DE3842378A1

DE3842378A1 - Acid-labile anchoring groups for the synthesis of peptide amides by means of a solid-phase method

Info

Publication number: DE3842378A1
Application number: DE3842378A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr Breipohl; Jochen Dr Knolle; Werner Dr Stueber
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1989-07-06

Abstract

The invention relates to novel compounds of the formula <IMAGE> in which R<1> is (C1-C8)-alkyl, R<2> is an amino acid radical which is protected by a urethane protective group which can be removed with a weak acid or base, or is an amino protective group which can be removed with a weak acid or base, R<3> is hydrogen or (C1-C4)-alkyl and Y<1>-Y<9> are identical or different radicals of hydrogen, (C1-C4)-alkyl, (C1-C4)-alkoxy or -O-(CH2)n-COOH, (where n = 1 to 6), one of these radicals being -O-(CH2)n-COOH, or Y<1>, Y<2> and Y<5>-Y<9> are identical or different radicals of hydrogen, (C1-C4)-alkyl or (C1-C4)-alkoxy, Y<3> is (C1-C8)-alkoxy or hydrogen and Y<4> is -(CH2)n-COOH or -NH-CO-(CH2)n -COOH (where n = 1 to 6). Processes for their preparation and the synthesis of peptide amides by means of a solid-phase method using these novel compounds (spacers) are described.

Description

Die Erfindung betrifft neue Spacer und ihre Herstellungsverfahren sowie die Synthese von Peptidamiden mittels Festphasenmethode unter Verwendung dieser säurelabilen Ankergruppen.The invention relates to new spacers and their Manufacturing process and the synthesis of peptide amides using the solid phase method using this acid labile anchor groups.

Zur Herstellung von Peptidamiden mittels Festphasensynthese verwendet man im allgemeinen Benzhydrylamin- oder Methylbenzhydrylaminharze, wie sie z. B. bei J. P. Tam et al., Tetrahedron Lett. 22, 2851 (1981) beschrieben sind. Eine weitere Methode besteht in der Ammonolyse von trägergebundenen Peptidbenzylestern (C. Ressler et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 3107 (1954)). Beide Methoden sind charakterisiert durch die zur Abspaltung des "Spacers" notwendige starke Säure (flüssiger Fluorwasserstoff oder Trifluormethansulfonsäure), Nebenreaktionen oder unvollständige Abspaltung.For the production of peptide amides by means of solid phase synthesis generally used benzhydrylamine or Methylbenzhydrylamine resins, such as z. B. J. P. Tam et al., Tetrahedron Lett. 22, 2851 (1981). A another method is the ammonolysis of carrier-bound peptide benzyl esters (C. Ressler et al., J. Am. Chem. Soc. 76: 3107 (1954)). Both methods are characterized by the cleavage of the "spacer" necessary strong acid (liquid hydrogen fluoride or Trifluoromethanesulfonic acid), side reactions or incomplete spin-off.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Spacer zu finden, die eine mildere und bessere Abspaltung von Peptidamiden vom Trägerharz ermöglichen.The invention is therefore based on the object of new spacers to find a milder and better split off from Enable peptide amides from the carrier resin.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verbindungen der allgemeinen Formel IThis object is achieved by the Compounds of the general formula I

worin
R¹ (C₁-C₈)-Alkyl,
R² ein Aminosäurerest, der mit einer schwach sauer oder basisch abspaltbaren Urethanschutzgruppe geschützt ist, oder eine schwach sauer oder basisch abspaltbare Aminoschutzgruppe,
R³ Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl,
Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy oder -O-(CH₂)_n-COOH, wobei die Reste gleich oder verschieden sein können, ein Rest aber -O-(CH₂)_n-COOH ist, oder
Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl oder (C₁-C₄)-Alkoxy, wobei die Reste gleich oder verschieden sein können, Y³ (C₁-C₈)-Alkoxy oder Wasserstoff und Y⁴ -(CH₂)_n-COOH oder -NH-CO-(CH₂)_n-COOH, und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeuten.wherein
R¹ (C₁-C₈) alkyl,
R² is an amino acid residue that is protected with a weakly acidic or basic cleavable urethane protecting group, or a weakly acidic or basic cleavable amino protecting group,
R³ is hydrogen or (C₁-C₄) alkyl,
Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl, (C₁-C₄) alkoxy or -O- (CH₂) _n -COOH, the radicals being equal to or may be different, but a radical is -O- (CH₂) _n -COOH, or
Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl or (C₁-C₄) alkoxy, where the radicals can be the same or different, Y³ (C₁-C₈) alkoxy or hydrogen and Y⁴ - (CH₂) _n -COOH or -NH-CO- (CH₂) _n -COOH, and
n is an integer from 1 to 6.

Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I worin R¹ Methyl und n eine ganze Zahl von 1, 2 oder 3 sind.Preferred compounds of the general formula I are those in which R 1 is methyl and n is an integer of 1, 2 or 3.

Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen dieser allgemeinen Formel I, worin R² ein Aminosäurerest, der mit Fmoc geschützt ist, oder eine Urethanschutzgruppe - insbesondere Fmoc - und R³ Wasserstoff bedeuten.Compounds of these general are also preferred Formula I, wherein R² is an amino acid residue associated with Fmoc is protected, or a urethane protection group - in particular Fmoc - and R³ are hydrogen.

Ferner stehen die Reste Y¹-Y⁹ insbesondere für Methyl oder Methoxy, wobei jedoch ein Rest -O-(CH₂)_n-COOH und mindestens 4 dieser Reste Wasserstoff sind oder die Reste Y¹, Y², Y⁵-Y⁹ für Methyl oder Methoxy, wobei jedoch mindestens 4 dieser Reste Wasserstoff sind, Y³ für Methyl und Y⁴ für -(CH₂)_n-COOH. Vorzugsweise steht ein Rest Y¹, Y³, Y⁵, Y⁷ oder Y⁸ für -O-(CH₂)_n-COOH. Furthermore, the radicals Y¹-Y⁹ are in particular methyl or methoxy, but a radical -O- (CH₂) _n -COOH and at least 4 of these radicals are hydrogen or the radicals Y¹, Y², Y⁵-Y⁹ for methyl or methoxy, but with at least 4 of these radicals are hydrogen, Y³ for methyl and Y⁴ for - (CH₂) _n -COOH. A radical Y¹, Y³, Y⁵, Y⁷ or Y⁸ is preferably -O- (CH₂) _n -COOH.

In Verbindungen, in denen Y⁴ -(CH₂)_n-COOH bedeutet, ist Y³ (C₁-C₄)-Alkoxy, insbesondere Methoxy und n=2; falls Y⁴ für -NH-CO-(CH₂)_n-COOH steht, sind bevorzugt Y¹ und Y³ Methoxy und n=2.In compounds in which Y⁴ is - (CH₂) _n -COOH, Y³ is (C₁-C₄) alkoxy, especially methoxy and n = 2; if Y⁴ is -NH-CO- (CH₂) _n -COOH, Y¹ and Y³ are preferably methoxy and n = 2.

Alkyl und Alkoxy können geradkettig oder verzweigt sein.Alkyl and alkoxy can be straight-chain or branched.

R² steht für eine basenlabile oder gegen schwache Säuren labile Schutzgruppe, wie z. B. Urethanschutzgruppen, wie Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse und Tse, vorzugsweise Fmoc (siehe z. B. Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, Nr. 3, Seiten 14-23) oder für den Rest einer Aminosäure vorzugsweise einer α-Aminosäure, die, falls chiral, in der D- oder L-Form vorliegen kann. Bevorzugt sind Reste natürlich vorkommender Aminosäuren, deren Enantiomeren, Homologen, Derivate und einfache Metaboliten (vgl. z. B. Wünsch et al., Houben-Weyl 15/1 und 2, Stuttgart, Thieme 1974). So kommen beispielsweise in Frage:
Aad, Abu, γAbu, ABz, 2ABz, εAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, βAib, Ala, βAla, ΔAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gln, Glu, Gly, Guv, hCys, His, hSer, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise, Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Lys, βLys, ΔLys, Met, Mim, Min, nArg, Nle, Nva, Oly, Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, ΔPro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, βThi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, Tyr, Val sowie die Reste der entsprechenden enantiomeren D-Aminosäuren.R² stands for a base-labile or labile protection group against weak acids, such as. B. urethane protecting groups such as Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse and Tse, preferably Fmoc (see, for example, Hubbuch, contacts (Merck) 1979, No. 3, pages 14-23) or for the rest of an amino acid preferably an α- amino acid which, if chiral, can be in the D or L form. Residues of naturally occurring amino acids, their enantiomers, homologs, derivatives and simple metabolites are preferred (see, for example, Wünsch et al., Houben-Weyl 15/1 and 2, Stuttgart, Thieme 1974). For example,
Aad, Abu, γ Abu, ABz, 2ABz, ε Aca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, β Aib, Ala, β Ala, Δ Ala, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg , Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gln, Glu, Gly, Guv , hCys, His, hSer, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise, Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Lys, β Lys, Δ Lys, Met, Mim, Min, nArg, Nle, Nva, Oly , Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, Δ Pro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, β Thi, Thr, Thy, Thx , Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, Tyr, Val and the residues of the corresponding enantiomeric D-amino acids.

