DE3927056A1

DE3927056A1 - Polymeric bio:sensor or bio:catalyst - comprises layers contg. immobilised biologically active material film pores

Info

Publication number: DE3927056A1
Application number: DE3927056A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Sc Nat Hintsche; Guenter Heinrich; Gerit Dr Sc Nat Kampfrath; Bernd Dipl Phys Hoffmann; Frieder Prof Dr Scheller; Juergen Dipl Ing Nentwig; Dorothea Dr Rer Nat Pfeiffer; Gert Dr Rer Nat Neumann
Original assignee: Akademie der Wissenschaften der DDR
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1989-08-16
Publication date: 1990-03-01
Also published as: DD290913A5

Abstract

Polymer layers contg an immobilised biologically active material (I) for use in biosensors (or biocatalysts) comprise a porous film of a polymer having functional gps. (I) is contained in the pores of the film, whose effective size (ie the size of the pore openings) is less than the molecular dia of (I). ADVANTAGE - The films retain (I) effectively while maintaining high permeability for small mols.

Description

Die Erfindung betrifft polymere Trägerschichten für Biosensoren mit immobilisierten biologisch aktiven Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. Es betrifft insbesondere substratspezifische Biosensoren zur Bestimmung von Substanzen in Lösung und kann in der analytischen Chemie sowie der medizinischen Diagnostik angewendet werden. Weiterhin betrifft die Erfindung die Stoffwandlung mit immobiliserten biologisch aktiven Komponenten und kann in der Biotechnologie eingesetzt werden.The invention relates to polymeric support layers for biosensors with immobilized biologically active materials and processes for their manufacture. It affects in particular substrate specific biosensors for the determination of substances in Solution and can be found in analytical chemistry as well medical diagnostics are applied. Furthermore concerns the invention the metabolism with immobilized biological active components and can be used in biotechnology will.

Als Biosensoren sind Enzymelektroden mit vorgelagerten Membranen bekannt, bei denen die Biokomponenten in einem homogenen polymeren Träger, gegebenenfalls zwischen Dialysenmembranen eingeschlossen ist (DD Patent GO1N 27 78 884 (1985); Anal. Chem. Acta 184 (1986) 287; J. Chem. Soc. Faraday Trans. I 82 (1986) 1259; Analyst (London) 111 (1986) 1235; Anal. Chem. 58 (1986) 1042; Anal. Chim. Acta 186 (1986) 287; Anal. Chim. Acta 187 (1986) 47).Enzyme electrodes with upstream membranes are used as biosensors known in which the biocomponents in a homogeneous polymer Carrier, optionally enclosed between dialysis membranes (DD Patent GO1N 27 78 884 (1985); Anal. Chem. Acta 184 (1986) 287; J. Chem. Soc. Faraday Trans. I 82 (1986) 1259; Analyst (London) 111 (1986) 1235; Anal. Chem. 58 (1986) 1042; Anal. Chim. Acta 186 (1986) 287; Anal. Chim. Acta 187 (1986) 47).

Die bioaktive Komponente kann auch auf der Oberfläche von Elektroden kovalent gebunden werden (Anal. Chim. Acta 142 (1982) 277, 158 (1984) 137; Anal. Chem. 48 (1976) 1679, 52 (1980) 1198, 53 (1981) 2090, 54 (1982) 1098, 56 (1984) 667, oder adsorbiert sein (Bioelectrochem. Bioenerg. 12 (1984) 297, 13 (1984) 163; Anal. Chim. Acta 169 (1985) 237; Agric. Biol. Chem. 48 (1984) 1969; J. Electroanal. Chem. 48 (1984) 289).The bioactive component can also be on the surface of Electrodes are covalently bound (Anal. Chim. Acta 142 (1982) 277, 158 (1984) 137; Anal. Chem. 48 (1976) 1679, 52 (1980) 1198, 53 (1981) 2090, 54 (1982) 1098, 56 (1984) 667, or adsorbed his (Bioelectrochem. Bioenerg. 12 (1984) 297, 13 (1984) 163; Anal. Chim. Acta 169 (1985) 237; Agric. Biol. Chem. 48 (1984) 1969; J. Electroanal. Chem. 48 (1984) 289).

