reached. At a cell density of 0.7-0.9 OD600 / ml, the culture was boosted with 2 mM IPTG / ml to induce gene expression and shaken for a further 4 h at 37 ° C at 200-240 rpm. The cells were harvested by subsequent centrifugation (15 min, 5825 x g). The cell sediment was resuspended in 1:10 diluted with ultrapure water BugBuster 10 × Protein Extraction Reagent (Novagen) and digested with benzonase (Novagen) and protease inhibitor cocktail (Complete without EDTA, the Fa. Roche Diagnostics GmbH) for 10-20 min with shaking at 4 ° C. Subsequent centrifugation at 16,000 x g for 20 min at 4 ° C, the supernatant was recovered and treated with the same volume of lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole). The resulting protein suspension was stored at 4 ° C overnight. For purification, 3 ml of nickel NTA agarose (from Quiagen) were packed in an empty column and equilibrated with 5 column volumes of lysis buffer. The protein suspension was applied to the column (without pump, flow by gravity) and then washed with washing buffer (50 mM NaH 2 PO 4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) (10 column volumes). Elution was carried out using elution buffer (2-3 column volumes) (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 250 mM Imi dazol, pH 8). Fractions were collected and assayed for the presence of transglutaminase inhibitor by SDS-PAGE (see 2 ). The yield was 20 mg of recombinant tridegin polypeptide per liter of expression culture at> 90% purity. The fractions containing the recombinant tridegin polypeptide were pooled and dialysed extensively against 50 mM NaH 2 PO 4 pH 8.0, 300 mM NaCl (2x against 21). Subsequently, the inhibitory activity of the purified protein was tested for factor XIIIa. As a test method of the Berichrom ® assay (Fa. Dade Behring) was used.

Durchführung des Behrichrom® Assays:Conduct of the Behrichrom ® Assay:

Der Assay beruht darauf, daß Faktor XIII durch in den Reagentien vorhandenes Thrombin zu Faktor XIIIa aktiviert wird. Faktor XIIIa verknüpft ein spezifisches Peptidsubstrat mit Glycinethylester unter Freisetzung von Ammonium Ionen. Diese werden in einer parallel ablaufenden enzymatischen Reaktion bestimmt. Gemessen wurde die Abnahme von NADH über die Extinktion bei 340 nm.Of the Assay is based on factor XIII by thrombin present in the reagents to factor XIIIa is activated. Factor XIIIa links a specific peptide substrate with glycine ethyl ester to release ammonium ions. These are determined in a parallel enzymatic reaction. Measured the decrease of NADH was over the absorbance at 340 nm.

Peptide lagen für die Messung in 50% Acetonitril in einer Stamm-Konzentration von 5 mM vor. Die vom Hersteller gelieferten NADH- und Nachweis-Reagentien wurden in 3 ml Wasser, und das Aktivator-Reagenz anschließend in 3 ml NADH-Reagenz gelöst. Aktivator- und Nachweisreagenz wurden 1:1 zum Gebrauch gemischt. Zur Messung im Mikrotiterplattenformat wurden 100 μl Probe (Inhibitor, bzw. Kontrollpuffer), 25 μl Faktor XIII (10 E/ml) und 150 μl Gebrauchsreagenz gemischt. Die Messung erfolgte kontinuierlich über 20 min bei 37°C in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 340 nm. Zur Auswertung wurden die Differenzen der Messwerte nach 16 und 20 min verglichen.peptides lay for the measurement in 50% acetonitrile in a stock concentration of 5 mM before. The NADH and detection reagents supplied by the manufacturer in 3 ml of water, and the activator reagent subsequently in 3 ml NADH reagent solved. Activator and detection reagents were mixed 1: 1 for use. For measurement in the microtiter plate format, 100 μl of sample (inhibitor, or control buffer), 25 μl Factor XIII (10 U / ml) and 150 μl Use reagent mixed. The measurement was carried out continuously over 20 min at 37 ° C in a microtiter plate photometer at 340 nm. For evaluation the differences of the measured values were compared after 16 and 20 min.

