DE4232781C1 - Sepg. individual constituents as sample mixt. - Google Patents

Sepg. individual constituents as sample mixt.

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Abstract

Sepn. of individual constituents of a mixt. is carried out by two immiscible relatively moving auxiliary materials, one being a stationary phase located in a sample chamber and being eluted by the mobile mixt.-collecting phase, the mixt. being sepd. as a result of the different retardation of motion of its individual constituents in the movement direction.An electric field is generated perpendicular to the mixt. movement direction and within the sample chamber (1). The individual constituents are withdrawn at sample chamber wall regions which are offset in the direction of the electric field lines and which lie opposite the inlet side of the sample chamber (1).

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Abtrennen einzelner Bestandteile eines Stoffgemisches mittels zweier nicht mischbarer, gegeneinander bewegter Hilfsstoffe, von denen sich einer als stationäre Phase in einer Probenkammer befindet und mit der zweiten, das Stoffgemisch aufnehmenden Phase eluiert wird, und wobei das Stoffgemisch aufgrund der unterschiedlich starken Verzögerung der Wanderungsbewegung seiner einzelnen Bestandteile in der Wanderungsrichtung getrennt wird.The invention relates to methods for separating individual Components of a mixture of substances by means of two immiscible, mutually moving auxiliary substances, one of which is a stationary phase in a Sample chamber is located and with the second, the mixture of substances receiving phase is eluted, and wherein the Mixture of substances due to the different degrees of delay the migratory movement of its individual Components are separated in the direction of migration.

Dieses als zweiphasige Chromatographie bezeichnete Verfahren hat in der analytischen Trenntechnik weite Verbreitung gefunden. Bei ihm wird eine im Idealfall punktförmige Probe der zu analysierenden Substanz auf eine der stationären Phase gefüllte hohle Säule aufgegeben und mittels des Eluenten durch diese Säule gespült. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Durchlaufgeschwindigkeit verlassen die einzelnen Bestandteile die Säule zu verschiedenen Zeiten. Eine Umsetzung dieser Analysetechnik in den präparativen Maßstab läßt sich bis zu einem gewissen Grad dadurch erreichen, daß der Säulendurchmesser vergrößert wird. Dies führt allerdings gleichzeitig zu einer Verringerung der Trennschärfe. Hinzu kommt, daß eine ganze Reihe von Substanzen chromatographisch nicht trennbar ist.This is referred to as two-phase chromatography Process has a wide range in analytical separation technology Spread found. With him, ideally  punctiform sample of the substance to be analyzed a hollow column filled with the stationary phase was abandoned and flushed through this column using the eluent. Because of their different throughput speeds the individual components leave the Pillar at different times. An implementation of this Analysis technology in the preparative scale can be achieve to a certain extent by the fact that Column diameter is increased. However, this leads at the same time to a reduction in the selectivity. Add to that a whole range of substances cannot be separated chromatographically.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, das auch für kontinuierliche präparative Zwecke anwendbar ist und bei dem zugleich das Spektrum der zu trennenden Substanzen wesentlich erweitert wird.The object of the invention is a method of the beginning Specify the type mentioned, even for continuous preparative purposes is applicable and where at the same time, the spectrum of the substances to be separated is essential is expanded.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Patentanspruchs 1. Durch dieses erfindungsgemäße Verfahren wird dem eindimensionalen Bewegungsablauf in der herkömmlichen Säulenchromatographie eine Bewegungskomponente in einer zweiten Dimension hinzugefügt und das im Prinzip diskontinuierlich arbeitende Chromatographieverfahren in ein kontinuierlich arbeitendes überführt. Zugleich wird der Verlust an Trennschärfe, der sich bei einem einmaligen breiten Applizieren des zu trennenden Stoffgemisches, wie in der präparativen Chromatographie allgemein üblich, zwangsläufig einstellt, vermieden.The invention solves this problem by a method with the characterizing features of the claim 1. Through this inventive method the one-dimensional movement in the conventional Column chromatography a component of motion added in a second dimension and that in Principle of discontinuous chromatography processes converted into a continuously working. At the same time, the loss of selectivity that occurs at a single wide application of the to be separated Mixture of substances, as in preparative chromatography generally used, inevitably sets, avoided.

