DE102019119147A1 - MICROSCOPE AND METHOD OF MICROSCOPY - Google Patents

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DE102019119147A1 DE102019119147.5A DE102019119147A DE102019119147A1 DE 102019119147 A1 DE102019119147 A1 DE 102019119147A1 DE 102019119147 A DE102019119147 A DE 102019119147A DE 102019119147 A1 DE102019119147 A1 DE 102019119147A1
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Tiemo Anhut
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Lichtquelle zum Bereitstellen von Anregungslicht, einem Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten des Anregungslichts in eine Objektebene, einem Detektionsstrahlengang zum Leiten von von einer Probe in der Objektebene abgestrahltem Licht, insbesondere von Fluoreszenzlicht, auf eine Kamera oder einen Detektor, einer Scaneinrichtung zum Scannen des Anregungslichts in der Objektebene, wobei die Scaneinrichtung eine erste Ablenkeinheit zum Ablenken des Anregungslichts in einer ersten Koordinatenrichtung und eine zweite Ablenkeinheit zum Ablenken des Anregungslichts in einer zweiten Koordinatenrichtung aufweist, wobei die zweite Ablenkeinheit im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit angeordnet ist. Das Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch dadurch gekennzeichnet, dass eine Zylinderoptik wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von der ersten Ablenkeinheit positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist und dass eine periodische Blendenanordnung wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der ersten Ablenkeinheit und der zweiten Ablenkeinheit positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Mikroskopie.The invention relates to a microscope with a light source for providing excitation light, an illumination beam path with a microscope objective for guiding the excitation light into an object plane, a detection beam path for guiding light emitted by a sample in the object plane, in particular fluorescent light, onto a camera or detector , a scanning device for scanning the excitation light in the object plane, the scanning device having a first deflection unit for deflecting the excitation light in a first coordinate direction and a second deflection unit for deflecting the excitation light in a second coordinate direction, the second deflection unit in the illumination beam path downstream from the first deflection unit is arranged. According to the invention, the microscope is characterized in that cylinder optics can optionally be positioned in the illuminating beam path upstream of the first deflection unit or removed from the illuminating beam path and that a periodic diaphragm arrangement can either be positioned in the illuminating beam path between the first deflecting unit and the second deflecting unit or removed from the illuminating beam path is. The invention also relates to a method for microscopy.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt ein Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem zweiten Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroskops. Ein gattungsgemäßes Mikroskop ist beispielsweise beschrieben in DE 10 2014 017 001 A1 und weist folgende Komponenten auf: eine Lichtquelle zum Bereitstellen von Anregungslicht, einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten des Anregungslichts in eine Objektebene, einen Detektionsstrahlengang zum Leiten von von einer Probe in der Objektebene abgestrahltem Licht, insbesondere von Fluoreszenzlicht, auf eine Kamera oder einen Detektor, eine Scaneinrichtung zum Scannen des Anregungslichts in der Objektebene, wobei die Scaneinrichtung eine erste Ablenkeinheit zum Ablenken des Anregungslichts in einer ersten Koordinatenrichtung und eine zweite Ablenkeinheit zum Ablenken des Anregungslichts in einer zweiten Koordinatenrichtung aufweist, und wobei die zweite Ablenkeinheit im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit angeordnet ist.In a first aspect, the present invention relates to a microscope according to the preamble of claim 1. In a second aspect, the invention relates to a method for using the microscope according to the invention. A generic microscope is described in, for example DE 10 2014 017 001 A1 and has the following components: a light source for providing excitation light, an illumination beam path with a microscope objective for guiding the excitation light into an object plane, a detection beam path for guiding light emitted by a sample in the object plane, in particular fluorescent light, to a camera or a detector , a scanning device for scanning the excitation light in the object plane, the scanning device having a first deflection unit for deflecting the excitation light in a first coordinate direction and a second deflection unit for deflecting the excitation light in a second coordinate direction, and wherein the second deflection unit in the illumination beam path downstream from the first Deflection unit is arranged.

Die Untersuchung von lebenden Zellen, Geweben oder Organismen hat sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten zu dem wichtigsten Anwendungsfeld der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Ein dazu sehr häufig eingesetztes Werkzeug ist das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM), weil es über die Konfokalität der Abbildung der Probe auf den Sensor, Emission außerhalb der Fokusebene des Objektives gegenüber fokaler Emission zu diskriminieren vermag. Dadurch können mit Hilfe dieser sogenannten optischen Schnitte dreidimensionale Bildinformationen der Proben gewonnen werden, ohne dass die Proben tatsächlich physisch zerschnitten werden müssen.The investigation of living cells, tissues or organisms has developed into the most important field of application of fluorescence microscopy over the past two decades. A tool that is very frequently used for this purpose is the confocal laser scanning microscope (LSM), because it is able to discriminate emission outside the focal plane of the objective from focal emission via the confocality of the image of the sample on the sensor. As a result, with the help of these so-called optical cuts, three-dimensional image information of the samples can be obtained without the samples actually having to be physically cut.

Der Nachteil des LSM ist der dem Prinzip innewohnende sequentielle Bildaufbau, der die erreichbare Bildrate begrenzt. Dies wird zumeist durch schnelleres Scannen des Anregungsspots über die Probe überwunden. Dadurch wird jedoch auch die Verweilzeit des Anregungslasers auf dem betreffenden Bildpixel reduziert. Demzufolge werden entweder die Bilder verrauschter, weil nur entsprechend weniger Photonen eingesammelt werden können oder die Intensität des Anregungslasers wird erhöht, um den Signalverlust auszugleichen.The disadvantage of the LSM is the sequential image structure inherent in the principle, which limits the image rate that can be achieved. This is mostly overcome by faster scanning of the excitation spot over the sample. However, this also reduces the dwell time of the excitation laser on the relevant image pixel. As a result, either the images become noisy because only a correspondingly fewer photons can be collected or the intensity of the excitation laser is increased in order to compensate for the loss of signal.

