DE4214822A1 - Appts. for continuous determn. of oxido:reductase substrate(s) - contg. immobilised enzyme - Google Patents

Appts. for continuous determn. of oxido:reductase substrate(s) - contg. immobilised enzyme

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Abstract

Appts. for continuous determn. of substrates of oxidoreductase enzymes having O2, NAD, NADP or artificial redox mediators as acceptors comprises: a receiver (1) for standard solns., connected via a tube (2) with a sterilising filter (3) and hence with a sample injector (4); a manifold (5) connected via a tube (6) with the tube (2) between the receiver (10 and filter (3); a buffer soln. container (7) connected to the manifold (5) via a tube (ii) contg. an air bubble trap (12); at least one immobilised oxidoreductase enzyme located between the working electrode in the measuring cell (1) and the manifold; a waste soln. container (13) connected via tubes (14 and 14a) with the manifold (5) and measuring cell respectively; valves (V) between each of the standard soln. containers and the receiver (1), in each of the tubes (6,11 and 140 entering the manifold, and between the filter (3) and the junction between tubes (2) and (6); and a control device for controlling the pump (8) and all the valves according to a predetermined program. The tubes are plastics hoses. The tube (11) between the manifold and measuring cell has an oxidoreductase enzyme covalently immobilised on its inner surface. The measuring cell has a working electrode, a reference electrode, a counter electrode and potentiostat. A plastics (esp. polyamide) gauze bearing a covalently immobilised oxidoreductase is placed over the working electrode. For H2O2-forming or O2-consuming enzymes, the working electrode is a Pt, platinised glassy carbon, platinised graphite or Au electrode. For NADH- or NADPH-forming enzymes, the working electrode is a mediator-modified electrode with a potential below 200 mV (versus S,C,E.), esp. a polypyrrole-quinone-modified Pt or glassy carbon electrode or a mediator-modified carbon paste electrode. Alternatively, the measuring cell has photometric or fluorometric detector. ADVANTAGE - The appts. is simple than conventional continuous-flow injection systems.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoredukta­ sen mit O2, NADH oder NADPH oder künstlichen Redoxmediatoren als Akzeptor.The invention relates to a device and a method for the continuous determination of substrates of Oxidoredukta sen with O 2 , NADH or NADPH or artificial redox mediators as acceptors.

Die kontinuierliche Bestimmung von Leitsubstanzen ist für die Regelung von biotechnologischen Prozessen von herausragender Bedeutung. Besonders wichtig ist die Bestimmung von Glucose und Lactat. Jedoch ist auch die Bestimmung aller Substrate von H2O2-bildenden Oxidasen oder von mediator-abhängigen Oxidoreduktasen, also insgesamt die Gruppe der Oxidoredukta­ sen mit O2, NAD und NADP oder künstlichen Redoxmediatoren als Akzeptor wichtig.The continuous determination of key substances is of outstanding importance for the regulation of biotechnological processes. The determination of glucose and lactate is particularly important. However, the determination of all substrates of H 2 O 2 -forming oxidases or of mediator-dependent oxidoreductases, that is to say the group of oxidoreductases with O 2 , NAD and NADP or artificial redox mediators as the acceptor, is also important.

Es sind bereits Vorrichtungen zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten dieser Enzymvorrichtungen bekannt, die das Fließinjektionssystem benutzen. Sie enthalten mindestens zwei Pumpen und ein Injektionsventil. Abgesehen von diesem uner­ wünscht großem Aufwand weisen sie in der Regel ein oder mehrere der folgenden Nachteile auf.There are already devices for continuous determination known from substrates of these enzyme devices that the Use flow injection system. They contain at least two Pumps and an injection valve. Aside from this imm wishes usually a great deal of effort several of the following disadvantages.

Der Abstand des Meßsystems vom Ort der Probenahme ist fixiert und damit von den räumlichen Gegebenheiten abhängig. Die Pumpe wird vielfach von der Probelösung durchflossen, so daß Verschleppungen auftreten. Die Anpassungsfähigkeit an die Größe der Probenvolumina ist begrenzt, der Reagentienver­ brauch unerwünscht hoch. Die simultane Bestimmung mehrerer Substrate ohne gegenseitige Beeinflussung ist nicht möglich.The distance of the measuring system from the sampling location is fixed and thus dependent on the spatial conditions. The Pump is often flowed through by the sample solution, so that Delay occurs. The adaptability to the The size of the sample volume is limited, the reagent volume need undesirably high. The simultaneous determination of several Substrates without mutual interference are not possible.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Vorrichtung nach dem Fließinjektionssystem zu schaffen, welche die obengenannten Nachteile nicht aufweist. The invention has for its object an improved To create device according to the flow injection system, which does not have the disadvantages mentioned above.  

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Vorrich­ tung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen mit O2, NAD oder NADP als Akzeptor, welche gekennzeichnet ist durch einen Standardlösungssammler 1, der durch eine Rohrleitung 2 mit einem Sterilfilter 3 und von dort weiter mit einer Probenzuführung 4 verbunden ist, durch eine Mehrwegeverbindung 5, die über Rohrleitung 6 mit der Rohrleitung 2 zwischen Sammler 1 und Sterilfilter 3 verbunden ist, durch einen Pufferlösungsbehälter 7, der über eine die Pumpe 8 enthaltene Rohrleitung 9 mit der Mehrwegeverbindung 5 verbunden ist, durch eine Meßzelle 10, die mit der Mehrwege­ verbindung 5 über eine Rohrleitung 11 verbunden ist, die eine Luftblasenfalle 12 enthält und innerhalb der Verbindung zwischen Arbeitselektrode in der Meßzelle 10 und der Mehrwe­ geverbindung 5 mindestens eine träger fixierte Oxidoreduktase angeordnet ist, einen Abfallösungsbehälter 13, der über Rohrleitungen 14 und 14a mit der Mehrwegeverbindung 5 bzw. der Meßzelle 10 verbunden ist, durch Sperrventile V zwischen jedem von mehreren Standardlösungsbehältern 15 und dem Stan­ dardlösungssammler 1, in jeder der in die Mehrwegeverbindung 5 eintretenden Leitungen 6, 11 und 14, und zwischen Steril­ filter 3 und der Einmündung von Rohrleitung 6 in Rohrleitung 2, sowie durch eine Steuervorrichtung, welche die Pumpe 8 und alle Ventile nach vorgegebenem Arbeitsschema steuert.This object is achieved according to the invention by a device for the continuous determination of substrates of oxidoreductases with O 2 , NAD or NADP as an acceptor, which is characterized by a standard solution collector 1 which is connected through a pipeline 2 with a sterile filter 3 and from there with a sample feed 4 is connected by a multi-way connection 5 , which is connected via pipe 6 to the pipe 2 between collector 1 and sterile filter 3 , by a buffer solution container 7 , which is connected via a pipe 9 containing the pump 8 to the multi-way connection 5 , by a measuring cell 10 , which is connected to the multi-way connection 5 via a pipe 11 , which contains an air bubble trap 12 and within the connection between the working electrode in the measuring cell 10 and the multi-way connection 5, at least one carrier-fixed oxidoreductase is arranged, a waste solution container 13 , which via pipes 14 and 1 4 a is connected to the multi-way connection 5 or the measuring cell 10 , by check valves V between each of several standard solution containers 15 and the standard solution collector 1 , in each of the lines 6 , 11 and 14 entering the multi-way connection 5 , and between sterile filters 3 and the confluence of pipeline 6 in pipeline 2 , and by a control device which controls the pump 8 and all valves according to a predetermined working scheme.

