DE4238967C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Messen von Redoxpotentialen - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zum Messen von Redoxpotentialen

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Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen von Redoxpotentialen infolge von radikalbewirkten Änderungen der Reduktions-Oxidationseigenschaften im biologischen Milieu. Dabei wird zum notwendigen Schutz des Schliffdiaphragmas der Referen­ zelektrode vor direktem Kontakt mit dem Analysematerial eine Elektrolytkapillare eingesetzt.
Es ist bekannt, Radikalwirkungen im biologischen Milieu im we­ sentlichen zu bestimmen bzw. zu erfassen:
  • 1. durch eine Messung der Elektronenspinresonanz (ESR),
  • 2. mittels der Bestimmung von Malondialdehyd (MDA) über eine Kopplung an Thiobarbitursäure (TBA) als kalorimetrischer Test,
  • 3. durch die DIEN-Konjugation (DC-Test) als Index der Lipidperoxidation oder
  • 4. über eine Messung der veränderten Fluoreszenzeigenschaften von Proteinen.
In folgenden Literaturstellen sind die angesprochenen Meßmetho­ den beschrieben:
DORMANDY, T. L. and WICKENS, D. G.
Clinical laboratory tests as indicators of free-radical reac­ tions. Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease by D. ARMSTRONG et al., eds.
RAVEN PRESS, New York, 1984, pp. 267-273.
DENHAM HARMAN
Free radicals and the origination, evolution and present status of the free-radical theory of aging.
Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease by D. ARMSTRONG et al., eds.
RAVEN PRESS, New York, 1984, pp. 1-12.
WILLIAM A. PRYOR
Free radicals in autoxidation and in aging.
Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease by D. ARMSTRONG et al., eds.
RAVEN PRESS, New York, 1984, pp. 13-41.
HAROLD M. SWARTZ
Electron spin resonance studies of cancer: Experimental results and conceptual implications.
Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease by D. ARMSTRONG et al., eds.
RAVEN PRESS, New York, 1984, pp. 275-292.
KALYANARAMAN. B. and SIVARAJAH K.
The electron spin resonance study of free radicals formed during the arachidonic acid cascade and cooxidation of xenobiotics by prostaglandin synthase.
Free Radicals in Biology, Vol. VI
Academic Press, Inc., 1984, pp. 149-198.
TORRIELLI. M. V. and M. U. DIANZANI, M. U.
Free radicals in inflammatory disease.
Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease by D. ARMSTRONG et al., eds.
RAVEN PRESS, New York, 1984, pp. 355-379.
Die Meßmethoden sind größtenteils ungeeignet, kompliziert auszu­ führen und aufwendig. Die dazugehörige Meßtechnik ist äußerst kapitalintensiv. Die gewonnenen Aussagen sind durch eine unzu­ reichende Spezifität bzw. auch durch eine unzureichende Sensiti­ vität begrenzt.
Weiter ist die Verwendung von Kapillaren als Stromschlüssel be­ kannt (Cammann, K. "Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektro­ den", Kap. 2.3.4, 2.4.1.1, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1977). Auch wird darin der Einsatz eines reinen Drah­ tes aus Silber ( oder eines versilberten Platindrahtes) ange­ sprochen, dessen Oberfläche mit Chlorionen konditioniert ist.
Der Nachteil dieser Anordnung besteht darin, daß sie bei Messun­ gen radikalbewirkter Änderungen von Redoxpotentialen im biologi­ schen Milieu, das Proteine, Lipoproteine enthält, nicht geeig­ net ist. Hier will die Erfindung Abhilfe schaffen.
Der in Ansprüchen angegebenen Erfindung liegt das Problem zu­ grunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen radikalbe­ wirkter Änderungen der Reduktions-Oxidationseigenschaften im biologischen Milieu vorzuschlagen, mit dem eindeutige quantita­ tive Aussagen sowohl bei Anwesenheit von Radikalen als auch nach dem im Körper eingetretenen Störeinfluß und/oder schädigenden Folgen durch den erfolgten Umsatz mit körpereigenen Substanzen möglich sind.