Wegen der starken Fokussierung des Lasers in die Probe werden im LSM sehr hohe Leistungsdichten erzeugt, mit denen die Probe beleuchtet wird. Das gilt insbesondere dann, wenn durch schnelleres Scannen auch noch die Bildrate maximiert werden soll. Sehr große Lichtdosen sind jedoch schädlich für die Proben und führen somit zu einem schnelleren Absterben der lebenden Probe (z.B. Unterbrechung der Zellteilung, sogenanntes freezing oder die Bildung von sogenannten blebs, siehe: S. Wäldchen et al.: Scientific Reports 5, Article number: 15348 (2015) [doi:10.1038/srep15348] ). Die Probe wird somit durch das genutzte Messinstrument massiv beeinflusst, so dass eine natürliche Beobachtung bestimmter Prozesse in der Probe mit einem LSM eigentlich nicht ohne weiteres möglich ist. Zumindest kann nicht in jedem Fall sichergestellt werden, dass die Messung nicht artefaktbehaftet ist. Bislang wurde bereits signifikante Forschungsarbeit in die Entwicklung probenschonender Beobachtungsmethoden investiert. Im Allgemeinen haben sich weitfeldbasierte Beobachtungsmethoden als sehr probenschonend herausgestellt. Die Schwierigkeit besteht dann darin, außerfokales Licht zu diskriminieren. Das wird in der Regel mit einer strukturierten Beleuchtung und anschließender Verrechnung der Bilddaten erreicht. Als Methoden haben sich dabei das Zeiss Apotome, das auf Basis eines Algorithmus, ähnlich dem von T. Wilson et al. (Opt. Lett. 22, p. 1905) , optische Schnitte im Weitfeld ermöglicht und die sogenannte Structured Illumination Microsopy (SIM) nach Gustafsson et al. (biophysj 94, p. 4957) , die neben dem optischen Schnitt auch noch eine Steigerung der Auflösung bringt, etabliert. Als Weitfeldmethoden liegt deren Nachteil jedoch in der begrenzten Eindringtiefe, in der sie noch funktionieren. Da das außerfokale Licht durch Verrechnung diskriminiert wird, überlagert es zunächst das eigentlich zu detektierende Signal auf dem Kamerasensor. Je dicker und dichter die Probe ist und je tiefer in die Probe hinein fokussiert werden soll, desto schlechter wird der Modulationskontrast des strukturierten Signals auf dem Sensor. Somit lässt sich mit zunehmender Probentiefe der Verrechnungsalgorithmus immer schlechter auf die akquirierten Daten anwenden. Das heißt, es kommt zu Verrechnungsartefakten.Due to the strong focus of the laser in the sample, very high power densities are generated in the LSM with which the sample is illuminated. This is especially true if the frame rate is to be maximized through faster scanning. However, very large doses of light are harmful to the samples and thus lead to faster death of the living sample (e.g. interruption of cell division, so-called freezing or the formation of so-called blebs, see: S. Wäldchen et al .: Scientific Reports 5, Article number: 15348 (2015) [doi: 10.1038 / srep15348] ). The sample is therefore massively influenced by the measuring instrument used, so that a natural observation of certain processes in the sample with an LSM is actually not easily possible. At least it cannot be ensured in every case that the measurement is not affected by artifacts. So far, significant research work has been invested in the development of observation methods that are gentle on samples. In general, wide-field-based observation methods have proven to be very gentle on the samples. The difficulty then is to discriminate extra-focal light. This is usually achieved with structured lighting and subsequent processing of the image data. The Zeiss Apotome, which is based on an algorithm similar to that of T. Wilson et al. (Opt. Lett. 22, p. 1905) , optical cuts in wide fields and the so-called Structured Illumination Microsopy (SIM) Gustafsson et al. (biophysj 94, p. 4957) , which, in addition to the optical cut, also brings an increase in resolution. As wide-field methods, however, their disadvantage is the limited penetration depth at which they still work. Since the extra-focal light is discriminated by offsetting, it initially superimposes the signal that is actually to be detected on the camera sensor. The thicker and denser the sample and the deeper it is to be focused into the sample, the worse the modulation contrast of the structured signal on the sensor. Thus, with increasing sample depth, it becomes increasingly difficult to apply the calculation algorithm to the acquired data. This means that billing artifacts occur.

Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop mit den oben angegebenen Merkmalen zu schaffen, bei dem verschiedene Mikroskopieverfahren durchgeführt werden können und außerdem leicht zwischen den verschiedenen Mikroskopieverfahren gewechselt werden kann. Außerdem soll ein variables Verfahren zur Mikroskopie angegeben werden.It can be seen as an object of the present invention to provide a microscope having the features indicated above, in which different microscopy methods can be carried out and, moreover, can easily be switched between the different microscopy methods. In addition, a variable method for microscopy is to be specified.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren zur Mikroskopie mit den Merkmalen des Anspruchs 23 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops und vorteilhafte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den abhängigen Ansprüchen und den Figuren, beschrieben.According to the invention, this object is achieved by a microscope having the features of claim 1 and by the method for microscopy having the features of claim 23. Preferred embodiments of the microscope according to the invention and advantageous variants of the method according to the invention are described below, in particular in connection with the dependent claims and the figures.

Das oben angegebene Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch dadurch gekennzeichnet, dass eine Zylinderoptik wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von der ersten Ablenkeinheit positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist und dass eine zweidimensionale periodische Blendenanordnung wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der ersten Ablenkeinheit und der zweiten Ablenkeinheit positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist.According to the invention, the above-mentioned microscope is characterized in that cylinder optics can optionally be positioned in the illuminating beam path upstream of the first deflection unit or removed from the illuminating beam path, and that a two-dimensional periodic diaphragm arrangement can either be positioned or off in the illuminating beam path between the first deflecting unit and the second deflecting unit can be removed from the illumination beam path.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Mikroskopie wird ein erfindungsgemäßes Mikroskop verwendet.A microscope according to the invention is used in the method according to the invention for microscopy.

Mit dem Begriff Licht wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung elektromagnetische Strahlung desjenigen Wellenlängenbereichs bezeichnet, der in der Mikroskopie einerseits typischerweise zur Beleuchtung oder Anregung (Anregungslicht) einer Probe zum Einsatz kommt und andererseits typischerweise von Proben zurückgestrahlt wird (Detektionslicht, Fluoreszenzlicht). Insbesondere wird unter dem Begriff Licht Infrarot-Licht, sichtbares Licht und Ultraviolett-Licht verstanden.In the context of the present description, the term light refers to electromagnetic radiation of the wavelength range that is typically used in microscopy on the one hand to illuminate or excite (excitation light) a sample and on the other hand is typically reflected back by samples (detection light, fluorescent light). In particular, the term light is understood to mean infrared light, visible light and ultraviolet light.