Bei Chip-Transduktoren werden die Biokomponenten entweder kovalent gebunden (Anal. Chem. 52 (1980) 1935; Anal. Chem. 57 (1985) 1924; Chem. Pharm. Bull. 33 (1985) 2556) oder in einer polymeren Trägerschicht, die in ihrer Gesamtheit eine geeignete Semipermeabilität aufweist, eingeschlossen (Sensors and Actuators 7 (1985) 1; Anal. Chem. 57 (1985) 1920; J. Mol. Catalyst 37 (1986) 133; J. Biotechnology 4 (1986) 135; Anal. Lett. 19 (1986) 85; Anal. Chem. 58 (1986) 1042).In chip transducers, the biocomponents are either covalently bound (Anal. Chem. 52 (1980) 1935; Anal. Chem. 57 (1985) 1924; Chem. Pharm. Bull. 33 (1985) 2556) or in one polymeric carrier layer, which in its entirety is a suitable Has semipermeability, included (Sensors and Actuators 7 (1985) 1; Anal. Chem. 57 (1985) 1920; J. Mol. Catalyst 37 (1986) 133; J. Biotechnology 4 (1986) 135; Anal. Lett. 19 (1986) 85; Anal. Chem. 58 (1986) 1042).

Für die biotechnologische Stoffwandlung sind polymere Schichten mit eingeschlossenen, biologisch aktiven Komponenten auf festen Trägern bekannt (DE-AS 26 42 232, DE-OS 26 38 193). Alle bekannten Lösungen mit polymeren Trägerschichten haben den Nachteil, daß auf Grund der homogenen Porengröße in der gesamten Schicht, größere Diffusionsbarrieren entstehen, die entsprechend lange Ansprechzeiten der Sensoren, bzw. verlängerte Reaktionszeiten bei Stoffwandlungen bedingen.Polymer layers are used for biotechnological material conversion with enclosed, biologically active components on solid Carriers known (DE-AS 26 42 232, DE-OS 26 38 193). All known Solutions with polymeric carrier layers have the disadvantage that due to the homogeneous pore size in the entire layer, Larger diffusion barriers arise, which are correspondingly long Response times of the sensors or extended reaction times at Condition material changes.

Bei kovalent gebundenen Biokomponenten in Biosensoren und Biokatalysatoren mit optimal kleinen Diffusionsbarrieren besteht der Nachteil, daß die weitgehend ungeschützten Biokomponenten störenden und inaktivierenden Einflüssen ausgesetzt sind.With covalently bound biocomponents in biosensors and Biocatalysts with optimally small diffusion barriers exist the disadvantage that the largely unprotected biocomponents are exposed to disturbing and inactivating influences.

Ziel der Erfindung ist es, substratspezifische Biosensoren mit kurzen Ansprechzeiten sowie Biokatalysatoren mit optimalen Diffusionsbedingungen zu entwickeln.The aim of the invention is to use substrate-specific biosensors short response times and biocatalysts with optimal To develop diffusion conditions.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, polymere Trägerschichten für Biosensoren und Biokatalysatoren zu entwickeln, die maximale Mengen von biologisch aktiven Materialien immobilisieren, dabei aber relativ kleine Diffusionsbarrieren für niedermolekulare Stoffe aufweisen. Die erfindungsgemäße polymere Trägerschicht besteht aus einer filmartigen, porösen und reaktive Gruppen enthaltenden Polymerschicht mit eingelagerten biologisch aktiven Materialien, deren effektive Porengröße asymmetrisch so verkleinert wird, daß sie an der Oberfläche kleiner als der Durchmesser der eingelagerten biologisch aktiven Moleküle ist. Erfindungsgemäß wird auf einen festen Träger eine poröse, funktionelle Gruppen enthaltende Polymerschicht zusammen mit eingeschlossenen biologisch aktiven Materialien erzeugt und von ihrer Oberfläche her mit einem niedermolekularen bi- oder polyfunktionellem Agenz in Reaktion gebracht. Die Poren an der Oberfläche müssen kleiner werden als der Moleküldurchmesser der biologisch aktiven Materialien, damit das Auswaschen der Biokomponente wirksam verhindert, das Aus- und Eindiffundieren von Substraten und Reaktionsprodukten der biochemischen Reaktion aber nur minimal behindert wird. Dazu enthält das Trägerpolymer eine ausreichende Zahl reaktiver Reste, die mit einem niedermolekularem bifunktionellen Agenz oder einem multifunktionellen Präpolymer, sogenannten Vernetzern, in gezielter Weise so miteinander reagieren, daß eine zusätzliche Quervernetzung die Porengröße und die Quellfähigkeit in Wasser verringert. Dabei werden gleichzeitig auch Biomoleküle an die polymere Matrix kovalent gebunden. Für die Vernetzung wird der Vernetzer in einem Lösungsmittel oder aus der Gasphase mit der Oberfläche der Polymerschicht in Kontakt gebracht. Die Menge des Vernetzers und/oder seine Verweildauer auf dem Polymerfilm bestimmen das Ausmaß der Quervernetzung.The object of the invention is polymeric carrier layers for biosensors and biocatalysts to develop the maximum Immobilize amounts of biologically active materials, doing so but relatively small diffusion barriers for small molecules Have fabrics. The polymeric carrier layer according to the invention consists of a film-like, porous and reactive groups containing polymer layer with embedded biologically active Materials whose effective pore size is asymmetrical is reduced to be smaller than the surface Diameter of the embedded biologically active molecules. According to the invention, a porous, functional group-containing polymer layer together with trapped biologically active materials and produced by their surface with a low molecular bi- or polyfunctional agent reacted. The pores on the The surface must become smaller than the molecular diameter of the biologically active materials so that the washing out of the Biocomponent effectively prevents diffusion and diffusion of substrates and reaction products of the biochemical reaction but is minimally disabled. For this purpose, the carrier polymer contains a sufficient number of reactive residues with a low molecular bifunctional agent or a multifunctional prepolymer, so-called crosslinking agents, in specifically react with each other so that an additional Cross-linking the pore size and swellability in water decreased. Biomolecules are also attached to the polymeric matrix covalently bound. For networking, the Crosslinker in a solvent or from the gas phase with the Surface of the polymer layer brought into contact. The amount of Crosslinker and / or its residence time on the polymer film determine the extent of cross-linking.