Funktionelle Gruppen in den Seitenketten der genannten Aminosäurereste können geschützt vorliegen. Geeignete Schutzgruppen sind bei Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, Nr. 3, Seiten 14-23 und bei Bullesbach, Kontakte (Merck) 1980, Nr. 1, Seiten 23-35 beschrieben. Functional groups in the side chains of the above Amino acid residues can be protected. Suitable Protection groups are in Hubbuch, contacts (Merck) 1979, No. 3, pages 14-23 and at Bullesbach, contacts (Merck) 1980, No. 1, pages 23-35.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß manThe invention also relates to a method of manufacture of the compounds of formula I, characterized in that is that one

a) a compound of formula II wherein
R¹ (C₁-C₈) alkyl,
Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl, (C₁-C₄) alkoxy or -O- (CH₂) n -COOH, the radicals being equal to or may be different, but a radical is -O- (CH₂) n -COOH, or
Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl or (C₁-C₄) alkoxy, where the radicals can be the same or different, Y³ (C₁-C₈) alkoxy or hydrogen and Y⁴ - (CH₂) n -COOH or -NH-CO- (CH₂) n -COOH, and
n is an integer from 1 to 6,
with a compound of formula III in which
R² is an amino acid residue that is protected with a weakly acidic or basic cleavable urethane protecting group, or a weakly acidic or basic cleavable amino protecting group and
R³ is hydrogen or (C₁-C₄) alkyl,
implements or
b) a compound of formula IV with hydroxylamine to a compound of formula V wherein R¹, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ and Y⁹ are as defined above,
then the oxime is reduced to the amine, preferably with zinc in glacial acetic acid or with Zn in ammoniacal ethanol (S. Gaehde, G. Matsueda, Int. J. Peptide Protein Res. 18, 451 (1981)) and the amine, if appropriate, by suitable means Reagents such as B. chloroformic acid derivatives or carbonic acid derivatives converted into compounds of formula I in which R² is a weakly acidic or basic removable amino protecting group and R³ is hydrogen.

Die Umsetzung einer Verbindung der Formel II mit einer Verbindung der Formel III führt man vorzugsweise in einem polaren, protischen Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure bei einer Temperatur zwischen 0°C und dem Siedepunkt des Reaktionsgemisches durch. The reaction of a compound of formula II with a Compound of formula III is preferably carried out in one polar, protic solvents, such as. B. acetic acid at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the Reaction mixture through.

Verbindungen der Formel II erhält man beispielsweise durch Reduktion von Benzophenon-Derivaten der Formel IV,Compounds of the formula II are obtained, for example, from Reduction of benzophenone derivatives of the formula IV,

worin, R¹, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ und Y⁹ wie oben definiert sind,
mit geeigneten, d. h. für die Ketogruppe selektiven Reduktionsmitteln wie z. B. Natriumborhydrid.wherein, R¹, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ and Y⁹ are as defined above,
with suitable, ie selective for the keto group reducing agents such. B. sodium borohydride.

Benzophenon-Derivate der Formel IV werdenBenzophenone derivatives of the formula IV are

a) by reaction of benzophenones of the formula IV, in which R¹ is as defined above and Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ and Y⁹ are hydrogen, (C₁-C₄) alkyl, (C₁-C₄) - Alkoxy and one of the radicals Y¹-Y⁹ hydroxyl,
with l -halo fatty acids of the formula VI Hal- (CH₂) n -COOH (VI) where Hal is halogen and n is as defined above,
or their esters, in the case of the esters then an alkaline saponification of the ester group z. B. with sodium hydroxide solution (M. Prashad et al., Indian J. Chem. 17B, 496-498 (1979)),
b) z. B. by reaction of benzoic acid chlorides of the formula VII with ω -phenoxyalkanoic acids of the formula VIII wherein R¹, Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ and Y⁹ are as defined under a), Y³ 'is -O- (CH₂) n -COOR⁴ and Y⁴' as Y⁴ is defined under a) or Y³ 'as Y³ is defined under a) and Y⁴ ′ is - (CH₂) n -COOR⁴, n is as defined under a) and R⁴ is (C₁-C₈) alkyl, preferably methyl or ethyl,
using a Lewis catalyst such as e.g. B. aluminum trichloride or titanium tetrachloride (Organikum, 13th edition, p. 354 (1974)), or
c) by reacting the corresponding benzoic acid chlorides of the formula VII with appropriately substituted phenols of the formula IX to give the corresponding phenyl esters of the formula X, subsequent Fries shift with Lewis acids such. B. Titanium tetrachloride (R. Martin et al., Monath. Chemie 110, 1057-1066 (1979)) and further reaction with ω -halo fatty acids of the formula VI, in which Hal and n are as defined above, are obtained.

Verbindungen der Formel VIII, worin Y³′ (C₁-C₈)-Alkoxy oder Wasserstoff und Y⁴′ -(CH₂)_n-COOR⁴ bedeuten, erhält man z. B., durch Umsetzung der entsprechenden Benzaldehyde in denen Y⁴′ für CHO steht mit Malonsäurehalbestern in Pyridin/Piperidin zu den entsprechenden Zimtsäureestern und anschließende Hydrierung. Man erhält in diesem Falle Verbindungen der Formel VIII mit n=2. Ebenfalls möglich ist die Umsetzung der entsprechenden Benzaldehyde mit α-Halogenessigsäureestern in Gegenwart von Zink, Dehydratisierung zu den Zimtsäureestern und anschließende Hydrierung.Compounds of formula VIII, wherein Y³ '(C₁-C₈) alkoxy or hydrogen and Y⁴' - (CH₂) _n -COOR⁴, z. B., by reacting the corresponding benzaldehydes in which Y⁴ 'represents CHO with malonic acid semiesters in pyridine / piperidine to give the corresponding cinnamic esters and subsequent hydrogenation. In this case, compounds of the formula VIII with n = 2 are obtained. It is also possible to react the corresponding benzaldehydes with α- haloacetic acid esters in the presence of zinc, dehydration to give the cinnamic acid esters and subsequent hydrogenation.

Verbindungen der Formel VIII, worin Y³′ für -O-(CH₂)_n-COOR⁴ und Y⁴′ für Y⁴ stehen, stellt man durch Umsetzung der entsprechenden Phenole der Formel IXCompounds of the formula VIII, in which Y³ 'is -O- (CH₂) _n -COOR⁴ and Y⁴' is Y stellt, are prepared by reacting the corresponding phenols of the formula IX

mit den entsprechenden α-Halogenalkansäureestern, z. B. mit Natriumhydrid in Dimethylformamid (DMF) oder Kaliumcarbonat in Aceton her.with the corresponding α- haloalkanoic acid esters, e.g. B. with sodium hydride in dimethylformamide (DMF) or potassium carbonate in acetone.

