DE3830061A1

DE3830061A1 - Method and arrangement for light scanning microscopy

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Publication number: DE3830061A1
Application number: DE19883830061
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Sc Nat Schuett; Fritz Dr Rer Nat Kuhlmann; Gerald Dipl Ing Gruemmer; Fred Dipl Phys Dr Rer Reinholz; Stine-Kathrein Kraeft; Otto Prof Dr Sc Nat Fiedler
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1988-09-03
Publication date: 1989-03-30
Also published as: DD265224A1

Abstract

The invention relates to a method of light scanning microscopy and an arrangement therefor, which serve to examine biological and solid state specimens, a higher amount of information being obtainable about object structures and object parameters. This is achieved in that the light which leaves the object is measured at points in terms of its intensity distribution in the image plane and in that variables of the intensity distribution, such as overall intensity, the position, size of extremes thereof and/or the width of peaks are processed in a computer and then used for image representation, in order to implement light scanning microscopes of type I, type II, type III in a single device. The arrangement for determining the scattered light distribution contains between the imaging optical system and the diaphragm of an opto-electronic transducer an electronically controllable optical deflection system (e.g. acousto-optical, electro-optical cell; polygon prism; rotating mirror). It is possible to use an integrated receiving arrangement of line-shaped or matrix-shaped elements (photodiodes or CCD elements) or a TV pick-up device having an image intensifier. Conventional scanning and image build-up techniques are used.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lichtrastermikroskopie, das die Erkennung von Objektdetails verbessert und günstig zur bildmäßigen Untersuchung biologischer und medizinischer Objekte als auch feinstrukturierter Festkörperoberflächen angewendet werden kann, sowie eine Anordnung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.The invention relates to a method for light scanning microscopy, that improves the recognition of object details and is cheap pictorial examination of biological and medical objects as well as finely structured solid surfaces can be, as well as an arrangement for performing such Procedure.

Lichtrastermikroskope bestehen aus einer Lichtquelle, einer Ein richtung zur Fokussierung des Lichtstrahles auf das zu untersu chende Objekt, einen optoelektronischen Wandler zum Empfang der vom Objekt durchgelassenen oder reflektierten Strahlen und einer Einrichtung zur Rasterung einer Objektfläche durch Bewegung des Objektes oder Ablenkung des Strahles. Als Lichtquelle dient vor zugsweise ein CW-Laser. Wird von jedem beleuchteten Objektpunkt das gesamte ausgehende Licht von dem Abbildungssystem zur Bild darstellung benutzt, so handelt es sich um das einfache Licht rastermikroskop, dessen Auflösungsvermögen dem des Lichtmikros kopes entspricht (als Typ I bezeichnet). Es ist ausführlich bei Sheppard, C. J. R.; Wilson, T. J. Microscopy 114 (1978) S. 179 be schrieben.Light scanning microscopes consist of a light source, an on Direction for focusing the light beam on the object to be examined object, an optoelectronic converter for receiving the rays transmitted or reflected by the object and one Device for rasterizing an object surface by moving the Object or beam deflection. Serves as the light source preferably a CW laser. Is from every illuminated object point all the outgoing light from the imaging system to the image representation used, it is simple light scanning microscope, the resolution of which is that of the light microscope kopes corresponds (referred to as Type I). It is detailed in Sheppard, C.J. R .; Wilson, T. J. Microscopy 114 (1978) p. 179 be wrote.

Werden zusätzlich von der Probe ausgehende Strahlungen wie z. B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Raman-Strahlung oder auch Photo elektronen mit Hilfe eines zweiten Detektors zur Bilddarstellung benutzt, so entsteht ein kombiniertes optoelektronisches Meß system, das eine Identifizierung probenspezifischer Parameter hoher Empfindlichkeit erlaubt (Europ. Patentanmeldung Veröff. 00 56 426 (1981) Verfahren und Vorrichtung zur lichtindu zierten rastermikroskopischen Darstellung von Probenparametern in ihrer räumlichen Verteilung).If additional radiation emanating from the sample, e.g. B. Fluorescence, phosphorescence, Raman radiation or photo electrons with the help of a second detector for image display uses a combined optoelectronic measurement system that identifies sample-specific parameters high sensitivity allowed (European patent application published 00 56 426 (1981) Method and device for light indu graceful scanning microscopic representation of sample parameters in their spatial distribution).

