DE4002693A1 - Regeneration of stored erythrocyte concentrates - with soln. contg. inosine, pyruvate, phosphate, sodium chloride and sodium hydroxide - Google Patents
Regeneration of stored erythrocyte concentrates - with soln. contg. inosine, pyruvate, phosphate, sodium chloride and sodium hydroxideInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regenerierung gelagerter Erythrozytenkonzentrate für Transfusionszwecke. Das Verfahren kann insbesondere bei Massivtransfusionen, bei Austauschtransfusionen, bei autologen Transfusionen, bei Sauerstoffmangelzuständen, im Zusammenhang mit der Kryokonservierung und bei jeder anderen Transfusion von Erythrozytenkonzentraten angewendet werden.The invention relates to a method for regeneration stored erythrocyte concentrates for transfusion purposes. The The method can be used in particular for massive transfusions Exchange transfusions, with autologous transfusions, with Oxygen deficiency associated with the Cryopreservation and any other transfusion of Erythrocyte concentrates are used.
Die Lagerung von Erythrozytenkonzentraten (EK) führt zu einer 2,3DPG (2,3-Diphosphoglyzerat)-Verarmung und einer teilweisen ATP (Adenosintriphosphat)-Verarmung. Das ATP ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Konzentrationsunterschiede der Kationen zwischen Erythrozyt und Plasma, für die Aufrechterhaltung der spezifischen Zusammensetzung der organischen Bestandteile, für die Erhaltung des Hämoglobins im Funktionszustand und für die Aufrechterhaltung der Zellstruktur. Die Hauptfunktion des 2,3DPG besteht in der Regulation der Sauerstoffabgabe. Die Affinität des Hämoglobins zum Sauerstoff verringert sich durch die Bindung von 2,3DPG, wodurch die Sauerstoffabgabe an das Gewebe erleichtert wird. Um die physiologischen Funktionen des ATP und des 2,3DPG zu gewährleisten, müssen die für den klinischen Einsatz vorgesehenen EK′s auch physiologische Werte, was den ATP- und 2,3DPG-Gehalt anbetrifft, aufweisen. Der physiologische ATP-Gehalt beträgt 60 mmol/mol Hb*Fe und der des 2,3DPG 250 mmol/mol Hb*Fe.The storage of erythrocyte concentrates (EK) leads to a 2,3DPG (2,3-diphosphoglycerate) depletion and a partial ATP (adenosine triphosphate) depletion. The ATP is responsible for maintaining the concentration differences of the Cations between erythrocyte and plasma, for which Maintaining the specific composition of the organic components, for the maintenance of hemoglobin in the Working condition and for the maintenance of Cell structure. The main function of the 2,3DPG is the Regulation of oxygen release. The affinity of hemoglobin to oxygen decreases by binding 2,3DPG, which facilitates the delivery of oxygen to the tissue. Around the physiological functions of the ATP and the 2,3DPG ensure the need for clinical use provided EK's also physiological values, which the ATP and 2.3DPG content. The physiological ATP content is 60 mmol / mol Hb * Fe and that of 2,3DPG 250 mmol / mol Hb * Fe.
An 2,3DPG und ATP verarmte EK′s sind bei Indikationen wie Massivtransfusionen, besonders bei Kindern, Transfusionen bei alten Patienten und Transfusionen bei Patienten mit kardiovaskulären und pulmonalen Erkrankungen nicht einsetzbar.EK's depleted in 2,3DPG and ATP are for indications such as Massive transfusions, especially in children, transfusions old patients and transfusions in patients with cardiovascular and pulmonary diseases cannot be used.