Die Rohrleitungen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung beste­ hen vorzugsweise ganz oder teilweise aus Kunststoff, wobei besonders bevorzugt Kunststoffschläuche verwendet werden. Der Kunststoff soll inert gegenüber den Lösungsmitteln sein. Daher werden entsprechende Rohrleitungen oder Schläuche aus Polytretrafluorethylen, Polypropylen, Polyethylen, Polyamiden bevorzugt, es können jedoch auch andere Kunststoffe bzw. Nicht-Kunststoffmaterialien wie Glasrohre u. dgl. verwendet werden. Wichtig ist, daß eine trägerfixierte Oxidoreduktase zwischen der Mehrwegeverbindung 5 und der Meßzelle 10 an­ geordnet wird. Dies erfolgt zweckmäßig so, daß die Rohrlei­ tung 11 mindestens einen Kunststoffschlauch enthält, an dessen Innenseite Oxidoreduktase kovalent fixiert ist. Die Fixierung von Enzymen an Kunststoffoberflächen ist an sich bekannt. Als besonders geeignet im Hinblick auf die Einfach­ heit der Fixierung und die Dauerhaftigkeit derselben sind Polyamidrohre wie z. B. Nylonschläuche oder Perlonschläuche. Auch Polyolefinschläuche, insbesondere Polyethylen- und Polypropylenschläuche, sowie Copolymere derselben, sind gut geeignet. Generell können alle Kunststoffe verwendet werden für welche Enzymfixierungsmethoden zur Verfügung stehen, die eine ausreichend hohe Fixierungsausbeute ermöglichen. Derar­ tige Kunststoffe und die zugehörigen Fixierungsmethoden sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.The pipes in the device according to the invention are preferably made entirely or partially of plastic, with plastic tubes being particularly preferably used. The plastic should be inert to the solvents. Corresponding pipes or hoses made of polytretrafluoroethylene, polypropylene, polyethylene, polyamides are therefore preferred, but other plastics or non-plastic materials such as glass tubes and the like can also be used. Like. Be used. It is important that a carrier-fixed oxidoreductase is arranged between the multipath 5 and the measuring cell 10 . This is advantageously done so that the Rohrlei device 11 contains at least one plastic hose, on the inside of which oxidoreductase is covalently fixed. The fixing of enzymes on plastic surfaces is known per se. As particularly suitable with regard to the simplicity of the fixation and the durability of the same are polyamide pipes such. B. nylon tubing or perlon tubing. Polyolefin hoses, in particular polyethylene and polypropylene hoses, as well as copolymers thereof, are also well suited. In general, all plastics can be used for which enzyme fixation methods are available, which enable a sufficiently high fixation yield. Such plastics and the associated fixing methods are known to the person skilled in the art and need not be explained in more detail here.

Die Meßzelle 10 enthält eine elektrochemische, photometrische oder fluorometrische Detektionsanordnung. Im Falle der elek­ trochemischen Detektion enthält die Meßzelle 10 mindestens eine Arbeitselektrode, eine Referenzelektrode und eine Gegen­ elektrode sowie einen Potentiostaten, welcher der oder den Arbeitselektroden ein konstantes Arbeitspotential aufprägt.The measuring cell 10 contains an electrochemical, photometric or fluorometric detection arrangement. In the case of electro-chemical detection, the measuring cell 10 contains at least one working electrode, a reference electrode and a counter electrode, as well as a potentiostat which imparts a constant working potential to the working electrode or electrodes.

Alternativ zur Fixierung des Enzyms an der Innenseite eines Kunststoffrohres oder Kunststoffschlauches ist auch die Verwendung eines Kunststoffnetzes möglich, welches den Vor­ teil hat, daß es direkt über der Arbeitselektrode in der Meßzelle 10 angebracht werden kann, beispielsweise einfach durch einen O-Ring. Damit wird der Weg zwischen der Bildung der zu messenden Substanz, also H2O2, NADH oder NADPH und der eigentlichen Meßstelle minimiert, was eine besonders hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit der Messung ermöglicht. Im speziellen kann der Kunststoffträger ein gewobenes Netz mit definierter Fadenstärke und Fadenabstand sein, so daß die Diffusionscharakteristika vorbestimmt werden können. As an alternative to fixing the enzyme on the inside of a plastic tube or plastic hose, the use of a plastic network is also possible, which has the advantage that it can be attached directly above the working electrode in the measuring cell 10 , for example simply by means of an O-ring. The path between the formation of the substance to be measured, that is to say H 2 O 2 , NADH or NADPH, and the actual measuring point is thus minimized, which enables particularly high accuracy and sensitivity of the measurement. In particular, the plastic carrier can be a woven network with a defined thread thickness and thread spacing, so that the diffusion characteristics can be predetermined.

Das unterscheidet diese Elektroden von Enzymmembran-Elektro­ den, die einen hohen Diffusionswiderstand aufweisen.This differentiates these electrodes from enzyme membrane electro those that have a high diffusion resistance.

Die Rohrleitung 11 kann auch mehrere parallel angeordnete Leitungen enthalten, in denen verschiedene Oxidoreduktasen fixiert vorliegen, so daß eine simultane Bestimmung mehrerer Substrate durch Umschaltung des Flüssigkeitsstromes von einer der parallelen Rohrleitungen zu einer anderen ermöglicht wird.The pipeline 11 can also contain a plurality of lines arranged in parallel, in which different oxidoreductases are fixed, so that a simultaneous determination of a plurality of substrates is made possible by switching the liquid flow from one of the parallel pipelines to another.

Geeignete Meßzellen sind an sich bekannt. Im folgenden wird die Erfindung anhand einer elektrochemischen Meßzelle näher beschrieben. Bei photometrischen oder fluorometrischen Meß­ zellen gelten die Erläuterungen mit den für den Fachmann offensichtlichen analogen Anordnungen. Mehrere Arbeitselek­ troden werden benötigt, wenn entweder mehrere verschiedene Oxidoreduktasen zur Bestimmung verschiedener Substrate einge­ setzt werden und dabei jeweils auf einem Kunststoffnetz fixiert direkt über der Arbeitselektrode angebracht sind. Ebenfalls kann es vorteilhaft sein im Falle der Anwendung mehrerer parallelgeschalteter Leitungen 11 mit darin fixier­ ten verschiedenen Oxidoreduktasen entweder für jede Rohrlei­ tung eine spezielle Arbeitselektrode anzuordnen oder für jede Art von gebildetem Akzeptor eine gesonderte Arbeitselektrode vorzusehen.Suitable measuring cells are known per se. The invention is described in more detail below with the aid of an electrochemical measuring cell. In the case of photometric or fluorometric measuring cells, the explanations apply with the analog arrangements obvious to the person skilled in the art. Several working electrodes are required if either several different oxidoreductases are used to determine different substrates and are attached to a plastic mesh directly above the working electrode. It may also be advantageous in the case of the use of a plurality of lines 11 connected in parallel with different oxidoreductases fixed therein either to arrange a special working electrode for each pipeline or to provide a separate working electrode for each type of acceptor formed.

