DE4032300A1

DE4032300A1 - Embedding of biological samples in methyl methacrylate] - by polymerisation after deaeration

Info

Publication number: DE4032300A1
Application number: DE19904032300
Authority: DE
Inventors: Manfred Prof Dr Rer Na Rimpler; Axel Prof Dr Med Georgii
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-11
Filing date: 1990-10-11
Publication date: 1992-04-16
Also published as: DE4032300C2

Abstract

Biological samples are embedded in a sectionable polymethyl methacrylate (PMM) block by introducing the sample into a polymerisation mixt. contg. methyl methacrylate (MMA) an initiator and opt. an activator, and polymerising the mixt. The improvement comprises deaerating the polymerisation mixt. contg. the sample under an inert gas atmos. for a short time at low temp. under a moderate vacuum before polymerisation. USE/ADVANTAGE - The process is esp. useful for preparing biopsy samples for histological examination. The advantages of deaeration are not made clear. The PPM blocks are stated to be partic. hard and suitable for prodn. of thin sections using an automatic microtome, but this is ascribed to polymerisation at low temps.

Description

Die Erfindung betrifft die Einbettung von biologischen Substraten, insbesondere Biopsien, in einen Polymethylmethacrylat-Block durch Einbringen der biologischen Substrate in ein monomeres Methylmeth acrylat, den Initiator und gegebenenfalls einen Aktivator enthaltende Polymerisationsmischung und die Polymerisation dieser Mischung zur Herstellung eines festen schneidfähigen Polymethylmethacrylat-Blocks.The invention relates to the embedding of biological substrates, especially biopsies, in a polymethyl methacrylate block Introduction of the biological substrates into a monomeric methyl meth acrylate, the initiator and optionally containing an activator Polymerization mixture and the polymerization of this mixture for Production of a solid, polymethyl methacrylate block capable of being cut.

Die Einbettung von biologischen Materialien, wie Biopsiematerialien, in nachfolgend erhärtende flüssige Medien ist seit langem bekannt. So erlangte die Einbettung von hartem Gewebe und unentkalktem Knochen in Methylmethacrylat mit anschließender Polymerisation bereits vor langem im Hinblick auf die hervorragende Schneidfähigkeit und die damit verbundene vorteilhafte histologische Beurteilung Bedeutung (vgl. R. Burkhardt, "Präparative Voraussetzungen zur klinischen Histologie des menschlichen Knochenmarks", Blut (1966), XIV, 30-46). Methylmeth acrylat (MMA) diffundiert in hohem Maße in die Biopsiepräparate, verdrängt dadurch Wasser- und Lösungsmittelreste und erhält beim Aus härten und anschließendem Schneiden feinste Strukturen (vgl. F. Meeuwsen, "A new plastic (K-plast) based on methylmethacrylate for light-microscopy", Reprint form "Histotechniek"/NL (1986) 3). MMA polymerisiert in langen Ketten ohne Quervernetzung. Deswegen läßt sich das Polymer leicht und schnell sowie ohne agressive organische Lösungs mittel aus den Schnittpräparaten herauslösen. Dadurch wird eine umfassende medizinische Beurteilung, insbesondere histologische Beurteilung der Schnitte erst möglich. Bis jetzt war der entscheidende Nachteil beim Einsatz von MMA die mit der Polymerisation verbundene hohe Wärmeentwicklung. Dabei können Temperaturen von etwa 80°C entstehen (vgl. Te Velde, H., Burkhart, R., Kleiverda, Lk., Leenheers-Binnendÿk, L., Sommerfeld, W., "Methylmethacrylate as an embedding meddium in histophatology", Histopathology (1977)I, 319-330). Diese hohen Temperaturen führen dazu, daß viele enzymatische Systeme inaktiviert werden (vgl. D. Chappard et al, "Embedding iliac bone biospies at low temperature using glycol and methyl methacrylates", Stain Technology (1983) 58, 299-308). Während der Polymerisation bilden sich außerdem häufig Gasblasen, die die Proben umgeben und zur Zer störung des Gewebes führen können (vgl. u. a. W. Schreil, R. Fischer, "Some observations on the formation of bubbles and the destruction of tissue during methacrylate embedding for electroon microscopy", Mikroskopie (1961)16, 153-158).Embedding biological materials, such as biopsy materials, in subsequently hardening liquid media has long been known. So achieved the embedding of hard tissue and uncalcified bone in methyl methacrylate with subsequent polymerization long in terms of the excellent cutting ability and thus associated advantageous histological assessment meaning (see R. Burkhardt, "Preparatory Requirements for the Clinical Histology of the human bone marrow ", Blut (1966), XIV, 30-46). Methylmeth acrylate (MMA) diffuses to a large extent into the biopsy specimens, displaces water and solvent residues and maintains when it is switched off harden and then cut the finest structures (see F. Meeuwsen, "A new plastic (K-plast) based on methyl methacrylate for light-microscopy ", reprint form" Histotechniek "/ NL (1986) 3). MMA polymerizes in long chains without cross-linking. That's why the polymer easily and quickly and without aggressive organic solutions Detach medium from the cut preparations. This will make one comprehensive medical assessment, especially histological Assessment of the cuts possible. So far, the key has been The disadvantage of using MMA is that associated with the polymerization high heat development. Temperatures of around 80 ° C arise (see Te Velde, H., Burkhart, R., Kleiverda, Lk., Leenheers-Binnendÿk, L., Sommerfeld, W., "Methyl methacrylate as an embedding medium in histophatology ", Histopathology (1977) I, 319-330). These high temperatures cause many enzymatic systems can be inactivated (cf. D. Chappard et al, "Embedding iliac bone biospies at low temperature using glycol and methyl methacrylates ", Stain Technology (1983) 58, 299-308). Form during the polymerization there are also often gas bubbles that surround the samples and dissolve disrupt the tissue (see, inter alia, W. Schreil, R. Fischer, "Some observations on the formation of bubbles and the destruction of tissue during methacrylate embedding for electroon microscopy ", Microscopy (1961) 16, 153-158).

