DE3939801A1 - Neue proteine und ihre herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine und deren Herstellung.

Es sind bereits eine Reihe von Proteinen - wie TPA, Urokinase und Streptokinase - bekannt, die Blutgerinnsel auflösen können. Ihre Wirkung besteht darin, daß sie das im Blutgerinnsel vorhandene Fibrin durch Spaltung von Peptidketten depolymerisieren und damit löslich machen. Die Auflösung von Blutgerinnseln kann auch dadurch erfolgen, daß ε-(γ-Glutamyl)-Lysin-Bindungen gelöst werden. Solche Stoffe sind aus Hirudo medicinalis isoliert worden. Hierzu gehört die Destabilase (Biochemistry, USSR 50, 357 (1985)), die ein Molekulargewicht von 12 300 Da besitzt (XII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Abstract 1727 (1989)).

Gegenstand der Erfindung ist ein neues, glykosyliertes Protein, welches ein apparentes Molekulargewicht von etwa 57 000 Da besitzt, sich aus Hirudo medicinalis isolieren läßt und ε-(γ-Glutamyl)-Lysin-Bindungen spaltet, sowie dessen Muteine.

Als Muteine sind Proteine zu verstehen, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden in der Proteinkette entstehen.

Das apparente Molekulargewicht ist mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese oder Gelchromatographie ermittelt worden. Die Meßgenauigkeit beträgt ±5000 Da.

Das neue Protein läßt sich aus Drüsenabsonderungen des Blutegels (Hirudo medicinalis) durch Chromatographie an S-Sepharose®, Concanavalin A und Kupferchelat isolieren. Aus den Drüsenabsonderungen von 500 g Blutegeln lassen sich 30 bis 200 Aktivitätseinheiten des Proteins isolieren.

Das hier beschriebene Protein liegt in den Drüsenabsonderungen in Konzentrationen zwischen 1-100 µg/kg vor. Um das Protein für pharma­ zeutische Zwecke in größeren Mengen verfügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1982) heranziehen. Für diesen Zweck muß zunächst die genetische Information für das neue Protein identifiziert und die entsprechende Nukleinsäure isoliert werden. Dazu wird das reine Protein mit Dithiothreitol reduziert, dann wird Iodacetamid zur Derivatisierung der freien SH-Gruppen zugesetzt, und anschließend wird das so behandelte Protein mit Bromcyan oder Trypsin in kleine Peptide gespalten. Die Auftrennung der Peptide erfolgt über reversed phase- Chromatographie. Die gereinigten Peptide werden anschließend sequenziert.

Die vorhandenen Peptidsequenzen erlauben nun durch die Synthese entspre­ chender Oligonukleotide eine eindeutige Identifizierung des Gens aus dem Genom oder aus entsprechenden c-DNA-Bänken durch sequenzspezifische Filterhybridisierung.

Die so erhaltene genetische Information für das Protein kann dann in verschiedenen Wirtszellen, wie eukaryotische Zellen, Hefen, Bacillus subtilis oder E. coli nach bekannten Methoden zur Expression gebracht und das Protein in größeren Mengen so erhalten werden. In den eukaryotischen Zellen entsteht dabei das Protein in glykosylierter Form, Bakterien liefern das Enzym in deglykosylierter Form.

Die Muteine, werden vorzugsweise nach gentechnischen Methoden dargestellt.

Das neue Protein ist eine Isopeptidase und kann durch seine enzymatische Aktivität die von dem aktivierten Faktor XIII quervernetzten Fibringerinnsel (Thrombus) auflösen. Diese Quervernetzung wird durch eine Isopeptidbindung zwischen Glutamat- und Lysinseitenketten gebildet. Die Spaltung erfolgt durch den Transfer eines y-Glutamylrestes auf eine andere Aminosäure, ein Dipeptid oder durch Hydrolyse. Das Dipeptid Glycylglycin beschleunigt die Reaktion um 500%. So kann dieses Enzym in der Behandlung thrombotischer Zustände (z. B. Myocardinfarkt, tiefe Venenthrombose und Atherosklerose) in der akuten Therapie wie auch in der Vorbeugung eingesetzt werden.

Auch freigesetzte Tumorzellen verankern sich über eine ε-(γ-Glutamyl)- Lysin-Bindung in ihrem Zielgewebe und entziehen sich dem Immunsystem dann durch Fibrinummantelung. Das neue Enzym eignet sich daher auch zur Verhinderung der Bildung von Metastasen.

Gewinnung des neuen Proteins a) Gewinnung des Egelsekrets

500 g Hirudo medicinalis wurden bei 4°C im Kühlraum mit wenig Wasser in Portionen zu ca. 50 g gehalten. Die Tiere wurden 2 h in 150 mM NaCl, 10 mM Arginin und 20 mM Phosphatpuffer ph 7,4 bei Raumtemperatur stimuliert. Nach 2 Tagen wurden sie 1 h in 150 mM NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4 und 1% Pilocarpin gebadet. Dabei sonderten sie große Mengen Schleim sowie eine enzymatische Aktivität ab, die das Farbsustrat γ-Glutamyl-para- Nitroanilid umsetzt. 500 g Egel sonderten 30 bis 200 Units dieser enzymatischen Aktivität ab.

b) Isolierung des Proteins aus dem Egelsekret

100 Units (vgl. a) wurden mit 5 l Äquilibrierungspuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 4,5, 10 mM NaCl, 0,01% Tween® 80) verdünnt. Der pH wurde auf 4,5 korrigiert. Das Endvolumen betrug ca. 6 l. Das Volumen wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Minute auf 350 ml S-Sepharose® aufgetragen, mit 4 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit einem Salz-Gradienten von 1 l 20 mM Natrium­ phosphatpuffer pH 4,5, 10 mM NaCl, 0,01% Tween® 80 nach 1 l 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 4,5, 500 mM NaCl, 0,01% Tween® 80 entwickelt. Die enzymatische Aktivität eluierte bei 50 bis 200 mM NaCl.