Die Erfindung macht dabei Gebrauch von einem Prinzip, das aus der sogenannten trägerfreien Durchflußelektrophorese, wie sie in der Zeitschrift "Applied microgravity technology II, 1989, Heft 1, Seiten 52 bis 56, beschrieben ist, bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein Stoffgemisch mittels eines Trägerelektrolyten durch eine Trennkammer befördert, in der senkrecht zur Eintrittsrichtung der Flüssigkeit ein elektrisches Feld erzeugt wird. Da in vielen Fällen die verschiedenen Bestandteile eines Stoffgemisches unterschiedlich stark abgelenkt werden, erreichen sie den Ausgang der Trennkammer an räumlich voneinander getrennten Positionen. Im Gegensatz zur Chromatographie wird die trägerfreie Durchflußelektrophorese in der Regel ohne den Einsatz einer stationären Phase durchgeführt.The invention makes use of a principle that from the so-called carrier-free flow electrophoresis, as described in the magazine "Applied microgravity technology II, 1989, volume 1, pages 52 to 56,  is described, is known. With this procedure a mixture of substances by means of a carrier electrolyte transported a separation chamber in the direction perpendicular to the direction of entry the liquid is an electric field is produced. Because in many cases the different Components of a mixture of substances vary in strength are deflected, they reach the exit of the separation chamber at spatially separate positions. In contrast to chromatography, the carrier-free Flow electrophoresis usually without the use a stationary phase.

Da die erfolgreiche Durchführung dieses bekannten Verfahrens eine absolut turbulenzfreie Strömung des Elektrolyten in der Trennkammer voraussetzt, ist in der DE 28 40 614 A1 bereits vorgeschlagen worden, ein gelförmiges Trägermedium für die zu trennenden Substanzen einzusetzen, das auf mechanischem Wege durch das elektrische Feld bewegt wird. Daneben ist aus der DE 25 08 844 A1 ein Verfahren bekannt geworden, mit dessen Hilfe das bei der trägerfreien, kontinuierlichen Durchflußelektrophorese sich durch das Geschwindigkeitsprofil des Trägerelektrolyten einstellende Strömungsprofil zur Verbesserung der Trennschärfe des Verfahrens kompensiert werden kann. Schließlich ist aus der US 51 31 994 ein Trennverfahren bekannt geworden, bei dem die trägerfreie Durchflußelektrophorese mit einem Membrantrennverfahren in der Weise kombiniert wird, daß eine in der Trennkammer angeordnete Membran tangential, d. h. im sogenannten Cross-Flow, vom Trägerelektrolyten angeströmt und auf der Außenseite der Membran die abzutrennende Substanz aufgefangen wird.Because the successful implementation of this known Process an absolutely turbulence-free flow of the Requires electrolytes in the separation chamber is in the DE 28 40 614 A1 has already been proposed gel-shaped carrier medium for the substances to be separated use that by mechanical means the electric field is moved. Next to it is from the DE 25 08 844 A1 discloses a method with whose help that with the strapless, continuous Flow electrophoresis through the velocity profile of the carrier electrolyte Flow profile to improve the selectivity of the Procedure can be compensated. Finally over a separation method has become known from US 51 31 994, in which the carrier-free flow electrophoresis with a membrane separation process combined in the way is that a membrane arranged in the separation chamber tangential, d. H. in the so-called cross-flow, from the carrier electrolyte flowed towards and on the outside of the Membrane the substance to be separated is collected.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wird hingegen die elektrophoretische Ablenkung der einzelnen Bestandteile des zu trennenden Stoffgemisches dem chromatographischen Effekt überlagert. Dies führt neben den bereits beschriebenen Vorteilen dazu, daß sich auch Substanzen voneinander trennen lassen, die mit rein chromatographischer Trenntechnik nicht trennbar sind. Andererseits lassen sich aufgrund des chromatographischen Trenneffektes Substanzen, wie beispielsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) und deren Bestandteile voneinander separieren, die auf dem oben genannten elektrophoretischem Wege nicht getrennt werden können. Durch eine gezielte Variation der Eluentengeschwindigkeit und damit der Aufenthaltsdauer im Bereich des elektrischen Feldes kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Grad der Ablenkung aus der primären Wanderungsrichtung beeinflußt werden.In the method according to the invention, however, the electrophoretic distraction of the individual components of the mixture of substances to be separated  chromatographic effect overlaid. This leads alongside the advantages already described that Have substances separated from each other with pure chromatographic separation technology are not separable. On the other hand, due to the chromatographic Separating substances, such as Deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) and separate their components from each other on not the electrophoretic way mentioned above can be separated. Through a targeted variation the eluent speed and thus the length of stay in the area of the electrical field can method according to the invention of the degree of distraction the primary direction of migration.

Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Die Figur zeigt eine schematische perspektivische Darstellung einer Probenkammer 1, die mit einem Chromatographie-Trennmaterial, im Fall des hier beschriebenen Ausführungsbeispiels handelt es sich dabei um ein spezifisches Trenngel, gefüllt ist. The invention will be explained in more detail below on the basis of an exemplary embodiment shown in the drawing. The figure shows a schematic perspective illustration of a sample chamber 1 which is filled with a chromatography separation material, in the case of the exemplary embodiment described here it is a specific separation gel.

Die Probenkammer 1 ist auf ihrer Oberseite mit einer Reihe von nebeneinanderliegenden schlitzförmigen Einlaßöffnungen 2 versehen, durch die der Eluent, im Fall des hier beschriebenen Ausführungsbeispiels eine wäßrige Lösung mit Puffersalzen, wie sie bei der Reinigung von Proteinen verwendet wird, also beispielsweise PBS oder TRIS in die Probenkammer strömt, wie in der Figur durch Pfeile angedeutet.The top of the sample chamber 1 is provided with a series of adjacent slot-shaped inlet openings 2 through which the eluent, in the case of the exemplary embodiment described here, has an aqueous solution with buffer salts, such as is used in the purification of proteins, for example PBS or TRIS in the sample chamber flows as indicated by arrows in the figure.

Auf der den Einlaßöffnungen 2 gegenüberliegenden Seite der Probenkammer 1 sind eine Reihe ebenfalls schlitzförmiger Auslaßöffnungen 3 angeordnet, die teilweise mit einem in der Figur nicht dargestellten Rückführsystem für den Eluenten verbunden sind und teilweise mit in der Figur ebenfalls nicht dargestellten Entnahmevorrichtungen für die einzelnen Fraktionen der zu zerlegenden Probensubstanz. Vervollständigt wird die Kammer durch eine Vorrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Feldes, dessen Feldlinien, in der Figur durch die Lage der Anode und der Kathode angedeutet, im wesentlichen senkrecht zu der durch die Pfeile gekennzeichnete Strömungsrichtung des Eluenten verlaufen. Diese Vorrichtung ist nach Art einer Membrankammer ausgebildet, d. h., der Elektrodenraum wird mittels geeigneter Membranen vom eigentlichen Trennraum abgeteilt, um ein Vermischen der im Elektrodenraum ablaufenden Prozesse mit der eigentlichen Trennung und ein Eindringen des Trennmaterials in den Elektrodenraum mechanisch zu verhindern, aber gleichzeitig die Permeation der Ionen zu erlauben. Die Feldstärke muß dem Trennproblem angepaßt werden. Das in seine einzelnen Komponenten zu zerlegende Stoffgemisch wird, wie in der Figur durch den stärkeren Pfeil angedeutet, durch eine der Einlaßöffnungen 2 zusammen mit dem Eluenten in die Probenkammer 1 eingebracht. Aufgrund der unterschiedlichen chromatographischen Eigenschaften, durch die sich eine unterschiedliche Verweildauer im elektrischen Feld und damit eine unterschiedlich starke Auslenkung aus der anfänglichen Einströmrichtung ergibt, und/oder der unterschiedlichen elektrophoretischen Eigenschaften der in dem Stoffgemisch enthaltenen Komponenten, die den gleichen Effekt bewirkt, lassen sich diese einzelnen Komponenten an unterschiedlichen Auslaßöffnungen 3 der Probenkammer 1 entnehmen. Dies erfolgt für die beiden Komponenten, aus denen im Fall des hier beschriebenen Ausführungsbeispiels das zu trennende Stoffgemisch besteht, an denjenigen Ausläßöffnungen 3, denen wiederum die stärker gezeichneten Pfeile zugeordnet sind. Die dabei von den verschiedenen Komponenten zurückgelegten Wege in der Probenkammer 1 sind in der Figur durch strichpunktierte Linienzüge angedeutet.On the side of the sample chamber 1 opposite the inlet openings 2 , a series of slot-like outlet openings 3 are arranged, some of which are connected to a return system for the eluent, not shown in the figure, and some of which are also not shown in the figure for the individual fractions of the individual fractions disassembling sample substance. The chamber is completed by a device for generating an electric field, the field lines of which, indicated in the figure by the position of the anode and the cathode, run essentially perpendicular to the flow direction of the eluent indicated by the arrows. This device is designed in the manner of a membrane chamber, that is to say the electrode space is separated from the actual separation space by means of suitable membranes in order to mechanically prevent mixing of the processes taking place in the electrode space with the actual separation and penetration of the separation material into the electrode space, but at the same time permeation to allow the ions. The field strength must be adapted to the separation problem. The mixture of substances to be broken down into its individual components is introduced into the sample chamber 1 together with the eluent through one of the inlet openings 2 , as indicated by the stronger arrow in the figure. Due to the different chromatographic properties, which result in a different residence time in the electric field and thus a different degree of deflection from the initial inflow direction, and / or the different electrophoretic properties of the components contained in the mixture of substances, which have the same effect, these can be remove individual components at different outlet openings 3 of the sample chamber 1 . For the two components that make up the mixture of substances to be separated in the case of the exemplary embodiment described here, this takes place at those outlet openings 3 , which in turn are assigned to the arrows drawn more strongly. The paths covered by the various components in the sample chamber 1 are indicated in the figure by dash-dotted lines.