Zusammengefaßt bestehen demzufolge Vor- und Nachteile des Einsatzes von MMA zur Einbettung von Biopsiematerialien in folgendem: Bei größeren Mengen kann die Temperatur bis etwa 100°C ansteigen. Es besteht keine Wasserlöslichkeit. Die Gewebe- und Reaktionspartner müssen wasserfrei sein. Es tritt keine Quervernetzung, sondern nur Kettenverlängerung auf, was für die spätere Verarbeitung vorteilhaft ist. Die Polymerisate sind sehr hart, was eine optimale Schneidbarkeit von Hartsubstanzen erst ermöglicht. Insgesamt gesehen stellte jedoch die bisherige MMA-Einbettungsmethode nicht zufrieden. Es hat nicht an Versuchen gefehlt, hier durch den Einsatz anderer Materialien Ver besserungen zu erzielen. Um beispielsweise die Probleme auszuschließen, die mit dem Einsatz von MMA verbunden sind, wurde dieses durch GMA (Glykolmethacrylat) bzw. eine Mischung aus MMA und GMA ersetzt. Polymeres GMA läßt sich jedoch nicht mehr lösen. Auch wird die Schneid fähigkeit schlechter (vgl. F. Meeuwsen, a.a.O.). Dafür ist GMA ist jedoch weniger toxisch, zeigt darüber hinaus eine geringere Wärmeentwicklung bei der Polymerisation und ist in Wasser löslich. Das Gewebe muß nicht vollständig wasserfrei sein, es kann jedoch die Härte des Polymerisats beeinflussen. Das Herauslösen des GMA aus dem Gewebsschnitten ist nicht möglich, da eine Quervernetzung stattfindet und das Polymerisat ist relativ weich, was die Qualität der Schneidbarkeit beeinträchtigt.In summary, there are advantages and disadvantages to use from MMA for embedding biopsy materials in the following: For larger quantities, the temperature can rise to around 100 ° C. It there is no water solubility. The tissue and reaction partners must be anhydrous. There is no cross-linking, just Chain extension on, which is advantageous for later processing. The polymers are very hard, which makes them ideal for cutting Hard substances made possible. Overall, however, the previous MMA embedding method not satisfied. It is not on Attempt to try, here by using other materials Ver to achieve improvements. For example, to rule out the problems associated with the use of MMA was made by GMA (Glycol methacrylate) or a mixture of MMA and GMA. However, polymeric GMA can no longer be dissolved. Also the cutting ability worse (see F. Meeuwsen, op. cit.). This is what GMA is for less toxic, also shows less heat development during the polymerization and is soluble in water. The tissue doesn't have to be completely anhydrous, but it can be the hardness of the polymer influence. The GMA is detached from the tissue sections not possible because cross-linking takes place and the polymer is relatively soft, which affects the quality of the cutability.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, möglichst ein Einbettungs verfahren vorzuschlagen, das sämtliche oben angesprochenen Vorteile be kannter Einbettungsverfahren einschließt, jedoch deren Nachteile weitest gehend behebt.The invention was therefore based on the object of embedding if possible propose a method that be all advantages mentioned above known embedding process, but its disadvantages as far as possible fixes.

Die Lösung obiger Aufgabe besteht darin, daß die Polymerisations mischung mit dem darin enthaltenen biologischen Material vor Einleitung der Polymerisation unter Inertgasatmosphäre kurzfristig bei niedriger Temperatur und unter gelindem Vakuum entlüftet wird.The solution to the above problem is that the polymerization mix with the biological material contained therein before introduction polymerization under an inert gas atmosphere for a short time at low Temperature and under gentle vacuum is vented.