Erfindungsgemäß wird das Problem durch die in den Patentansprü­ chen 1 bis 6 angegebenen Merkmale gelöst.
Mit der Erfindung werden folgende Vorteile erzielt:
  • 1. In nativen Biomaterialien wie Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis usw. sind redoxanalytische Untersuchungen möglich. Die zur Messung notwendige Referenzelektrode wird über die Elektrolytkapillare mit dem Analysenmaterial lediglich indirekt in Kontakt gebracht. Auf diese Weise bleibt das empfindliche Schliffdiaphragma der Referenz­ elektrode durch das Analysenmaterial (Proteine, Lipoproteine, Lipide u. a.) unbeeinflußt.
  • 2. Die Spülbehandlung der inerten blanken Platinelektrode als Ableitelektrode mittels Kochsalzlösung höherer Konzentration nach jeder Messung bewirkt eine Überwindung der durch Chemisorption beim Kontakt mit dem Analysenmaterial an der Oberfläche fixierten Substanzen. Die Platinoberfläche wird somit ohne eine aggressive Vorbehandlung für weitere Messungen reproduzierbar gereinigt und konditioniert. Routinemessungen großer Probenserien sind ohne größeren Zeitaufwand möglich.
  • 3. Durch die Zugabe der Biowirkstoffe bzw. weiterer Redoxindikatoren werden Aussagen über die Reduktions- Oxidationsbedingungen in den Analysenproben erhalten. Die Messungen werden standardisiert vorgenommen. Die Meßergebnisse sind also direkt miteinander vergleichbar. Der die Redoxeigenschaften (Nachgiebigkeit, Beschwerung, rH-Wert, Redoxpufferung) verändernde Einfluß von Radikalreaktionen wird direkt meßbar. Routinemäßig sind Aussagen über den im lebenden Organismus ausgeübten Störeinfluß bzw. über den schädigenden Einfluß durch Radikalwirkungen bis zu Aussagen über sich entwickelnde bzw. mögliche pathologische Zustände zu gewinnen.
Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In der beigefügten Zeichnung ist ein schemati­ scher Aufbau der Meßvorrichtung dargestellt.
Die in der Figur schematisch dargestellte Meßvorrichtung besteht aus:
  • a) einer Referenzelektrode 1 (als Halbelement mit einem bekannten Potentialwert gegenüber der Normal-Wasser­ stoff-Elektrode),
  • b) einer mit der Referenzelektrode 1 luftdicht und flexibel verbundenen, mit einem Elektrolyt gefüllten Kapillare 3 (Elektrolytkapillare),
  • c) einer blanken Platinelektrode als Ableitelektrode 5 sowie
  • d) aus einem Voltmeter mit digitaler Meßanzeige 6 (Di­ gitalvoltmeter).
Die Wirkungsweise wird wie folgt beschrieben:
Mit Hilfe der Elektrolytkapillare 3, gefüllt mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9%ig, w/v) als Elektrolyt, isoto­ nisch zum Analysenmaterial 7, wird das gegenüber der verstopfenden bzw. blockierenden Wirkung der Lipoproteine und anderer Inhaltsstoffe in den Meßproben empfindliche Schliffdiaphragma 2 am unteren Schaftende der Referenz­ elektrode 1 vom Analysenmaterial 7 im Probengefäß 4 ferngehalten, mit diesem jedoch elektrisch in Kontakt gebracht. Die parallel zur Elektrolytkapillare 3 eintau­ chende blanke Platinelektrode 5 dient als inerte Ableitelek­ trode 5 für die Elektronen aus den Übergängen der zu ver­ folgenden Redoxreaktionen. Die ablaufenden Redoxübergänge werden als Potential (-änderungen) an einem Digitalvolt­ meter 6 trägheitsfrei abgelesen.
