DE3936594A1 - (gamma)-glutamyl-transferasen zur behandlung von krankheiten - Google Patents

(gamma)-glutamyl-transferasen zur behandlung von krankheiten

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Description

Es ist bereits bekannt, daß man mit Proteinen, wie TPA, Urokinase oder Streptokinase, Blutgerinnsel auflösen kann. Diese Proteine führen dazu, daß das im Blutgerinnsel vorhandene Fibrin durch Spaltung von Peptid­ bindungen depolymerisiert und löslich gemacht wird.
Weiter sind γ-Glutamyl-Transferasen bekannt. Diese Proteine dienten bisher nur als Markerenzyme (Clin. Chem. 15, 124 (1969)), denen zelluläre Aufgaben zugeschrieben wurden. Therapeutisch wurden sie bislang nicht eingesetzt, vielmehr wurden sie nur für diagnostische Zwecke eingesetzt. Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, daß γ-Glutamyl-Transferasen in der Lage sind, Fibrin zu depolymerisieren.
Gegenstand der Erfindung sind γ-Glutamyl-Transferasen zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
Als Krankheiten, die mit γ-Glutamyl-Transferasen behandelt werden können, sind insbesondere solche zu nennen, die durch Bildung von Blutgerinnseln hervorgerufen werden. Hierzu gehören Myokardinfarkt, Atherosklerose und Venenthrombose. Weiter kommen zur Behandlung mit γ-Glutamyl-Transferasen Erkrankungen in Betracht, die durch metastatische Tumoren verursacht werden. Hierzu gehören insbesondere Bronchial-, Prostata- und Mamakrazinome sowie Melanome.
Die Behandlung kann sowohl im akuten Fall als auch prophylaktisch erfolgen.
Bevorzugt sind γ-Glutamyl-Transferasen humanen Ursprungs, da sie im menschlichen Körper keine Antikörperbildung verursachen.
γ-Glutamyl-Transferasen spalten spezifisch γ-Glutamyl(ε-lysyl)-Isopeptid­ bindungen oder andere γ-Glutamyl-Isopeptidbindungen durch den Transfer eines γ-Glutamylrestes auf eine andere Aminosäure oder durch Hydrolyse. Solche γ-Glutamyl-Isopeptidbindungen kommen in Blutgerinnseln vor. γ-Glutamyl-Transferasen wirken daher spezifisch auf die Quervernetzung im Blutgerinnsel, ohne normale Peptidbindungen anzugreifen.
Auch freigesetzte Tumorzellen können sich über solche Isopeptidbindungen in fremden Geweben verankern und dem Immunsystem durch eine Ummantelung mit Fibrin entgehen. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, γ-Glutamyl-Trans­ ferasen auch zur Bekämpfung von Tumorerkrankungen einzusetzen.
Durch Kombination mit anderen Fibrinolytika wie Urokinase, Streptokinase oder tPA läßt sich die fibrinolytische Aktivität der γ-Glutamyl-Trans­ ferasen noch verbessern. Das gleiche gilt für Kombinationen mit Anti­ thrombotika, wie Heparin oder Hirudin.
Wichtig für die Anwendung als Therapeutika ist einerseits die enzymatische Aktivität der γ-Glutamyl-Transferasen und andererseits die Ähnlichkeit mit dem körpereigenen Protein. Diese Forderungen erfüllen auch verkürzte Polypeptide auf der Basis des menschlichen Enzyms sowie leicht veränderte Peptidsequenzen. Solche Muteine, die sich durch Austausch, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren von menschlicher γ-Glutamyl-Transferase unterscheiden, lassen sich gentechnisch teilweise leichter herstellen und können verbesserte Eigenschaften besitzen, wie verminderten Abbau durch proteolytische Enzyme.
Die Behandlung mit γ-Glutamyl-Transferasen kann mit den Substanzen selbst erfolgen oder aber auch mit Substanzen, die im Körper die Bildung von γ-Glutamyl-Transferasen oder deren Sekretion in den Blutkreislauf induzieren. Eine solche Substanz ist zum Beispiel das Vitamin A.
Die Wirkung der γ-Glutamyl-Transferasen läßt sich wie folgt zeigen:
  • A.a. Herstellung von FXIIIa-quervernetzten Fibringerinnseln