Analog können auch die der allgemeinen Formel I entsprechenden Verbindungen der Formeln VII, VIII, IX und X hergestellt werden.Analogously, those of the general formula I corresponding compounds of formulas VII, VIII, IX and X are made.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Verbindung der Formel I, bei der Festphasensynthese von Verbindungen der Formel XIThe invention further relates to the use of a Compound of formula I, in the solid phase synthesis of Compounds of formula XI

P-R²-NH-R³ (XI)P-R²-NH-R³ (XI)

in welcher P für einen Peptidrest aus q p+1 α-Aminosäuren steht, R² ein Aminosäurerest, der mit einer schwach sauer oder basisch abspaltbaren Urethangruppe geschützt ist, oder eine schwach sauer oder basisch abspaltbare Aminoschutzgruppe bedeutet und R³ wie oben definiert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel XI, in welcher P, R² und R³ wie oben definiert sind, durch Festphasensynthese, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der Formel I mit in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien über die -O-(CH₂)_n-COOH, -(CH₂)_n-COOH oder -NH-CO-(CH₂)_n-COOH Gruppierung an ein Harz kuppelt, die Schutzgruppe des Aminosäurerestes R² oder die Schutzgruppe R² abspaltet, stufenweise q-p durch basenlabile oder gegen schwache Säuren labile Aminoschutzgruppen temporär geschützte α-Aminosäuren gegebenenfalls in Form ihrer aktivierten Derivate ankuppelt und nach beendetem Aufbau das Peptid der Formel XI, durch Behandeln mit einer mittelstarken Säure von Harz freisetzt, wobei gleichzeitig oder durch geeignete Maßnahmen daran anschließend temporär eingeführte Seitenkettenschutzgruppen wieder abgespalten werden.in which P represents a peptide residue from q p +1 α -amino acids, R² is an amino acid residue which is protected with a weakly acidic or basic cleavable urethane group, or a weakly acidic or basic cleavable amino protecting group and R³ is as defined above, and a Process for the preparation of a peptide of the formula XI, in which P, R² and R³ are as defined above, by solid phase synthesis, which is characterized in that a compound of the formula I with coupling reagents customary in peptide chemistry via the -O- (CH₂) _n -COOH, - (CH₂) _n -COOH or -NH-CO- (CH₂) _n -COOH group couples to a resin, splits off the protective group of the amino acid residue R² or the protective group R², step by step qp by base-labile or labile against weak acids amino protective groups temporarily protected α- amino acids, optionally coupled in the form of their activated derivatives, and after the structure has ended, the peptide of the formula XI, by treatment with a medium-strength acid v on releases resin, whereby side chain protection groups which have been temporarily introduced thereafter are split off again simultaneously or by means of suitable measures.

Falls zur Verhinderung von Nebenreaktionen oder für die Synthese spezieller Peptide erforderlich, sind die funktionellen Gruppen in der Seitenkette von Aminosäuren durch geeignete Schutzgruppen (siehe z. B. T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", New York, John Wiley & Sons, 1981) zusätzlich geschützt, wobei in erster Linie Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But) eingesetzt werden.If for the prevention of side reactions or for the Synthesis of special peptides are required functional groups in the side chain of amino acids through suitable protective groups (see e.g. T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, New York, John Wiley & Sons, 1981) additionally protected, being in the first Line Arg (Tos), Arg (Mts), Arg (Mtr), Asp (OBzl), Asp (OBut), Cys (4-MeBzl), Cys (Acm), Cys (SBut), Glu (OBzl), Glu (OBut), His (Tos), His (Fmoc), His (Dnp), His (Trt), Lys (Cl-2), Lys (Boc), Met (O), Ser (Bzl), Ser (But), Thr (Bzl), Thr (But) be used.

Die als Trägermaterial verwendeten Harze sind kommerziell erhältlich oder selbst hergestellt, wie z. B. Alkoxybenzylalkoholharze, Aminomethylharze oder Benzhydrylaminoharze. Bevorzugt sind Aminomethyl-, Benzhydrylamino-(BHA) und Methylbenzhydrylamino-Harze (MBHA). Die Beladung bestimmt man durch Aminosäureanalyse und/oder Elementaranalyse.The resins used as the carrier material are commercial available or self-made, such as B. Alkoxybenzyl alcohol resins, aminomethyl resins or Benzhydrylamino resins. Aminomethyl, Benzhydrylamino (BHA) and methylbenzhydrylamino resins (MBHA). The loading is determined by amino acid analysis and / or Elemental analysis.

Als Kupplungsreagenz für die Verbindung der Formel I und die weiteren Aminosäurederivate können alle möglichen in der Peptidsynthese verwendeten Aktivierungs-Reagenzien, siehe z. B. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, verwendet werden, insbesondere aber Carbodiimide wie z. B. N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N′-Diisopropylcarbodiimid oder N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Die Kupplung kann dabei direkt durch Addition von Aminosäurederivat mit dem Aktivierungsreagenz und gegebenenfalls einem die Racemisierung unterdrückenden Zusatz wie z. B. 4-Dimethylaminopyridin, 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)) oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin (HOObt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2054 (1970) zum Harz durchgeführt werden oder aber die Voraktivierung des Aminosäurederivats als symmetrisches Anhydrid oder HOBt- bzw. HOObt-Ester kann separat erfolgen und die Lösung der aktivierten Spezies in einem geeigneten Lösungsmittel zum kupplungsfähigen Peptidharz gegeben werden.As a coupling reagent for the compound of formula I and further amino acid derivatives can all possible in the Activation reagents used in peptide synthesis, see e.g. B. Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Volume 15/2, are used, but especially carbodiimides such. B. N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N, N'-diisopropylcarbodiimide or N-ethyl-N ′ - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide. The Coupling can be done directly by adding Amino acid derivative with the activation reagent and optionally one that suppresses racemization Addition such as B. 4-dimethylaminopyridine, 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)) or 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazine (HOObt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2054 (1970) on the resin or but the preactivation of the amino acid derivative as symmetrical anhydride or HOBt or HOObt ester can done separately and the solution of the activated species in a suitable solvent for coupling Peptide resin can be given.

Die Kupplung bzw. Aktivierung der Verbindung der Formel I und der Aminosäurederivate mit einem der obengenannten Aktivierungsreagenzien kann in Dimethylformamid oder Methylenchlorid oder einer Mischung aus beiden durchgeführt werden. Das aktivierte Aminosäurederivat wird üblicherweise in einem 1,5- bis 4fachen Überschuß eingesetzt. In Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung eintritt, wird die Kupplungsreaktion wiederholt, ohne vorher die für die Kupplung der nächstfolgenden Aminosäure nötige Entblockung der α-Aminogruppe des Peptidharzes durchzuführen. The coupling or activation of the compound of formula I and the amino acid derivatives with one of the above-mentioned activation reagents can be carried out in dimethylformamide or methylene chloride or a mixture of both. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. In cases where an incomplete coupling occurs, the coupling reaction is repeated without first carrying out the deblocking of the α- amino group of the peptide resin necessary for the coupling of the next amino acid.

Der erfolgreiche Ablauf der Kupplungsreaktion kann mittels der Ninhydrin-Reaktion, wie z. B. von E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34 595 (1970) beschrieben, überprüft werden. Die Synthese kann auch automatisiert z. B. mit einem Peptid-Synthesizer Modell 430A der Fa. Applied Biosystems durchgeführt werden, wobei entweder die vom Gerätehersteller vorgesehenen Syntheseprogramme oder aber auch vom Benutzer selbst erstellte verwendet werden können. Letztere werden insbesondere bei der Verwendung von mit der Fmoc-Gruppe geschützten Aminosäurederivaten eingesetzt.The successful course of the coupling reaction can be done using the ninhydrin reaction, e.g. B. by E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34 595 (1970). The synthesis can also be automated e.g. B. with a peptide synthesizer Model 430A from Applied Biosystems be carried out, either from Device manufacturers provided synthesis programs or can also be used by the user. The latter are used especially when using the Fmoc group protected amino acid derivatives used.

Die Abspaltung der Peptidamide vom Harz erfolgt durch Behandlung mit in der Peptidsynthese üblicherweise verwendeten mittelstarken Säuren (z. B. Trifluoressigsäure) wobei als Kationenfänger Substanzen wie Phenol, Kresol, Thiokresol, Anisol, Thioanisol, Ethandithiol, Dimethylsulfid, Ethylmethylsulfid oder ähnliche in der Festphasensynthese übliche Kationenfänger einzeln oder eine Mischung von zwei oder mehr dieser Hilfsmittel zugesetzt werden. Die Trifluoressigsäure kann dabei auch durch geeignete Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, verdünnt angewendet werden. Bei der Abspaltung des Spacers vom Harz erfolgt gleichzeitig die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen.The peptide amides are split off from the resin by Treatment with usually in peptide synthesis used medium strong acids (e.g. trifluoroacetic acid) where substances such as phenol, cresol, Thiocresol, anisole, thioanisole, ethanedithiol, Dimethyl sulfide, ethyl methyl sulfide or the like in the Solid phase synthesis customary cation scavenger individually or one Mixture of two or more of these auxiliaries added will. The trifluoroacetic acid can also by suitable solvents, such as. B. methylene chloride, diluted be applied. When the spacer is split off from the resin, this takes place simultaneously the separation of the side chain protection groups.