Im Falle von H2O2-bildenden oder O2-verbrauchenden Oxidore­ duktasen werden als Arbeitselektroden Platinelektroden, platinisierte Glaskohlenstoffelektroden, platinisierte Gra­ phitelektroden oder Goldelektroden bevorzugt. Jedoch können auch andere Arbeitselektroden verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie für die H2O2-Bestimmung geeignet sind.In the case of H 2 O 2 -forming or O 2 -consuming oxidores ductases, platinum electrodes, platinized glass carbon electrodes, platinized graphite electrodes or gold electrodes are preferred as working electrodes. However, other working electrodes known to be suitable for H 2 O 2 determination can also be used.

Im Falle von NADH oder NADPH bildenden Oxidoreduktasen werden zweckmäßig mediator-modifizierte Elektroden mit einem Poten­ tial von 0 bis 200 mV gegen Kalomelelektrode vorgesehen. In the case of NADH or NADPH forming oxidoreductases appropriately mediator-modified electrodes with a poten tial from 0 to 200 mV against the calomel electrode.  

Besonders bevorzugte Arbeitselektroden für letzteren Fall sind Polypyrrol-Chinon modifizierte Platinelektroden oder gleicherweise modifizierte Glaskohlenstoffelektroden oder mediator-modifizierte Kohlepasteelektroden. Derartige Elek­ troden sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und werden daher nicht näher erläutert.Particularly preferred working electrodes for the latter case are polypyrrole-quinone modified platinum electrodes or equally modified glassy carbon electrodes or mediator-modified carbon paste electrodes. Such elec Troden are also known to the person skilled in the art and are therefore not explained in more detail.

Zur Immobilisierung der Oxidoreduktasen an den Träger werden ebenfalls die bekannten Immobilisierungsmethoden eingesetzt. Im Falle von Nylonschlauch oder Nylongewebe wird vorzugsweise eine Aktivierung mit Dimethylsulfat vorgenommen, das akti­ vierte Nylon wird mit einem Diamin gekuppelt und das so aktivierte Nylon (oder Perlon) wird im Falle von Glycoenzymen mit einem Perjodat-oxidierten Glycoenzym unter Bildung von Schiff′schen Basen, die dann reduziert werden, fixiert. Im Falle einer Fixierung von Carboxylgruppen enthaltenden Enzy­ men werden letztere mit Carbodiimid aktiviert und in dieser aktivierten Form dann direkt an das aktivierte Nylon gebunden oder mit einem anderen divalenten Lösungsmittel wie Glutar­ dialdehyd vernetzt. Mit divalenten Fixierungsmitteln kann auch eine direkte Trägerbindung erfolgen, indem der Träger, z. B. das Nylon, zuerst mit dem divalenten Mittel inkubiert und dann mit dem Enzym umgesetzt wird. Ein besonders geeigne­ tes divalentes Fixierungsmittel Glutardialdehyd.To immobilize the oxidoreductases on the support also the known immobilization methods used. In the case of nylon tubing or nylon fabric is preferred an activation with dimethyl sulfate, the acti fourth nylon is coupled with a diamine and so activated nylon (or Perlon) is used in the case of glycoenzymes with a periodate-oxidized glycoenzyme to form Schiff bases, which are then reduced, fixed. in the In the case of fixation of enzyme containing carboxyl groups The latter are activated with carbodiimide and in this activated form then bound directly to the activated nylon or with another divalent solvent such as glutar cross-linked dialdehyde. With divalent fixatives direct carrier binding is also carried out by the carrier, e.g. B. the nylon, first incubated with the divalent agent and then reacted with the enzyme. A particularly suitable tes divalent fixative glutardialdehyde.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich durch einen im Vergleich zu bekannten Fließinjektionssystemen erheblich vereinfachten Aufbau aus. Das gesamte Meßsystem wird mittels eines Computers gesteuert, wobei die Schlauchquetschventile (v1-v9), Start und Stop der Pumpe sowie deren Laufrichtung über eine DigitalIO-Karte mit angeschlossenem Relaisboard gesteuert werden. Die Geschwindigkeit der Pumpe wird über einen D/A-Wandler geregelt. Die Stromwerte, die an beiden Arbeitselektroden mittels eines Bipotentiostaten gemessen werden, werden mit Hilfe eines A/D-Wandlers digitalisiert und in den Computer eingelesen. The device according to the invention is characterized by a Compared to known flow injection systems considerably simplified structure. The entire measuring system is by means of controlled by a computer, the pinch valves (v1-v9), start and stop of the pump and its direction of rotation via a DigitalIO card with a connected relay board to be controlled. The speed of the pump is about controlled a D / A converter. The current values on both Working electrodes measured using a bipotentiostat are digitized with the help of an A / D converter and read into the computer.  

Ein typischer Meßvorgang hat folgenden Ablauf:A typical measuring process has the following sequence:

  • 1. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
    Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Pufferlösung durch die Meßzelle.    1. v1-v7, v9 closed; v8 opened
    The pump runs forward and pumps buffer solution through the measuring cell.
  • 2. v2-v6, v8, v9 geschlossen; v1, v7 geöffnet
    Die Pumpe läuft rückwärts und saugt den Standard #1 an. Dieser Vorgang erfolgt so lange, bis im Manifold 2 hinter dem Ventil v7 Standardlösung 1 anliegt.    2. v2-v6, v8, v9 closed; v1, v7 open
    The pump runs backwards and sucks standard # 1. This process continues until standard solution 1 is present in manifold 2 behind valve v7.
  • 3. v1-v8 geschlossen; v9 geöffnet
    Die angesaugte Standardlösung wird bei vorwärts lau­ fender Pumpe in den Abfall gepumpt.    3. v1-v8 closed; v9 opened
    The aspirated standard solution is pumped into the waste when the pump is running.
  • 4. v2-v6, v8, v9 geschlossen; v1, v7 geöffnet
    Die Pumpe läuft sehr langsam rückwärts und saugt den Standard #1 an.    4. v2-v6, v8, v9 closed; v1, v7 open
    The pump runs backwards very slowly and sucks standard # 1.
  • 5. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
    Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Standard #1 durch die Meßzelle.    5. v1-v7, v9 closed; v8 opened
    The pump runs forward and pumps standard # 1 through the measuring cell.

Die Schritte 4-5 werden so lange wiederholt, bis die im Pro­ gramm vorgegebene Anzahl an Injektionen erreicht ist. Dann werden analog für die Standardlösungen 2-5 dieser Zyklus wiederholt. Aus den Mittelwerten der Peakströme wird automa­ tisch eine Kalibrierkurve erhalten, die als Grundlage der Probenmessung dient.Steps 4-5 are repeated until the number of injections specified in the program has been reached. Then this cycle is repeated analogously for the standard solutions 2 -5. A calibration curve is automatically obtained from the mean values of the peak currents and serves as the basis for the sample measurement.