Das erfindungsgemäße Mikroskop eignet sich grundsätzlich für unterschiedliche optische Kontrastmechanismen. Typischerweise wird von einer Probe zurückgestrahltes Fluoreszenzlicht gemessen. Es kann sich dabei um einfache Fluoreszenz, aber auch um 2- oder 3-Photonen-Fluoreszenz handeln. Die Bildgebung kann aber auch aufgrund von anderen nichtlinearen Prozessen, wie zum Beispiel CARS, erfolgen.The microscope according to the invention is basically suitable for different optical contrast mechanisms. Fluorescent light reflected back from a sample is typically measured. It can be simple fluorescence, but also 2- or 3-photon fluorescence. However, the imaging can also take place on the basis of other non-linear processes, such as CARS, for example.

Als Lichtquelle können im Prinzip bekannte Quellen zum Einsatz kommen, welche das Licht in dem gewünschten Wellenlängenbereich mit der gewünschten Intensität bereitstellen. Typischerweise werden Laser verwendet.In principle, known sources which provide the light in the desired wavelength range with the desired intensity can be used as the light source. Lasers are typically used.

Als Beleuchtungsstrahlengang wird derjenige Strahlweg bezeichnet, über den das von der verwendeten Lichtquelle bereitgestellte Anregungslicht bis zur Objektebene geleitet wird.The beam path through which the excitation light provided by the light source used is directed to the object plane is referred to as the illumination beam path.

Als Detektionsstrahlengang wird derjenige Strahlweg bezeichnet, über den das von der Probe in der Objektebene abgestrahlte Licht zu einer Kamera oder einem Detektor geleitet wird.The beam path through which the light emitted by the sample in the object plane is directed to a camera or a detector is referred to as the detection beam path.

Zum Leiten des Anregungslichts und des von der Probe abgestrahlten Lichts können dabei strahlführende Komponenten, beispielsweise brechende, beugende und/oder reflektierende Komponenten, insbesondere Linsen und Spiegel, vorhanden sein.To guide the excitation light and the light emitted by the sample, beam-guiding components, for example refractive, diffractive and / or reflective components, in particular lenses and mirrors, can be present.

Der Beleuchtungsstrahlengang beinhaltet insbesondere ein Mikroskopobjektiv mit einer objektseitigen Brennebene, die als Objektebene bezeichnet wird, und einer rückwärtigen Brennebene, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung als Pupillenebene oder Objektivpupille bezeichnet wird.The illumination beam path contains, in particular, a microscope objective with an object-side focal plane, which is referred to as the object plane, and a rear focal plane, which is referred to in the context of the present description as the pupil plane or objective pupil.

Die Komponenten, mit denen das Beleuchtungslicht und das Detektionslicht geführt und geleitet werden, können teilweise dieselben sein. Insbesondere kann das Mikroskopobjektiv des Beleuchtungsstrahlengangs auch Teil des Detektionsstrahlengangs sein. Der Detektionsstrahlengang kann auch ein separates, eigenes Mikroskopobjektiv aufweisen.The components with which the illuminating light and the detection light are guided and guided can in part be the same. In particular, the microscope objective of the illumination beam path can also be part of the detection beam path. The detection beam path can also have a separate, separate microscope objective.

Die Probe kann insbesondere eine biologische, gegebenenfalls auch eine lebende biologische Probe, sein. Typischerweise ist die Probe mit geeigneten Fluoreszenzfarbstoffe präpariert.The sample can in particular be a biological, possibly also a living biological sample. Typically the sample is prepared with suitable fluorescent dyes.

Unter einer Kamera wird für die vorliegende Beschreibung eine Einrichtung verstanden, bei der ein bestimmtes Sehfeld nachgewiesen wird. Insbesondere kann eine Kamera einen zweidimensional segmentierten Detektor-Chip aufweisen. Beispielsweise kann eine sCMOS- Kamera zum Einsatz kommen. Als Detektoren zum Nachweis des von der Probe abgestrahlten Lichts können grundsätzlich bekannte Komponenten, beispielsweise PMTs (Photo Multiplier Tube), Photodioden, beispielsweise SPADs, (Single Photon Avalanche Diode) verwendet werden.For the present description, a camera is understood to mean a device in which a specific field of view is detected. In particular, a camera can have a two-dimensionally segmented detector chip. For example, an sCMOS camera can be used. Basically known components, for example PMTs (Photo Multiplier Tube), photodiodes, for example SPADs (Single Photon Avalanche Diode) can be used as detectors for detecting the light emitted by the sample.

Als Scaneinrichtung wird diejenige Komponente bezeichnet, mit der das Anregungslicht, insbesondere fokussiert oder jedenfalls in einer gewünschten Weise räumlich konditioniert, über eine Probe geführt wird. In diesem Sinn wird unter dem Scannen des Anregungslichts in der Objektebene das definierte und kontrollierte Führen, beispielsweise eines Fokalpunkts oder mehrerer Fokalpunkte oder eines Beleuchtungsmusters, in einer Objektebene und damit über eine Probe verstanden.The scanning device denotes that component with which the excitation light, in particular focused or at least spatially conditioned in a desired manner, is guided over a sample. In this sense, the scanning of the excitation light in the object plane is understood to mean the defined and controlled guiding, for example of a focal point or several focal points or an illumination pattern, in an object plane and thus over a sample.

Die erste und die zweite Ablenkeinheit sind diejenigen Komponenten, mit denen das eigentliche Ablenken des Anregungslichts in einer ersten beziehungsweise zweiten Koordinatenrichtung bewerkstelligt wirdThe first and the second deflection unit are those components with which the actual deflection of the excitation light is accomplished in a first or second coordinate direction

Die erste Ablenkeinheit und/oder die zweite Ablenkeinheit können insbesondere durch Scannerspiegel, beispielsweise durch galvanometrische Scanner, gebildet sein. Grundsätzlich sind aber auch andere Möglichkeiten der räumlichen Strahlmanipulation, beispielsweise mit akusto-optischen Komponenten, denkbar. Besonders bevorzugt werden die erste Ablenkeinheit und die zweite Ablenkeinheit in zueinander optisch konjugierten Positionen angeordnet. Mit den Begriffen strahlabwärts und strahlaufwärts werden in dieser Beschreibung relative Anordnungen von bestimmten Komponenten im Strahlweg bezogen auf eine Strahlrichtung beschrieben. Wenn dabei eine Komponente A im Strahlengang strahlabwärts von einer Komponente B angeordnet ist, bedeutet das, dass der Strahl zuerst die Komponente B durchläuft oder passiert, bevor er zu Komponente A gelangt. Umgekehrt ist es, wenn A im Strahlengang strahlaufwärts von B positioniert ist.The first deflection unit and / or the second deflection unit can in particular be formed by scanner mirrors, for example by galvanometric scanners. In principle, however, other possibilities of spatial beam manipulation, for example with acousto-optical components, are also conceivable. The first deflection unit and the second deflection unit in mutually optically conjugate positions are particularly preferred arranged. The terms downstream and upstream are used in this description to describe relative arrangements of certain components in the beam path with reference to a beam direction. If a component A is arranged in the beam path downstream from a component B, this means that the beam first passes through or passes through component B before it reaches component A. It is the other way round when A is positioned in the beam path upstream from B.