    100 µl Rinderfibrinogen (Miles, Nr. 82-022-4; enthält FXIII) in einer Konzentration von 4 mg/ml in TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) wurden mit 100 µl Rinderthrombin (Sigma, Nr. T 6634; 5 U/ml in TBS/25 mM Ca-Acetat) versetzt und 2-5 h bei 37°C in Eppendorf-Reaktionsgefäßen (1,5 ml) inkubiert.
    Dabei entstanden stabile, FXIIIa-quervernetzte Fibringerinnsel, die durch vorsichtiges Schütteln von der Wand des Reaktionsgefäßes abgelöst wurden.
  • b. Nachweis der Quervernetzung der nach Beispiel 1 erzeugten Fibringerinnsel
    Die von der Gefäßwand gelöten Gerinnsel wurden mit 1 ml PBS (10 mM NaPO4-Puffer, pH 7,0, 150 mM NaCl) gewaschen und anschließend 20 h in 200 µl PBS bei 37°C inkubiert.
    Nach Zugabe von 1 ml 5%iger Monochloressigsäure wurde weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gerinnsel wurden dann 5 min bei 3000 rpm abzentrifugiert; im Überstand wurde die optische Dichte bei 280 nm als Maß für die Proteinfreisetzung bestimmt. Nach Inkubation mit PBS wurde kein Protein freigesetzt.
  • c. Einwirkung von γ-Glutamyl-Transferase (γ-GT, EC 2.3.2.2.) auf FXIIIa-quervernetzte Fibringerinnsel
    Die nach A.a. erzeugten Gerinnsel wurden wie unter A.b. beschrieben gewaschen und anschließend 20 h mit 200 µl γ-Glutamyl-Transferase (Sigma Nr. G 4756; 50 U/ml in PBS) inkubiert. Die Messung der freigesetzten Proteinmenge erfolgte wie in A.b. angegeben.
    Als Kontrolle diente eine Mischung aus 200 µl γ-GT-Lösung und 1 ml 5%iger Monochloressigsäure, deren optische Dichte (280 nm) sofort bestimmt wurde.
    Inkubation mit γ-GT führte zu einer deutlichen Destabilisierung des Fibringerinnsels, wie die Zunahme der Absorption im Überstand verglichen mit der Kontrolle zeigt.
    * (TBS: tris buffered saline, PBS: phosphate buffered saline.)
  • B. Fibrinplattentest zum Nachweis fibrinolytischer Aktivität von γ-Glutamyl-Transferase
    3 ml 1%ige Low-Metlting-Agarose in Wasser (erhitzt auf 40°C) und 3 ml Rinderfibrinogen (8 mg/ml in TBS*) wurden gemischt und sofort nach Zugabe von 0,2 ml Thrombin (0,1-5 U/ml in 200 mM CaCl2) 2 h bei 37°C inkubiert.
    Dabei wurde quervernetztes Fibrin gebildet, das im gelierenden Agar eingebettet war.
    In ausgestanzte (2 mm ⌀) Vertiefungen wurden je 2 µl γ-GT (1000 U/ml) appliziert. Nach 20 h Inkubation bei 37°C entstanden deutlich sichtbare Lysehöfe, die die fibrinolytische Aktivität von γ-GT anzeigten.
    Alternativ kann die Agaroseeinbettung entfallen; es ergeben sich äquivalente Ergebnisse (Lysehofbildung).

Claims (10)

1. γ-Glutamyl-Transferasen zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
2. Menschliche γ-Glutamyl-Transferasen zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
3. Muteine oder Teilsequenzen menschlicher γ-Glutamyl-Transferasen zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
4. Verwendung von γ-Glutamyl-Transferasen zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch Blutgerinnsel hervorgerufen werden.
5. Verwendung von γ-Glutamyl-Transferasen zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch metastasierende Tumoren verursacht werden.
6. Verwendung menschlicher γ-Glutamyl-Transferasen gemäß Anspruch 3 und 4.
7. Parenteral verabfolgbares Arzneimittel, enthaltend eine γ-Glutamyl-Transferase und ein Fibrinolytikum.
8. Parenteral verabfolgbares Arzneimittel, enthaltend eine γ-Glutamyl-Transferase und ein Antithrombotikum.
9. Parenteral verabfolgbares Arzneimittel gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die γ-Glutamyl-Transferasen humanen Ursprungs ist.
10. Verwendung von γ-Glutamyl-Transferasen-Induktoren zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch Blutgerinnsel hervorgerufen werden.
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