  • 5. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
    Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt Pufferlösung durch die Meßzelle.    5. v1-v7, v9 closed; v8 opened
    The pump runs forward and pumps buffer solution through the measuring cell.
  • 6. v1-v5, v8, v9 geschlossen; v6, v7 geöffnet
    Die Pumpe läuft rückwärts und saugt Probe an. Dieser Vorgang erfolgt so lange, bis im Manifold 2 hinter dem Ventil v7 frische Probe anliegt.    6. v1-v5, v8, v9 closed; v6, v7 open
    The pump runs backwards and draws in sample. This process continues until fresh sample is present in manifold 2 behind valve v7.
  • 7. v1-v8 geschlossen; v9 geöffnet
    Die angesaugte alte Probe wird bei vorwärts laufender Pumpe in den Abfall gepumpt.     7. v1-v8 closed; v9 opened
    The aspirated old sample is pumped into the waste with the pump running forward.
  • 8. v1-v5, v8, v9 geschlossen; v6, v7 geöffnet
    Die Pumpe läuft sehr langsam rückwärts und saugt ein definiertes Volumen der Probe an.    8. v1-v5, v8, v9 closed; v6, v7 open
    The pump runs backwards very slowly and draws in a defined volume of the sample.
  • 9. v1-v7, v9 geschlossen; v8 geöffnet
    Die Pumpe läuft vorwärts und pumpt die injizierte Probe durch die Meßzelle.    9. v1-v7, v9 closed; v8 opened
    The pump runs forward and pumps the injected sample through the measuring cell.

Die Schritte 8-9 werden so lange wiederholt, bis die im Pro­ gramm vorgegebene Anzahl in Injektionen erreicht ist. Dann werden die Schritte 5-9 bzw. 8-9 wiederholt, bis die Anzahl von Injektionen erreicht ist, nach der eine Überprüfung der Kalibrierung erfolgt. Der Nutzer hat die Möglichkeit, entwe­ der eine vollständige neue Kalibrierkurve mit allen z. B. 5 Standardlösungen durchzuführen, oder eine der Standardlösun­ gen zu injizieren.The steps 8-9 are repeated until the in the Pro predetermined number of injections has been reached. Then steps 5-9 or 8-9 are repeated until the number of injections is reached, after which a review of the Calibration is done. The user has the option of either which is a complete new calibration curve with all z. B. 5 Standard solutions, or one of the standard solutions gene to inject.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird anhand der beigefügten Zeichnung näher beschrieben. In dieser stellen dar:The device according to the invention is based on the attached Drawing described in more detail. In this represent:

Abb. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 1 is a schematic representation of the device according to the invention;

Abb. 2 ein Konzentrationsprofil bei Injektion einer NAD-Lösung; Fig. 2 shows a concentration profile when an NAD solution is injected;

Abb. 3 eine den Verlauf einer Glucosebestimmung bei unter­ schiedlichen Konzentrationen über 100 h; Fig. 3 shows the course of a glucose determination at different concentrations over 100 h;

Abb. 4 den zeitlichen Verlauf einer Simultanbestimmung von Glucose und Lactat über 100 h; Fig. 4 shows the time course of a simultaneous determination of glucose and lactate over 100 h;

Abb. 5 eine Kalibrierkurve für Glucose; Fig. 5 shows a calibration curve for glucose;

Abb. 6 den Ablauf einer Fermentation; Fig. 6 the course of a fermentation;

Abb. 7 eine weitere graphische Darstellung eines Fermentati­ onsverlaufes über 900 h. Fig. 7 shows a further graphical representation of a fermentation course over 900 h.

VorrichtungsaufbauDevice construction

Als Leitung 11 wird ein Enzym-Nylonschlauch oder über Wech­ selventile werden verschiedene Enzym-Nylonschläuche einge­ baut. Im Falle der Verwendung von Enzymen-Nylonnetzen wird das Netz mit Hilfe eines O-Ringes über der Elektrodenfläche fixiert.As line 11 , an enzyme nylon hose or change valves, various enzyme nylon hoses are installed. If enzyme nylon mesh is used, the mesh is fixed with the help of an O-ring over the electrode surface.

Nach Injektion eines Standards oder der Probe wird das Flüs­ sigkeitssegment mit Hilfe der Pumpe durch den bzw. durch einen der Enzymschläuche gepumpt. Dort wird das Substrat enzymatisch umgesetzt unter Bildung einer Spezies, die elek­ trochemisch an einer geeigneten Elektrode in der Meßzelle erfaßt werden kann. Als Meßsignal erhält man proportional zur Konzentration des Substrates und entsprechend der Selektivi­ tät der enzymatischen Reaktion einen Strom durch die Meßzel­ le. Die Meßzelle ist dabei ein Durchfluß-Dreielektrodensystem mit ca. 20 µl Volumen, einer 3 mm Arbeitselektrode, einer Ag/AgCl Referenzelektrode und einer Edelstahlkapillar als Auslaß und Gegenelektrode. Ein konstantes Arbeitspotential wird mittels eines Potentiostaten an der Arbeitselektrode aufgeprägt und die Potentialdifferenz zur Referenzelektrode wird zeitlich konstant gehalten.After the injection of a standard or the sample, the flow liquid segment with the help of the pump pumped one of the enzyme tubes. There is the substrate implemented enzymatically to form a species, the elec trochemically on a suitable electrode in the measuring cell can be detected. The measurement signal obtained is proportional to Concentration of the substrate and according to the selectivity the enzymatic reaction flows through the measuring cell le. The measuring cell is a flow-through three-electrode system with approx. 20 µl volume, a 3 mm working electrode, one Ag / AgCl reference electrode and a stainless steel capillary as Outlet and counter electrode. A constant work potential is by means of a potentiostat on the working electrode imprinted and the potential difference to the reference electrode is kept constant over time.

