DE3907162A1 - Process for the preparation of the enzyme myeloperoxidase - Google Patents
Process for the preparation of the enzyme myeloperoxidaseInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase durch Reinigen und Aktivieren von menschlichen Leukozyten, Aufschließen und Extrahieren des erhaltenen Materiales und Reinigung des Enzymes.The invention relates to a process for the preparation of the enzyme myeloperoxidase by cleaning and activating of human leukocytes, digesting and extracting of the resulting material and purification of the enzyme.
Das Enzym Myeloperoxydase kann als Diagnosticum in Infarktfällen verwendet werden, die Größe des Infarktes ist dem Myeloperoxydase-Spiegel im Gewebe proportional (Journal of Cardiovascular Pharmacology 7 [1985], 1154 bis 1160). Auch zwischen entzündlichen Erkrankungen und dem Myeloperoxydase-Spiegel besteht ein Zusammenhang (Blood, Vol. 60, No. 3, September 1982). Auch ein Herstellungsverfahren für Myeloperoxydase ist im Schrifttum beschrieben (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 245 [1986], No. 1, 167 bis 173 und Biochemistry, Vol. 3, No. 9 [1964], 1234 bis 1238), bei denen jedoch nicht aktiviert wird.The enzyme myeloperoxidase can be used as a diagnostic agent in Infarct cases are used, the size of the infarction is proportional to the myeloperoxidase level in the tissue (Journal of Cardiovascular Pharmacology 7 [1985], 1154 to 1160). Also between inflammatory diseases and the myeloperoxidase level is related (Blood, Vol. 60, No. 3, September 1982). Also a manufacturing process for myeloperoxidase is in the literature (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 245 [1986], no. 1, 167-173 and Biochemistry, Vol. 3, no. 9 [1964], 1234-1238) but not activated.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfacheres und besseres Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase, bei welchem von einem bereits vor ihm verwendeten Ausgangsstoff ausgegangen wird, zu schaffen.The invention is based on the object, a simpler and better method for producing the enzyme Myeloperoxidase, in which of one already before him starting material is used.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.The above was surprisingly by the invention reached.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase durch Reinigen und Aktivieren von menschlichen Leukozyten, Aufschließen und Extrahieren des erhaltenen Materiales und Reinigen des Enzymes, welches dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsstoff eine bereits zur Herstellung von unter anderen Interferon oder Interleucin verwendete aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion [buffy coat] verwendet wird, als Aktivierungsmittel Sendei-Viren, Concanavalin A (Merck Index, 10th Edition, 1983, Nr. 2460 beziehungsweise Concavalin A, Phytohämagglutinin, Lensculinaris Lectin oder Ca++-Ionophor eingesetzt wird und bei der Reinigung des Enzymes der chromatographische Reinigungsschritt an einer mit carboxymethyliertem "Controlled pore-glass" gefüllten Säule durchgeführt wird.The invention relates to a process for the preparation of the enzyme myeloperoxidase by purifying and activating human leukocytes, digesting and extracting the resulting material and purifying the enzyme, which comprises using as starting material an already used for the production of, inter alia, interferon or interleucin from human Blood-borne, leukocyte-rich blood fraction [buffy coat] is used as activating agent sendi viruses, concanavalin A (Merck Index, 10 th Edition, 1983, No. 2460 or concavalin A, phytohemagglutinin, lectensulculis lectin or Ca ++ ionophore is used and in the purification of the enzyme, the chromatographic purification step is carried out on a column packed with carboxymethylated controlled pore-glass.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird also zur Herstellung der zur Induktion der Myeoloperoxydase erforderlichen Leukozytensuspension als Ausgangsstoff eine bereits zur Herstellung von unter anderen Interferon oder Interleucin 2 verwendete, aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion [buffy coat] verwendet.In the method according to the invention is therefore for the production required for the induction of myeoloperoxidase Leukocyte suspension as starting material one already for the production of, inter alia, interferon or Interleucin 2 used, derived from human blood, leucocyte-rich blood fraction [buffy coat] used.
Die Herstellung des menschlichen Leukozyteninterferons ist in der ungarischen Patentschrift 182 209 beschrieben.The production of human leukocyte interferon is described in Hungarian Patent 182,209.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention will be apparent from the following examples explained in more detail.