Eine Verbesserung der Auflösung räumlicher Strukturen bringt das von Sheppard, C. J. R. DE-OS 28 18 651 (1987), beschriebene konfo kale Lichtrastermikroskop (als Typ II bezeichnet).This improves the resolution of spatial structures conf. described by Sheppard, C.J.R. DE-OS 28 18 651 (1987) kale light scanning microscope (referred to as type II).

Es besitzt in der Bildebene eine Lochblende, deren Durchmesser kleiner ist als der des Bildes des Fokus auf dem Objekt, so daß das gesamte aus dem Strahlbündel herausgestreute oder gebeugte Licht ausgeblendet bleibt und nur das zentrale Maximum zur Bild darstellung genutzt wird. Insbesondere verbessert sich die Tie fenschärfe.It has a pinhole in the image plane, its diameter is smaller than that of the image of the focus on the object, so that all of it scattered or diffracted from the beam Light remains hidden and only the central maximum for the picture representation is used. In particular, the tie improves sharpness.

Dichte- und Dickeninhomogenitäten des Objektes lassen sich gün stig mit einem Scanning-Mikroskop sichtbar machen, das nach dem Differential-Phasenkontrast-Prinzip arbeitet (Dekkers, N. H., de Lang, Optik Vol 41 (1974) S. 452). Es besitzt einen geteilten Sensor (split sensor), auf dem die Fokusfläche symmetrisch abge bildet wird. Die beiden Sensorhälften bilden die Differenz der auffallenden Intensität, so daß Dichte- oder Dickengradienten im Fokusbereich des Objektes sichtbar werden. Eine weitere Ver besserung dieser Methode bringt der Vorschlag von Sheppard, C. J. R. und Wilson, T. (EP-PS 01 68 983 A1 (1985) Scanning microscope), das Zentrum des geteilten Sensors abzudecken und nur Randzonen des abgebildeten Lichtstrahles zur Detektion zu benutzen. Das Ausblenden der starken Mittenintensität hat den Vorteil, daß bei der Differenzbildung der Randintensitäten auch Bereiche mit kleinerem Phasenkontrast sichtbar werden.Density and thickness inhomogeneities of the object can be gün visualize with a scanning microscope, which after the Differential phase contrast principle works (Dekkers, N.H., de Lang, Optik Vol 41 (1974) p. 452). It has a shared one Sensor (split sensor) on which the focus area is symmetrically offset is forming. The two sensor halves form the difference between striking intensity, so that density or thickness gradients become visible in the focus area of the object. Another ver Sheppard's proposal improves this method, C. J. R. and Wilson, T. (EP-PS 01 68 983 A1 (1985) Scanning microscope), to cover the center of the split sensor and only marginal zones of the light beam shown for detection to use. Hiding the strong center intensity has the Advantage that when differentiating the marginal intensities too Areas with smaller phase contrast become visible.

Nachteilig ist, daß die bisher vorgeschlagenen Verfahren und Ein richtungen der Lichtrastermikroskopie mit Detektoren arbeiten, die das Licht über mehr oder weniger großen Flächen integrieren. Das gilt auch für das konfokale Lichtrastermikroskop, wo die In tegration in der Ausblendung des gesamten Streulichtes zu sehen ist (Integraler Fehlbetrag).The disadvantage is that the previously proposed method and a directions of light scanning microscopy work with detectors, that integrate the light over more or less large areas. This also applies to the confocal light scanning microscope, where the In tegration in the suppression of all stray light is (integral shortfall).

Die Integration ist ein Faktor, der wesentlich zur Begrenzung der örtlichen Strukturerkennung beiträgt.Integration is a factor that is essential to limiting contributes to local structure recognition.