Die Reinigung der so erhaltenen Rohpeptide erfolgt mittels Chromatographie an ®Sephadex, Ionenaustauscherharzen oder HPLC.The crude peptides thus obtained are purified by means of Chromatography on ®Sephadex, ion exchange resins or HPLC.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorstehenden Erfindung, ohne daß sie darauf beschränkt wäre.The following examples serve to explain the above invention, without being limited thereto.

example 1 4-phenoxybutyric acid methyl ester

In 160 ml eisgekühltes, trockenes Methanol werden 16 ml Thionylchlorid eingetropft und anschließend 36 g Phenoxybuttersäure in Portionen zugegeben. Danach wird eine Stunde bei 40°C gerührt. Dann wird das überschüssige Methanol abgezogen und der verbliebene Rückstand aus Petrolether (Kühlen auf -20°C) umkristallisiert.
Ausbeute: 34,5 g, Schmelzpunkt: 25,5-26,5°C16 ml of thionyl chloride are added dropwise to 160 ml of ice-cold, dry methanol and then 36 g of phenoxybutyric acid are added in portions. The mixture is then stirred at 40 ° C for one hour. The excess methanol is then drawn off and the remaining residue is recrystallized from petroleum ether (cooling to -20 ° C.).
Yield: 34.5 g, melting point: 25.5-26.5 ° C

Example 2 4- (4'-Methoxybenzoyl) -phenoxybutyric acid methyl ester

25,6 g wasserfreies Aluminiumtrichlorid werden in 64 ml 1,2-Dichlorethan gelöst, und 28,6 g 4-Methoxybenzoylchlorid werden zugegeben. Dann werden unter heftigem Rühren 31 g 4-Phenoxybuttersäuremethylester langsam zugegeben. Man rührt noch 4 Stunden bei 50°C, läßt abkühlen und gießt die Reaktionsmischung auf Eiswasser. Man trennt die ölige organische Schicht und die Wasserphase, wäscht die organische Phase mit Wasser und kristallisiert durch Zugabe von wenig Methanol. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt und aus Essigester umkristallisiert.
Ausbeute: 41 g, Schmelzpunkt: 117-118°C25.6 g of anhydrous aluminum trichloride are dissolved in 64 ml of 1,2-dichloroethane and 28.6 g of 4-methoxybenzoyl chloride are added. Then 31 g of methyl 4-phenoxybutyrate are slowly added with vigorous stirring. The mixture is stirred for a further 4 hours at 50 ° C., allowed to cool and the reaction mixture is poured onto ice water. The oily organic layer and the water phase are separated, the organic phase is washed with water and crystallized by adding a little methanol. The precipitated product is filtered off and recrystallized from ethyl acetate.
Yield: 41 g, melting point: 117-118 ° C

Example 3 4- (4'-methoxybenzoyl) phenoxybutyric acid

41 g 4-(4′-Methoxybenzoyl)-phenoxybuttersäuremethylester aus Beispiel 2 werden in 600 ml Dimethoxyethan/Wasser 4 : 1 gelöst und 63 ml 2 N Natronlauge zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, säuert dann mit 3 N Salzsäure auf pH 3 an und entfernt das organische Lösungsmittel im Vakuum. Die ausgefallene Säure wird abfiltriert und im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute: 38,7 g, Schmelzpunkt: 141-142°C41 g of methyl 4- (4'-methoxybenzoyl) phenoxybutyrate from Example 2 are dissolved in 600 ml of 4: 1 dimethoxyethane / water and 63 ml of 2N sodium hydroxide solution are added. The mixture is stirred for 4 hours at room temperature, then acidified to pH 3 with 3 N hydrochloric acid and the organic solvent is removed in vacuo. The precipitated acid is filtered off and dried in vacuo over phosphorus pentoxide.
Yield: 38.7 g, melting point: 141-142 ° C

Example 4 (4-carboxylatopropyloxyphenyl) -4'-methoxyphenylcarbinol

18,9 g 4-(4′-Methoxybenzoyl)-phenoxybuttersäure (Beispiel 3) werden in 600 ml Methanol bei 40°C gelöst, 60 ml 1 N Natronlauge und 3,4 g Natriumborhydrid portionsweise zugegeben. Man rührt noch eine Stunde bei 40°C, reduziert dann auf kleines Volumen und stellt mit 3 N Salzsäure auf pH 2,8. Danach wird das Methanol am Rotationsverdampfer abgezogen, die wäßrige Mischung mit Ethylacetat extrahiert und die organische Lösung mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel entfernt. Es verbleiben 18,2 g einer amorphen Substanz, die sofort weiter umgesetzt wird.18.9 g of 4- (4'-methoxybenzoyl) phenoxybutyric acid (Example 3) are dissolved in 600 ml of methanol at 40 ° C, 60 ml of 1N Sodium hydroxide solution and 3.4 g of sodium borohydride in portions admitted. The mixture is stirred for another hour at 40 ° C., reduced then to small volume and adjust to pH with 3N hydrochloric acid 2.8. Then the methanol is on a rotary evaporator stripped, the aqueous mixture extracted with ethyl acetate and the organic solution with saturated Washed sodium chloride solution. After drying over The solvent is removed from sodium sulfate. It 18.2 g of an amorphous substance remain immediately is implemented further.

General instructions for coupling Fmoc-amide (9-fluorenylmethyl carbamate) on carbinol derivatives

20 mmol Fmoc-amid und 20 mmol frisch hergestelltes Carbinol werden in 50 ml warmem Eisessig gelöst. Dann werden 5 Tropfen konzentrierte Schwefelsäure zugegeben und bei Raumtemperatur oder bei 40°C gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach beendeter Reaktion wird Eisessiglösung auf Eiswasser gegossen, das ausgefallene Produkt abgesaugt und umkristallisiert. 20 mmol Fmoc-amide and 20 mmol freshly made carbinol are dissolved in 50 ml of warm glacial acetic acid. Then 5 Drops of concentrated sulfuric acid added and at Stirred at room temperature or at 40 ° C. The progression the reaction is carried out by means of thin layer chromatography controlled. After the reaction has ended, glacial acetic acid solution poured onto ice water, the precipitated product is suctioned off and recrystallized.

Example 5 N-Fmoc- (4-carboxylatopropyloxyphenyl) -4'-methoxyphenyl) methylamide

Nach obiger Vorschrift wird das unter Beispiel 4 hergestellte (4-Carboxylatopropyloxyphenyl)-4′-methoxyphenylcarbinol umgesetzt.
Ausbeute: 91 g, Schmelzpunkt: 186-187°C.According to the above procedure, the (4-carboxylatopropyloxyphenyl) -4'-methoxyphenylcarbinol prepared in Example 4 is reacted.
Yield: 91 g, melting point: 186-187 ° C.

Analyse: C₃₃H₃₁NO₆
berechnet:
C 73,73, H 5,81, N 2,61;
gefunden:
C 73,6, H 6,0, N 2,6.Analysis: C₃₃H₃₁NO₆
calculated:
C 73.73, H 5.81, N 2.61;
found:
C 73.6, H 6.0, N 2.6.

Example 6 N-Fmoc- (4-carboxylatomethyloxyphenyl) -4'-methoxyphenyl) methylamide

Nach obiger Vorschrift wird das in der deutschen Patentanmeldung P 37 11 866.8, Beispiel 3, beschriebene (4-Carboxylatomethyloxyphenyl)-4′-methoxyphenylcarbinol umgesetzt.
Ausbeute: 60%, Schmelzpunkt: 176-179°C.According to the above regulation, the (4-carboxylatomethyloxyphenyl) -4′-methoxyphenylcarbinol described in German patent application P 37 11 866.8, example 3, is reacted.
Yield: 60%, melting point: 176-179 ° C.

Analyse: C₃₁H₂₇NO₆
berechnet:
C 73,15, H 5,35, N 2,75;
gefunden:
C 73,3, H 5,3, N 2,95.Analysis: C₃₁H₂₇NO₆
calculated:
C 73.15, H 5.35, N 2.75;
found:
C 73.3, H 5.3, N 2.95.