Als Ausgangsstoff wurde eine leukozytenreiche Fraktion, die bei der Auftrennung des von nativem Blut anfällt, das sogenannte "buffy coat" verwendet. Eine Einheit dieser Blutfraktion enthielt 1,4 × 10⁹ Leukozyten und hatte ein Volumen von etwa 40 ml. Eine konzentrierte Variante einer solchen ist handelsüblich, diese hat ein Volumen von 10 ml. Die aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion, das "buffy coat" enthält neben Leukozyten auch Erythrozyten und Blutplasma. Bei der Reinigung müssen diese Stoffe entfernt werden.The starting material was a leukocyte-rich fraction, which in the separation of the native blood incurred, the so-called "buffy coat" used. One unit of this blood fraction contained 1.4 × 10⁹ leukocytes and had a volume of approximately 40 ml. A concentrated variant of such is commercially available, this has a volume of 10 ml. The human blood-derived, leucocyte-rich Blood fraction, the "buffy coat" contains beside Leukocytes also include red blood cells and blood plasma. at Cleaning these substances must be removed.
Zu 100 Einheiten aus menschlichem Blut stammender, leukozytenreicher Blutfraktion ["buffy coat"] (4000 ml bzw. 1000 ml) wurde die 3fache Menge einer auf 0±4°C gekühlten 0,83 gew.-%igen wäßrigen Ammoniumchloridlösung zugegeben und der Ansatz wurde 10 Minuten mit Eis gekühlt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren (1400 min-1, 20 Minuten lang) aus der Suspension absetzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und die Zellmasse in etwa 400 ml einer salzhaltigen Phosphatpufferlösung {phosphate buffer saline [PBS]} suspendiert.To 100 units of human blood-derived, leukocyte-rich blood fraction ["buffy coat"] (4000 ml or 1000 ml) was added 3 times the amount of a cooled to 0 ± 4 ° C 0.83 wt .-% aqueous ammonium chloride solution and the approach was chilled with ice for 10 minutes. Then, the cells were allowed to settle out of the suspension by centrifugation (1400 min -1 , 20 minutes), the supernatant liquid was decanted, and the cell mass was suspended in about 400 ml of a saline phosphate buffer saline [PBS].
Zusammensetzung der salzhaltigen Phosphatpufferlösung:Composition of saline phosphate buffer solution:
Die Zellsuspension hatte ein Volumen von etwa 500 ml, die Konzentration der Zellen betrug 3 bis 4 × 10⁸ Zellen/ml.The cell suspension had a volume of about 500 ml, the concentration of the cells was 3 to 4 × 10⁸ Cells / ml.
Die Behandlung mit Ammoniumchlorid wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß zu 1 Vol.-Teil Zellsuspension 9 Vol.-Teile 0,83 gew.-%ige Ammoniumchloridlösung zugegeben werden.The treatment with ammonium chloride was repeated, but with the difference that to 1 part by volume of cell suspension 9 parts by volume 0.83 wt .-% ammonium chloride solution be added.
Die nach dem Zentrifugieren erhaltene Zellmasse wurde in 400 ml salzhaltiger Phosphatpufferlösung erneut suspendiert, das Volumen der Suspension betrug etwa 500 ml.The cell mass obtained after centrifuging was dissolved in 400 ml saline phosphate buffer solution resuspended, the volume of the suspension was about 500 ml.
Das Aktivieren diente dazu, die Leukozyten zur Erzeugung von Myeloperoxydase anzuregen. 500 ml Leukozytensuspension, die etwa 1,4 × 10¹¹ Zellen enthielt, wurden in 10 000 ml Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung eingebracht:Activation served to produce the leukocytes of myeloperoxidase. 500 ml of leukocyte suspension, containing about 1.4 × 10 11 cells, were in 10 000 ml of nutrient fluid of the following Composition introduced:
Zum Aktivieren wurden 15 ml einer Sendei-Virensuspension mit einem Titer von 100 HA [Hämagglutinin]/ml verwendet. Das Gemisch wurde 15 bis 20 Stunden lang bei 37°C gerührt. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren (2000 g, 30 Minuten) aus der Nährlösung entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, die Zellen wurden in so viel salzhaltiger Phosphatpufferlösung suspendiert, daß das Endvolumen der Suspension 500 ml betrug.To activate, 15 ml of a sendi virus suspension with a titer of 100 HA [hemagglutinin] / ml used. The mixture became 15 to 20 hours long stirred at 37 ° C. Thereafter, the cells were passed through Centrifuge (2000 g, 30 minutes) from the nutrient solution away. The supernatant liquid became Discarded, the cells became so much more saline Phosphate buffer solution suspended that the final volume the suspension was 500 ml.