Im Rahmen der Erfindung lassen sich nun vielfältige biologische Substanzen heranziehen bzw. nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einbetten, um danach die erforderlichen Schnitte mit dem Ziel der Ermittlung des angestrebten medizinischen Befunds herstellen. Besondere Bedeutung hat daher die Erfindung im Hinblick auf die histologische Befundermittlung. Als Biopsiematerialien kommen dabei vielfältige Ausgangspräparate in Frage. Im Vordergrund steht die histologische Beur teilung menschlicher Organe. Dabei spielen die nachfolgend aufgeführten Biopsiesubstrate eine besondere Rolle:
Bei der Einbettung von Knochenmark zeigt das erfindungsgemäße Verfahren deshalb besondere Vorteile, weil hier das Nebeneinander eines Netzwerkes aus hartem Knochen und des dazwischenliegenden zarten Fettbindegewebes mit den eingelagerten Blutbildungsherden besser als durch jedes andere Verfahren histologisch beurteilt werden kann. Dies gilt auch für kompakte Knochenanteile und Zähne. Auch kann Weich gewebe in engem Kontakt mit Knochen eingebettet werden, wenn dieses im Zusammenhang untersucht werden muß, z. B. Material aus dem Gesichtsschädel mit der Frage nach Tumor (Kieferhöhlen, Mundhöhle). So läßt sich besonders gut auch Weichgewebe einbetten bzw. untersuchen, bei dem besonders dünne Schnitte zur Beurteilung von krankhaften Veränderungen notwendig sind, so in erster Linie die Organe des lymphatischen Systems (Lymphknoten, Milz, Tonsillen), insbesondere bei den von diesen Organen ausgehenden Tumoren (maligne Lymphome), aber auch Weichgewebe, bei denen das Material besonders spärlich ist und optimale Schnitte erforderlich sind (kleine Proben, d. h. Biopsien), sowie jedes andere Gewebe, bei dem aus wissenschaftlichen Gründen oder wegen besonderer diagnostischer Fragestellungen sehr gute und dünne Schnitte notwendig sind (z. B. Hoden, Niere, Herzmuskel). Within the scope of the invention, a variety of biological substances can now be used or embedded using the method according to the invention in order to subsequently produce the necessary cuts with the aim of determining the desired medical finding. The invention is therefore of particular importance with regard to histological diagnosis. A wide variety of starting specimens can be used as biopsy materials. The focus is on the histological assessment of human organs. The biopsy substrates listed below play a special role:
When embedding bone marrow, the method according to the invention shows particular advantages because the juxtaposition of a network of hard bone and the delicate fat connective tissue in between with the embedded blood formation foci can be assessed histologically better than by any other method. This also applies to compact bone parts and teeth. Also soft tissue can be embedded in close contact with bone if this needs to be examined in context, e.g. B. Material from the facial skull with the question of tumor (maxillary sinuses, oral cavity). It is particularly easy to embed or examine soft tissue that requires particularly thin incisions to assess pathological changes, primarily the organs of the lymphatic system (lymph nodes, spleen, tonsils), especially in the case of tumors originating from these organs (malignant lymphomas), but also soft tissue, in which the material is particularly sparse and optimal cuts are required (small samples, ie biopsies), as well as any other tissue in which very good and thin cuts are necessary for scientific reasons or because of special diagnostic questions are (e.g. testicles, kidney, heart muscle).

Im Hinblick auf die Histologie von Wirbeltieren ist die Erfindung eben falls von besonderer Bedeutung, wobei prinzipiell alle vorstehend genannten Fragestellungen auch bei höheren Tieren denkbar sind, sowohl bei normalen Organen in der Biologie wie auch bei pathologischen Ver änderungen in der Tiermedizin. Schließlich hat die Erfindung auch Relevanz im Hinblick auf die Histologie von niederen Tieren, da zahl reiche niedere Tiere (z. B. Insekten) ein nebeneinander von Weichgewebe und Hartsubstanzen (Panzer) aufweisen. Im Hinblick auf die Beurteilung von Bakterien, Pilzen und Zellkulturen, wo ein optimales Schnittpräparat ebenfalls angestrebt wird, ist die Erfindung ebenfalls von Bedeutung, desgleichen im weitesten Bereich der Botanik, um analog zu zoologischen Fragestellungen optimale Schnitte zu erzielen.In terms of vertebrate histology, the invention is flat if of particular importance, in principle all of the above mentioned questions are also conceivable in higher animals, both in normal organs in biology as well as in pathological ver changes in veterinary medicine. Finally, the invention also has Relevance with regard to the histology of lower animals, since number rich lower animals (e.g. insects) a side by side of soft tissue and have hard substances (tanks). In terms of assessment of bacteria, fungi and cell cultures, where an optimal cutting preparation the invention is also important, likewise in the broadest area of botany, analogous to zoological To achieve optimal cuts.

Zwingendes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist demzufolge die abschließende Behandlung des monomeren Methylmethacrylats, dem auch das biologische Material einverleibt ist, unter Inertgasatmosphäre, insbesondere Stickstoffatmosphäre, kurzfristig und bei niedriger Temperatur sowie unter gelindem Vakuum. Auch kann das monomere Methylmethacrylat, bevor es dieser Behandlung unterzogen worden ist, ebenfalls bereits, gegebenenfalls unter Rühren, unter Stickstoffatmos phäre entlüftet werden. Auf jeden Fall muß dafür gesorgt werden, daß mit Beginn der Polymerisation störender Sauerstoff weitestgehend durch die beschriebenen Maßnahmen entfernt worden ist.The essential feature of the method according to the invention is accordingly the final treatment of the monomeric methyl methacrylate, the the biological material is also incorporated, under an inert gas atmosphere, especially nitrogen atmosphere, short term and at low Temperature as well as under gentle vacuum. This can also be monomeric Methyl methacrylate before undergoing this treatment also already, if necessary with stirring, under nitrogen atmosphere be vented. In any case, it must be ensured that with the beginning of the polymerization, the most disturbing oxygen the described measures have been removed.