Als feste Träger sind die Oberflächen von Sensorelementen, die beispielsweise aus Metallen oder Siliziumverbindungen bestehen, sowie Stützelemente für Biokatalysatoren aus Glas, Metall, Keramik oder Kunststoffen geeignet.The surfaces of sensor elements are the solid supports consist for example of metals or silicon compounds, as well as support elements for biocatalysts made of glass, metal, Suitable for ceramics or plastics.

Für die Beschichtung sind alle filmbildenden, haftfähigen Polymere geeignet, deren Präpolymere die oben definierten Eigenschaften der Schichten zu realisieren gestatten. Die Struktureigenschaften des Polymeren werden so gewählt, daß mit eingelagerter Biokomponente eine geringe Diffusionsbarriere für Substrate und Reaktionsprodukte besteht, die die Voraussetzung für kurze Sensoransprechzeiten bzw. effektive Substratwandlung bildet. Vorzugsweise sind Polyurethane, Polymethacrylate u. a. zur Verwendung geeignet.All film-forming, adhesive are for the coating Suitable polymers whose prepolymers are those defined above Allow properties of the layers to be realized. The Structural properties of the polymer are chosen so that with embedded biocomponent has a low diffusion barrier for Substrates and reaction products exist which are the prerequisite for short sensor response times or effective substrate conversion forms. Polyurethanes, polymethacrylates and the like are preferably used. a. to Suitable for use.

Bei Polyurethanfilmen beispielsweise sind als Vernetzer vorzugsweise Diisocyanate mit unterschiedlich langen Molekülketten sowie Präpolymere mit drei oder mehr Isocyanatgruppen pro Molekül geeignet. In 0,1 bis 5%iger Konzentration werden die Vernetzer in Lösungsmitteln, die den Polymerfilm nicht an- oder auflösen, durch Tauchen oder Aufsprühen zeitlich bis zum gewünschten Porenverschluß appliziert.In the case of polyurethane films, for example, are crosslinkers preferably diisocyanates with different lengths Molecular chains and prepolymers with three or more Suitable isocyanate groups per molecule. In 0.1 to 5% The crosslinkers are concentrated in solvents which Do not dissolve or dissolve polymer film by dipping or Spray on until the desired pore closure applied.

Gegebenenfalls wird bei der Vernetzung durch Sprühen durch die Verwendung von Masken, ein Verteilungsmuster der Biokomponenten in der Weise realisiert, daß aus flächigen nicht vernetzten Gebieten der Polymerschicht die Biokomponente im Gegensatz zu den vernetzten Gebieten ausgewaschen wird.If necessary, crosslink by spraying the use of masks, a pattern of distribution of the Biocomponents are realized in such a way that they are not flat networked areas of the polymer layer in the biocomponent Contrary to the networked areas is washed out.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen darin, daß geforderte Eigenschaften wie Haftfestigkeit des erzeugten Films, die Retention biologisch aktiven Materialien und optimale Durchlaßfähigkeit für kleine Moleküle durch einen einzigen Polymerfilm erreicht wird. Mit einer solchen polymeren Trägerschicht ausgestattete Biosensoren erreichen kürzere Ansprechzeiten, bzw. Biokatalysatoren eine effektive Stoffwandlung. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The advantages of the method according to the invention are that required properties such as adhesive strength of the film produced, the retention of biologically active materials and optimal Permeability for small molecules through a single one Polymer film is reached. With such a polymer Biosensors equipped with a carrier layer achieve shorter ones Response times, or biocatalysts an effective Fabric conversion. The invention is intended to: Embodiments are explained in more detail.