Um das Enzym Myeloperoxydase freizusetzen, müssen die Leukozyten aufgebrochen werden. Zu diesem Zweck wurde die Zellsuspension 7mal gefrieren gelassen und wieder aufgetaut. Das Gefrierenlassen erfolgte bei -70°C, das Auftauen bei Raumtemperatur. Bei dieser Behandlung zerfielen die Zellen und das Enzym ging in Lösung. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren (20 000 g, 60 Minuten) von der enzymhaltigen Lösung abgetrennt.To release the enzyme myeloperoxidase, must the leukocytes are broken up. To this end the cell suspension was allowed to freeze 7 times and thawed again. The freezing took place at -70 ° C, thawing at room temperature. At this Treatment decomposed the cells and the enzyme went into solution. The cell debris was removed by centrifugation (20 000 g, 60 minutes) of the enzyme-containing Solution separated.
Die niedermolekularen Verunreinigungen wurden durch Ultrafiltration entfernt. Die Extrakte wurden mit einem Ultrafilter AMICON® DC-4 unter Verwendung eines "Hohlfaser"-Einsatzes ["Hollow-fiber"-Einsatzes] mit dem "Cut off"-Wert von 100 000 diafiltriert. Dieser Einsatz hält Moleküle mit einer Molmasse über 100 000 Dalton zurück und läßt Moleküle mit einer unter 100 000 Dalton liegenden Molmasse durch. Die Enzymaktivität befindet sich in der Fraktion mit mehr als 100 000 Dalton Molmasse. Das Volumen der erhaltenen enzymhaltigen Fraktion wurde auf etwa 200 ml eingestellt.The low molecular weight impurities were passed through Ultrafiltration removed. The extracts were with an ultrafilter AMICON® DC-4 using of a "hollow fiber" insert diafiltered with the "cut off" value of 100,000. This insert holds molecules with a molecular weight over 100 000 daltons back and leaves molecules with a molar mass below 100 000 daltons by. The enzyme activity is in the fraction with more than 100,000 daltons molecular weight. The volume the enzyme-containing fraction obtained was about 200 ml set.
Die Verunreinigungen wurden durch Verändern des pH-Wertes gefällt. Zur enzymhaltigen Fraktion (200 ml) wurden 200 ml einer 0,1 m Kaliumcitratlösung (pH-Wert = 4) zugegeben, wodurch 400 ml Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 erhalten wurden. Durch das Verändern des pH-Wertes fiel ein Teil der verunreinigten Eiweiße aus. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren (7000 g, 30 Minuten) entfernt. Die überstehende Flüssigkeit (etwa 350 ml) enthielt das Enzym. The impurities were removed by altering the pH value like. To the enzyme-containing fraction (200 ml) was added 200 ml of a 0.1 M potassium citrate solution (pH = 4) was added, giving 400 ml of solution having a pH of about 4.5. By changing the pH value fell a part of the contaminated proteins. The rainfall was removed by centrifugation (7000 g, 30 minutes). The supernatant liquid (about 350 ml) contained the enzyme.
A) Adsorption: Die 350 ml enzymhaltige Fraktion (pH-Wert 4,5) wurden mit einer Volumgeschwindigkeit von 100 ml/h auf eine Chromatographiersäule C 16/20, die 20 ml CM-CPG enthielt, gedrückt. Die unten an der Säule ausgetretene Flüssigkeit wurde im Kreislauf zurückgeführt, wodurch eine wirksamere Adsorption erreicht wurde. So wurde eine Nacht lang bei 0 bis 4°C adsorbiert.A) Adsorption: The 350 ml enzyme-containing fraction (pH 4.5) were at a volume rate of 100 ml / h a chromatography column C 16/20, containing 20 ml CM-CPG. The leaked at the bottom of the column Liquid was recirculated, resulting in more effective adsorption was achieved. So one became Adsorbed overnight at 0 to 4 ° C.
B) Waschen I: Die Füllung wurde mit 60 ml einer 0,1 m Kaliumcitratlösung (pH-Wert = 4) gewaschen. Die Waschlösung zeigte keine Enzymaktivität, sie wurde verworfen.B) Washing I: The filling was made with 60 ml of a 0.1 M potassium citrate solution (pH = 4) washed. The wash solution showed no Enzyme activity, it was discarded.