Wenn im Rahmen der Erfindung von einem gelindem Vakuum gesprochen wird, dann ist dieser Hinweis deswegen wichtig, weil beispielsweise, wie nachfolgend detailliert beschrieben, ein zu starkes Vakuum die optimale Zusammensetzung der zu polymerisierenden Mischung durch Abdampfen monomeren Methylmethacrylats stören könnte. Vorzugsweise beträgt das Vakuum etwa 300 bis 900 hPa, insbesondere 450 bis 750 hPa. Die Beachtung dieser Vakuumverhältnisse gewährleistet jedoch noch nicht allein den mit der Erfindung angestrebten Erfolg. Auch ist die Zeit und Temperatur der Entlüftung von Bedeutung. Werden diese Gesichtspunkte nicht bedacht, dann werden auch die oben angesprochenen gewünschten Störungen eintreten. If spoken in the context of the invention of a gentle vacuum then this note is important because, for example, how described in detail below, too strong a vacuum is the optimal one Composition of the mixture to be polymerized by evaporation monomeric methyl methacrylate could interfere. This is preferably Vacuum about 300 to 900 hPa, especially 450 to 750 hPa However, observing these vacuum conditions does not guarantee only the success sought with the invention. Time is also and Vent temperature is important. Be these points of view not considered, then the ones mentioned above are also considered Disturbances occur.

Vorzugsweise wird in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 25°C entlüftet. Die Zeitdauer der Entlüftung beträgt vorzugsweise etwa 10 bis 60 s, insbesondere 20 bis 40 s.Preferably in a temperature range of about 15 to 25 ° C vented. The duration of the venting is preferably about 10 to 60 s, in particular 20 to 40 s.

Vor der oben angesprochenen Behandlung kann die Polymerisations mischung zur Optimierung des gesamten Verfahrensablaufes, d. h. vor Einbringen des biologischen Materials, unter Stickstoffatmosphäre gerührt werden. Da die Mehrzahl der im Handel erhältlichen monomeren Methyl methacrylat-Materialien einen Inhibitor enthält, ist es zweckmäßig, seine Inhibierungswirkung durch Zugabe eines geeigneten Aktivators, insbesondere von N,N′-Dimethylanilin zu beheben.Before the treatment mentioned above, the polymerization mixture to optimize the entire process, d. H. in front Introducing the biological material, stirred under a nitrogen atmosphere will. Since the majority of the commercially available monomeric methyl contains an inhibitor, it is appropriate to its methacrylate materials Inhibitory effect by adding a suitable activator, to fix in particular of N, N'-dimethylaniline.

Auf jeden Fall muß in der Polymerisationsmischung ein Initiator für die Polymerisation enthalten sein.In any case, an initiator for the Polymerization may be included.

Von besonderem Vorteil ist hierunter das Dibenzoylperoxid. Als grobe Richtlinie könnte hier angegeben werden, daß auf etwa 10 Mol monomeres Methylmethacrylat etwa 0,1 bis 0,3 mMol Initiator, insbe sondere Dibenzoylperoxid entfallen. In Einzelfällen kann es wünschens wert sein, die Härte des Fertigerzeugnisses, wie es erfindungsgemäß erhalten wird, zu steuern. Dies kann durch Zugabe eines geeigneten Weichmachers erfolgen, insbesondere von Nonylphenol-polyglycol-ether acetat.Among them, dibenzoyl peroxide is particularly advantageous. As a rough one Guideline could be given here that about 10 mol monomeric methyl methacrylate about 0.1 to 0.3 mmol initiator, esp special dibenzoyl peroxide is eliminated. In individual cases it may be desirable be worth the hardness of the finished product as it is according to the invention is obtained to control. This can be done by adding an appropriate one Plasticizers are made, especially of nonylphenol polyglycol ether acetate.