Relativ hoher Aufwand (optisch und mechanisch) entsteht beim konfokalen Lichtrastermikroskop durch die genaue Mitführung der Empfängerblende beim Abrastern des Objektes.Relatively high effort (optically and mechanically) arises with confocal light scanning microscope due to the precise carrying of the Receiver aperture when scanning the object.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die Lichtrastermikro skopie ein Verfahren und eine Anordnung zu entwickeln, mit deren Hilfe mehr und genauere Informationen über Objektstrukturen und Objektparameter gewonnen werden können.The aim of the invention is for the light grid micro to develop a method and an arrangement with which Help more and more accurate information about object structures and Object parameters can be obtained.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Anordnung für die Lichtrastermikroskopie zu entwickeln, womit eine genauere Abtastung des Bildes eines Objektpunktes und damit mehr Informationen von extrem kleinen Objektstrukturen bei hoher Abtastgeschwindigkeit erreicht werden. The invention is based, a method and a task Develop arrangement for light scanning microscopy, with what a more precise scanning of the image of an object point and thus more information from extremely small object structures at high ones Scanning speed can be achieved.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das von einem punktförmig bestrahlten Objektbereich ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitätsverteilung in der Bildebene (senkrecht zur Strahlachse) in einer oder in mehreren Richtungen kontinuierlich oder in kleinen Schritten gemessen wird. Aus der Intensitätsverteilung werden charakteristische Größen wird die Gesamtintensität, die Lage und Größe von Extremwerten und/oder die Breite von Peaks der Abtastkurve bestimmt und von einem Rechner verarbeitet. Der Meßvorgang wird bei rechnergesteuerter Flächenrasterung (x-y-Richtung) des Objektes von Punkt zu Punkt wiederholt. Die jeweils erhaltenen charakteristischen Größen der Intensitätsverteilung werden zur Bilddarstellung genutzt, sie verbessern die Erkennung von Objektdetails.The object is achieved in that the light emanating from a point-irradiated object area is measured continuously or in small steps with respect to its intensity distribution in the image plane (perpendicular to the beam axis) in one or more directions. Characteristic variables are used to determine the total intensity, the position and size of extreme values and / or the width of peaks of the scanning curve from the intensity distribution and processed by a computer. The measurement process is repeated from point to point with computer-controlled surface grid (xy direction) of the object. The characteristic quantities of the intensity distribution obtained in each case are used for image display, they improve the detection of object details.

Die charakteristischen Größen und/oder ihre mathematischen Ver knüpfungen (Verhältnisbildungen von Größen und Lagen der Extrem werte, Integration über den Abtastweg) dienen der Grauwertstufung in der Bilddarstellung des Objektbereiches. Die bloße Bildung des Integrals der Intensitätsverteilung eines jeden Objektbereiches liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ I. Die bloße Messung und Verarbeitung der Höhe des Intensitätsmaximums der In tensitätskurve liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ II. Dabei spielt es keine Rolle, an welcher Stelle im Abtast bereich die Kurve erscheint, so daß der Meßvorgang auf eine Im pulshöhenanalyse reduziert werden kann. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, ohne mechanisches Nachführen der Blende ein Strahl scanning in dieser Richtung vorzunehmen.The characteristic quantities and / or their mathematical ver knotting (relationship formation of sizes and positions of the extreme values, integration via the scanning path) serve the gray value grading in the image representation of the object area. The mere formation of the Integrals of the intensity distribution of each object area provides raster images of the type I scanning microscope Measurement and processing of the height of the intensity maximum of the In intensity curve provides raster images of the scanning microscope from Type II. It does not matter at which point in the scan area the curve appears, so that the measuring process is based on an Im pulse height analysis can be reduced. This results in the Possibility of a beam without mechanically tracking the aperture scanning in this direction.

Die Abrasterung des Objektes x- und y-Richtung erfolgt durch Be wegung des Objektes oder des Strahles oder beider in Stufen oder bei höheren Abtastgeschwindigkeiten kontinuierlich.The scanning of the object x and y direction is carried out continuously by moving the object or the beam or both in steps or at higher scanning speeds.