Example 7 Synthesis of H-Leu-Gly-Gly-Gly-Gln-Gly-Lys-Val-Leu-Gly-NH₂ using the anchor described in Example 5

Die Synthese erfolgte in einem Peptidsynthesizer der Fa. Labotec.The Synthesis was carried out in a peptide synthesizer from Labotec.

Von 1,5 g Boc-Val-Harz (Beladung 0,76 mmol/g) wurde zunächst mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid die Schutzgruppe entfernt. Nach dem Waschen mit Dichlormethan und Ethyldiisopropylamin und wiederum Dichlormethan wurde das Harz getrocknet. Anschließend gab man 2,1 mmol des in Beispiel 5 hergestellten Ankers zusammen mit 3,15 mmol HOBt gelöst in 20 ml trockenem DMF auf das Harz und fügte dann 2,3 mmol Diisopropylcarbodiimid dazu. Unter langsamem Durchmischen ließ man bei Raumtemperatur über Nacht reagieren. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit der Ninhydrin-Reaktion (Kaiser-Test) überprüft. Dann wurde das Harz abgesaugt, mit DMF gewaschen und anschließend das Peptid am Harz aufgebaut (für die Synthese wurden 1 g des oben hergestellten Harzes eingesetzt), wobei folgende Schritte cyclisch durchlaufen wurden.1.5 g of Boc-Val resin (loading 0.76 mmol / g) was initially used the protective group with trifluoroacetic acid in methylene chloride away. After washing with dichloromethane and This became ethyldiisopropylamine and again dichloromethane Resin dried. Then 2.1 mmol of the in Example 5 manufactured anchor together with 3.15 mmol HOBt dissolved in 20 ml of dry DMF on the resin and then added Add 2.3 mmol diisopropylcarbodiimide. Under slow Mixing was allowed to take place at room temperature overnight react. The completeness of the reaction was checked with the Ninhydrin reaction (Kaiser test) checked. Then that became Aspirated resin, washed with DMF and then that Peptide built up on the resin (1 g of the Resin prepared above used), the following Steps were cycled through.

Cleavage of the Fmoc protective group with 20% piperidine in DMF,
- washing the resin with DMF,
- Coupling of the Fmoc amino acid with in situ activation as HOBt ester using diisopropyl carbodiimide as an activation reagent (1.5 mmol amino acid, 2.25 mmol HOBt, 1.6 mmol diisopropyl carbodiimide).

Falls die Kupplung unvollständig war (Kaiser-Test) wurde der Kupplungsschritt wiederholt. Als letzte Aminosäure wurde Boc-Leu-OH eingesetzt.If the coupling was incomplete (Kaiser test) the coupling step is repeated. Boc-Leu-OH was used as the last amino acid.

Nach beendeter Synthese wurde das Harz mit DMF und Isopropanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Die Abspaltung erfolgte während einer Zeit von 2,5 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Mischung aus 20 ml Trifluoressigsäure/15 ml Dichlormethan/5 ml Thioanisol/0,5 ml Ethandithiol. Anschließend wurde in Diethylether abgesaugt und mit 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan nachgewaschen. Das ausgefallene Rohpeptid wurde abgesaugt und dreimal mit Diethylether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 91% Rohpeptid.
Aminosäureanalyse: Gly 5,1; Glu 0,98; Leu 1,78; Val 0,81; Lys 1,01. After the synthesis was complete, the resin was washed with DMF and isopropanol and dried under high vacuum. The cleavage took place over a period of 2.5 hours at room temperature with a mixture of 20 ml trifluoroacetic acid / 15 ml dichloromethane / 5 ml thioanisole / 0.5 ml ethanedithiol. It was then filtered off with suction in diethyl ether and washed with 50% trifluoroacetic acid in dichloromethane. The precipitated crude peptide was filtered off with suction and washed three times with diethyl ether and dried under high vacuum.
Yield: 91% crude peptide.
Amino acid analysis: Gly 5.1; Glu 0.98; Leu 1.78; Val 0.81; Lys 1.01.

Example 8 2,4-Dimethoxycinnamic acid ethyl ester

83 g 2,4-Dimethoxybenzaldehyd und 66 g Malonsäuremonoethylester werden in 100 ml trockenem Pyridin gelöst und nach Zugabe von 1 ml Piperidin und 40 g Molekularsieb unter Rückfluß erhitzt bis die CO₂-Entwicklung aufgehört hat. Das Reaktionsgemisch wird nach Abkühlen auf zerstoßenes Eis gegossen und mit konz. Salzsäure unter Rühren auf pH 1-2 gestellt. Man rührt noch 20 Minuten nach, saugt das ausgefallene Produkt ab, wäscht mit 1 N Salzsäure und Wasser und trocknet im Exsiccator.
Ausbeute: 100,2 g, Schmp. 58°C.83 g of 2,4-dimethoxybenzaldehyde and 66 g of malonic acid monoethyl ester are dissolved in 100 ml of dry pyridine and, after addition of 1 ml of piperidine and 40 g of molecular sieve, heated under reflux until the CO₂ evolution has ceased. After cooling, the reaction mixture is poured onto crushed ice and concentrated with. Hydrochloric acid adjusted to pH 1-2 with stirring. The mixture is stirred for a further 20 minutes, the precipitated product is filtered off, washed with 1 N hydrochloric acid and water and dried in a desiccator.
Yield: 100.2 g, mp. 58 ° C.

Example 9 2,4-Dimethoxyhydrocinnamic acid ethyl ester

100,2 g 2,4-Dimethoxyzimtsäureethylester werden in 400 ml Methanol gelöst und mit Palladium/Kohle bei Normaldruck hydriert. Man saugt vom Katalysator ab und engt im Vakuum ein.
Ausbeute: 94,7 g gelbliches Öl.100.2 g of ethyl 2,4-dimethoxycinnamate are dissolved in 400 ml of methanol and hydrogenated with palladium / carbon at normal pressure. It is suctioned off from the catalyst and concentrated in vacuo.
Yield: 94.7 g of yellowish oil.

Example 10 3- [2,4-Dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionic acid ethyl ester

52 g Aluminiumtrichlorid werden in 200 ml 1,2-Dichlorethan suspendiert und auf 0°C gekühlt. Anschließend werden bei dieser Temperatur 66,5 g 4-Methoxybenzoylchlorid zugetropft gefolgt von 94,7 g 2,4-Dimethoxyhydrozimtsäureethylester in 30 ml 1,2-Dichlorethan. Anschließend wird unter Feuchtigkeitsausschluß auf 50°C erhitzt, bis die Reaktion beendet ist. Danach wird die Reaktionsmischung auf Eiswasser gegossen, die organische Phase abgetrennt und nach Verdünnen mit 200 ml Methylenchlorid mit Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser extrahiert. Man trocknet über Magnesiumsulfat und engt ein. Es verbleibt eine grau-braune Festsubstanz, die direkt weiter umgesetzt wird.
Ausbeute: 128,9 g, Schmp. 89°C.52 g of aluminum trichloride are suspended in 200 ml of 1,2-dichloroethane and cooled to 0 ° C. Then 66.5 g of 4-methoxybenzoyl chloride are added dropwise at this temperature, followed by 94.7 g of ethyl 2,4-dimethoxyhydrocinnamate in 30 ml of 1,2-dichloroethane. The mixture is then heated to 50 ° C. with the exclusion of moisture until the reaction has ended. The reaction mixture is then poured onto ice water, the organic phase is separated off and, after dilution with 200 ml of methylene chloride, extracted with sodium bicarbonate solution and water. It is dried over magnesium sulfate and concentrated. A gray-brown solid substance remains, which is directly implemented further.
Yield: 128.9 g, mp. 89 ° C.