Die Messung ergab für den gereinigten Transglutaminase Inhibitor einen IC50 von 2–4 μM (s. 3)The measurement revealed an IC 50 of 2-4 μM for the purified transglutaminase inhibitor (s. 3 )

Beispiel 2: Expression und Reinigung von modifizierten Trideginen aus Escherichia coliExample 2: Expression and purification of modified tridegins from Escherichia coli

Modifizierte Tridegine wurden durch gezielte Mutagenese des für das Wildtyp Tridegin Polypeptid kodierenden Expressionsplasmides erzeugt. Die Mutagenese wurde durch PCR mit den QuikChange Reagenzien (der Fa. Stratagene) laut Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Oligonukleotide SEQ ID Nr. 27 bis SEQ ID Nr. 40 und die jeweiligen revers-komplementären Sequenzen wurden für die Mutagenese verwendet.modified Tridegins were obtained by targeted mutagenesis of the wild-type tridegin polypeptide generated expression plasmids. Mutagenesis was carried out PCR with the QuikChange reagents (from Stratagene) according to instructions carried out by the manufacturer. The oligonucleotides SEQ ID NO: 27 to SEQ ID NO: 40 and the respective reverse complement Sequences were for used the mutagenesis.

Die DNA-Sequenzen der erhaltenen Mutanten wurden durch Sequenzierung überprüft. Die jeweilige codierende Sequenz im Plasmid pET22b wurde nach gängigen Verfahren in den Escherichia coli -Expressionsstamm Origami® B(DE3) (der Fa. Novagen) transferiert und in LB-Flüssigmedium mit Ampicillin, Kanamycin und Tetracyclin wie oben bereits beschrieben kultiviert. Zusätzlich gefundene, spontan aufgetretene Doppelmutanten wurden auch exprimiert und gereinigt. Die Expression, Reinigung und Aktivitätsbestimmung erfolgte wie in Beispiel 1 genannt. Folgende Aktivitäten wurden für die einzelnen modifizierten Tridegine gemessen (Tabelle 2). Die Bezeichnung der modifizierten Tridegine erfolgte nach dem Schema XnY.The DNA sequences of the obtained mutants were checked by sequencing. The respective coding sequence in the plasmid pET22b was transferred by conventional methods in the Escherichia coli Origami -Expressionsstamm ® B (DE3) (Fa. Novagen) and grown in LB liquid medium supplemented with ampicillin, kanamycin and tetracycline as previously described. Additionally found, spontaneously occurring double mutants were also expressed and purified. Expression, purification and activity determination were carried out as mentioned in Example 1. The following activities were measured for the individual modified tridegins (Table 2). The name of the modified tridegins was according to the scheme XnY.

Dabei bezeichnet X die Aminosäure, die durch Mutagenese verändert wurde, n definiert die Position dieser Aminosäure in der Polypeptidkette und Y bezeichnet die nach der Mutagenese vorhandene Aminosäure.there X denotes the amino acid, which changed by mutagenesis n has defined the position of this amino acid in the polypeptide chain and Y denotes the amino acid present after mutagenesis.

Tabelle 2: Inhibitorische Wirkung modifizierten Trideginen auf den Faktor XIIIa im Berichrom®-Assay.

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Table 2: Inhibitory effect modified Trideginen to factor XIIIa in Berichrom ® assay.
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Die relative inhibitorische Wirkung (%) wurde bei einer Endonzentration der Variante von 5,45 μM bestimmt. Die inhibitorische Wirkung des rekombinanten Tridegin Polypeptides wurde auf 100 % (bei 5,45 μM) normiert.The relative inhibitory effect (%) was at an endon concentration the variant of 5.45 μM certainly. The inhibitory effect of recombinant tridegin Polypeptide was normalized to 100% (at 5.45 μM).