Die vorliegende Erfindung geht von vielfältigen Erkenntnissen aus: So beruht sie darauf, daß bei der radikalischen Polymerisation, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weiterhin abläuft, der molekulare Sauerstoff sorgfältig ausgeschlossen werden muß. Daher müssen alle Lösungen vorher entlüftet und mit Stickstoff gesättigt werden, der erst kurz vor der Benutzung durch Entgasung entfernt wird. Zur Bestimmung der Enzymaktivität des Gewebes ist es dabei wichtig, daß der Peroxidgehalt möglichst gering ist. Letztes geschieht durch Zusatz von Aktivatoren, wodurch der Gehalt an Katalysator herabgesetzt wird, vorzugsweise, um eine Reduzierung der Polymerisationstemperatur zu erreichen. Die käuflichen MMA-Monomeren sind regelmäßig mit einem Inhibitor versetzt, der vor der Benutzung entfernt bzw. zerstört werden muß. Bei entstabilisierten und wasserfreien Monomeren kann der Peroxid anteil noch weiter gesenkt werden, wodurch die Reaktionstemperatur ebenfalls erniedrigt werden kann.The present invention is based on diverse findings: it is based on the fact that in the case of the radical polymerization which occurs in the Implementation of the method according to the invention continues to run molecular oxygen must be carefully excluded. Therefore All solutions must be deaerated beforehand and saturated with nitrogen be removed by degassing just before use. To determine the enzyme activity of the tissue, it is important that the peroxide content is as low as possible. The latter happens through addition of activators, which reduces the catalyst content, preferably to reduce the polymerization temperature to reach. The commercially available MMA monomers are regularly with a Inhibitor added, which are removed or destroyed before use got to. In the case of destabilized and anhydrous monomers, the peroxide Proportion can be reduced even further, reducing the reaction temperature can also be lowered.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. bei der Auswahl der Reagenzien sowie der Probenvorbereitung wird vorzugsweise folgendes bedacht: Vorzugsweise werden alle Ausgangschemikalien, die handelsüblich sind, mit dem Reinhaltsgrad "zur Synthese" bezogen. Alle Chemikalien und die einzubettenden Proben sind vorzugsweise frei von Alkoholresten und Wasser. Bei Anwesenheit von Wasser und Alkohol entstehen bei der Polymerisation Blasen, so daß der Kunststoff trübe wird und die Polymerisation nicht vollständig ist. Durch sorgfältige Infiltration der Proben mit der MMA-Mischung, die durch Vakuum unter Stickstoffatmosphäre gesteigert werden kann, lassen sich Wasser- und Alkoholreste in der wünschenswerten Weise entfernen. Um Gasblasen möglichst auszuschließen, die sich um das Biopsiematerial und im Kunst stoffblock bilden können, wird das MMA-Gemisch inklusive Probe unter Stickstoffatmosphäre entlüftet.To carry out the method according to the invention or at Choice of reagents and sample preparation is preferred The following is considered: Preferably all starting chemicals, the are commercially available, with the degree of purity "for synthesis". All Chemicals and the samples to be embedded are preferably free of Alcohol residues and water. In the presence of water and alcohol Bubbles form during the polymerization, so that the plastic becomes cloudy and the polymerization is not complete. By careful Infiltration of the samples with the MMA mixture, carried out by vacuum Nitrogen atmosphere can be increased, water and Remove alcohol residues in the desirable way. To gas bubbles exclude as far as possible who are concerned with the biopsy material and in art block of material, the MMA mixture including the sample is placed under Deaerated nitrogen atmosphere.

Die Wahl der beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Geräte ist nicht kritisch. Dennoch erweisen sich folgende Geräte als besonders vorteilhaft: Für die Polymerisation werden vorzugsweise braune Gläschen (Außendurchmesser: 24 mm; Innendurchmesser: 22 ml; Höhe: 64 mm) benutzt, die vor der Anwendung in Chromschwefelsäure gereinigt, mit entmineralisiertem Wasser ausgewaschen und getrocknet werden. Zum Verschließen der Gläschen werden dichtschließende Kunststoffstopfen benutzt. Wird eine Innentemperaturmessung gewünscht, dann wird ein am Ende zugeschmolzenes Glasröhrchen in das Gläschen gestellt, in das ein Thermofühler eingeführt wird. Die Temperaturaufzeichnung erfolgt ausgehend von dem Temperaturfühler über ein digitales Temperaturmeß gerät, das mit einem Schreiber verbunden ist. Vor jeder Versuchsreihe wird die Meßanordnung geeicht.The choice of the devices to be used in the method according to the invention is not critical. Nevertheless, the following devices prove to be special Advantageous: Brown glasses are preferred for the polymerization (Outer diameter: 24 mm; inner diameter: 22 ml; height: 64 mm) used, cleaned in chromic sulfuric acid before use, with demineralized water can be washed out and dried. To the Sealing the jars becomes tightly closing plastic stoppers used. If an indoor temperature measurement is desired, then an on Put the end of the melted glass tube into the glass, into the one Thermal sensor is introduced. The temperature is recorded starting from the temperature sensor via a digital temperature measurement device connected to a recorder. Before each series of tests the measuring arrangement is calibrated.

Bei der Vorbereitung der Probengefäße wird vorzugsweise wie folgt vorge gangen: Die einzubettenden Proben werden auf einen im Vial vorher poly merisierten "MMA-Boden" gelegt. Durch die etwas rauhere Oberfläche der "MMA-Böden", im Gegensatz zu den Glasböden, lassen sich die Proben besser zentrieren und verändern ihre Lage beim Bewegen nicht. Außerdem treten zwischen Boden und Biopsiematerial keine Schlieren und Glasblasen auf, was häufig zu beobachten ist, wenn die Probe direkt auf den Glasboden gelegt wird.When preparing the sample vessels, the procedure is preferably as follows The samples to be embedded are placed on a poly in the vial beforehand merized "MMA floor". Due to the somewhat rougher surface the "MMA shelves", in contrast to the glass shelves, the Center samples better and do not change their position when moving. In addition, there are no streaks and between the floor and biopsy material Glass bubbles on what is often observed when the sample is directly on the glass shelf is placed.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten MMA-Monomeren werden vorzugsweise in folgender Weise vorbehandelt: Sie werden ent stabilisiert und gereinigt. Dabei geht man so vor, daß sie vorzugsweise mit 0,5 N NaOH so lange extrahiert werden, bis die wäßrige Phase nicht mehr braun gefärbt ist. Anschließend wird mit destilliertem Wasser neutral gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abgesaugt, unter Stickstoff entlüftet, vorsichtig in eine braune Flasche umgefüllt und mit Stickstoff gesättigt. Die derartig behandelten Monomeren können bei +4°C längere Zeit gelagert werden. Kurz vor der Benutzung der Ausgangsmonomeren werden diese entgast, um den Stick stoff zu entfernen.The MMA monomers used in the process according to the invention are preferably pretreated in the following way: They are ent stabilized and cleaned. The procedure is such that it is preferred extracted with 0.5 N NaOH until the aqueous phase is not is colored more brown. Then add distilled water washed neutral, dried with anhydrous sodium sulfate, aspirated, vented under nitrogen, carefully into a brown bottle decanted and saturated with nitrogen. Those treated in this way Monomers can be stored at + 4 ° C for a long time. Shortly before the Using the starting monomers, these are degassed to the stick remove fabric.