Es sind verschiedene Kombinationen von immobilisierten Redox­ enzymen und Elektroden möglich. Dabei richtet sich die Art der Arbeitselektrode nach dem zu detektierenden Produkt der enzymatischen Reaktion. Für H2O2-bildende Oxidasen wie z. B. Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Ascorbatoxidase, Galactoseoxi­ dase, Xanthinoxidase usw., ebenso wie für O2-verbrauende Enzyme eignet sich insbesondere eine Platinelektrode, plati­ nisierte Glaskohlenstoffelektrode, platinisierte Graphitelek­ trode oder Goldelektrode. Für Dehydrogenasen wie z. B. Glucosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogena­ se, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase usw. muß entweder dem Pufferstrom das Co-Enzym NAD+ zugemischt werden, oder es muß durch eine sequentielle Injektionsfolge, die durch das Vorwärts- und Rückwärtslaufen der Pumpe und das Öffnen und Schließen von Schlauchquetschventilen erreicht werden kann, ein Injektionsprofil geschaffen werden bei dem die Probe innerhalb eines Co-Enzymsegments injiziert wird. Dazu wird erst ein Flüssigkeitssegment co-enzym-haltiger Pufferlösung durch Rückwärtslaufen der Pumpe angesaugt, durch kurzes Vorwärtslaufen der Pumpe wird dieses Segment zur Hälfte am Probeneinlaß vorbeigeschoben, dann wird durch erneutes Rückwärtspumpen ein Probesegment angesaugt. Dadurch entsteht das in Abb. 2 gezeigte Konzentrationsprofil. Natür­ lich kann außer einem Coenzym auch ein beliebiger anderer Reaktionspartner, der für die gewünschte Nachweisreaktion benötigt wird, injiziert werden.Different combinations of immobilized redox enzymes and electrodes are possible. The type of working electrode depends on the product of the enzymatic reaction to be detected. For H 2 O 2 -forming oxidases such as. B. glucose oxidase, lactate oxidase, ascorbate oxidase, galactoseoxi dase, xanthine oxidase etc., as well as for O 2 -consuming enzymes, a platinum electrode, plati nized glass carbon electrode, platinized graphite electrode or gold electrode is particularly suitable. For dehydrogenases such as B. glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase etc. must either be mixed with the buffer stream, the co-enzyme NAD +, or it must be through a sequential injection sequence, which is caused by the forward and backward running of the pump and the opening and closing of pinch valves can be achieved, an injection profile can be created in which the sample is injected within a co-enzyme segment. For this purpose, first a liquid segment of co-enzyme-containing buffer solution is sucked in by running the pump backwards, half of this segment is pushed past the sample inlet by running the pump briefly forward, then a sample segment is sucked in by pumping backwards again. This creates the concentration profile shown in Fig. 2. In addition to a coenzyme, any other reaction partner that is required for the desired detection reaction can of course be injected.

Beim Pumpen dieser Segmentanordnung durch das Schlauchsystem erfolgt eine Durchmischung durch kontrollierte Dispersion, so daß miteinander durchmischte Probe und Co-Enzym entweder im Nylonschlauch mit immobilisierter Dehydrogenase oder direkt in der Meßzelle am über die Arbeitselektrode gespannten Nylonnetz mit immobilisierter Dehydrogenase reagieren können. Das als Folge der enzymatischen Reaktion gebildete NADH wird dann an einer mediator-modifizierten Elektrode bei einem Potential von 0-200 mV gegen Kalomelelektrode umgesetzt. Als Elektroden kommen beispielsweise in Frage: Polypyrrol-Chinon modifizierte Platin- oder Glaskohlenstoffelektroden, media­ tor-modifizierte Kohlepasteelektroden als Hochdruckpreßlinge oder mediator-modifizierte Kohlepasteelektroden.When pumping this segment arrangement through the hose system there is mixing by controlled dispersion, so that mixed sample and co-enzyme either in Nylon tubing with immobilized dehydrogenase or directly in the measuring cell clamped over the working electrode Nylon mesh can react with immobilized dehydrogenase. The NADH formed as a result of the enzymatic reaction becomes then on a mediator-modified electrode at one Potential of 0-200 mV implemented against calomel electrode. As Electrodes are an example: polypyrrole quinone modified platinum or glassy carbon electrodes, media Tor modified carbon paste electrodes as high pressure compacts or mediator-modified carbon paste electrodes.

Zusätzlich kann der gewünschte Meßbereich mit dem beschriebe­ nen System durch die Variation der Pumpgeschwindigkeit und des Injektionsvolumens variiert werden. Bei hoher Pumpge­ schwindigkeit ist die Diffusion des Substrats durch das Netz (also zu den aktiven Zentren der immobilisierten Enzymen) langsam gegen die Breite des Konzentrationsprofils der Probe. Dadurch wird das Signal kleiner und am Enzym herrscht eine virtuell kleinere Konzentration des zu messenden Substrats. In addition, the desired measuring range can be described with the system by varying the pumping speed and of the injection volume can be varied. With a high pump Speed is the diffusion of the substrate through the network (i.e. to the active centers of the immobilized enzymes) slowly against the width of the concentration profile of the sample. This makes the signal smaller and there is one on the enzyme virtually smaller concentration of the substrate to be measured.  

Als Folge der Kalibrierung des Gesamtsystems unter Berück­ sichtigung der einstellbaren Parameter können für die gleiche Enzymelektrode Kalibrierkurven verschiedenen Linearitätsbe­ reichs und Steigung erhalten werden. Bei Verkleinerung des Probenvolumens wird eine höhere Verdünnung durch die system­ immanente kontrollierte Dispersion erreicht.As a result of the calibration of the entire system under consideration The adjustable parameters can be viewed for the same Enzyme electrode calibration curves different linearity empire and slope are preserved. When reducing the Sample volume will have a higher dilution by the system inherent controlled dispersion achieved.

Das System hat folgende Vorteile:The system has the following advantages:

Der Abstand des Meßsystems vom Ort der Probenahme kann durch die variable Laufzeit der Pumpe zum Ansaugen der alten Probe nahezu beliebig groß sein.The distance of the measuring system from the sampling location can be determined by the variable running time of the pump for sucking in the old sample be almost any size.

Das System benötigt lediglich eine (genaue) Pumpe und einige Magnetventile, wogegen in einem herkömmlichen Fließinjekti­ onssystem mindestens zwei Pumpen und ein Injektionsventil benötigt werden.The system only needs one (accurate) pump and some Solenoid valves, whereas in a conventional flow injection onsystem at least two pumps and one injection valve are needed.

Die Pumpe wird nie von der Probenlösung durchflossen; dadurch ist eine Verschleppung der Probe unmöglich.The sample solution never flows through the pump; thereby the sample cannot be carried over.

Die Verdünnung erfolgt durch kontrollierte Dispersion entlang der Teflonschläuche. Aufgrund der Möglichkeit, extrem kleine Probenvolumina reproduzierbar zu injizieren (<5 µl) kann der Linearitätsbereich der enzymatischen Reaktion in weiten Bereichen verschoben werden. Durch entsprechende Vergrößerung des Injektionsvolumens können gering-konzentrierte Proben untersucht werden, und im Extremfall können quasi-stationäre Messungen zur Bestimmung des Diffusionsgrenzstromes von oxidierbaren Spezies durchgeführt werden.The dilution is carried out by controlled dispersion the Teflon tubing. Because of the possibility of being extremely small The can inject samples in a reproducible way (<5 µl) Wide range of linearity of the enzymatic reaction Areas to be moved. By appropriate enlargement of the injection volume can be low-concentration samples can be examined, and in extreme cases quasi-stationary Measurements to determine the diffusion limit current of oxidizable species are carried out.

Das System hat einen äußerst geringen Reagenzienverbrauch.The system has an extremely low reagent consumption.

Durch die Art der Injektion sind nahezu beliebige Injektions­ profile zu realisieren. So kann durch eine kleine Modifikati­ on des Systems eine Abfolge Coenzym-Probe-Coenzym oder allgemein Reaktionspartner-Probe-Reaktionspartner oder Standard-Reaktionspartner-Probe-Reaktionspartner realisiert werden. Im letzteren Fall erhält man simultan in jeder Mes­ sung einen Kalibrierwert.Due to the type of injection, almost any injection to realize profiles. So with a little modification a sequence of coenzyme-sample-coenzyme or  generally reactant-sample-reactant or Standard reaction partner-sample reaction partner realized will. In the latter case, you get simultaneously in each measurement a calibration value.