Embodiments example 1

10 µl einer Lösung von 10% Polyurethan in Aceton mit 100 U/ml suspendierender Glucoseoxidase werden auf eine in Si-Technologie hergestellte Dünnschichtmetallelektrode aufgetropft und wahlweise mit 1000 U/min zu einem gleichmäßigen Film abgeschleudert. Nachdem während 30 min bei 295 K das Lösungsmittel weitgehend abgedampft ist, läßt man auf die polymere Schicht über dem aktiven Elektrodenareal eine 1%ige Lösung von isocyanathaltigem Polyurethanpräpolymer in Äthylacetat 30 Minuten einwirken. Nach anschließender 24-stündiger Quellung im 0.001 mol/l Acetatpuffer pH 6.5 ist der Glucosesensor einsatzbereit.10 µl of a solution of 10% polyurethane in acetone with 100 U / ml Suspending glucose oxidase are based on an in Si technology manufactured thin film metal electrode and dropped optionally at 1000 rpm to form a uniform film thrown off. After at 305 K for 30 min Solvent has largely evaporated, you can on the polymer layer over the active electrode area a 1% Solution of isocyanate-containing polyurethane prepolymer in ethyl acetate Leave on for 30 minutes. After subsequent swelling for 24 hours The glucose sensor is in 0.001 mol / l acetate buffer pH 6.5 ready to use.

Example 2

2 µl einer 2%igen Lösung von Polyurethan in Chloroform/Aceton (90 : 10) mit 100 U/ml suspendierter Urease werden in die durch die Verkappung eines pH-sensitiven Feldeffekttransistors gegebene Grube eingetropft und ca. 30 Minuten bei 295 K zur Abdunstung des Lösungsmittels gelagert. Die weitere Behandlung erfolgt analog Beispiel 1, jedoch mit einer Lösung von 5% Diphenyldiisocyanat in Äthylacetat. Der resultierende Harnstoffsensor ist nach 24 Stunden Lagerung in Phosphatpuffer (0.001 mol/l; pH 7.0) einsatzbereit.2 µl of a 2% solution of polyurethane in chloroform / acetone (90: 10) with 100 U / ml suspended urease are in the by the Capping of a pH-sensitive field effect transistor Pit dripped in and about 30 minutes at 295 K to evaporate the Solvent stored. The further treatment is carried out analogously Example 1, but with a solution of 5% diphenyl diisocyanate in Ethyl acetate. The resulting urea sensor is after 24 Hours storage in phosphate buffer (0.001 mol / l; pH 7.0) ready to use.

Example 3

Auf flächigen Gebilden aus Glas, Keramik, Polyvinylchlorid oder Polyester wird eine Suspension von 80 U/ml Invertase und 100 U/ml GOD in einer 10%igen Lösung von Polyurethan in Aceton zu einem Film aufgegossen. Nach 1 Stunde abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur wird der gesamte Polymerfilm mit einer 2%igen Lösung von Phenyldiisocyanat in Äthylacetat homogen besprüht und nach 30 min in 0.001 mol/l Phosphatpuffer pH 7.0 überführt. Nach weiteren 5 Stunden in Phosphatpuffer (0.1 mol/l; pH 7.0) werden die Biokatalysatoren zur Disaccharidspaltung eingesetzt. Alternativ können während des Besprühens Zonen abgedeckt werden, aus denen während des Quellvorganges bioaktive Komponenten ausgewaschen werden.On flat structures made of glass, ceramic, polyvinyl chloride or Polyester becomes a suspension of 80 U / ml invertase and 100 U / ml GOD in a 10% solution of polyurethane in acetone into one Infused film. After 1 hour evaporate off the solvent The entire polymer film is at room temperature with a 2% Solution of phenyl diisocyanate in ethyl acetate sprayed homogeneously and transferred to 0.001 mol / l phosphate buffer pH 7.0 after 30 min. To another 5 hours in phosphate buffer (0.1 mol / l; pH 7.0) the biocatalysts used for disaccharide cleavage. Alternatively, zones can be covered during spraying, from which bioactive components during the swelling process be washed out.

Claims

1. Polymeric support layers with immobilized active materials for biosensors, characterized in that it consists of a film-like, porous and functional group-containing polymer layer with embedded biologically active materials, the effective pore size of which is smaller than the diameter of the embedded biologically active molecules.

2. Process for the production of polymeric carrier layers with immobilized biologically active materials, thereby characterized in that on a solid support a polymer layer generated with embedded biologically active materials and then by the action of a bi- or polyfunctional Crosslinker both the pore size is reduced asymmetrically, as well as biologically active molecules are bound directly.

3. The method according to claim 2, characterized in that as solid support for the polymer layer the active surface of a Sensors or flat structures made of glass, ceramics or polymers be used.

4. The method according to claim 2 and 3, characterized in that crosslinking by contact of the crosslinker with the surface the polymer layer from a solvent or from the gas phase takes place and optionally zones of the surface of the Networking can be excluded.