Zur Ermittlung bestimmter Probenparameter wird die Intensitäts verteilung von Streustrahlungen gemessen, deren Wellenlängen in folge von inelastischen Wechselwirkungen der Strahlen mit dem Objekt verändert sind, z. B. Fluoreszenz- oder Ramanstrahlung. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß weiterhin dadurch gelöst, daß zur Durchführung des Verfahrens eine rastermikroskopische Anord nung erstellt ist, in der sich zwischen dem abbildenden optischen System und der Blende des optoelektronischen Wandlers ein elektro nisch steuerbares optisches Ablenksystem befindet, eine akustoop tische oder elektrooptische Zelle. The intensity is used to determine certain sample parameters distribution of scattered radiation measured, whose wavelengths in follow inelastic interactions of the rays with the Object are changed, e.g. B. fluorescence or Raman radiation. The object is further achieved in that a scanning microscopic arrangement for performing the method voltage is created in which there is between the imaging optical System and the aperture of the optoelectronic converter an electro nisch controllable optical deflection system, an acoustoop table or electro-optical cell.

Bei nur eindimensionaler Ablenkung ist das Ablenksystem vorzugs weise ein rotierendes Polygonprisma. Die Blende, die sich vor dem optoelektronischen Wandler in der Bildebene befindet, hat eine Öffnungsweite, die kleiner ist als der Durchmesser des Bildes des Laserfokus auf dem Objekt. Das Bild des beleuchte ten Objektbereiches wird über die Blende gelenkt und vom dahin ter befindlichen Wandler als zeitabhängige Intensität registriert.If the deflection is only one-dimensional, the deflection system is preferred a rotating polygon prism. The aperture that is in front the optoelectronic converter is located in the image plane an opening width that is smaller than the diameter of the Image of the laser focus on the object. The image of the illuminate th object area is steered over the aperture and from there ter located converter registered as a time-dependent intensity.

Anstelle des Polygonprismas können schwingen de Ablenkelemente, wie z. B. lichtbrechende planparallele Körper oder Schwingspiegel oder auch gleichmäßig bewegte Drehspiegel angeordnet sein.Instead of the polygon prism can swing de deflection elements, such as. B. refractive plane-parallel body or oscillating mirror or evenly moving rotating mirror be arranged.

Für eine 2D-Darstellung der Intensitätsverteilung des vom be leuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes ist das Polygonprisma mit geringfügig in Richtung der Drehachse angeschrägten Prismen flächen versehen.For a 2D representation of the intensity distribution of the be the illuminated object area of outgoing light is the polygon prism with prisms slightly beveled in the direction of the axis of rotation provided areas.

Der optoelektronische Wandler, die Blende und das Ablenksystem können durch eine integrierte Empfängeranordnung, durch zeilen- oder matrizenförmig angeordnete Elemente (Photodioden oder CCD- Elemente) oder auch durch eine TV-Aufnahmeeinrichtung, vorzugs weise mit Bildvorverstärker (Ebiscon) ersetzt sein. Die Zeile, die Matrix oder das Empfängertarget sind jeweils in der Bild ebene des Objektbereiches senkrecht zur Strahlachse angeordnet.The optoelectronic converter, the aperture and the deflection system can by an integrated receiver arrangement, by line or elements arranged in a matrix (photodiodes or CCD Elements) or by a TV recording device, preferably be replaced with image preamplifier (Ebiscon). The line, the matrix or the recipient target are each in the picture plane of the object area arranged perpendicular to the beam axis.

Für Messungen von Streustrahlungen, deren Wellenlängen vom Objekt durch inelastische Wechselwirkungen ver ändert sind, ist ein Filter im Strahlengang oberhalb des halb durchlässigen Spiegels angeordnet.For measurements of scattered radiation, their Ver wavelengths from the object through inelastic interactions changes, there is a filter in the beam path above the half translucent mirror arranged.

Für wahlweises Arbeiten im Auflicht oder im Durchlicht kann das Lichtrastermikroskop einen Strahlteiler im Strahlengang des Lasers enthalten. Die beiden Teilstrahlen sind über optische Unterbrecher- und Umlenkvorrichtungen an das Objekt geführt, ein Strahl für Durchlichtmessungen und ein Strahl für Auflichtmes sungen.For optional work in reflected light or in transmitted light, this can be done Light scanning microscope a beam splitter in the beam path of the Lasers included. The two partial beams are over optical Interrupter and deflection devices guided to the object Beam for transmitted light measurements and one beam for incident light measurements sung.