Bei einer kontinuierlichen Zufuhr von Stoffgemisch und Eluent können auch die Fraktionen des Stoffgemisches kontinuierlich aufgefangen werden. Der Grad der Ablenkung der einzelnen Substanzen läßt sich dabei innerhalb gewisser Grenzen durch die Wahl des in der Probenkammer befindlichen Trennmaterials und die Durchflußgeschwindigkeit des Eluenten beeinflussen. Diese Parameter lassen sich stets so wählen, daß sich für die meisten Stoffgemische ein optimaler Trenneffekt ergibt.With a continuous supply of substance mixture and The fractions of the mixture of substances can also be eluent be continuously collected. The degree of distraction the individual substances can be within certain limits by choosing the one in the sample chamber separating material and the flow rate of the eluent. These parameters can always be chosen so that for the most mixtures of substances gives an optimal separation effect.

Die Abgrenzung zur Chromatographie besteht in der Nutzung der Elektrophorese in der 2. Dimension, um zu einem kontinuierlichen Verfahren zu kommen.The distinction from chromatography is in the Use of electrophoresis in the 2nd dimension to to come in a continuous process.

Die Abgrenzung zur Durchflußelektrophorese besteht in der primären Nutzung der chromatographischen Eigenschaften des Trägers als Separator und der elektrophoretischen Eigenschaften als sekundäre Delokalisierung zum Auffangen.The distinction from flow electrophoresis is in the primary use of the chromatographic properties the carrier as a separator and the electrophoretic Properties as secondary delocalization to catch.

Claims (3)

1. Verfahren zum Abtrennen einzelner Bestandteile eines Stoffgemisches mittels zweier nicht mischbarer, gegeneinander bewegter Hilfsstoffe, von denen sich einer als stationäre Phase in einer Probenkammer befindet und mit der zweiten, das Stoffgemisch aufnehmnenden Phase eluiert wird, und wobei das Stoffgemisch aufgrund der unterschiedlich starken Verzögerung der Wanderungsbewegung seiner einzelnen Bestandteile in der Wanderungsrichtung getrennt wird, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probenkammer (1) ein in etwa senkrecht zur Wanderungsrichtung des Stoffgemisches gerichtes elektrisches Feld erzeugt wird, und daß die einzelnen Bestandteile an in Richtung der elektrischen Feldlinien versetzt angeordneten Bereichen der der Einlaßseite der Probenkammer (1) gegenüberliegenden Wand der Probenkammer (1) entnommen werden. 1. A method for separating individual constituents of a substance mixture by means of two immiscible, mutually moving auxiliary substances, one of which is located as a stationary phase in a sample chamber and is eluted with the second phase which absorbs the substance mixture, and the substance mixture due to the different degrees of delay the migration of its individual components is separated in the direction of migration, characterized in that an electric field directed approximately perpendicular to the direction of migration of the mixture of substances is generated in the sample chamber ( 1 ), and in that the individual components at regions of the electrode which are offset in the direction of the electrical field lines the wall of the sample chamber ( 1 ) opposite the inlet side of the sample chamber ( 1 ) can be removed. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffgemisch sowie der Eluent kontinuierlich in die Probenkammer (1) eingeleitet werden.2. The method according to claim 1, characterized in that the mixture of substances and the eluent are introduced continuously into the sample chamber ( 1 ). 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluent ein wäßriges Elektrolyt eingesetzt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that as an eluent, an aqueous electrolyte is used.
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