Um das erfindungsgemäße Verfahren zu optimieren, werden die vorzugs weise eingesetzten Reaktionspartner des MMA vorzugsweise wie folgt hierfür vorbereitet: Das Dibenzoylperoxid (BPO), bevorzugter Initiator, wird im Vakuum über ein geeignetes Trocknungsmittel, insbesondere Phosphorpentoxid, getrocknet. Das Plastoid N, d. h. das Nonylphenol-poly glycol-etheracetat, wird unter Inertgasatmosphäre, vorzugsweise Stick stoffatmosphäre, entlüftet. Kurz vor der Benutzung wird entgast, um den Stickstoff weitgehend zu entfernen.In order to optimize the method according to the invention, the preferred wise reactants of the MMA preferably used as follows prepared for this: dibenzoyl peroxide (BPO), preferred initiator, is in a vacuum over a suitable drying agent, in particular Phosphorus pentoxide, dried. The plastoid N, i.e. H. the nonylphenol poly glycol ether acetate, is under an inert gas atmosphere, preferably stick atmosphere, vented. Shortly before use, the device is degassed Remove nitrogen to a large extent.

Die Blockhöhe spielt im Hinblick auf die mit der Erfindung angestrebten Effekte eine gewisse Rolle. Um die Chemikalienmenge und die daraus resultierenden Polymerabfälle gering zu halten, aber andererseits einen ausreichend großen Kunststoffblock für das Mikrotom zu erzielen, hat sich eine Höhe des Blockes von etwa 200 mm als optimal erwiesen. Diese Höhe wird in dem vorstehend bezeichneten Gerät durch 9 ml Monomer gemisch erreicht.The block height plays with regard to those aimed at with the invention Effects a certain role. About the amount of chemicals and the result to keep the resulting polymer waste low, but on the other hand one to achieve a sufficiently large plastic block for the microtome a height of the block of approximately 200 mm proved to be optimal. These Height is determined in the above device by 9 ml of monomer mixture reached.

Der bevorzugte Standardablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich wie folgt umreißen: Monomer + Initiator + Weichmacher + unter N₂ Atmosphöre rühren + Aktivator, unter Stickstoffatmosphäre rühren, 9 ml Ausgangsmaterial in Vial füllen, bei Raumtemperatur Vakuum unter Stickstoffatmosphäre anlegen und 30 sec entgasen, Vial verschließen und bei etwa 16 bis 20°C, insbesondere etwa 18°C im Wasserbad 18 bis 30 h, insbesondere etwa 24 h polymerisieren.The preferred standard sequence of the process according to the invention can be outlined as follows: monomer + initiator + plasticizer + stir under N ₂ atmosphere + activator, stir under a nitrogen atmosphere, fill 9 ml of starting material in a vial, apply a vacuum at room temperature under a nitrogen atmosphere and degas for 30 seconds, close the vial and polymerize at about 16 to 20 ° C., in particular about 18 ° C. in a water bath for 18 to 30 hours, in particular about 24 hours.