Beispiel 3: Inhibitorische Wirkung von Fragmenten des Tridegin PolypeptidesExample 3: Inhibitory Effect of fragments of the tridegin polypeptide

25 Peptide mit einer Länge von 20 Aminosäuren wurden auf Basis des rekombinanten Tridegin Polypeptides nach einem gängigen Verfahren der Peptidsynthese chemisch synthetisiert (von der Fa. Pepscan, Lelystad, NL). Die Peptide tragen N-terminal eine Acetylgruppe und C-terminal entsprechend eine Amidgruppe. Die Sequenzen wurden so gewählt, dass diese

  • a) die gesamte Sequenz 1 abdecken und
  • b) mit jeweils in 18 Aminosäurenresten überlappen (siehe Tabelle 3, Sequenzen 2–26).
25 peptides with a length of 20 amino acids were chemically synthesized on the basis of the recombinant tridegin polypeptide according to a common method of peptide synthesis (from the company Pepscan, Lelystad, NL). The peptides carry an N-terminal acetyl group and C-terminal corresponding to an amide group. The sequences were chosen so that these
  • a) cover the entire sequence 1 and
  • b) each overlap in 18 amino acid residues (see Table 3, Sequences 2-26).

Die relative inhibitorische Wirkung (%) wurde mittels des oben beschriebenen Berichrom®-Assays bei einer Endkonzentration der Peptide von 7,27 μM bestimmt. Die inhibitorische Wirkung des rekombinanten Tridegin Polypeptides wurde bei einer Endkonzentration von 7,27 μM auf 100 % normiert.The relative inhibitory effect (%) was determined by the above-described Berichrom ® assays at a final concentration of the peptides of 7.27 uM. The inhibitory effect of the recombinant tridegin polypeptide was normalized to 100% at a final concentration of 7.27 μM.

Tabelle 3: Inhibitorische Wirkung von Peptiden des rekombinanten Tridegins auf den Faktor XIIIa im Berichrom®-Assay.

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Table 3: Inhibitory effect of peptides of the recombinant Tridegins to factor XIIIa in Berichrom ® assay.
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Die drei C-terminalen Peptide (SEQ ID NO:24, 25, 26) wurden nach HPLC Aufreinigung nochmals getrennt auf ihre inhibitorische Wirkung auf den Faktor XIIIa mittels Berichrom®-Assay gemessen. Folgende IC50-Werte wurden gemessen:

  • • SEQ ID No. 24: IC50: 7 μM
  • • SEQ ID No. 25: IC50: 4 μM
  • • SEQ ID No. 26: IC50: 5 μM
The three C-terminal peptides (SEQ ID NO: 24, 25, 26) were measured by HPLC purification again separated for their inhibitory effect on factor XIIIa by Berichrom ® assay. The following IC 50 values were measured:
  • SEQ ID no. 24: IC 50 : 7 μM
  • SEQ ID no. 25: IC 50 : 4 μM
  • SEQ ID no. 26: IC 50 : 5 μM

Beispiel 4: Expression und Reinigung von durch Austausch von Cystein- Resten modifizierten Trideginen aus Escherichia coliExample 4: Expression and purification of Cysteine-modified tridegins from Escherichia coli

Diese modifizierten Tridegine wurden durch gezielte Mutagenese der im wildtyp Tridegin enthaltenen Cysteine erzeugt. Das Ziel dieser Mutagenese war der schrittweise Austausch der Cysteinreste, die zur Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken geeignet sind. Die Neigung zur Bildung von Disulfidbrücken und die damit einhergehende Aggregation des Endproduktes wurde durch entsprechende chromatographischen Analysen des originären Transglutaminase-Inhibitor (SEQ ID No.1) in An- bzw. Abwesenheit von reduzierenden Agenzien (z.B. Mercaptoethanol, DTT) nachgewiesen. So zeigte das aufgereinigte, rekombinante Tridegin Polypeptid bei einem Gelfiltrationslauf (auf einer HiPrep 26/60 Sephacryl-S200 HR Säule der Fa. Amersham-Pharmacia; 20mM Natriumphosphat pH 8,0, 300mM NaCl; 1 ml/min) etwa einen Anteil von 80% multimeren, hochmolekularen Aggregaten. Die Anteil der Aggregate war signifikant geringer (< 20 %) wenn das rekombinante Tridegin unter reduzierenden Bedingungen in einem Gelfiltrationslauf in 1.5 mM DTT, 20mM Natriumphosphat pH 8,0, 300mM NaCl aufgetrennt wurde.These modified tridegins were generated by targeted mutagenesis of cysteines contained in wild-type tridegin. The aim of this mutagenesis was the gradual replacement of the cysteine residues that led to the release formation of intermolecular disulfide bridges are suitable. The tendency to form disulfide bridges and the concomitant aggregation of the final product was detected by appropriate chromatographic analyzes of the original transglutaminase inhibitor (SEQ ID No.1) in the presence or absence of reducing agents (eg mercaptoethanol, DTT). Thus, the purified, recombinant tridegin polypeptide in a gel filtration run (on a HiPrep 26/60 Sephacryl S200 HR column from Amersham-Pharmacia, 20 mM sodium phosphate pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 ml / min) showed approximately 80% % multimeric, high molecular weight aggregates. The proportion of aggregates was significantly lower (<20%) when the recombinant tridegin was separated under reducing conditions in a gel filtration run in 1.5 mM DTT, 20 mM sodium phosphate pH 8.0, 300 mM NaCl.