Für eine dreidimensionale Bilddarstellung sind das Objekt oder der Strahlfokus oder beide in Richtung der Strahlachse (Achse des Abbildungssystems = z-Achse) schrittweise verschiebbar an geordnet.For a three-dimensional image display, the object or the beam focus or both are arranged so that they can be displaced step by step in the direction of the beam axis (axis of the imaging system = z axis).

Zum Zwecke herkömmlicher lichtmikroskopischer Beobachtung des Objektes sind außer einer an sich bekannten Vorrichtung zur gleichmäßigen Ausleuchtung des gesamten Objektes im Strahlen gang des abbildenden Systems ein halbdurchlässiger Spiegel und ein Okular angeordnet.For the purpose of conventional light microscopic observation of the Object are apart from a known device for uniform illumination of the entire object in the beam of the imaging system is a semi-transparent mirror and an eyepiece.

Anhand eines Ausführungsbeispiels wird die Erfindung näher er läutert. Es zeigtThe invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment purifies. It shows

Fig. 1 eine mögliche Ausführungsform einer Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Lichtrastermikro skopie, Fig. 1 shows a possible embodiment of an assembly for performing microscopy of the method for micro raster light,

Fig. 2 schematisch die Intensitätsverteilung des von einem beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes. Fig. 2 shows schematically the intensity distribution of outgoing light from an illuminated object space.

Bei der Anordnung nach Fig. 1 ist das aus einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser 9, austretende Licht und einem opti schen System 8, bestehend aus einer Vorrichtung zur Strahlauf weitung, Fokussierung und Strahlablenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, auf die Unterseite des Objektes 7 oder mit einer weiteren Lichtquelle, vorzugs weise einem Laser 10 über eine Optik 11, bestehend aus einer Vorrichtung zur Strahlaufweitung, Fokussierung und Strahlab lenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, über einen halbdurchlässigen Spiegel 12 und die Op tik 4 auf die Oberseite des Objektes 7 fokussiert. Das Objekt 7 wird durch eine Vorrichtung zur mechanischen Verschiebung 16 durch den Rechner 14 in drei Translationsfreiheitsgraden repro duzierbar bewegt. Das vom beleuchteten Punkt des Objektes 7 ausgehende Licht wird sowohl bei der Transmissions- als auch der Reflektionsvariante des Beispiels durch die Optik 4 und den halbdurchlässigen Spiegel 12 durch das Polygonprisma 1 hindurch auf die Blende 2 abgebildet. Bei Bewegung (drehende) des Polygonprismas 1 wird das vom jeweiligen Objektpunkt aus gehende Licht an der Lochblende 2 vorbeigeführt und vom Foto detektor 3 erfaßt. Der A/D-Wandler 13 und der Rechner 14 er fassen die Intensitätsverteilung des vom jeweiligen beleuchte ten Objektpunkt ausgehenden Lichtes. Dabei kontrolliert ein mit dem Rechner 14 verbundenes optoelektronisches System 17 die Stellung des Polygonprismas. Es gestattet, zur Aufnahme der In tensitätsverteilung stets dieselben Flächenpaare des Polygon prismas 1 zu benutzen, um gerätebedingte Intensitätsschwankun gen zu vermeiden. Über die Optik 4, einen weiteren halbdurch lässigen Spiegel 6 und das Okular 18 kann der zu untersuchende Objektbereich visuell in herkömmlicher Durchlichtmikroskopie betrachtet werden, wenn das Objekt 7 mittels des Kondensors 20 und der Leuchte 21 über den halbdurchlässigen Spiegel 19 gleichmäßig beleuchtet wird.In the arrangement according to FIG. 1, this is from a light source, preferably a laser 9 , emerging light and an optical system 8 , consisting of a device for beam expansion, focusing and beam deflection in the direction perpendicular to the axis of rotation of the polygon prism 1 , on the Underside of the object 7 or with another light source, preferably a laser 10 via an optical system 11 , consisting of a device for beam expansion, focusing and beam deflection in the direction perpendicular to the axis of rotation of the polygon prism 1 , via a semitransparent mirror 12 and the optics 4 focused on the top of the object 7 . The object 7 is moved by a device for mechanical displacement 16 by the computer 14 in three degrees of translational freedom. The light emanating from the illuminated point of the object 7 is imaged onto the diaphragm 2 through the optics 4 and the semitransparent mirror 12 through the polygon prism 1 both in the transmission and the reflection variant of the example. When moving (rotating) the polygon prism 1 , the light from the respective object point is guided past the pinhole 2 and detected by the photo detector 3 . The A / D converter 13 and the computer 14 detect the intensity distribution of the light emanating from the respective illuminated object point. An optoelectronic system 17 connected to the computer 14 controls the position of the polygon prism. It allows the same area pairs of the polygon prism 1 to be used to record the intensity distribution in order to avoid device-related intensity fluctuations. Via the optics 4 , another semi-transparent mirror 6 and the eyepiece 18 , the object area to be examined can be viewed visually in conventional transmitted light microscopy if the object 7 is illuminated uniformly by means of the condenser 20 and the lamp 21 via the semi-transparent mirror 19 .