C Waschen II: Die Säule wurde mit 60 ml der salzhaltigen Phosphatpufferlösung der im Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung gewaschen, die Waschlösung wurde verworfen.C Washing II: The column was washed with 60 ml of saline Phosphate buffer solution in the section a) specified composition washed, the washing solution was discarded.
D) Eluieren: Die Myeloperoxydase wurde mit einer Lösung, die 1,5 Mol NaCl und 0,5 Mol tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan [TRIS] enthielt und einen pH-Wert von 8,2 hatte, von der Säule gewaschen. Die Enzymaktivität erschien in einer einzigen scharfen Fraktion, die ein Volumen von etwa 20 ml hatte. D) Elution: Myeloperoxidase was treated with a solution 1.5 moles of NaCl and 0.5 moles tris (hydroxymethyl) aminomethane [TRIS] contained and had a pH of 8.2, washed from the column. The enzyme activity appeared in a single sharp fraction containing a volume of about 20 ml.
Die an der CM-CPG-Säule gewonnene enzymhaltige Fraktion (20 ml) wurde auf eine 1800 ml ULTRAGEL AcA 54 enthaltende Säule vom Typ K 50/100 aufgebracht und mit 2 Mol NaCl/salzhaltige Phosphatpufferlösung der im Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung eluiert. In der Fraktion der Molmasse von 6040 bis 8040 war die Myeloperoxydase rein erhältlich. Zur Auswahl der entsprechenden Fraktionen wurde die Säule vorher mit Hilfe von Molmasse-Normen kalibriert.The enzyme-containing fraction obtained on the CM-CPG column (20 ml) was added to a 1800 ml ULTRAGEL AcA 54 Column of type K 50/100 applied and with 2 mol NaCl / saline phosphate buffer solution described in section a) eluted. In the fraction of Molar mass from 6040 to 8040 was myeloperoxidase pure available. To select the appropriate fractions was The column was previously calibrated using molecular weight standards.
Die Gesamtaktivität des erhaltenen Produktes betrug durchschnittlich 2000 E und die ein Maß für die Reinheit des Produktes darstellende spezifische Aktivität lag bei 70 bis 100 E/mg Protein. Die Konzentration betrug 50 E/ml.The total activity of the product obtained was an average of 2000 E and a measure of purity specific activity of the product was included 70 to 100 U / mg protein. The concentration was 50 U / ml.
Die Menge von Enzymen wird üblicherweise in auf Grund der Aktivität bestimmten Enzymeinheiten angegeben. Definitionsgemäß ist 1 Einheit diejenige Enzymmenge, welche innerhalb 1 Minute bei 25°C in einem Medium mit einem pH-Wert von 6,00 1 µM H₂O₂ zersetzt. Die Geschwindigkeit der Zersetzung des H₂O₂ kann spektrophotometrisch verfolgt werden. Genaue Beschreibung der Verfahrensweise: G. Allan, P. Phattacherjee, C. D. Brook, N. G. Read, A. S. Parke: J. Cardiovasc. Pharm. 7 [1985], 1154 bis 1160.The amount of enzymes is usually in due the activity of certain enzyme units specified. By definition, 1 unit is that amount of enzyme which within 1 minute at 25 ° C in a medium with a pH of 6.00 1 μM H₂O₂ decomposes. The speed of Decomposition of H₂O₂ can be followed spectrophotometrically become. Detailed description of the procedure: G. Allan, P. Phattacherjee, C.D. Brook, N.G. Read, A.S. Parke: J. Cardiovasc. Pharm. 7 [1985], 1154-1160.
Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendei-Virus Concanavalin A in einer Konzentration von 15 µg/ml verwendet. It was described in Example 1, section b) The procedure, however, to activate in place of the transmiti virus concanavalin A in a concentration of 15 μg / ml.
Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendei-Virus Phytohämagglutinin in einer Konzentration von 10 µg/ml verwendet.It was described in Example 1, section b) The procedure, however, to activate in place of the transmiti virus phytohemagglutinin in one concentration of 10 μg / ml.
Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendei-Virus Lensculinaris Lectin in einer Konzentration von 30 µg/ml verwendet.It was described in Example 1, section b) The procedure, however, to activate in place of the Sendei virus Lensculinaris Lectin in one concentration of 30 μg / ml.
Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendei-Virus Ca++-Ionophor mit der Bezeichnung A 23 187 in einer Konzentration von 0,15 µg/ml verwendet.The procedure was as described in Example 1, Section b), but used to activate in place of the Sendei virus Ca ++ ionophore designated A 23 187 at a concentration of 0.15 μg / ml.
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Non-Patent Citations (1)
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