Die Mutagenese wurde mit den QuikChange Reagenzien (der Fa. Stratagene) laut Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Oligonukleotide SEQ ID No. 41 bis SEQ ID No. 46 und die jeweiligen revers-komplementären Sequenzen wurden für die Mutagenese verwendet. Die DNA-Sequenzen der erhaltenen Mutanten wurden durch Sequenzierung überprüft.The Mutagenesis was performed with the QuikChange reagents (from Stratagene). according to the manufacturer's instructions. The oligonucleotides SEQ ID No. 41 to SEQ ID NO. 46 and the respective reverse-complementary sequences were for the Mutagenesis used. The DNA sequences of the obtained mutants were checked by sequencing.

Die jeweilige codierende Sequenz im Plasmid pET22b wurde nach gängigen Verfahren in den Escherichia coli-Expressionsstamm Origami® B(DE3) (der Fa. Novagen) transferiert und in LB-Flüssigmedium wie oben beschrieben kultiviert. Die Expression, Reinigung und Aktivitätsbestimmung erfolgte wie in Beispiel 1 genannt. Folgende inhibitorische Aktivitäten wurden für die einzelnen Mutanten gemessen (siehe Tabelle 4). Die Bezeichnung der Mutanten erfolgte nach dem Schema XnY.The respective coding sequence in the plasmid pET22b was according to standard processes into the Escherichia coli expression strain Origami B ® (DE3) (Fa. Novagen) and cultured in LB liquid medium described above. Expression, purification and activity determination were carried out as mentioned in Example 1. The following inhibitory activities were measured for the individual mutants (see Table 4). The designation of the mutants took place according to the scheme XnY.

Dabei bezeichnet X die Aminosäure, die durch Mutagenese verändert wurde, n definiert die Position dieser Aminosäure in der Polypeptidkette, und Y bezeichnet die nach der Mutagenese vorhandene Aminosäure.there X denotes the amino acid, which changed by mutagenesis n is the position of this amino acid in the polypeptide chain, and Y denotes the amino acid present after mutagenesis.

Tabelle 4: Inhibitorische Wirkung von durch Austausch von Cystein-Resten modifizierten Trideginen auf den Faktor XIIIa im Berichom®-Assay.

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Table 4: Inhibitory effect of modified by replacement of cysteine residues Trideginen to factor XIIIa in Berichom ® assay.
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Die relative inhibitorische Wirkung (%) wurde bei einer Endonzentration der Variante von 5,45 μM bestimmt. Die inhibitorische Wirkung des rekombinanten wildtyp Tridegin Polypeptides wurde auf 100 % (bei 5,45 μM) normiert.The relative inhibitory effect (%) was at an endon concentration the variant of 5.45 μM certainly. The inhibitory effect of the recombinant wild-type tridegin Polypeptide was normalized to 100% (at 5.45 μM).

Beispiel 5: Verbesserung der fibrinolytischen Aktivität von Gewebe-Plasminogen Aktivator (tPA) und Urokinases in Anwesenheit von rekombinantem Tridegin oder einem Fragment von Tridegin.Example 5: Improvement the fibrinolytic activity of tissue plasminogen Activator (tPA) and urokinases in the presence of recombinant Tridegin or a fragment of tridegin.