Example 11 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionic acid

55,8 g 3-[2,4-Dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl)phenyl]propionsäureethylester werden mit 300 ml 2 N Natronlauge und 300 ml Dioxan versetzt und über Nacht gerührt. Dann wird das Dioxan abgezogen und die alkalische wäßrige Lösung einmal mit 100 ml Essigester extrahiert. Die Wasserphase wird mit konz. Salzsäure auf pH 2 gestellt wobei ein Teil des Produktes ausfällt. Man extrahiert dreimal mit je 200 ml Essigester, wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Der Rückstand wird aus Essigester/Aceton/Hexan umkristallisiert.
Ausbeute: 37 g, Schmp. 177-180°C.55.8 g of ethyl 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionate are mixed with 300 ml of 2N sodium hydroxide solution and 300 ml of dioxane and stirred overnight. The dioxane is then drawn off and the alkaline aqueous solution is extracted once with 100 ml of ethyl acetate. The water phase is with conc. Hydrochloric acid adjusted to pH 2 whereby part of the product fails. It is extracted three times with 200 ml of ethyl acetate, the organic phase is washed with water, dried over sodium sulfate and concentrated. The residue is recrystallized from ethyl acetate / acetone / hexane.
Yield: 37 g, mp 177-180 ° C.

Example 12 2,4-Dimethoxycinnamic acid methyl ester

Eine Mischung aus 105,6 g 2,4-Dimethoxybenzaldehyd, 93,6 g Malonsäuremonomethylester-Kaliumsalz, 200 ml Pyridin (über KOH getrocknet), 1,2 ml Piperidin, 36 ml Essigsäure und 48 g Molekularsieb 3Å wird so lange auf 150°C erhitzt, bis die CO₂-Entwicklung aufgehört hat. Die Lösung wird warm auf Eis gegossen, mit konz. Salzsäure auf pH 1-2 angesäuert und noch 20 Minuten im Eisbad nachgerührt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 1 N HCl und Wasser nachgewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 113,8 g, Schmelzpunkt: 78°CA mixture of 105.6 g of 2,4-dimethoxybenzaldehyde, 93.6 g of monomethyl malonate potassium salt, 200 ml of pyridine (dried over KOH), 1.2 ml of piperidine, 36 ml of acetic acid and 48 g of 3Å molecular sieve is kept at 150 ° for as long as this C heated until the CO₂ development has stopped. The solution is poured warm on ice, with conc. Acidified hydrochloric acid to pH 1-2 and stirred for another 20 minutes in an ice bath. The precipitate is filtered off, washed with 1 N HCl and water and dried.
Yield: 113.8 g, melting point: 78 ° C

Example 13 2,4-dimethoxycinnamic acid

In einem 1-l-Dreihalskolben mit Magnetrührer, Rückflußkühler und Innenthermometer werden 180 ml trockenes Pyridin vorgelegt und darin 124,9 g Malonsäure unter Rühren gelöst. Dann werden 166,18 g 2,4-Dimethoxybenzaldehyd in Portionen zugegeben, wobei die Innentemperatur auf 25°C absinkt. Zu der erhaltenen Mischung gibt man 9,9 ml trockenes Piperidin und erwärmt dann langsam. Die Badtemperatur wird auf 130°C eingestellt. Nach 1,5 Stunden ist die CO₂-Entwicklung beendet, und die Mischung siedet bei 107°C. Anschließend wird die Mischung heiß auf 1 kg Eis gegossen. Man säuert mit konz. HCl unter Rühren auf pH 1 an, rührt noch 20 Minuten unter Eiskühlung nach und saugt den Niederschlag ab. Man wäscht noch je 3mal mit je 200 ml 2 N HCl und Wasser nach und trocknet. Der noch verbliebene Aldehyd wird durch suspendieren des Niederschlages in 600 ml heißem Cyclohexan und erneutes Absaugen entfernt. Man wäscht anschließend mit 100 ml heißem Cyclohexan nach und trocknet im Exsiccator. Aus dem Filtrat kristallisiert der Aldehyd bei Abkühlen aus. Eine weitere Möglichkeit der Reinigung besteht in der Umkristallisation aus Methanol/Wasser. Dazu wird das Produkt heiß in möglichst wenig Methanol gelöst und mit Wasser bis zur Trübung versetzt. Nach Abkühlen fällt die Zimtsäure aus während der Aldehyd in Lösung bleibt.
Ausbeute: Zimtsäure 181,4 g (mit Cyclohexan behandelt), Aldehyd 14,5 g (aus Cyclohexan ausgefallen).
Schmelzpunkt: 182-184°C. 180 ml of dry pyridine are placed in a 1 liter three-necked flask with a magnetic stirrer, reflux condenser and internal thermometer and 124.9 g of malonic acid are dissolved therein with stirring. Then 166.18 g of 2,4-dimethoxybenzaldehyde are added in portions, the internal temperature dropping to 25 ° C. 9.9 ml of dry piperidine are added to the mixture obtained, and the mixture is then slowly warmed. The bath temperature is set to 130 ° C. After 1.5 hours, the CO₂ evolution is complete and the mixture boils at 107 ° C. The mixture is then poured hot onto 1 kg of ice. You acidify with conc. HCl to pH 1 with stirring, stirring for a further 20 minutes while cooling with ice and suctioning off the precipitate. It is washed 3 times each with 200 ml of 2N HCl and water and dried. The remaining aldehyde is removed by suspending the precipitate in 600 ml of hot cyclohexane and suctioning it off again. It is then washed with 100 ml of hot cyclohexane and dried in a desiccator. The aldehyde crystallizes out of the filtrate on cooling. Another possibility for purification is recrystallization from methanol / water. To do this, the product is dissolved hot in as little methanol as possible and water is added until it becomes cloudy. After cooling, the cinnamic acid precipitates while the aldehyde remains in solution.
Yield: cinnamic acid 181.4 g (treated with cyclohexane), aldehyde 14.5 g (precipitated from cyclohexane).
Melting point: 182-184 ° C.

Example 14 Methyl 3- (2,4-dimethoxyphenyl) propionate

20,8 g 2,4-Dimethoxyzimtsäure werden in einer Mischung aus 500 ml Methanol und 100 ml Essigester heiß gelöst und nach Zugabe von 1 g Katalysator (10% Pd/C) bei Normaldruck hydriert. Die Wasserstoffaufnahme sollte nach 3 Stunden beendet sein. Falls die Hydrierung nicht vollständig ist wird nochmals frischer Katalysator zugesetzt. Nach beendigter Reaktion wird der Katalysator abgetrennt, die Lösung auf ca. 200 ml eingeengt und 20 ml einer ca. 2,4 M methanolischen Salzsäure zugegeben und die Mischung 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Veresterung ist dann vollständig. Man zieht im Vakuum das Methanol ab, nimmt den Rückstand in 200 ml Essigester auf, wäscht die organische Phase mit NaHCO₃-Lösung und gesättigter NaCl-Lösung (je 3mal 50 ml), trocknet über Na₂SO₄ und engt ein.
Ausbeute: 20,0 g eines Öls.20.8 g of 2,4-dimethoxycinnamic acid are dissolved hot in a mixture of 500 ml of methanol and 100 ml of ethyl acetate and, after addition of 1 g of catalyst (10% Pd / C), hydrogenated at atmospheric pressure. Hydrogen uptake should be complete after 3 hours. If the hydrogenation is not complete, fresh catalyst is added again. When the reaction is complete, the catalyst is separated off, the solution is concentrated to about 200 ml and 20 ml of about 2.4 M methanolic hydrochloric acid are added and the mixture is left to stand at room temperature for 2 days. The esterification is then complete. The methanol is removed in vacuo, the residue is taken up in 200 ml of ethyl acetate, the organic phase is washed with NaHCO 3 solution and saturated NaCl solution (3 times 50 ml each), dried over Na 2 SO 4 and concentrated.
Yield: 20.0 g of an oil.

Example 15 Methyl 3- (2,4-dimethoxyphenyl) propionate

113,8 g 2,4-Dimethoxyzimtsäuremethylester werden unter Erwärmen in 1,5 l Methanol gelöst und an 5 g Katalysator (10% Pd/C) hydriert. Nach Filtration des Katalysators wird eingeengt. Es verbleiben 113 g eines Öles, das direkt in die nachfolgende Friedel-Crafts-Acylierung eingesetzt wird.
Ausbeute: 113 g Öl.113.8 g of 2,4-dimethoxycinnamic acid methyl ester are dissolved in 1.5 l of methanol with heating and hydrogenated over 5 g of catalyst (10% Pd / C). After filtering the catalyst, the mixture is concentrated. There remain 113 g of an oil which is used directly in the subsequent Friedel-Crafts acylation.
Yield: 113 g of oil.