So stellten R. C. Dennis et al. (Surgery 77 (1975) 741-747) fest, daß ein 150% 2,3DPG enthaltendes EK zu einer signifikant höheren Sauerstoffausnutzung des Gewebes und zu einer verbesserten myocardialen Funktion nach einer Operation führt im Vergleich zu einem nur 70% 2,3DPG enthaltendem EK. E. Beutler (Vox. Sang. 34 (1978) 113-115) weist darauf hin, daß bei schwer kranken Patienten die Kompensationsmechanismen der 2,3DPG-Regeneration erliegen und für diese Patienten maximal eine Woche gelagerte EK verwendet werden sollten.For example, R. C. Dennis et al. (Surgery 77 (1975) 741-747) found that an EK containing 150% 2.3DPG resulted in a significant higher oxygen utilization of the tissue and to a leads to improved myocardial function after surgery compared to an EK containing only 70% 2,3DPG. E. Beutler (Vox. Sang. 34 (1978) 113-115) points out that the compensation mechanisms of the seriously ill patients 2,3DPG regeneration succumb and maximal for these patients EK stored for a week should be used.
Seit Anfang der 70er Jahre ist bekannt, daß sich gelagerte EK′s durch Inkubation mit inosin-, pyruvat- und phosphathaltigen Lösungen (IPP-Lösungen) regenerieren lassen.It has been known since the early 1970s that EK’s by incubation with inosine, pyruvate and Let phosphate-containing solutions (IPP solutions) regenerate.
Oski et al. (Blood 37 (1971) 52-58) inkubieren in einer IPP-haltigen Lösung, benötigen aber eine 2- bzw. 4stündige Inkubation bei +37C, um 70 bzw. 150% des normalen 2,3DPG-Gehaltes zu erreichen. C. Leber (Prom.A, 1987) und R.Oski et al. (Blood 37 (1971) 52-58) incubate in one IPP-containing solution, but need a 2 or 4 hour Incubation at + 37C, around 70 or 150% of normal To reach 2.3 DPG content. C. Leber (Prom.A, 1987) and R.
Bräutigam und R. Giese (Diplomarbeit 1987) verwenden IPP-Lösungen, mit denen bereits nach 2-stündiger Inkubation normale 2,3DPG-Werte erreicht werden können. Von Nachteil ist hier die hohe Osmolalität, vor allem aufgrund des hohen NaCl-Gehaltes dieser Lösungen (700 mosmol/kg). Das führt zur Zellschrumpfung, wodurch die Erythrozyten schlechter deformierbar sind und damit eine geringere Überlebensrate besitzen. Klinisch führt der Deformierbarkeitsverlust zu Lungenödemen und zu cardiogenen Schockzuständen.Groom and R. Giese (diploma thesis 1987) use IPP solutions with which already after 2 hours of incubation normal 2.3DPG values can be achieved. The disadvantage is here the high osmolality, mainly due to the high NaCl content of these solutions (700 mosmol / kg). That leads to Cell shrinkage, which makes erythrocytes worse are deformable and thus a lower survival rate have. Clinically, the loss of deformability leads to Pulmonary edema and cardiogenic shock.
Ebenfalls eine zu hohe Osmolalität hat die von Valeri et al. (Transfusion 22 (1982) 102-106) verwendete Inkubationslösung (500 mosmol/kg). Auch der pH-Wert dieser Inkubationslösung ist mit 7,2 zu gering, um das EK wirksam zu neutralisieren. Weitere Versuche zur Aufrechterhaltung des 2,3DPG-Wertes bestanden bisher auch darin, den pH-Wert zu Beginn der Lagerung zu erhöhen (D. Strauss et al. in: VII. Int. Symp., Strukt. u. Funkt. d. Erythr., Akademie-Verlag, Berlin, 1975, 483-486), die Regenerierungslösungen mit entsprechenden Zusätzen, wie z. B. Dihydroxyaceton, zu versehen (US-PS 37 95 581) und die Glykolyseenzyme zu beeinflussen (US-PS 47 74 088). Bei diesen Versuchen ist die Lagerdauer begrenzt, und der 2,3DPG-Erhalt geht mit einem ATP-Verlust einher, was zu einer geringen Überlebensrate der Erythrozyten führt.The osmolality of Valeri et al. (Transfusion 22 (1982) 102-106) used incubation solution (500 mosmol / kg). The pH of this incubation solution is also 7.2 too low to effectively neutralize the EK. Further Attempts to maintain the 2.3 DPG value passed so far also in the pH at the beginning of storage increase (D. Strauss et al. in: VII. Int. Symp., Strukt. u. Radio. d. Erythr., Akademie-Verlag, Berlin, 1975, 483-486), the Regeneration solutions with appropriate additives, such as. B. Dihydroxyacetone, to be provided (US-PS 37 95 581) and the Influencing glycolysis enzymes (US Pat. No. 4,774,088). With these Trying is limited in storage time and 2,3DPG receipt is associated with an ATP loss, resulting in a low Survival rate of erythrocytes leads.