Die Enzyme können entweder an die Innenseite eines Nylon­ schlauches nach dessen Aktivierung, oder an aktivierte Nylon­ gewebe kovalent immobilisiert werden. Die Enzym-Nylon­ schläuche werden dann zwischen der Luftblasenfalle und einer konventionellen Meßzelle eingesetzt; das beim Durchgang der Probe durch den Enzymschlauch gebildete H2O2 wird an der Arbeitselektrode (Platin oder platinisierter Kohlenstoff) oxidiert. Die Enzym-Nylonnetze werden direkt über die Ober­ fläche der Arbeitselektrode gespannt, so daß extrem kurze Diffusionswege bei in weiten Grenzen frei wählbarem Diffusi­ onswiderstand des Nylonnetzes gewährleistet werden. Diese Methode erlaubt die simultane Bestimmung mehrerer Substrate ohne gegenseitige Beeinflussung.The enzymes can either be covalently immobilized on the inside of a nylon tube after its activation, or on activated nylon fabric. The enzyme nylon tubes are then inserted between the air bubble trap and a conventional measuring cell; the H 2 O 2 formed when the sample passes through the enzyme tube is oxidized on the working electrode (platinum or platinized carbon). The enzyme nylon nets are stretched directly over the surface of the working electrode, so that extremely short diffusion paths with freely selectable diffusion resistance of the nylon net are guaranteed. This method allows the simultaneous determination of several substrates without mutual interference.

Die an aktiviertem Nylon immobilisierten Enzyme zeigen eine außergewöhnlich hohe Aktivität bei gleichzeitig guter Lang­ zeitstabilität.The enzymes immobilized on activated nylon show one exceptionally high activity with good long time stability.

Die Steuerung der Anlage erfolgt interaktiv mittels eines unter Microsoft Windows 3 × laufenden Programms. Die Kali­ brierkurve wird automatisch erstellt; die Meßwerte werden aus den Peakhöhen, die automatisch erkannt werden, berechnet und auf Diskette oder Festplatte abgespeichert, so daß eine nachvollziehbare Dokumentation möglich ist.The system is controlled interactively using a under Microsoft Windows 3 × running program. The potash brier curve is created automatically; the measured values are off the peak heights that are automatically recognized are calculated and stored on disk or hard drive, so that a comprehensible documentation is possible.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.

Beispiel 1example 1 A: Aktivierung von Nylonschlauch oder NylongewebeA: Activation of nylon hose or nylon fabric

Das Nylon (entweder Nylongewebe mit definierter Fadenstärke und prozentualer Öffnung oder Nylonschlauch) wird mit Dime­ thylsulfat aktiviert. Der Schlauch wird dazu mit Dimethylsul­ fat gefüllt und 4 min in ein kochendes Wasserbad eingetaucht. Die Nylonnetze werden in einem Glaskölbchen in Dimethylsulfat für eine definierte Zeit, die optimiert wurde bezüglich der maximalen Enzymbeladung bei höchstmöglicher Netzstabilität, in ein Wasserbad mit kochendem Wasser eingetaucht.The nylon (either nylon fabric with a defined thread thickness and percentage opening or nylon tube) comes with dime  activated ethyl sulfate. The hose is made with dimethyl sul fat filled and immersed in a boiling water bath for 4 min. The nylon nets are placed in a glass flask in dimethyl sulfate for a defined time that has been optimized with regard to the maximum enzyme loading with the highest possible network stability, immersed in a water bath with boiling water.

Die Reaktion wird durch Eintauchen des Schlauches bzw. des Kölbchens in Eiswasser gestoppt. Das Dimethylsulphat wird aus dem Schlauch bzw. Kölbchen gespült und das aktivierte Nylon wird mit eiskaltem Methanol 30 min gespült. Dann wird 2 h mit einer Lösung aus 1,6-Diaminohexan (1,5 g/50 ml) inkubiert, dann mit 0,1 M NaCl gespült.The reaction is achieved by immersing the hose or the Kölbchens stopped in ice water. The dimethyl sulfate is made rinsed the hose or cologne and activated nylon is rinsed with ice-cold methanol for 30 min. Then with 2 h incubated with a solution of 1,6-diaminohexane (1.5 g / 50 ml), then rinsed with 0.1 M NaCl.

B: Immobilisierung von Enzymen an aktiviertem NylonB: Immobilization of enzymes on activated nylon

  • a) Immobilisierung von Perjodat-oxidierten Glycoenzy­ men. Bei Glycoenzymen können die protein-gebundenen Zuckerre­ ste mit Perjodat unter Bildung von Aldehydfunktionen an der Enzymoberfläche oxidiert werden. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgt dann unter Bildung von Schiff′schen Basen zwischen den Aldehydgruppen am Enzym und den Aminogruppen am aktivierten Nylon.
    Dazu wird der Nylonschlauch mit Perjodat-oxidierter Glucose­ oxidase (1 mg/ml) gefüllt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nylonnetze werden in einer entsprechenden Enzymlösung 3 h inkubiert. Der Schlauch oder das Netz wird dann mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 gespült. Dann werden die Schiff′schen Basen mittels einer wäßrigen Lösung von NaBH4 zu den sekundären Aminen reduziert. Es wird erneut mit Phosphat­ puffer gespült. Der Enzym-Nylonschlauch oder die Enzym-Nylon­ netze werden in Phosphatpuffer im Kühlschrank bis zum Gebrauch aufbewahrt.     a) Immobilization of periodate-oxidized Glycoenzy men. In glycoenzymes, the protein-bound sugar residues can be oxidized with periodate to form aldehyde functions on the enzyme surface. The immobilization of the enzyme then takes place with the formation of Schiff bases between the aldehyde groups on the enzyme and the amino groups on the activated nylon.
    For this purpose, the nylon tube is filled with periodate-oxidized glucose oxidase (1 mg / ml) and incubated overnight at room temperature. The nylon nets are incubated in an appropriate enzyme solution for 3 hours. The tube or mesh is then rinsed with 0.1 M phosphate buffer pH 7.0. Then the Schiff bases are reduced to the secondary amines by means of an aqueous solution of NaBH 4 . It is rinsed again with phosphate buffer. The enzyme nylon tube or the enzyme nylon nets are stored in phosphate buffer in the refrigerator until use.
  • b) Immobilisierung von Enzymen nach Aktivierung pro­ tein-gebundener Carboxylgruppen mit Carbodiimid. 10 mg/ml Glucoseoxidase wird mit 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimid-metho-p-toluolsulphonat in 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 in Gegenwart 0,1 M Glucose aktiviert. Das aktivierte Enzym wird in den vorbereiteten Nylonschlauch gefüllt, oder ein Nylonnetz wird in einer aktivierten Enzymlösung für 3 h inkubiert. Der Schlauch oder das Netz wird dann mit Phosphat­ puffer gewaschen, und das immobilisierte Enzym wird durch Reaktion mit 2,5% Glutardialdehydrolösung (10 min) querver­ netzt.b) immobilization of enzymes after activation pro tein-bound carboxyl groups with carbodiimide. 10 mg / ml Glucose oxidase is mixed with 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulphonate in 0.1 M acetate buffer pH 4.5 activated in the presence of 0.1 M glucose. That activated Enzyme is filled into the prepared nylon tube, or a nylon mesh is placed in an activated enzyme solution for 3 h incubated. The hose or mesh is then covered with phosphate buffer washed, and the immobilized enzyme is through Cross reaction with 2.5% glutardialdehyde solution (10 min) nets.
  • c) Immobilisierung von Enzymen mit Glutardialdehyd. Der Nylonschlauch bzw. das Nylonnetz wird 30 min mit 5% Glutardialdehydlösung inkubiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und dann mit 1 mg/ml Enzym für 3 h inkubiert. Das nicht­ kovalent gebundene Enzym wird durch Spülen mit 0,1 m NaCl abgewaschen. Die Schiff′schen Basen werden wie unter a) beschrieben mit NABH4 reduziert.c) Immobilization of enzymes with glutardialdehyde. The nylon tube or nylon mesh is incubated for 30 min with 5% glutardialdehyde solution, washed with phosphate buffer and then incubated with 1 mg / ml enzyme for 3 h. The non-covalently bound enzyme is washed off by rinsing with 0.1 M NaCl. The Schiff bases are reduced with NABH 4 as described under a).