Example 16 Methyl 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionate

36,6 g Aluminiumtrichlorid werden in 130 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und 42,65 g 4-Methoxybenzoylchlorid zur auf 0°C gekühlten Lösung zugegeben. Bei dieser Temperatur wird anschließend 56 g 3-(2,4-Dimethoxyphenyl)propionsäuremethylester (Beispiel 17) gelöst in 30 ml 1,2-Dichlorethan zugetropft und dann unter Feuchtigkeitsausschluß bis zur Beendigung der Reaktion (ca. 36 Stunden) bei 50°C gerührt. Die abgekühlte Reaktionsmischung wird mit 200 ml Wasser versetzt, mit 400 ml CH₂Cl₂ verdünnt, mit Bicarbonat und Wasser extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Man löst in Diisopropylether und fällt mit Hexan. Nach Absaugen erhält man 62,1 g und aus der Mutterlauge weitere 10,5 g des Produktes.
Ausbeute: 72,6 g, Schmelzpunkt: 114-117°C.36.6 g of aluminum trichloride are dissolved in 130 ml of 1,2-dichloroethane and 42.65 g of 4-methoxybenzoyl chloride are added to the solution cooled to 0 ° C. At this temperature, 56 g of methyl 3- (2,4-dimethoxyphenyl) propionate (Example 17) dissolved in 30 ml of 1,2-dichloroethane are then added dropwise and then with the exclusion of moisture until the reaction has ended (about 36 hours) at 50 ° C. touched. The cooled reaction mixture is mixed with 200 ml of water, diluted with 400 ml of CH₂Cl₂, extracted with bicarbonate and water, dried over sodium sulfate and concentrated. It is dissolved in diisopropyl ether and precipitated with hexane. After suctioning off, 62.1 g of the product and a further 10.5 g of the product are obtained from the mother liquor.
Yield: 72.6 g, melting point: 114-117 ° C.

Example 17 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionic acid

60,9 g 3-[2,4-Dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl)phenyl]propionsäuremethylester werden mit 300 ml 2 N Natronlauge und 300 ml Dioxan versetzt und über Nacht gerührt. Dann wird das Dioxan abgezogen und die alkalische wäßrige Lösung einmal mit 100 ml Essigester extrahiert. Die Wasserphase wird mit konz. Salzsäure auf pH 2 gestellt, wobei ein Teil des Produktes ausfällt. Man extrahiert dreimal mit je 200 ml Essigester, wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Der Rückstand wird aus Essigester/Aceton/Hexan umkristallisiert.
Ausbeute: 51,3 g, Schmelzpunkt: 177-180°C.60.9 g of methyl 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionate are mixed with 300 ml of 2N sodium hydroxide solution and 300 ml of dioxane and stirred overnight. The dioxane is then drawn off and the alkaline aqueous solution is extracted once with 100 ml of ethyl acetate. The water phase is with conc. Hydrochloric acid adjusted to pH 2, whereby part of the product fails. It is extracted three times with 200 ml of ethyl acetate, the organic phase is washed with water, dried over sodium sulfate and concentrated. The residue is recrystallized from ethyl acetate / acetone / hexane.
Yield: 51.3 g, melting point: 177-180 ° C.

Example 18 5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy-4'-methoxybenzophenone oxime

37 g 3-[2,4-Dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl)phenyl]propionsäure, 22,4 g Hydroxylamin · Hydrochlorid und 21 g Natriumacetat (wasserfrei) werden in 300 ml absoluten Ethanol gegeben und unter Feuchtigkeitsausschluß 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man saugt von Ungelöstem ab, engt ein und versetzt den Rückstand mit Wasser. Dann wird mit 1 N Salzsäure auf pH 2 gestellt und mit Essigester extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus Essigester/Hexan umkristallisiert.
Ausbeute: 34,3 g, Schmp. 124-128°C.37 g of 3- [2,4-dimethoxy-5- (4-methoxybenzoyl) phenyl] propionic acid, 22.4 g of hydroxylamine · hydrochloride and 21 g of sodium acetate (anhydrous) are added to 300 ml of absolute ethanol and refluxed for 24 hours with exclusion of moisture heated. It is suctioned off from undissolved, concentrated and water is added to the residue. Then it is adjusted to pH 2 with 1 N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with water, dried over magnesium sulfate and concentrated. The residue is recrystallized from ethyl acetate / hexane.
Yield: 34.3 g, mp 124-128 ° C.

Example 19 N- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) - [5-carboxylatoethyl-2,4- dimethoxyphenyl) -4'-methoxyphenyl] methylamine

34 g 5-Carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy-4′-methoxybenzophenonoxim werden in eine Mischung von 100 ml Ethanol und 500 ml 25%iger Ammoniaklösung gegeben, dann werden 29,5 g Zinkpulver zugegeben und die Mischung über Nacht bei 50°C gerührt. Dann werden weitere 30 g Zink und 260 ml 25%iger Ammoniak zugegeben und weitere 24 Stunden bei 50°C gerührt. Man saugt heiß vom Zink ab und zieht Ethanol ab. Die gekühlte wäßrige Phase wird mit konz. Salzsäure neutral gestellt und einmal mit Essigester extrahiert. Das erhaltene Amin wird nicht isoliert sondern die wäßrige Lösung direkt weiter umgesetzt. Dazu stellt man die Lösung mit festem Natriumhydrogencarbonat auf pH 8, verdünnt mit 250 ml Tetrahydrofuran und gibt 31 g 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat hinzu und rührt über Nacht. Dann wird von Ungelöstem abfiltriert, das Tetrahydrofuran im Vakuum abgezogen und die wäßrige Phase mit 1 N Schwefelsäure sauer gestellt. Man extrahiert mit Essigester, wäscht die organische Phase mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung, trocknet über Magnesiumsulfat und engt ein. Der Rückstand wird in Essigester heiß gelöst, nach kurzem Abkühlen mit Ether und dann bis zur Trübung mit Hexan versetzt. Man läßt über Nacht im Kühlraum stehen, saugt das ausgefallene Produkt ab und kristallisiert nochmals in der beschriebenen Weise.
Ausbeute: 37,1 g, Schmp. 149-151°C.34 g of 5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy-4'-methoxybenzophenone oxime are added to a mixture of 100 ml of ethanol and 500 ml of 25% ammonia solution, then 29.5 g of zinc powder are added and the mixture is added overnight at 50 ° C touched. Then another 30 g of zinc and 260 ml of 25% ammonia are added and the mixture is stirred at 50 ° C. for a further 24 hours. The hot zinc is suctioned off and ethanol is removed. The cooled aqueous phase is concentrated with. Hydrochloric acid neutralized and extracted once with ethyl acetate. The amine obtained is not isolated, but the aqueous solution is directly reacted further. To do this, the solution is adjusted to pH 8 with solid sodium hydrogen carbonate, diluted with 250 ml of tetrahydrofuran and 31 g of 9-fluorenylmethylsuccinimidyl carbonate are added and the mixture is stirred overnight. The undissolved material is then filtered off, the tetrahydrofuran is stripped off in vacuo and the aqueous phase is acidified with 1N sulfuric acid. It is extracted with ethyl acetate, the organic phase is washed with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and concentrated. The residue is dissolved hot in ethyl acetate, after briefly cooling with ether and then mixed with hexane until cloudy. The mixture is left to stand overnight in the cold room, the precipitated product is filtered off with suction and crystallized again in the manner described.
Yield: 37.1 g, mp 149-151 ° C.

Alternativ kann man das Produkt auch durch katalytische Hydrierung des Oxims an 10% Palladium/Kohle in ammoniakalischem Ethanol und nachfolgende Umsetzung mit 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat wie oben beschrieben erhalten.Alternatively, the product can also be catalytic Hydrogenation of the oxime on 10% palladium / carbon in ammoniacal ethanol and subsequent implementation with 9-fluorenylmethylsuccinimidyl carbonate as described above receive.