Um eine vollständige Polymerisation bei niedriger Temperatur zu erzielen, müssen die Monomeren vorzugsweise weitgehend entstabilisiert werden. N,N′-Dimethyl-p-toluidin (DMT) als Ersatz für das N,N′-Dimethyl anilin (DMA) bringt nicht den gleichen Erfolg, da bei gleicher Außen temperatur die Innentemperatur sehr viel höher ist, sich Gasblasen bilden und ein höherer Anteil an Monomeren vorliegt. Bei der Absenkung der Außentemperatur auf +9°C liegt die Innentemperatur niedriger. Es bilden sich aber ebenfalls Gasblasen. Die Polymerisation ist nicht vollständig. Das Vakuum darf nicht größer als 600 hPa sein, während die Entlüftungs zeit 30 sec nicht überschreiten sollte, da selbst bei niedrigen Temperaturen das Peroxid Radikale bilden kann. Außerdem verdampfen die Monomeren und die Aktivatoren im Vakuum sehr leicht. Im Mono mergemisch stellt sich dann ein anderes prozentuales Verhältnis zu den anderen Komponenten ein, was zu höheren Temperaturen führt. Wichtig ist auch noch die Erkenntnis, daß die Kunststoffblöcke, die mit DMA oder DMT versetzt, bei Lichteinfluß nach ca. 4 Tagen gelb werden, während die Polymerisate, wenn sie in braunen Gläschen aufbewahrt werden, zu keiner Verfärbung führen.To complete polymerization at low temperature too achieve, the monomers preferably preferably largely destabilized will. N, N'-dimethyl-p-toluidine (DMT) as a replacement for the N, N'-dimethyl aniline (DMA) does not bring the same success because it has the same appearance temperature the internal temperature is much higher, gas bubbles form and there is a higher proportion of monomers. When lowering the Outside temperature to + 9 ° C, the inside temperature is lower. Make it up but also gas bubbles. The polymerization is not complete. The vacuum must not be greater than 600 hPa during the venting time should not exceed 30 sec, even at low Temperatures that peroxide can form radicals. Also evaporate the monomers and the activators in a vacuum very easily. In mono a different percentage ratio to the other components, which leads to higher temperatures. Important is also the realization that the plastic blocks that are used with DMA or DMT offset, turn yellow after about 4 days when exposed to light, while the polymers when stored in brown jars will not lead to discoloration.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt sowohl gegenüber den eingangs geschilderten bekannten MMA- und GMA-Methoden, sei es auch in Kombi nation, sowie auch gegenüber der bekannten Paraffineinbettung viel fältige Verbesserungen. Es lassen sich aufgrund der besonderen Härte der MMA-Polymerisatblöcke in einfacher Weise unter Verwendung auto matischer Mikrotome besonders dünne Schnitte herstellen. Bei kalk haltigen Substanzen stellt sich gegenüber Entkalkungsmethoden eine deutlich kürzere Bearbeitungsdauer ein, vor allem wird die Möglichkeit zur Anwendung von Spezialfärbungen erschlossen, die notwendig sind, um über den erhaltenen Mineralgehalt des Knochens die Erkrankung zu diagnostizieren. Im Vergleich zu der GMA-Einbettung stellt sich eine ungleich größere Härte des Kunststoffblocks mit der Bewahrung der Möglichkeit ein, den Kunststoff mit folgenden zwei Vorteilen in dem wünschenswerten Umfang herauszulösen: So ist die Anwendung von sauren Farbstoffen, die in vielen wichtigen Färbungen enthalten sind und die somit bei der GMA-Methode nur schlecht einsetzbar sind, möglich. Darüber hinaus stellt sich eine bessere Handhabbarkeit der Schnitte bei Aufbringen auf Objektträger ein. Die GMA-Schnitte haben eine honig artige Konsistenz und neigen zur Faltenbildung (Übereinanderschlagen von Schnittanteilen), während die MMA-Schnitte von dem erfindungsgemäß erhaltenen Blöcken höchstens wellig sind, was aber durch Glattpinseln verhindert werden kann.The inventive method shows both compared to the beginning known MMA and GMA methods described, be it in combination nation, as well as a lot compared to the known paraffin embedding vast improvements. Due to the special hardness of the MMA polymer blocks in a simple manner using auto of microtomes make particularly thin sections. With lime contains substances compared to decalcification methods significantly shorter processing time, especially the possibility developed for the application of special stains that are necessary to the disease through the mineral content of the bone diagnose. In comparison to the GMA embedding, there is one much greater hardness of the plastic block with the preservation of the Possibility one in the plastic with the following two advantages desirable scope: So is the use of acidic Dyes that are contained in many important colors and are therefore difficult to use with the GMA method. In addition, the cuts are easier to handle Apply to slides. The GMA cuts have a honey like consistency and tend to form wrinkles (overlapping of Cuts), while the MMA cuts of the invention blocks obtained are at most wavy, but this is due to smooth brushes can be prevented.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Poly merisationsmischung mit dem darin enthaltenen biologischen Substrat vor Einleitung der Polymerisation unter Inertgasatmosphäre kurzfristig bei niedriger Temperatur und unter gelindem Vakuum entlüftet wird. Die er haltenen Methylmethacrylat-Polymerisatblöcke zeichnen sich durch eine besondere Härte aus, so daß hiermit vorteilhafte dünne Schnitte unter Verwendung automatischer Mikrotome herstellbar sind und hierdurch enzym- und immunhistochemische Reaktionen möglich werden. Diese Vor teile gehen insbesondere auf die vorteilhafte Kaltpolymerisation, auf der die vorliegende Erfindung beruht, zurück.The inventive method is characterized in that the poly merization mixture with the biological substrate contained therein Initiation of the polymerization under an inert gas atmosphere at short notice low temperature and under a gentle vacuum. Which he Holding methyl methacrylate polymer blocks are characterized by a special hardness, so that hereby advantageous thin cuts under Use of automatic microtomes can be produced and thereby enzyme and immunohistochemical reactions are possible. This before parts go in particular on the advantageous cold polymerization, on the the present invention is based.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Beispiels noch näher erläutert werden:The invention will be explained in more detail below using an example are explained:

example

Herangezogen wird folgende Infiltrierlösung:
10 ml MMA (94,09 mMol), 47 mg BPO (0,19 mMol) sowie 1 ml Plastoid N (Nonylphenol-polyglycol-etheracetat) (10%) werden mit einem Magnet rührer gut durchmischt und bei Raumtemperatur sowie unter Stickstoff atmosphäre bei einem Vakuum von 600 hPa 30 sec lang entlüftet.The following infiltration solution is used:
10 ml MMA (94.09 mmol), 47 mg BPO (0.19 mmol) and 1 ml Plastoid N (nonylphenol polyglycol ether acetate) (10%) are mixed well with a magnetic stirrer and at room temperature and under a nitrogen atmosphere vented under a vacuum of 600 hPa for 30 sec.