Als Zylinderoptik wird eine strahlmanipulierende optische Einrichtung verstanden, bei der sich eine räumliche Strahlmanipulation für zwei verschiedene und zueinander senkrechte Koordinatenrichtungen quantitativ unterscheidet.Cylinder optics is understood to be a beam-manipulating optical device in which a spatial beam manipulation differs quantitatively for two different coordinate directions that are perpendicular to one another.

Unter einer periodischen zweidimensionalen Blendenanordnung wird für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung eine Komponente mit einer Vielzahl von Blenden, insbesondere Lochblenden, verstanden, wobei sich die Mittelpunkte der Lochblenden auf einem zweidimensionalen periodischen Gitter befinden.For the purposes of the present description, a periodic two-dimensional diaphragm arrangement is understood to mean a component with a plurality of diaphragms, in particular perforated diaphragms, the center points of the perforated diaphragms being located on a two-dimensional periodic grid.

Wenn in der vorliegenden Beschreibung davon die Rede ist, dass eine Komponente in dem Strahlengang, insbesondere dem Beleuchtungsstrahlengang, positionierbar ist und aus dem Strahlengang entfernbar ist, soll das bedeuteten, dass geeignete Einrichtungen zur mechanischen Halterung und zur mechanischen räumlichen Manipulation der betreffenden Komponente vorhanden sind. Diese Einrichtungen zur mechanischen räumlichen Manipulation können im Prinzip manuell betätigbar sein. Besonders bevorzugt sind diese Einrichtungen aber elektromechanischer Natur, sodass die Komponenten (Zylinderoptik, periodische Blendenanordnung) durch eine Steuerung in den Strahlengang/den Beleuchtungsstrahlengang eingeführt, beispielsweise eingeschoben und/oder eingeschwenkt, und ebenso aus dem Strahlengang/dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt werden, beispielsweise herausgeschoben und/oder herausgeschwenkt, werden können.If in the present description it is mentioned that a component can be positioned in the beam path, in particular the illumination beam path, and can be removed from the beam path, this is intended to mean that suitable devices for mechanical mounting and mechanical spatial manipulation of the component concerned are available . These devices for mechanical spatial manipulation can in principle be actuated manually. However, these devices are particularly preferably of an electromechanical nature, so that the components (cylinder optics, periodic diaphragm arrangement) are introduced into the beam path / the illumination beam path by a controller, for example pushed in and / or pivoted in, and also removed from the beam path / the illumination beam path, for example pushed out and / or can be swiveled out.

Die vorliegende Erfindung hat erkannt, dass bei einer Scaneinrichtung der in DE 10 2014 017 001 A1 beschriebenen Art der Raum zwischen den beiden Scaneinheiten, insbesondere eine dort gebildete Zwischenbildebene, zur räumlichen Strukturierung des Anregungslichts genutzt werden kann. Außerdem hat die vorliegende Erfindung erkannt, dass das räumlich strukturierte Anregungslicht mithilfe eines Scanners besonders rasch in einer Objektebene verschoben werden kann.The present invention has recognized that in a scanning device in DE 10 2014 017 001 A1 described type of space between the two scanning units, in particular an intermediate image plane formed there, can be used for the spatial structuring of the excitation light. In addition, the present invention has recognized that the spatially structured excitation light can be shifted particularly quickly in an object plane with the aid of a scanner.

Als wesentliche Idee der vorliegenden Erfindung kann also erachtet werden, bei einer Scaneinrichtung, bei der die Ablenkung in zwei verschiedenen Koordinatenrichtungen mithilfe von zwei unterschiedlichen und räumlich getrennten Ablenkeinheiten erfolgt, das Anregungslicht mithilfe einer zwischen den beiden Ablenkeinheiten positionierten geeigneten Komponente, wie beispielsweise einer zweidimensionalen periodischen Blendenanordnung, zu strukturieren. Mithilfe der sich im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Blendenanordnung befindenden Ablenkeinheit kann die Beleuchtungsstruktur sodann in der Objektebene linear verschoben werden.In a scanning device in which the deflection takes place in two different coordinate directions with the aid of two different and spatially separated deflection units, the excitation light with the aid of a suitable component positioned between the two deflection units, such as a two-dimensional periodic component, can therefore be regarded as an essential idea of the present invention Aperture arrangement to structure. With the aid of the deflection unit located in the illumination beam path downstream from the diaphragm arrangement, the illumination structure can then be shifted linearly in the object plane.

Als ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung kann erachtet werden, dass eine zusätzliche Betriebsart zum konfokalen Punktscan ermöglicht wird, die eine Untersuchung der Probe mit einer optischen Auflösung oberhalb der klassischen Beugungsbegrenzung erlaubt, wobei dieses im Vergleich zu einem Weitfeldsystem mit strukturierten Beleuchtung auch für optisch dickere Proben möglich ist. Außerdem wird erreicht, dass dieser Modus hoch parallelisiert ist, so dass die Probe weitgehend geschont werden kann.An essential advantage of the present invention can be seen in the fact that an additional operating mode to the confocal point scan is made possible, which allows an examination of the sample with an optical resolution above the classic diffraction limit, this also for optically thicker ones compared to a wide-field system with structured illumination Rehearsals is possible. What is also achieved is that this mode is highly parallelized, so that the sample can be largely protected.

Die vorliegende Erfindung kombiniert also vorteilhafte Eigenschaften der konfokalen und der Weifeldmikroskopie, insbesondere mit strukturierter Beleuchtung. Über Konfokalität von Detektion und Beleuchtung wird die Auflösungsverbesserung eines SIM-Mikroskops auf deutlich größere Eindringtiefen erweitert, da außerfokales Licht vor dessen Detektion diskriminiert wird. Darüber hinaus wird die Probenbelastung gegenüber einem klassischen Laser-Scanning-Mikroskop deutlich verringert. Die Bildraten für SIM sind bei der vorliegenden Erfindung auf ein Drittel der Bildraten der verwendeten Kamera begrenzt.The present invention thus combines advantageous properties of confocal and white field microscopy, in particular with structured illumination. Confocality of detection and illumination extends the resolution improvement of a SIM microscope to significantly greater penetration depths, since extra-focal light is discriminated before it is detected. In addition, the sample load is significantly reduced compared to a classic laser scanning microscope. The frame rates for SIM are limited in the present invention to a third of the frame rates of the camera used.