Die aktiven Fraktionen wurde gesammelt. Durch Verdünnung wurde der Puffer auf 20 mM Natriumacetat pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂ eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine Concanavalin A-Säule (25 ml) gegeben und mit 4 Säulenvolumen des gleichen Puffers gewaschen. Die Elution erfolgte mit dem gleichen Puffer mit zusätzlich 10 mM Mannose oder 5 mM α-Methylmannosid.

Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in einem Puffer so verdünnt, daß eine Endkonzentration von 20 mM Natriumphosphat pH 7,0, 500 mM Natriumchlorid, 0,01% Tween® 80, erreicht wurde. Eine Kupferchelatsäule (2 ml Volumen) äquilibriert im gleichen Puffer, wurde beladen und mit 15 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer, gefolgt von 15 Säulenvolumen 20 mM Bernsteinsäure pH 7,0, 500 mM NaCl, 0,01% Tween® 80 gewaschen. Danach wurde die Säule mit einem Gradienten nach 20 mM Bernsteinsäure pH 4,5, 500 mM NaCl, 0,01% Tween® 80 eluiert. Die Aktivität eluierte bei pH 6 bis 5,4.

Charakterisierung des Proteins

Nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Silberfärbung sind drei Banden zu erkennen (Low molecular weight marker von Pharmacia): Eine Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 57 000 Da und zwei Banden bei 30 000 Da. Wird das Molekulargewicht durch Molekularsieb­ chromatographie (TSK G 3000, Puffer: 20 mM Na₂HPO₄ 0,1 M NaCl pH 7,0 Flußrate: 0,7 ml/min) ermittelt, zeigt das Protein ein apparentes Molekulargewicht von ca. 44 000 (+5000 Da) Da. Die spezifische Aktivität beträgt ca. 580 U/mg. Zur Bestimmung der Aktivität wurde folgender Test verwendet: 50 µl Puffer (5 mM Tris pH 8,4, 0,01% Tween® 80) 50 µl Farbreagenz (γ-Glutamyl)-p-nitroanilid, 1 mg/ml) wurden mit 50 µl Probe 60 min bei 37°C inkubiert und anschließend die Zunahme der Extinktion bei 405 nm ermittelt. 1 U ist definiert als enzymatische Aktivität, die 1 µMol γ-Glutamyl-para-Nitroanilid in 1 min bei 37°C umsetzt und dadurch eine Absorptionszunahme bei 405 nm verursacht.

Das natürliche Protein ist ein Glycoprotein, was durch seine Mannose-abhängige Elution von der Concanavalin A-Säule belegt ist.

Protease-Hemmstoffe wie Cystatin C (10 µg), Aprotionin (100 µg) und Benzamidin (10 mM) hemmen die Aktivität nicht. 100 µM Serin zusammen mit 100 µM Borat pH 8,4 hemmen ca. 50% der enzymatischen Aktivität. Das Enzym wird durch Zugabe von 1-5 mM HgCl₂ vollständig gehemmt. Weiterhin hemmt reduziertes, nicht aber oxidiertes Glutathion das Enzym. Triton® X-100 läßt die Aktivität nahezu unbeeinflußt und kann vor einer Denaturierung durch SDS schützen. Das pH-Optimum liegt zwischen pH 8 und pH 9. Das Enzym ist aber noch bis pH 12 aktiv. Darüber hinaus ist die unspezifische Hydrolyse des Substrats bereits dominant.

Nachweis der Fibrin-lösenden Wirkung

100 µl Rinderfibrinogen (Miles Nr. 82-0222-4; enthält Faktor XIII) in einer Konzentration von 4 mg/ml in TBS (= 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) werden mit 10 µl Rinderthrombin (Sigma Nr. T6634, 5 U/ml in TBS mit 25 mM Kalziumacetat) versetzt und 2 bis 5 h bei 37°C in Eppendorf-Re­ aktionsgefäßen inkubiert. Dabei entstehen stabile, Faktor XIIIa-quer­ vernetzte Fibringerinnsel.

Diese werden einmal mit 10 mM Natriumphoshpat pH 7,5, 150 mM NaCl gewaschen und anschließend mit 200 µl Speichelsekret von Hirudo medicinalis inkubiert (20 h, 37°C). Nach Zugabe von 1 ml 5%iger Monochloressigsäure wird die freigesetzte Proteinmenge im Überstand (OD 280 nm) bestimmt.

Claims (1)

1. Aus Hirudo medicinalis isolierbares glykosyliertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 57 000 Da, welches ε-(γ-Glutamyl)- Lysin-Bindungen spaltet.