Die Immobilisierungsmethode a) ist geeignet für Glycoenzyme wie Glucoseoxidase, Invertase, Peroxidase. Methode b) ist geeignet für prinzipiell alle Enzyme durch Verwendung der proteingebundenen Carboxylgruppen von Asparaginsäure, Glut­ aminsäure (allerdings wird Lactatoxidase durch Carbodiimid desaktiviert). Methode c) ist ebenfalls im Prinzip für alle Enzyme durch Verwendung der Lysinseitenketten einsetzbar.Immobilization method a) is suitable for glycoenzymes such as glucose oxidase, invertase, peroxidase. Method b) is suitable for basically all enzymes by using the protein-bound carboxyl groups of aspartic acid, embers amino acid (however, lactate oxidase is caused by carbodiimide deactivated). Method c) is also in principle for everyone Enzymes can be used by using the lysine side chains.

Bei den Messungen wurde im allgemeinen 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 + 0,5 M NaCl benutzt. Im Prinzip ist aber der für das jeweilige Enzym optimale Puffer mit dem entsprechend optima­ len pH-Wert verwendbar, solange er keine elektrochemisch interferierende Verbindungen enthält. Generally 0.1 M phosphate buffer was used in the measurements pH 7.4 + 0.5 M NaCl used. In principle, however, that is for that each enzyme optimal buffer with the corresponding optima len pH value can be used as long as it is not electrochemical contains interfering compounds.  

Beispiel 2Example 2

Abb. 3 zeigt den Verlauf einer Glucose-Messung über 100 h mit der in Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtung unter Verwendung eines nach Methode a) immobilisierten Glucoseoxidase-Nylon­ schlauchs. Die Schwankungen entsprechen den Temperaturschwan­ kungen zwischen Tag/Nacht und können durch eine selbstverständlich notwendige Thermostatisierung der Meßzelle und des Enzymschlauchs verhindert werden. Nach anfänglichem Verlust an Aktivität durch Auswaschen nicht kovalent gebunde­ nen Enzyms aus dem Nylonschlauch bleibt die Response über den Versuchszeitraum konstant. Die Schläuche wurden mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert; ein signifikanter Aktivi­ tätsverlust war nicht feststellbar. Fig. 3 shows the course of a glucose measurement over 100 h with the device described in Example 1 using a glucose oxidase-nylon tube immobilized according to method a). The fluctuations correspond to the temperature fluctuations between day / night and can be prevented by a naturally necessary thermostatting of the measuring cell and the enzyme tube. After an initial loss of activity by washing out non-covalently bound enzyme from the nylon tube, the response remains constant over the test period. The tubes were stored for several months at room temperature; there was no significant loss of activity.

Beispiel 3Example 3

In einer Vorrichtung mit einer 4-Elektroden enthaltenden Meßzelle 10, wobei über eine 1. Arbeitselektrode ein Glucose­ oxidase-Nylonnetz (Immobilisierungsmethode a)), über eine zweite ein Lactatoxidase-Nylonnetz (Immobilisierungsmethode c)) gespannt war, wurden Lösungen mittels des beschriebenen Systems untersucht, die 1 mM an Glucose, 1 mM an Lactat, 2 mM an Glucose, 2 mM an Lactat und Mischungen aus Glucose/Lactat mit je 1 mM bzw. 2 mM waren. Die Gegenwart von Glucose hatte keinen Einfluß auf die Bestimmung von Lactat und umgekehrt. Abb. 4 zeigt den entsprechenden Versuch über einen Zeitraum von 100 h. Die Glucose bzw. Lactatsignale setzen sich zusam­ men aus den reinen Lösungen und den Mischungen.In a device with a 4-electrode measuring cell 10 , a glucose oxidase nylon mesh (immobilization method a)) being stretched over a 1st working electrode and a lactate oxidase nylon mesh (immobilization method c) over a second, solutions were described using the described system investigated that were 1 mM of glucose, 1 mM of lactate, 2 mM of glucose, 2 mM of lactate and mixtures of glucose / lactate with 1 mM and 2 mM, respectively. The presence of glucose had no influence on the determination of lactate and vice versa. Fig. 4 shows the corresponding test over a period of 100 h. The glucose or lactate signals are composed of the pure solutions and the mixtures.

Die Kalibrierkurven können durch die Fadenstärke im Verhält­ nis zu der Größe der Öffnungen im Netz, aber auch durch eine zusätzliche diffusionslimitierende Membran vor dem Nylonnetz im linearen Bereich beeinflußt werden. Abb. 5 zeigt Kali­ brierkurven für Glucose erhalten mit Nylonnetzen verschiede­ ner Qualität. Netz1pp558 wurde zusätzlich mit einer Dialysemembran mit Ausschlußgrenze 50 000 Daltons abgedeckt.The calibration curves can be influenced in the linear range by the thread thickness in relation to the size of the openings in the network, but also by an additional diffusion-limiting membrane in front of the nylon network. Fig. 5 shows calibration curves for glucose obtained with nylon nets of different quality. Netz1pp558 was additionally covered with a dialysis membrane with an exclusion limit of 50,000 Daltons.