Besonders bevorzugt sind die erste Ablenkeinheit und die zweite Ablenkeinheit jeweils in Ebenen angeordnet sind, die zur hinteren Brennebene eines Mikroskopobjektivs optisch konjugiert sind (Pupillenebenen).Die Komponenten der Scaneinrichtung sind bevorzugt so dimensioniert und zueinander angeordnet wie in DE 10 2014 017 001 A1 beschrieben, auf deren Inhalte insoweit verwiesen wird. Insbesondere ist eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops bevorzugt, bei der die Scaneinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit und der zweiten Ablenkeinheit eine Scanoptik zum Bereitstellen einer Pupillenebene aufweist. In dieser Pupillenebene kann dann zweckmäßig die zweite Ablenkeinheit angeordnet werden. Die Scanoptik wird auch als Scanobjektiv bezeichnet.The first deflection unit and the second deflection unit are particularly preferably arranged in planes which are optically conjugate to the rear focal plane of a microscope objective (pupil planes). The components of the scanning device are preferably dimensioned and arranged in relation to one another as in DE 10 2014 017 001 A1 described, the content of which is referred to. In particular, an embodiment of the microscope according to the invention is preferred in which the scanning device in the illumination beam path has scanning optics for providing a pupil plane downstream of the first deflection unit and the second deflection unit. The second deflection unit can then expediently be arranged in this pupil plane. The scan optics are also known as the scan lens.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist zwischen der ersten Ablenkeinheit und der zweiten Ablenkeinheit eine Abbildungsoptik vorhanden, welche die erste Ablenkeinheit auf die zweite Ablenkeinheit abbildet.In a further advantageous embodiment of the microscope according to the invention, imaging optics are present between the first deflection unit and the second deflection unit the first deflection unit images onto the second deflection unit.

Diese Abbildungsoptik kann grundsätzlich Linsen oder eine Kombination von Linsen aufweisen. Besonders bevorzugt wird die Abbildungsoptik aber durch einen Hohlspiegel, insbesondere sphärischen, oder torischen, Hohlspiegel gebildet. Zur konkreten Dimensionierung und Anordnung einer solchen Abbildungsoptik mit einem Hohlspiegel sowie zu deren vorteilhaften Eigenschaften wird wiederum verwiesen auf DE 10 2014 017 001 A1 .These imaging optics can in principle have lenses or a combination of lenses. The imaging optics are particularly preferably formed by a concave mirror, in particular a spherical or toric concave mirror. For the specific dimensioning and arrangement of such an imaging optics with a concave mirror and for their advantageous properties, reference is again made to DE 10 2014 017 001 A1 .

Die oben beschriebenen Vorteile kommen in besonderer Weise bei Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Mikroskops zum Tragen, bei denen die periodische Blendenanordnung an einer Position eines Zwischenbilds in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar ist. Das bedeutet, dass die periodische Blendenanordnung in die Objektebene abgebildet wird.The advantages described above are particularly effective in exemplary embodiments of the microscope according to the invention in which the periodic diaphragm arrangement can be introduced into the illumination beam path at a position of an intermediate image. This means that the periodic diaphragm arrangement is imaged in the object plane.

In diesem Zusammenhang ist eine vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemäßen Mikroskops dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik ein erstes Zwischenbild gebildet ist, welches die Scanoptik in ein, insbesondere gekrümmtes, zweites Zwischenbild abbildet, wobei das zweite Zwischenbild zwischen der zweiten Ablenkeinheit und der Abbildungsoptik liegt, und dass die Abbildungsoptik dergestalt angeordnet ist, dass sie ein von der ersten Ablenkeinheit kommendes kollimiertes Strahlenbündel in das zweite Zwischenbild fokussiert.Eine alternativen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist dadurch gekennzeichnet, dass Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik wieder ein erstes Zwischenbild gebildet ist, dass die Scanoptik Licht aus dem ersten Zwischenbild in ein kollimiertes Strahlenbündel überführt und dass die Abbildungsoptik dergestalt angeordnet ist, dass sie das von der zweiten Ablenkeinheit kommende kollimierte Strahlenbündel in ein zweites Zwischenbild fokussiert, welches zwischen der Abbildungsoptik und der ersten Ablenkeinheit liegt.In this context, an advantageous further development of the microscope according to the invention is characterized in that a first intermediate image is formed in the illumination beam path downstream of the scanning optics, which the scanning optics images in a, in particular curved, second intermediate image, the second intermediate image between the second deflection unit and the imaging optics and that the imaging optics are arranged in such a way that they focus a collimated beam coming from the first deflection unit into the second intermediate image. An alternative embodiment of the microscope according to the invention is characterized in that a first intermediate image is again formed downstream from the scanning optics the scanning optics converts light from the first intermediate image into a collimated beam, and the imaging optics are arranged in such a way that they capture the collimated beams coming from the second deflection unit The bundle is focused into a second intermediate image, which lies between the imaging optics and the first deflection unit.

Im ersten Fall befindet sich also das zweite Zwischenbild zwischen der der zweiten Ablenkeinheit und der Abbildungsoptik und im zweiten Fall befindet sich das zweite Zwischenbild zwischen der Abbildungsoptik und der ersten Ablenkeinheit.In the first case, the second intermediate image is located between the second deflection unit and the imaging optics and in the second case the second intermediate image is located between the imaging optics and the first deflection unit.