Um das therapeutische Potential der erfindungsgemäßen Polypeptide aufzuzeigen wurde die Blutgerinnung und Fibrinolyse in Anwesenheit von rekombinantem Tridegin Polypeptid (SEQ ID NO: 1, 5) oder einem Fragment von Tridegin (SEQ ID NO: 25, 6) in Vollblut gemessen. Dazu wurden sogenannte Thrombelastogramme aufgezeichnet. Die Thrombelastographie ist ein gängiges Verfahren zur Messung von Gerinnung und Fibrinolyse. Dabei wird die Änderung der Viskosität des Blutes durch die Änderung des Drehwiderstandes eines im Blut befindlichen Stempels gemessen (Calatzis et al., 2000). Die 4 zeigt die typischen Phasen der Gerinnung und Fibrinolyse in einem Thrombelastogramm. Thrombelastogramme quantifizieren wichtige Parameter der Hämostase:

  • • Gerinnungszeit (Zeit zwischen Initiierung der Gerinnung bis zum Beginn einer messbaren Änderung der Blut-Viskosität, Clotting time, CT)
  • • Stabilität des Thrombus (Maximale Amplitude, Maximum Clot Firmness, MCF)
  • • Zeit der Fibrinolyse (Zeit zwischen dem Beginn einer messbaren Änderung der Blut-Viskosität und Erreichen des Ausgangswertes vor der Gerinnung, Lysis-time, LT).
In order to demonstrate the therapeutic potential of the polypeptides according to the invention, blood coagulation and fibrinolysis in the presence of recombinant tridegin polypeptide (SEQ ID NO: 1, 5 ) or a fragment of tridegin (SEQ ID NO: 25, 6 ) measured in whole blood. For this purpose, so-called thrombelastograms were recorded. Thrombelastography is a common method for measuring coagulation and fibrinolysis. In this case, the change in the viscosity of the blood is measured by the change in the rotational resistance of a stamp located in the blood (Calatzis et al., 2000). The 4 shows the typical phases of coagulation and fibrinolysis in a thrombelastogram. Thrombelastograms quantify important parameters of hemostasis:
  • Clotting time (time between initiation of coagulation until the beginning of a measurable change in blood viscosity, clotting time, CT)
  • Thrombus Stability (Maximum Amplitude, Maximum Clot Firmness, MCF)
  • • Time of fibrinolysis (time between the onset of a measurable change in blood viscosity and reaching the baseline pre-coagulation, lysis-time, LT).

Für die dargestellten Messungen wurde das ROTEG®-Gerät der Fa. Pentapharm GmbH, München verwendet. 5 und 6 zeigen die Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut nach Zugabe von Ca2+ (Starteg-Reagenz, Fa. Pentapharm GmbH) und Thromboplastin-Phospholipid (Integ-Reagenz, Fa. Pentapharm GmbH). Diese Reagenzien dienen zur Induktion der Koagulation.For the measurements shown the ROTEG ® device the company was. Pentapharm GmbH, Munich used. 5 and 6 show the thrombelastograms of citrated whole blood after addition of Ca 2+ (Starteg reagent, Fa. Pentapharm GmbH) and thromboplastin phospholipid (Integ reagent, Fa. Pentapharm GmbH). These reagents serve to induce coagulation.

Um die erfindungsgemäße synergistische Wirkung von herkömmlichen, in der Thrombose-Therapie verwendeten, fibrinolytischen Agenzien mit rekombinantem Tridegin Polypeptid und modifizierten Trideginen zu zeigen, wurden verschiedene Versuche durchgeführt. Die Thrombelastogramme zeigen, dass das rekombinante Tridegin Polypeptid und ein modifiziertes Tridegin die Fibrinolyse durch die als Beispiel gewählten fibrinolytischen Agenzien Gewebe-Plasminogen Aktivator (tPA) und Urokinase beschleunigt und verbessert. Dies wird durch

  • a) die geringere Amplitude (geringere Stabilität des Thrombus) und
  • b) die beschleunigte Fibrinolyse deutlich.
In order to demonstrate the synergistic effect according to the invention of conventional fibrinolytic agents with recombinant tridegin polypeptide and modified tridegins used in thrombosis therapy, various experiments were carried out. The thrombelastograms show that the recombinant tridegin polypeptide and a modified tridegin accelerate and enhance fibrinolysis by the exemplary fibrinolytic agents tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase. This is going through
  • a) the lower amplitude (lower stability of the thrombus) and
  • b) the accelerated fibrinolysis significantly.