Example 20 Production of the Fmoc amide resin

30,7 g aminomethyliertes Polystyrol-Harz (Beladung 1,04 mMol NH₂/g und 28 g (49,5 mMol) N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-[(5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy--phenyl)-4′- methoxyphenyl]methylamin werden in einer Mischung aus 210 ml Dimethylformamid und 90 ml Dichlormethan suspendiert. Es werden 6,4 g HOObt und 23 ml Diisopropylcarbodiimid zugegeben und die Mischung über Nacht geschüttelt. Danach war die Reaktion beendet, und das Harz wurde abgesaugt, mit DMF, DCM und MTB-Ether gewaschen. Nach Trocknung im Hochvakuum erhielt man 46,5 g Produkt mit einer Beladung von 0,57 mMol/g (bestimmt durch Elementaranalyse) bzw. 0,54 mMol/g (bestimmt durch Testabspaltung von Fmoc-NH₂ und Quantifizierung über HPLC).30.7 g of aminomethylated polystyrene resin (loading 1.04 mmol NH₂ / g and 28 g (49.5 mmol) of N- (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) - [(5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy - phenyl) -4′- methoxyphenyl] methylamine are in a mixture of 210 ml Dimethylformamide and 90 ml of dichloromethane suspended. It 6.4 g HOObt and 23 ml diisopropylcarbodiimide added and the mixture shaken overnight. After that was the reaction ended and the resin was suctioned off with DMF, DCM and MTB ether washed. After drying in a high vacuum 46.5 g of product were obtained with a loading of 0.57 mmol / g (determined by elemental analysis) or 0.54 mmol / g (determined by test elimination from Fmoc-NH₂ and quantification HPLC).

Peptide synthesis

Für die Peptid-Synthese wurde folgendes Reaktionsschema angewendet:
Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit 20% Piperidin in DMF, Waschen mit NMP, Aufkuppeln der nachfolgenden Fmoc-Aminosäure als in NMF gelöster HOObt-Ester oder als in DMF oder NMP mit Diisopropylcarbodiimid in situ voraktivierter HOObt-Ester, Waschen mit NMP. Dieser Zyklus wurde durchlaufen bis das Peptid am Harz aufgebaut war. Die Effektivität der Kupplung kann mittels Ninhydrin-Test verfolgt werden.The following reaction scheme was used for peptide synthesis:
Cleavage of the Fmoc protective group with 20% piperidine in DMF, washing with NMP, coupling of the subsequent Fmoc amino acid as HOObt esters dissolved in NMF or as HOObt esters pre-activated in situ in DMF or NMP with diisopropyl carbodiimide, washing with NMP. This cycle was continued until the peptide was built up on the resin. The effectiveness of the coupling can be monitored using the ninhydrin test.

Example 21 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

Das Peptid wurde an 877 mg des oben hergestellten Harzes synthetisiert. Die Abspaltung des Rohpeptids erfolgte mittels TFA/Ethandithiol/Thioanisol 90/5/5 bei Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde. Man erhielt 450 mg Rohprodukt, das mit einer authentischen Probe im HPLC identisch war.
FAB-MS (G, TFA): 1182 (M+H⁺).The peptide was synthesized on 877 mg of the resin prepared above. The crude peptide was cleaved off using TFA / ethanedithiol / thioanisole 90/5/5 at room temperature within 1 hour. 450 mg of crude product were obtained, which was identical to an authentic sample in HPLC.
FAB-MS (G, TFA): 1182 (M + H⁺).

Example 22 H-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH₂

Das Peptid wurde an 877 mg des oben hergestellten Harzes synthetisiert. Die Abspaltung des Rohpeptids erfolgte mittels TFA/Wasser 95/5 bei Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde. Man erhielt aus 100 mg Harz 38 mg Rohprodukt, das mit einer authentischen Probe identisch war.
FAB-MS (3-NBA): 641 (M+H⁺). The peptide was synthesized on 877 mg of the resin prepared above. The crude peptide was cleaved off using TFA / water 95/5 at room temperature within 1 hour. 38 mg of crude product, which was identical to an authentic sample, was obtained from 100 mg of resin.
FAB-MS (3-NBA): 641 (M + H⁺).

Example 23 H-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

Die Synthese dieses Peptides erfolgte wie oben beschrieben an 877 mg Harz. Als erste Aminosäure wurde Fmoc-Glu-OtBu aufgekuppelt. Dieses ergibt nach der Abspaltung vom Harz mit 95% TFA/Wasser das Peptid mit C-terminalem Glutamin.This peptide was synthesized as described above on 877 mg of resin. The first amino acid was Fmoc-Glu-OtBu uncoupled. This results in the separation from the resin with 95% TFA / water the peptide with C-terminal glutamine.

Claims

1. Compound of the general formula I wherein
R¹ (C₁-C₈) alkyl,
R² is an amino acid residue that is protected with a weakly acidic or basic cleavable urethane protecting group, or a weakly acidic or basic cleavable amino protecting group,
R³ is hydrogen or (C₁-C₄) alkyl,
Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl, (C₁-C₄) alkoxy or -O- (CH₂) _n -COOH, the radicals being equal to or may be different, but a radical is -O- (CH₂) _n -COOH, or
Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl or (C₁-C₄) alkoxy, where the radicals can be the same or different, Y³ (C₁-C₈) alkoxy or hydrogen and Y₄ - (CH₂) _n -COOH or -NH-CO- (CH₂) _n -COOH, and n is an integer from 1 to 6.

2. A compound of formula I according to claim 1, in which R¹ is methyl and n is an integer of 1, 2 or 3.

3. Compound of formula I according to one or more of the Claims 1 to 2 in which R² is an amino acid residue which is protected with Fmoc, or a urethane protecting group and R³ is hydrogen.

4. A compound of formula I according to one or more of claims 1 to 3, in which the radicals Y¹-Y⁹ are methyl or methoxy, but one radical -O- (CH₂) _n -COOH and at least 4 of these radicals are hydrogen or the radicals Y¹, Y², Y⁵-Y⁹ are methyl or methoxy, but at least 4 of these radicals are hydrogen, Y³ is methyl and Y⁴ is - (CH₂) _n -COOH.

5. A compound of formula I according to one or more of claims 1 to 4, in which a radical Y¹, Y³, Y⁵, Y⁷ or Y⁸ is -O- (CH₂) _n -COOH.

6. A compound of formula I according to one or more of claims 1 to 4, in which Y⁴ is - (CH₂) _n -COOH, Y³ (C₁-C₄) alkoxy and n = 2, or Y⁴ for -NH-CO- (CH₂) _n -COOH, Y¹ and Y³ are methoxy and n = 2.

7. A process for the preparation of a compound of formula I according to one or more of claims 1 to 6, characterized in that

a) a compound of formula II wherein
R¹ (C₁-C₈) alkyl,
Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl, (C₁-C₄) alkoxy or -O- (CH₂) _n -COOH, the radicals being equal to or may be different, but a radical is -O- (CH₂) _n -COOH, or
Y¹, Y², Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸, Y⁹ hydrogen, (C₁-C₄) alkyl or (C₁-C₄) alkoxy, where the radicals can be the same or different, Y³ (C₁-C₈) alkoxy or hydrogen and Y₄ - (CH₂) _n -COOH or -NH-CO- (CH₂) _n -COOH, and n is an integer from 1 to 6,
with a compound of formula III in which
R² is an amino acid residue that is protected with a weakly acidic or basic cleavable urethane protecting group, or a weakly acidic or basic cleavable amino protecting group and
R³ is hydrogen or (C₁-C₄) alkyl,
implements or
b) a compound of formula IV with hydroxylamine to a compound of formula V wherein R¹, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ and Y⁹ are as defined above,
reacted, then the oxime reduced to the amine, the amine optionally converted into compounds of formula I in which R² is a weakly acidic or basic removable amino protecting group and R³ is hydrogen.

8. Use of a compound of formula I according to one or more of claims 1 to 6, in the solid-phase synthesis of compounds of formula XI P-R²-NH-R³ (XI) in which P for a peptide residue from q p +1 α- amino acids R² and R³ are as defined in claim 1.

9. A process for the preparation of a peptide of formula XI, in which P, R² and R³ are as defined in claim 8, by solid phase synthesis, characterized in that a compound of formula I with coupling reagents customary in peptide chemistry via the -O- ( CH₂) _n -COOH, - (CH₂) _n -COOH- or -NH-CO- (CH₂) _n -COOH group couples to a resin, splits off the protective group of the amino acid residue R² or the protective group R², gradually qp by base-labile or against weak acids labile amino-protecting groups, temporarily protected α- amino acids, optionally coupled in the form of their activated derivatives, and after the structure has ended, the peptide of the formula XI is released from the resin by treatment with a medium-strength acid, with side chain protective groups which have been temporarily introduced thereafter being split off again, or by suitable measures .