Bevorzugt ist in beiden Fällen, dass die periodische Blendenanordnung an der Position des zweiten Zwischenbilds in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar ist. Die Abbildung des zweidimensionalen Punktmusters in die Objektebene kann noch weiter verbessert werden bei einer Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops, bei der sich die periodische Blendenanordnung auf einer gewölbten Fläche, insbesondere einer Kugelfläche, befindet, wobei die Krümmung der gewölbten Fläche gleich oder näherungsweise gleich ist wie die Krümmung des zweiten Zwischenbilds. Die periodische Blendenanordnung kann bevorzugt gebildet sein durch eine, insbesondere lithographische hergestellte, Lochblendenmatrix.Zum Durchführen des von Schropp et al. beschriebenen Verfahrens ( M. Schropp et al.: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23 -36 ) sind die Löcher der Lochblendenmatrix auf den Positionen eines zweidimensionalen hexagonalen oder quadratischen Gitters positioniert. Die Löcher der Lochblendenmatrix weisen bevorzugt einen Durchmesser von 0,5 bis 1,5 mal dem Durchmesser eines Airyscheibchens auf. Dadurch kann ein optimaler Modulationskontrast nach Abbildung des Punktmusters in die Probe erreicht werden. Dir relevanten Parameter für die Berechnung des Durchmessers eines Airyscheibchens sind dabei die Wellenlänge des verwendeten Anregungslichts und die numerische Apertur der Abbildungsoptik, welche das zweite Zwischenbild erzeugt.In both cases, it is preferred that the periodic diaphragm arrangement can be introduced into the illumination beam path at the position of the second intermediate image. The mapping of the two-dimensional point pattern in the object plane can be improved even further in a variant of the microscope according to the invention, in which the periodic diaphragm arrangement is located on a curved surface, in particular a spherical surface, the curvature of the curved surface being the same or approximately the same as that Curvature of the second intermediate image. The periodic diaphragm arrangement can preferably be formed by a, in particular lithographically produced, aperture diaphragm matrix. To carry out the process described by Schropp et al. described procedure ( M. Schropp et al .: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23 -36 ) the holes of the pinhole matrix are positioned on the positions of a two-dimensional hexagonal or square grid. The holes of the perforated diaphragm matrix preferably have a diameter of 0.5 to 1.5 times the diameter of an Airy disc. As a result, an optimal modulation contrast can be achieved after imaging the point pattern in the sample. The relevant parameters for calculating the diameter of an Airy disc are the wavelength of the excitation light used and the numerical aperture of the imaging optics that generate the second intermediate image.

Für Zylinderoptik kommt es im Prinzip darauf an, dass sie eine Fokussierung in der zweiten Zwischenbildebene in einer Koordinatenrichtung mindestens teilweise aufhebt. Beispielsweise kann die Zylinderoptik mindestens eine Zylinderlinse oder einen zylindrischen Hohlspiegel aufweisen. Bei bevorzugten Varianten des erfindungsgemäßen Mikroskops kann die Zylinderoptik in einem kollimierten Teil des Beleuchtungsstrahlengangs positioniert werden. Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops ist die erste Ablenkeinheit zum variablen Ablenken des Anregungslichts in einer Richtung quer, insbesondere senkrecht, zu der Koordinatenrichtung, in welcher durch die Zylinderoptik die Fokussierung mindestens teilweise aufgehoben ist, eingerichtet. Ein durch die Wirkung der Zylinderoptik in der zweiten Zwischenbildebene gebildeter Linienfokus kann somit mit der ersten Ablenkeinheit quer, insbesondere senkrecht, zu einer Erstreckungsrichtung des Linienfokus in der zweiten Zwischenbildebene und damit auch in der Objektebene bewegt werden.For cylinder optics, it is fundamentally important that they at least partially cancel a focus in the second intermediate image plane in one coordinate direction. For example, the cylinder optics can have at least one cylinder lens or a cylindrical concave mirror. In preferred variants of the microscope according to the invention, the cylinder optics can be positioned in a collimated part of the illumination beam path. In a preferred variant of the microscope according to the invention, the first deflection unit is set up for the variable deflection of the excitation light in a direction transverse, in particular perpendicular, to the coordinate direction in which the focusing is at least partially canceled by the cylinder optics. A line focus formed by the action of the cylinder optics in the second intermediate image plane can thus be moved with the first deflection unit transversely, in particular perpendicularly, to a direction of extension of the line focus in the second intermediate image plane and thus also in the object plane.

Zum Durchführen von konfokalen Mikroskopieverfahren kann in dem Detektionsstrahlengang, insbesondere in einem descannten Teil, ein Detektor mit einer konfokalen Loch- oder Schlitzblende vorhanden sein. Eine konfokale Loch- oder Schlitzblende ist wegen der inhärenten Lokalisierung der Anregung bei der 2-Photonen- oder 3-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie nicht unbedingt notwendig. Für SIM-Verfahren und für Verfahren zur schnellen konfokalen Mikroskopie sind Ausgestaltungen bevorzugt, bei denen im Detektionsstrahlengang strahlabwärts von einem Farbteiler zum räumlichen Trennen von Anregungslicht und von einer Probe abgestrahltem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, eine Kamera vorhanden ist. Beispielsweise kann die Kamera eine sCMOS-Kamera sein, d.h. sie kann einen sCMOS Chip aufweisen. Besonders bevorzugt ist für konfokale SIM-Verfahren und für Verfahren zur schnellen konfokalen Mikroskopie außerdem, wenn die Kamera einen, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschluss aufweist, der als konfokale Blende dienen kann.To carry out confocal microscopy methods, a detector with a confocal pinhole or slit diaphragm can be present in the detection beam path, in particular in a descanned part. A confocal pinhole or slit diaphragm is not absolutely necessary because of the inherent localization of the excitation in 2-photon or 3-photon fluorescence microscopy. For SIM methods and for methods for fast confocal microscopy, embodiments are preferred in which in the detection beam path downstream from a color splitter for spatial separation of excitation light and light emitted from a sample, in particular fluorescent light, a camera is available. For example, the camera can be an sCMOS camera, ie it can have an sCMOS chip. For confocal SIM methods and for methods for fast confocal microscopy, it is also particularly preferred if the camera has an, in particular electronic, slit shutter that can serve as a confocal shutter.