Die MMA-Böden werden wie folgt hergestellt:
10 ml MMA (94,09 mMol), 350 mg BPO (1,44 mMol) sowie 2,5 ml Plastoid N (Nonylphenol-polyglycol-etheracetat) (25%ig) werden mit einem Magnet rührer gut gemischt und bei Raumtemperatur sowie unter Stickstoffatmos phäre bei einem Vakuum von 600 hPa 30 sec lang entlüftet. Hiervon werden 400 Mikroliter in Einbettgläschen gegeben und wie oben, aber ohne Magnetrührung, entlüftet. Die Gläschen werden verschlossen und bei 50°C im Wärmeschrank polymerisiert. Die Höhe des MMA-Bodens beträgt ca. 1 mm.The MMA floors are manufactured as follows:
10 ml MMA (94.09 mmol), 350 mg BPO (1.44 mmol) and 2.5 ml plastoid N (nonylphenol polyglycol ether acetate) (25%) are mixed well with a magnetic stirrer and at room temperature and under Nitrogen atmosphere vented at a vacuum of 600 hPa for 30 sec. 400 microliters of this are placed in single-walled jars and vented as above, but without magnetic stirring. The jars are sealed and polymerized at 50 ° C in the heating cabinet. The height of the MMA base is approx. 1 mm.

Die Einbettung des Biopsiematerials erfolgt in folgender Weise:
10 ml MMA (94,09 mMol), 47 mg BPO (0,19 mMol) sowie 1 ml Plastoid N (Nonylphenol-polyglycol-etheracetat) (10%) werden unter Stickstoffatmos phäre gemischt. Hierzu werden 50 Mikroliter N,N′-Dimethylanilin (DMA) (0,39 mMol) hinzugefügt. Es wird unter Stickstoffatmosphäre gerührt. 9 ml dieser Lösung werden vorsichtig auf die MMA-Böden gegeben. Darauf wird die Gewebeprobe in Form von Knochenmark hinzugefügt. Dadurch wird verhindert, daß sich Luft unter den Probenboden befindet. Es schließt sich eine Entlüftung bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmos phäre sowie unter einem Vakuum von 600 hPa während 30 sec an. Die Gläschen werden anschließend sofort verschlossen und bei 19°C im Wasserbad polymerisiert. Nach 24 h ist die Polymerisation vollständig abgeschlossen.The biopsy material is embedded in the following way:
10 ml of MMA (94.09 mmol), 47 mg of BPO (0.19 mmol) and 1 ml of Plastoid N (nonylphenol polyglycol ether acetate) (10%) are mixed under a nitrogen atmosphere. 50 microliters of N, N'-dimethylaniline (DMA) (0.39 mmol) are added. It is stirred under a nitrogen atmosphere. 9 ml of this solution are carefully added to the MMA trays. The tissue sample is then added in the form of bone marrow. This prevents air from being under the sample floor. This is followed by venting at room temperature under a nitrogen atmosphere and under a vacuum of 600 hPa for 30 sec. The jars are then immediately sealed and polymerized in a water bath at 19 ° C. The polymerization is complete after 24 h.

Claims

1. Process for embedding biological substrate, in particular biopsy substrates, in a polymethyl methacrylate block by introducing the biological substrate into a monomeric methyl methacrylate, a polymerization mixture containing an initiator and optionally an activator and polymerization of this mixture to produce a solid, polymethyl methacrylate block capable of being cut, characterized in that the polymerization mixture with the biological substrate contained therein is briefly vented under an inert gas atmosphere at a low temperature and under a gentle vacuum before initiating the polymerization.

2. The method according to claim 1, characterized in that under stick atmosphere is vented.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that at about 15 to 25 ° C is vented.

4. The method according to at least one of claims 1 to 3, characterized characterized in that during about 10 to 60 s, in particular 20 to 40 s is vented.

5. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that at a vacuum of about 300 to 900 hPa, in particular 450 to 750 hPa is vented.

6. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the polymerization mixture before Ein bring the biological substrate stirred under a nitrogen atmosphere becomes.

7. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the polymerization mixture is a suitable one Activator, in particular N, N'-dimethylaniline, is added.

8. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that on the bottom of the embedding vessel a floor material made of a polymethyl methacrylate is located.

9. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the polymerization mixture for control a plasticizer is incorporated into the hardness of the finished product.

10. The method according to claim 9, characterized in that as a soft Macher Nonylphenol polyglycol ether acetate is used.

11. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that an initiator in the polymerization mixture Form of dibenzoyl peroxide is incorporated.

12. The method according to claim 12, characterized in that to about 10 moles of monomeric methyl methacrylate about 0.1 to 0.3 mmoles of dibenzoyl peroxide can be used.