Das Filter 5 dient zur Abtrennung des Fluoreszenzlichtes der Probe vom beleuchtenden Primärstrahl.The filter 5 serves to separate the fluorescent light of the sample from the illuminating primary beam.

Fig. 2 stellt schematisch die Intensitätsverteilung des von einem beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes in der Bildebene in einer Richtung x dar zwecks Erklärung der Licht rastermikroskope der Typen I, II und III. Fig. 2 shows schematically the intensity distribution of the light emanating from an illuminated object area in the image plane in a direction x for the purpose of explaining the light scanning microscopes of types I, II and III.

Zur Bilddarstellung auf einer Bildausgabeeinheit 15 werden charakteristische Merkmale der Intensitätsverteilung des vom beleuchteten Objektbereiches ausgehenden Lichtes wie z. B. Lage, Höhe und Breite der Maxima und Minima und/oder deren mathematische Verknüpfung (Typ III; Fig. 2c) oder das Inte gral der Intensitätsverteilung zur Aufnahme des Rasterbildes nach Typ I (Fig. 2a) oder die Höhe des Maximums zur Aufnahme von Rasterbildern des Types II (Fig. 2b) herangezogen. For image display on an image output unit 15 , characteristic features of the intensity distribution of the light emanating from the illuminated object area, such as e.g. B. Location, height and width of the maxima and minima and / or their mathematical link (type III; Fig. 2c) or the inte gral of the intensity distribution for recording the raster image according to type I ( Fig. 2a) or the height of the maximum for recording of raster images of type II ( Fig. 2b).

Verzeichnis der verwendeten BezugszeichenList of the reference symbols used

1 Polygonprisma
2 Detektorblende (Lochblende)
3 Fotodetektor
4 Optik
5 Filter
6 halbdurchlässiger Spiegel
7 Probe (Objekt)
8, 11 optisches System (Strahlaufweitung, Fokussierung, Strahlablenkung)
9, 10 Laser
12 halbdurchlässiger Spiegel
13 Analog/Digitalwandler
14 Rechner
15 Bildausgabegerät
16 Verstelleinheit (elektromechanisch)
17 optoelektronisches System
18 Okular
19 halbdurchlässiger Spiegel
20 Kondensor
21 Leuchte 1 polygon prism
2 detector diaphragm (pinhole)
3 photo detector
4 optics
5 filters
6 semi-transparent mirror
7 sample (object)
8, 11 optical system (beam expansion, focusing, beam deflection)
9, 10 lasers
12 semi-transparent mirror
13 analog / digital converter
14 computers
15 image output device
16 adjustment unit (electromechanical)
17 optoelectronic system
18 eyepiece
19 semi-transparent mirror
20 condenser
21 lamp