Beispiel 4Example 4

In einem Versuch unter realistischen Bedingungen wurde die beschriebene Vorrichtung zur kontinuierlichen Überwachung einer Hefefermentation benutzt. Dabei wurde eine Arbeitselek­ trode mit einem Nylon-Glucoseoxidase-Netz überspannt, die zweite mit einem vergleichbaren Netz und zusätzlich mit einer Dialysemembran mit Ausschlußgrenze 50 000 Daltons. So konnte mit der einen Elektrode der niedrige Konzentrationsbereich genau erfaßt werden, mit der zweiten die höhere Konzentrati­ on, bei denen die erste schon eine Sättigungscharakteristik aufwies. Abb. 6 zeigt den Verlauf der Fermentation mit den an beiden Elektroden erhaltenen unterschiedlichen Signalhöhen; die gute Übereinstimmung der bestimmten Konzentrationen an Glucose mit beiden Elektroden zeigt Abb. 7.In an experiment under realistic conditions, the device described was used for the continuous monitoring of a yeast fermentation. One working electrode was spanned with a nylon glucose oxidase network, the second with a comparable network and additionally with a dialysis membrane with an exclusion limit of 50,000 Daltons. So with one electrode the low concentration range could be measured precisely, with the second the higher concentration, for which the first one already had a saturation characteristic. Fig. 6 shows the course of the fermentation with the different signal levels obtained on both electrodes; Fig. 7 shows the good agreement of the determined concentrations of glucose with both electrodes.

Claims (11)

1. Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Sub­ straten von Oxidoreduktasen mit O2, NAD oder NADP als Akzeptor oder künstlichen Redoxmediatoren gekennzeichnet durch einen Standardlösungssammler (1), der durch eine Rohr­ leitung (2) mit einem Sterilfilter (3) und von dort weiter mit einer Probenzuführung (4) verbunden ist, durch eine Mehrwegeverbindung (5), die über Rohrlei­ tung (6) mit der Rohrleitung (2) zwischen Sammler (1) und Sterilfilter (3) verbunden ist, durch einen Puf­ ferlösungsbehälter (7), der über eine die Pumpe (8) enthaltene Rohrleitung (9) mit der Mehrwegeverbindung (5) verbunden ist, durch eine Meßzelle (10), die mit der Mehrwegeverbindung (5) über eine Rohrleitung (11) verbunden ist, die eine Luftblasenfalle (12) enthält und innerhalb der Verbindung zwischen Arbeitselektrode in der Meßzelle (10) und der Mehrwegeverbindung (5) mindestens eine träger fixierte Oxidoreduktase an­ geordnet ist, einen Abfallösungsbehälter (13), der über Rohrleitungen (14) und (14a) mit der Mehrwegever­ bindung (5) bzw. der Meßzelle (10) verbunden ist, durch Sperrventile V zwischen jedem von mehreren Standardlösungsbehältern (15) und dem Standardlösungs­ sammler (1), in jeder der in die Mehrwegeverbindung (5) eintretenden Leitungen (6, 11 und 14), und zwi­ schen Sterilfilter (3) und der Einmündung von Rohrlei­ tung (6) in Rohrleitung (2), sowie durch eine Steuervorrichtung, welche die Pumpe (8) und alle Ventile nach vorgegebenem Arbeitsschema steuert.1. Device for the continuous determination of sub strates of oxidoreductases with O 2 , NAD or NADP as acceptor or artificial redox mediators characterized by a standard solution collector ( 1 ) through a pipe ( 2 ) with a sterile filter ( 3 ) and from there with a sample feeder ( 4 ) is connected by a multi-way connection ( 5 ), which is connected via pipe ( 6 ) to the pipe ( 2 ) between the collector ( 1 ) and sterile filter ( 3 ), through a buffer solution container ( 7 ) Via a pipeline ( 9 ) containing the pump ( 8 ) is connected to the multi-way connection ( 5 ), through a measuring cell ( 10 ) which is connected to the multi-way connection ( 5 ) via a pipeline ( 11 ) which forms an air bubble trap ( 12 ) and at least a carrier-fixed oxidoreductase is arranged within the connection between the working electrode in the measuring cell (10) and the multi-way connection (5), a Abfallösungsbeh lter (13) via pipes (14) and (14 a) with the multipath Ever compound (5) and the measuring cell (10) is connected, through check valves V between each of a plurality of standard solution containers (15) and the standard solution collector (1 ), in each of the multi-way connection ( 5 ) entering lines ( 6 , 11 and 14 ), and between the sterile filter ( 3 ) and the confluence of pipeline device ( 6 ) in the pipeline ( 2 ), and by a control device which the Controls the pump ( 8 ) and all valves according to the specified working scheme. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohrleitungen (2, 6, 9, 11, 14 und 14a) ganz oder teilweise aus Kunststoff, insbesondere in Schlauchform, bestehen.2. Apparatus according to claim 1, characterized in that the pipes ( 2 , 6 , 9 , 11 , 14 and 14 a) are made entirely or partially of plastic, in particular in the form of a tube. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Rohrleitung (11) mindestens einen Kunststoff­ schlauch enthält an dessen Innenseite Oxidoreduktase kovalent fixiert ist.3. Apparatus according to claim 2, characterized in that the pipeline ( 11 ) contains at least one plastic hose on the inside of which oxidoreductase is covalently fixed. 4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (10) mindestens eine Arbeitselektro­ de, eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode sowie einen Potentiostaten, welcher der oder den Arbeitselektroden ein konstantes Arbeitspotential aufprägt, enthält.4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the measuring cell ( 10 ) contains at least one working electrode de, a reference electrode and a counter electrode and a potentiostat, which imprints a constant working potential on the working electrode or electrodes. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Arbeitselektrode in der Meßzelle (10) ein Kunststoffnetz mit kovalent fixierter Oxidoreduktase angebracht ist.5. The device according to claim 4, characterized in that a plastic network with covalently fixed oxidoreductase is attached above the working electrode in the measuring cell ( 10 ). 6. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger der Oxidoreduktase aus Poly­ amid besteht.6. The device according to claim 3 or 5, characterized, that the plastic carrier of the oxidoreductase made of poly amide exists. 7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode bei H2O2-bildenden oder O2 verbrauchenden Oxidoreduktasen eine Platinelektrode, platinisierte Glaskohlenstoffelektrode, platinisierte Graphitelektrode oder Goldelektrode ist.7. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the working electrode in H 2 O 2 -forming or O 2 consuming oxidoreductases is a platinum electrode, platinized glassy carbon electrode, platinized graphite electrode or gold electrode. 8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode bei NADH oder NADPH bildenden Oxidoreduktasen eine mediator-modifizierte Elektrode mit einem Potential von kleiner 200 mV gegen Kalo­ melelektrode ist.8. Device according to one of claims 1 to 6, characterized,  that the working electrode at NADH or NADPH forming Oxidoreductases a mediator-modified electrode with a potential of less than 200 mV against Kalo is mel electrode. 9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode eine Polypyrrol-Chinon modi­ fizierte Platinelektrode oder -Glaskohlenstoffelektro­ de oder eine mediator-modifizierte Kohlepasteelektrode ist.9. The device according to claim 8, characterized, that the working electrode modi a polypyrrole-quinone fected platinum electrode or glassy carbon electro de or a mediator-modified carbon paste electrode is. 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (10) einen photometrischen oder fluorometrischen Detektor enthält.10. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the measuring cell ( 10 ) contains a photometric or fluorometric detector. 11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch sequentielle Schaltung der Ventile bei kontrollierter Pumpengeschwindigkeit und Richtung, beliebige Sequenzen von Probe, Reaktionspartnern, Standardlösungen einstellbar sind.11. The device according to claim 1, characterized, that by sequential switching of the valves controlled pump speed and direction, any sequences of sample, reaction partners, Standard solutions are adjustable.
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