In der GB-PS 20 00 023 wird zur Aufrechterhaltung des 2,3DPG-Gehaltes die Verwendung einer Resuspensionslösung (Zusatz direkt nach der Blutabnahme) in Kombination mit einer initialen Anhebung des pH-Wertes beschrieben. Hier werden noch nach 28 d Lagerung normale 2,3DPG-Werte gemessen, was allerdings einer kontinuierlichen Phosphatzufuhr, verbunden mit einem Ionenaustauscher, bedarf.In GB-PS 20 00 023 is used to maintain the 2.3 DPG content the use of a resuspension solution (Additive immediately after taking blood) in combination with a initial increase in pH is described. Here are still after 28 d storage normal 2.3DPG values measured, what however, a continuous supply of phosphate combined with an ion exchanger.
G. L. Moore et al. (Vox. Sang. 53 (1987) 15-18) haben ein bei -80C gelagertes Citrat-Phosphat-Dextrose-EK (CPD-EK) nach dem Auftauen mit einer Lösung, die Adenin, Ascorbat-2-phosphat, Natriumphosphat, Dextrose und Mannitol enthält, versehen. Diese Lösung hat einen pH-Wert von 11 und eine relativ hohe Osmolarität von 466 mosmol/l. Der 2,3DPG-Gehalt kann 21 d aufrechterhalten werden, wohingegen der ATP-Gehalt nur 62% des Normalwertes beträgt.G.L. Moore et al. (Vox. Sang. 53 (1987) 15-18) have one at -80C stored citrate-phosphate-dextrose-EK (CPD-EK) after the Thawing with a solution containing adenine, ascorbate-2-phosphate, Contains sodium phosphate, dextrose and mannitol. These Solution has a pH of 11 and a relatively high one Osmolarity of 466 mosmol / l. The 2,3DPG content can be 21 d be maintained, whereas the ATP content only 62% of the Normal value.
Bei allen bisher bekannten Lösungen des Problems werden durch entsprechende Zusätze und/oder pH-Werterhöhungen entweder der 2,3DPG-Gehalt oder der ATP-Gehalt auf Kosten des anderen längere Zeit aufrechterhalten, oder durch eine zu hohe Osmolarität der Inkubationslösungen wird die Erythrozytenmorphologie und damit die Überlebensrate negativ beeinflußt.In all known solutions to the problem are by appropriate additives and / or pH increases either the 2,3DPG content or the ATP content at the expense of the other maintained for a long time, or by too high The osmolarity of the incubation solutions Erythrocyte morphology and thus the survival rate negative influenced.
Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur Regenerierung von gelagerten Erythrozytenkonzentraten bereitzustellen, mit dem innerhalb kurzer Zeit und ohne großen Aufwand sowohl normale 2,3DPG-Werte als auch normale ATP-Werte erreicht werden können, dabei eine ausreichende Überlebensrate der Erythrozyten garantiert ist und die Erythrozytenmorphologie nicht beeinträchtigt wird. Mit diesem Verfahren sollen gelagerte EK′s innerhalb kurzer Zeit zur wirksamen klinischen Anwendung, besonders zu Transfusionszwecken, bereit sein.The aim of the invention is to provide a simple method for Regeneration of stored erythrocyte concentrates to provide with the within a short time and without large Effort both normal 2.3DPG values and normal ATP values can be achieved with a sufficient survival rate the erythrocyte is guaranteed and the erythrocyte morphology is not affected. With this procedure stored EK's within a short time for effective clinical Be ready for use, especially for transfusion purposes.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine inosin-, pyruvat- und phosphatenthaltende Inkubationslösung (IPP-Lösung) bereitzustellen, durch deren Zusatz die gewünschte schnelle Regenerierung der gelagerten Erythrozytenkonzentrate innerhalb von 60-90 min. erreicht wird, ohne andere wichtige Parameter zu beeinträchtigen.The object of the invention is an inosine, pyruvate and phosphate-containing incubation solution (IPP solution) to provide, by adding them the desired quick Regeneration of the stored erythrocyte concentrates within from 60-90 min. is achieved without other important parameters too affect.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man einem beliebigem Volumen EK bei +37C 20-40 Volumenanteile in % einer Inkubationslösung zusetzt, die 20-40 mmol/l Inosin, 20-40 mmol/l Pyruvat, 20-60 mmol/l Phosphat, 20-40 mmol/l NaCl und 40-80 mmol/l NaOH enthält (IPP/NaCl/NaOH-Lösung).According to the invention the object is achieved in that one any volume EK at + 37C 20-40 volume fractions in% one Incubation solution that adds 20-40 mmol / l inosine, 20-40 mmol / l pyruvate, 20-60 mmol / l phosphate, 20-40 mmol / l NaCl and Contains 40-80 mmol / l NaOH (IPP / NaCl / NaOH solution).
Durch die erfindungsgemäße Auswahl dieser Lösung wird es möglich, den 2,3DPG- und den ATP-Gehalt 1-8 Wochen bei +4C gelagerter EK′s nach 60-90minütiger Inkubation mindestens auf Normalwerte zu erhöhen (Abb. 1). Ohne Zugabe von NaOH ist eine 2stündige Inkubation nötig, um physiologische Werte zu erreichen. Mit der erfindungsgemäßen Inkubationslösung können durch längere Inkubation auch hypernormale Werte erreicht werden. Ein hypernormaler 2,3DPG-Gehalt bewirkt eine noch günstigere Sauerstoffabgabe ans Gewebe, bei 300-400% des normalen 2,3DPG-Gehaltes treten jedoch toxische Effekte auf.By selecting this solution according to the invention, it is possible to increase the 2,3DPG and the ATP content to EK values stored at + 4C for 1-8 weeks after 60-90 minutes of incubation at least to normal values ( Fig. 1). Without the addition of NaOH, a 2 hour incubation is necessary to achieve physiological values. With the incubation solution according to the invention, hypernormal values can also be achieved by prolonged incubation. A hypernormal 2.3DPG content results in an even more favorable oxygen release to the tissue, but at 300-400% of the normal 2.3DPG content there are toxic effects.
In Abb. 2 wird die Veränderung des intra- und extrazellulären pH-Wertes 21 Tage konservierter Erythrozyten durch die erfindungsgemäße Inkubationslösung dargestellt. Der für den Regenerierungsprozeß wirksame intrazelluläre pH-Wert beläuft sich auf etwa 7,1. Wenn die Inkubationslösung nur IPP enthält, erfolgt die Regenerierung lediglich bei einem pH-Wert zwischen 6,7 und 6,8. Fig. 2 shows the change in the intracellular and extracellular pH value of preserved erythrocytes for 21 days by the incubation solution according to the invention. The intracellular pH value that is effective for the regeneration process is approximately 7.1. If the incubation solution contains only IPP, the regeneration only takes place at a pH value between 6.7 and 6.8.
Aus Abb. 3 erkennt man, daß sich die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) im oberen Bereich von Normwerttabellen bewegt (Frauen: 20,0-22,5 mmol/l; Männer: 18,5-21 mmol/l). Damit wird eine wichtige Zielstellung erreicht, da jetzt die Voraussetzungen für eine optimale Deformierbarkeit und Überlebensrate der Erythrozyten erfüllt sind.From Fig. 3 it can be seen that the mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) is in the upper range of standard value tables (women: 20.0-22.5 mmol / l; men: 18.5-21 mmol / l). This achieves an important goal, since the conditions for optimal deformability and survival rate of the erythrocytes are now fulfilled.