Außerdem kann eine Steuereinrichtung vorhanden sein zum zueinander synchronisierten, insbesondere periodischen, Ansteuern der ersten Ablenkeinheit und eines, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschlusses der Kamera. Das erfindungsgemäße Mikroskop ermöglicht insbesondere eine vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen, bei dem zum Durchführen von SI-Mikroskopie die Zylinderoptik und die periodische Blendenanordnung im Beleuchtungsstrahlengang positioniert werden, ein durch die periodische Blendenanordnung erzeugtes Punktmuster in die Objektebene abgebildet wird, mit der Zylinderoptik ein Linienfokus erzeugt wird, der mit der ersten Ablenkeinheit über die periodische Blendenanordnung gescannt wird, die für die SI-Mikroskopie notwendige Phasenverschiebung des Punktmusters in der Objektebene mit der zweiten Ablenkeinheit erzeugt wird, mit einer Kamera mindestens drei Teilbilder mit unterschiedlicher Phasenlage des Punktmusters aufgenommen werden und die drei Teilbilder miteinander verrechnet werden. Im Vergleich zum Stand der Technik können substantielle Vorteile erreicht werden, weil die Verschiebung des Punktmusters in der Probenebene mit der Scaneinheit, insbesondere einem galvanischen Scanner, besonders schnell durchgeführt werden kann. Besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang, wenn die Kamera einen, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschluss aufweist, der synchronisiert mit der ersten Ablenkeinheit angesteuert wird.Weitere vorteilhafte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch Betätigung der zweiten Ablenkeinheit ermöglicht. Beispielsweise kann mit der zweiten Ablenkeinheit ein beleuchteter Bereich der Probe innerhalb eines Sehfelds der Kamera verschoben verschoben werden (Panning).In addition, a control device can be provided for the synchronized, in particular periodic, control of the first deflection unit and an, in particular electronic, slit shutter of the camera. The microscope according to the invention enables in particular an advantageous variant of the according to the invention, in which the cylinder optics and the periodic diaphragm arrangement are positioned in the illumination beam path for performing SI microscopy, a point pattern generated by the periodic diaphragm arrangement is imaged in the object plane, with the cylinder optics a line focus is generated , which is scanned with the first deflection unit over the periodic aperture arrangement, the phase shift of the point pattern in the object plane necessary for SI microscopy is generated with the second deflection unit, at least three partial images with different phase positions of the point pattern are recorded with a camera and the three partial images be offset against each other. Compared to the prior art, substantial advantages can be achieved because the displacement of the point pattern in the sample plane can be carried out particularly quickly with the scanning unit, in particular a galvanic scanner. In this context, it is particularly preferred if the camera has an, in particular electronic, slit shutter, which is controlled synchronized with the first deflection unit. Further advantageous variants of the method according to the invention are made possible by operating the second deflection unit. For example, the second deflection unit can be used to displace an illuminated area of the sample within a field of view of the camera (panning).

Das erfindungsgemäße Mikroskop eignet sich auch für die konventionelle Laser-Scanning-Mikroskopie. Hierzu werden die Zylinderoptik und die periodische Blendenanordnung aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt und dass von der Probe abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, wird mit dem Detektor nachgewiesen wird, wobei vor dem Detektor eine konfokale Lochblende angeordnet sein kann. Im Fall der 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie oder 3-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie ist eine konfokale Lochblende nicht unbedingt notwendig. Bei einer weiteren vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann schnelle konfokale Mikroskopie mit einem Linienfokus durchgeführt werden. Hierzu wird die Zylinderoptik im Beleuchtungsstrahlengang positioniert, die periodische Blendenanordnung aber aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt und das von der Probe abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, wird mit dem Detektor nachgewiesen wird, wobei vor dem Detektor eine konfokale Schlitzblende angeordnet sein kann, oder das von der Probe abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, mit der Kamera nachgewiesen wird, wobei ein, insbesondere elektronischer, Schlitzblendenverschluss der Kamera als konfokale Schlitzblende wirken kann. Wie im Fall der konventionellen konfokalen Laser-Scannen-Mikroskopie ist im Fall der im Fall der 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie oder 3-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie ist eine konfokale Blende vor dem Detektor oder der Kamera nicht unbedingt notwendig.Weitere Vorteile und Merkmale eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Mikroskops sowie von Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Folgenden im Zusammenhang mit den beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Darin zeigen:

  • 1: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Mikroskops und
  • 2: eine schematische Darstellung einer periodischen Blendenanordnung zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Mikroskop.
The microscope according to the invention is also suitable for conventional laser scanning microscopy. For this purpose, the cylinder optics and the periodic diaphragm arrangement are removed from the illumination beam path and that light emitted by the sample, in particular fluorescent light, is detected with the detector, a confocal aperture diaphragm being arranged in front of the detector. In the case of 2-photon fluorescence microscopy or 3-photon fluorescence microscopy, a confocal pinhole is not absolutely necessary. In a further advantageous variant of the method according to the invention, rapid confocal microscopy can be carried out with a line focus. For this purpose, the cylinder optics are positioned in the illumination beam path, but the periodic diaphragm arrangement is removed from the illumination beam path and the light emitted by the sample, especially fluorescent light, is detected with the detector, whereby a confocal slit diaphragm can be arranged in front of the detector, or that of the sample emitted light, in particular fluorescent light, is detected with the camera, wherein an, in particular electronic, slit shutter of the camera can act as a confocal slit shutter. As in the case of conventional confocal laser scanning microscopy, in the case of 2-photon fluorescence microscopy or 3-photon fluorescence microscopy, a confocal aperture in front of the detector or camera is not absolutely necessary. Other advantages and features of a Exemplary embodiments of the microscope according to the invention and variants of the method according to the invention are described below in connection with the accompanying schematic figures. Show in it:
  • 1 : a schematic representation of an embodiment of the microscope according to the invention and
  • 2 : a schematic representation of a periodic diaphragm arrangement for use in a microscope according to the invention.

Das in 1 schematisch gezeigte erfindungsgemäße System beinhaltet im Wesentlichen einen im Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs und der Scaneinrichtung modifizierten Aufbau der in DE 10 2014 017 001 A1 beschriebenen Art. Die Modifikation besteht aus zwei in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbaren Komponenten, nämlich der Zylinderoptik 20 und der periodischen Blendenanordnung 40. Die periodische Blendenanordnung 40 kann auch als Blendenstruktur bezeichnet werden.This in 1 The system according to the invention shown schematically essentially comprises a structure modified in the area of the illumination beam path and the scanning device of the structure shown in FIG DE 10 2014 017 001 A1 The modification consists of two components that can be introduced into the illumination beam path, namely the cylinder optics 20th and the periodic aperture arrangement 40 . The periodic diaphragm arrangement 40 can also be referred to as a diaphragm structure.