Aus der Verlängerung der Gerinnungszeit (CT) von 190 Sekunden in Abwesenheit eines Transglutaminase Inhibitors zu 380 Sekunden in Anwesenheit des rekombinanten wildtyp Tridegin Polypeptides (SEQ ID NO: 1) oder eines modifizierten Tridegins wird außerdem ersichtlich, dass das rekombinante Tridegin Polypeptid und ein modifiziertes Tridegin zusätzlich die Blutgerinnung hemmt (vgl. 5A und B).It is also apparent from the extension of the coagulation time (CT) of 190 seconds in the absence of a transglutaminase inhibitor at 380 seconds in the presence of the recombinant wild-type tridegin polypeptide (SEQ ID NO: 1) or a modified tridegin, the recombinant tridegin polypeptide and a modified tridegin additionally inhibits blood clotting (cf. 5A and B).

Sequenzprotokoll

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sequence Listing
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Claims (8)

Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Modifikation enthält, ausgewählt aus einer Substitution mindestens eines Cysteins durch eine andere Aminosäure und/oder einer Substitution mindestens einer der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch eine andere Aminosäure und/oder einer Deletion des N- und C-Terminus, wobei das verbleibende Polypeptid mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID Nr. 47) enthält und aus weniger als 40 Aminosäuren besteht, und/oder einer kovalenten Verknüpfung mit Polyethylenglykol.Polypeptide according to SEQ ID NO: 1, characterized in that it contains at least one modification selected from a substitution of at least one cysteine by another amino acid and / or a substitution of at least one of the following amino acids - Lys2, Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 - by another amino acid and / or a deletion of the N- and C-terminus, the remaining polypeptide having at least the amino acid sequence DDIYQRPVEFPNLPLK (SEQ ID NO. 47) and consists of less than 40 amino acids, and / or a covalent linkage with polyethylene glycol. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in an sich bekannter Weise ein gentechnisches oder peptidchemisches Verfahren einsetzt.Process for the preparation of a polypeptide according to Claim 1, characterized in that in known per se A gene engineering or peptide chemical method uses. Verwendung eines Polypeptides nach Anspruch 1 als Transglutaminaseinhibitor.Use of a polypeptide according to claim 1 as Transglutaminaseinhibitor. Verwendung eines Polypeptides nach Anspruch 1 zur Prävention und Therapie von Thrombosen.Use of a polypeptide according to claim 1 for prevention and therapy of thrombosis. Arzneimittel enthaltend ein Polypeptid nach Anspruch 1 und mindestens einem galenischen Hilfsstoff.A pharmaceutical composition containing a polypeptide according to claim 1 and at least one galenic adjuvant. Kombinationspräparat enthaltend ein Polypeptid nach Anspruch 1 und mindestens einen weiteren pharmazeutischen Wirkstoff.combination preparation containing a polypeptide according to claim 1 and at least one further pharmaceutical agent. Kombinationspräparat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff ein Antikoagulans, vorzugsweise Inhibitoren von Thrombin, Faktor Xa und/oder Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation, ist.combination preparation according to claim 6, characterized in that the further active ingredient an anticoagulant, preferably inhibitors of thrombin, factor Xa and / or inhibitors of platelet aggregation. Kombinationspräparat enthaltend ein Polypeptid nach Anspruch 1 und gegebenenfalls einen weiteren pharmazeutischen Wirkstoff in beliebiger Kombination mit Acetylsalicylsäure, Heparin, niedermolekularem Heparin, Heparinoid, Hirudin, Bivalirudin, Melagatran, Abciximab, Eptifibabide, Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA), Streptokinase, Staphylokinase, Urokinase, Eminase, Hementin und/oder Plasmin.combination preparation containing a polypeptide according to claim 1 and optionally one another pharmaceutical active ingredient in any combination with acetylsalicylic acid, Heparin, low molecular weight heparin, heparinoid, hirudin, bivalirudin, Melagatran, abciximab, eptifibabide, tissue plasminogen activator (tPA), Streptokinase, staphylokinase, urokinase, eminase, hementin and / or Plasmin.
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