In Abb. 4 ist die morphologische Regenerierung dargestellt. Der erreichte Wert des morphologischen Index von 0,88+/-0,04 zeigt, daß die Erythrozyten eine gute Überlebensrate haben, und sie somit ihrer physiologischen Funktion gerecht werden können. Fig. 4 shows the morphological regeneration. The achieved value of the morphological index of 0.88 +/- 0.04 shows that the erythrocytes have a good survival rate and can therefore fulfill their physiological function.
Die Osmolalität der extrazellulären Flüssigkeit beträgt nach der Inkubation 312+/-19 mosmol/kg, was dem physiologischen Wert von 300 mosmol/kg nahekommt. Damit wird eine weitere Forderung an die Inkubationslösung erfüllt.The osmolality of the extracellular fluid after incubation is 312 +/- 19 mosmol / kg, which is the physiological value of 300 mosmol / kg approximates. So that will fulfilled another requirement for the incubation solution.
Die erreichte Hämolyserate von 0,21+/-0,07% erfüllt ebenfalls die Anforderung für Transfusionen (<1%).The achieved hemolysis rate of 0.21 +/- 0.07% also met the requirement for transfusions (<1%).
Durch die Anwendung der erfindungsgemäßen NaOH-enthaltenden Inkubationslösung mit verringertem Phosphat- und NaCl-Gehalt wird somit eine schnelle Regenerierung der EK′s erreicht, wobei die Erythrozytenmorphologie erhalten bleibt. Die Erythrozyten können nach der Transfusion ihrer physiologischen Aufgabe gerecht werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren regenerierten EK′s sind noch mindestens 7 Tage bei +4C nachlagerbar, wobei alle wesentlichen Parameter annähernd erhalten bleiben. Die Erfindung ist auch zur Regenerierung kryokonservierter EK′s anwendbar.By using the NaOH-containing invention Incubation solution with reduced phosphate and NaCl content is thus a rapid regeneration of the EK's achieved the erythrocyte morphology is retained. The erythrocytes can after the transfusion of their physiological task satisfy. The with the inventive method regenerated EK's are at least 7 days at + 4C re-stockable, with all essential parameters approximate remain. The invention is also for regeneration cryopreserved EK's applicable.
Ein CPD-stabilisiertes und SAGM-resuspendiertes Erythrozytenkonzentrat wird in einem 3fach Beutelsystem (FENWAL) 3 Wochen bei +4C gelagert. 40 ml von diesem EK werden mit 30 Vol.-% (17 ml) der erfindungsgemäßen Inkubationslösung (30 mmol/l Inosin, 30 mmol/l Pyruvat, 45 mmol/l Phosphat, 31 mmol/l NaCl, 62 mmol/l NaOH) unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Box versetzt. Infolge der komplexen Wirkung der Inkubationslösung kann der ATP- und 2,3DPG-Gehalt, wie in Abb. 1 ersichtlich, regeneriert werden. Aufgrund des geradlinigen Anstieges des 2,3DPG-Gehaltes werden nach etwa 90minütiger Inkubation physiologische 2,3DPG-Werte erreicht (250 mmol/mol Hb*Fe). Der physiologische ATP-Gehalt (60 mmol/mol Hb*Fe) wird bereits nach 30 minütiger Inkubation erreicht. Ohne die Zugabe von NaOH ist eine 2stündige Inkubation nötig, um physiologische Werte zu erreichen.A CPD-stabilized and SAGM-resuspended erythrocyte concentrate is stored in a triple bag system (FENWAL) for 3 weeks at + 4C. 40 ml of this EK are mixed with 30% by volume (17 ml) of the incubation solution according to the invention (30 mmol / l inosine, 30 mmol / l pyruvate, 45 mmol / l phosphate, 31 mmol / l NaCl, 62 mmol / l NaOH) placed in a laminar flow box under sterile conditions. Due to the complex effect of the incubation solution, the ATP and 2,3DPG content can be regenerated, as shown in Fig. 1. Due to the straight-line increase in the 2.3DPG content, physiological 2.3DPG values are reached after about 90 minutes of incubation (250 mmol / mol Hb * Fe). The physiological ATP content (60 mmol / mol Hb * Fe) is reached after just 30 minutes of incubation. Without the addition of NaOH, a 2 hour incubation is necessary to achieve physiological values.
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