Die Verfahrensschritte sind folgende:
Die Messungen werden im standardisierten Probenvolumen von 0,5 ml vorgenommen. Die erste Probe wird ohne jegliche Vorbehandlung ausgemessen. Als Ergebnis wird das Leer- oder Basispotential erhalten. Vier weitere Meßproben werden wie folgt vorbehandelt:
Durch Zugabe von
1. 5 mg ATP
2. 5 mg ATP sowie 50 mikro g Coffein
3. 5 mg GTP
4. 5 mg FAD+.
Nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei 20°C wird in diesen Proben ebenfalls das Oxidations-Reduktions-Poten­ tial bestimmt. Im Anschluß an jede Messung werden die Meß­ fühler, Platinelektrode 5 und Elektrolytkapillare 3 30 Se­ kunden in dreimolarer Kochsalzlösung, anschließend 30 Se­ kunden in physiologischer (0,9%iger, w/v) Kochsalzlösung gespült. Nach dieser Behandlung ist die blanke Platinelek­ trode 5 für eine erneute Messung einsetzbar.
Die absoluten Potentialwerte und die relativen Änderungen des Basispotentials je nach der Vorbehandlung der Proben 7 erlauben Aussagen über erfolgte Umsetzungen bzw. Reaktionen mit Radikalen (vergl. Tabellen-Anhang!).

Claims (7)

1. Verfahren zum Messen von Redoxpotentialen infolge von radi­ kalbewirkten Änderungen der Reduktions-Oxidationseigenschaften bei relativer Verschiebung des Potentialwertes des Basispoten­ tials durch Zugabe der Biowirkstoffe im biologischen Milieu, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem parallel zur Elektrolyt­ kapillare (3) in das Analysenmaterial (7) als Ableitelektrode (5) eine blanke Platinelektrode mit einer durch hohe Konzen­ trationen an Chlorionen, vorzugsweise größer/gleich zweimolar Natriumchlorid in aqua destillata, konditionierten Oberfläche benutzt wird, daß bei dem als Elektrolyt eine 0,9%ige (w/v) Lösung von Natriumchlorid in aqua destillata verwendet wird, daß bei dem bei gestörten Reduktions-Oxydations-Verhältnissen nach Radikalreaktionen im biologischen Milieu die Wirkstoffe:
  • - Adeosintriphosphorsäure-Dinatriumsalz (ATP),
  • - ATP plus Coffein,
  • - Guanosintriphosphorsäure-Dinatriumsalz (GTP) und
  • - Flavinadenindinukleotid/oxidiert (FAD⁺)
eingesetzt und daß die ablaufenden Redoxübergänge als Potential­ änderungen an einem Digitalvoltmeter (6) trägheitsfrei gemessen werden.
2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine zum notwendigen Schutz des Schliffdiaphragmas (2) und zur Vermeidung eines direkten Kon­ taktes mit dem Analysematerial (7) benutzte Referenzelektrode (1) luftdicht und flexibel in einer Elektrolytkapillare (3) angeordnet ist, daß parallel zu der Elektrolytkapillare (3) in das Analysenmaterial (7) eine Ableitelektrode (5) eintaucht und daß zum trägheitsfreiem Messen der die ablaufenden Redoxüber­ gänge darstellenden Potentialänderungen ein Digitalvoltmeter (6) vorgesehen ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das untere Teilstück der Referenzelektrode (1) das Schliffdiaphrag­ ma (2) bildet.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Schliffdiaphragma (2) in einen oben abgedichteten, mit einem gegenüber dem Analysenmaterial (7) isotonischen Elektrolyt gefüllten Hohlraum als Erweiterung des Glasmantels der Elektro­ lytkapillare (3) hineinragt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das untere, spitze Teilstück der Elektrolytkapillare (3) in das Probengefäß (4) mit dem Analysenmaterial (7) eintaucht.
6. Vorrichtung nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die parallel zur Elektrolytkapillare (3) in das Analysen­ material (7) eintauchende Ableitelektrode (5) eine blanke Pla­ tinelektrode ist, die eine durch hohe Konzentrationen an Chlorionen, vorzugsweise größer/gleich zweimolar Natriumchlorid in aqua destillata, konditionierte Oberfläche besitzt.
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