Claims

1. Method for light scanning microscopy of high information acquisition of object structures, in which the object is successively point-illuminated, preferably by a laser of short wavelength, and the light emanating from each illuminated object area is recorded by an optoelectronic transducer with an upstream aperture and used for image display, characterized in that the light emanating from the individual illuminated object area with regard to its intensity distribution in the image plane is measured continuously or in small discrete steps in one or more directions, from the intensity distribution characteristic quantities such as the total intensity, the position, size of extreme and / or the width of peaks are determined and processed by a computer, that the measuring process is repeated from point to point with computer-controlled screening of the object and the characteristic quantities of the intensity distribution obtained in each case be used for image display.

2. The method and claim 1, characterized in that the characteristic quantities and / or their mathematical Link to gray value differentiation of the image of the Object area are used and for comparison with be known methods by forming the integral of the Inten sity distribution for obtaining raster images of Ra Type I stereomicroscope or by determining the height of the maximum intensity in the beam axis for extraction of raster images of the type II scanning microscope to be pulled.

3. The method and claim 1-2, characterized in that the movement of the object or the beam or both when scanning the object in steps or at height speeds occur continuously.

4. The method according to claim 1-3, characterized in that Intensity distributions of scattered radiation measured whose wavelengths are due to inelastic Interactions of the incident radiation with the Ob ject are changed, e.g. B. fluorescence or Raman radiation.

5. Arrangement for a light scanning microscope for performing the method according to claim 1-4, characterized in that there is an electronically controllable optical deflection system ( 1 ) between the imaging optical system ( 4 ) and the diaphragm ( 2 ) of the optoelectronic transducer ( 3 ) , which consists of an acousto-optical or electro-optical cell or with one-dimensional deflection before preferably a rotating polygon prism ( 1 ) and that the aperture ( 2 ), which is located in the image plane of the scanning system and over which the image of the respectively illuminated Object area is steered, has an opening width that is smaller than the diameter of the image of the laser focus on the object.

6. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5, characterized in that the polygon prism ( 1 ) by vibrating deflection elements, such as. B. refractive plane-parallel body or oscillating mirror is replaced.

7. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5, characterized in that the polygon prism ( 1 ) is replaced by a uniformly moving rotating mirror.

8. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5, characterized in that the polygon prism for the purpose 2D representation of the scattered light curve of an object area with slightly slanted in the direction of the axis of rotation Prism surfaces is provided.

9. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5, characterized in that the deflection system, consisting for example of the polygon prism ( 1 ), the diaphragm ( 2 ) and the optoelectronic converter ( 3 ), by an optoelectronic receiver line or by an optoelectronic receiver matrix replaced and the light-sensitive receiver surface is arranged in the image plane of the object area perpendicular to the beam axis.

10. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5, characterized in that the deflection system, consisting for example of the polygon prism ( 1 ), the diaphragm ( 2 ) and the optoelectronic transducer ( 3 ) by a TV recording device, preferably with image preamplifier, he sets and the optoelectronic transducer surface is arranged in the image plane of the object area perpendicular to the beam axis.

11. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 4 and 7, characterized in that an optical filter ( 5 ) above the semitransparent mirror ( 12 ) is arranged for measurements of scattered radiation whose wavelengths are changed by the object.

12. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 7-11, characterized in that a beam splitter in blasting Gang of the laser is arranged and the partial beams over optical interrupter and deflection devices are such that the microscope either in reflected light or works in transmitted light.

13. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5-12, characterized in that the object or the Strahlfo kus or both in the direction of the axis of the imaging system (z direction) are gradually displaceable for the purpose of depth scanning and computer-controlled three-dimensional image display.

14. Arrangement for a light scanning microscope according to claim 5-13, characterized in that in the beam path of the imaging system, a semi-transparent mirror ( 6 ) and an eyepiece ( 18 ) are arranged for conventional light microscopic observation of the object in transmitted light when the object ( 7 ) by means of the lamp ( 21 ), the condenser ( 20 ), the semi-transparent mirror ( 19 ) for imaging by means of the optics ( 4 ) is illuminated uniformly.