2 zeigt eine schematische Darstellung einer hexagonalen Lochblendenmatrix 40, bei der sich die einzelnen Löcher oder Lochblenden 45 an den Positionen eines zweidimensionalen hexagonalen Gitters befinden, wie sie durch Schropp et al. inspiriert ist (siehe Schropp et al: Photonics 2017, 4, 33 ). Möglich wäre gemäß Schropp et al. auch eine Anordnung der Löcher oder Lochblenden 45 an den Positionen eines zweidimensionalen quadratischen Gitters. Schropp et al. haben bereits gezeigt, dass ein solches strukturiertes Muster dazu geeignet ist, durch nur einen Scan in einer Richtung eine Auflösungserhöhung zu erzielen. Die in dem Kasten 100 zusammengefassten Komponenten können auch als Scankopf bezeichnet werden. Die in dem Kasten 200 zusammengefassten Komponenten können auch als Mikroskopstativ bezeichnet werden. Im Einzelnen:

  • Das in 1 schematisch dargestellte Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 300 weist als wesentliche Bestandteile eine Lichtquelle 10 zum Bereitstellen von Anregungslicht 12, einen Beleuchtungsstrahlengang, einen Detektionsstrahlengang und eine Scaneinrichtung 41, 43, 44 zum Scannen des Anregungslichts 12 in einer Objektebene 61 auf. Der Beleuchtungsstrahlengang dient zum Leiten des Anregungslichts 12 in eine Objektebene 61, in der eine Probe 60 angeordnet ist. Die Objektebene 61 liegt in einer Brennebene eines Mikroskopobjektiv 62, welches Bestandteil des Beleuchtungsstrahlengangs ist. Der Detektionsstrahlengang dient zum Leiten von von der Probe 60 in der Objektebene 61 abgestrahltem Licht, insbesondere von Fluoreszenzlicht 66, auf eine Kamera 70 oder einen Detektor 74. Die Scaneinrichtung weist eine erste Ablenkeinheit 41 zum Ablenken des Anregungslichts 12 in einer ersten Koordinatenrichtung x und eine zweite Ablenkeinheit 43 zum Ablenken des Anregungslichts 12 in einer zweiten Koordinatenrichtung y auf. Die zweite Ablenkeinheit 43 ist im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit 41 angeordnet. Die erste Ablenkeinheit 41 und/oder die zweite Ablenkeinheit 43 ist beziehungsweise sind bevorzugt durch, insbesondere galvanometrische, Scannerspiegel gebildet.
2 shows a schematic representation of a hexagonal pinhole matrix 40 , in which the individual holes or pinholes 45 are at the positions of a two-dimensional hexagonal grid as described by Schropp et al. is inspired (see Schropp et al: Photonics 2017, 4, 33 ). According to Schropp et al. also an arrangement of the holes or pinholes 45 at the positions of a two-dimensional square grid. Schropp et al. have already shown that such a structured pattern is suitable for achieving an increase in resolution with just one scan in one direction. The one in the box 100 combined components can also be referred to as a scan head. The one in the box 200 combined components can also be referred to as a microscope stand. In detail:
  • This in 1 schematically illustrated embodiment of a microscope according to the invention 300 has a light source as essential components 10 for providing excitation light 12 , an illumination beam path, a detection beam path and a scanning device 41 , 43 , 44 for scanning the excitation light 12 in one object level 61 on. The illumination beam path is used to guide the excitation light 12 in an object level 61 , in which a sample 60 is arranged. The object level 61 lies in a focal plane of a microscope objective 62 which is part of the illumination beam path. The detection beam path is used to guide the sample 60 in the object level 61 emitted light, especially fluorescent light 66 , on a camera 70 or a detector 74 . The scanning device has a first deflection unit 41 for deflecting the excitation light 12 in a first coordinate direction x and a second deflector 43 for deflecting the excitation light 12 in a second coordinate direction y on. The second deflection unit 43 is in the illuminating beam path down the beam from the first deflection unit 41 arranged. The first deflection unit 41 and / or the second deflection unit 43 is or are preferably formed by, in particular galvanometric, scanner mirrors.

Die Ablenkeinheit 41 und die zweite Ablenkeinheit 43 sind in dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel jeweils in Ebenen PE1, PE2 angeordnet, die zu einer hinteren Brennebene 63 des Mikroskopobjektivs 62 optisch konjugiert sind. Die Ebenen PE1 und PE2 werden als Pupillenebenen bezeichnet.The deflection unit 41 and the second deflector 43 are in the in 1 Embodiment shown in each case in planes PE1 , PE2 arranged leading to a back focal plane 63 of the microscope objective 62 are optically conjugated. The levels PE1 and PE2 are called pupil planes.

In dem gezeigten Ausführungsbeispiel weist die Scaneinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit 41 und der zweiten Ablenkeinheit 43 außerdem eine Scanoptik 44 auf, durch welche die Pupillenebene PE1 bereitgestellt wird. Die Scanoptik 44 kann auch als Scanobjektiv bezeichnet werden.In the exemplary embodiment shown, the scanning device points in the illumination beam path downstream from the first deflection unit 41 and the second deflector 43 also a scan optics 44 on through which the pupil plane PE1 provided. The scanning optics 44 can also be referred to as a scanning lens.

Weiterhin ist bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel zwischen der ersten Ablenkeinheit 41 und der zweiten Ablenkeinheit 43 eine Abbildungsoptik 42 vorhanden ist, welche die erste Ablenkeinheit 41 auf die zweite Ablenkeinheit 43 abbildet. Die Abbildungsoptik 42 ist in der gezeigten Variante durch einen, insbesondere sphärischen, oder torischen, Hohlspiegel 47 gebildet. Die zweite Pupillenebene PE2 wird demgemäß durch die Abbildungsoptik 42 bereitgestellt.Furthermore, the in 1 illustrated embodiment between the first deflection unit 41 and the second deflector 43 an imaging optics 42 is present, which is the first deflection unit 41 on the second deflector 43 maps. The imaging optics 42 is in the variant shown by a, in particular spherical, or toric, concave mirror 47 educated. The second pupil level PE2 is accordingly through the imaging optics 42 provided.

In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik 44 ein erstes Zwischenbild ZB1 gebildet, welches die Scanoptik 44 in ein zweites Zwischenbild ZB2 abbildet, welches zwischen der zweiten Ablenkeinheit und der Abbildungsoptik 42 liegt. Die Abbildungsoptik 42 ist in diesem Beispiel dergestalt angeordnet, dass sie ein von der ersten Ablenkeinheit 41 kommendes kollimiertes Strahlenbündel in das zweite Zwischenbild ZB2 fokussiert. Das zweite Zwischenbild ZB2 kann insbesondere nicht eben, also räumlich gekrümmt sein.In the exemplary embodiment shown, the illumination beam path is downstream of the scanning optics 44 a first intermediate image ZB1 formed which the scan optics 44 into a second intermediate image ZB2 images which between the second deflection unit and the imaging optics 42 lies. The imaging optics 42 is arranged in this example in such a way that it is one of the first deflection unit 41 incoming collimated beam in the second intermediate image ZB2 focused. The second intermediate image ZB2 can in particular not be flat, that is to say spatially curved.

Erfindungsgemäß ist eine periodische Blendenanordnung 40 vorhanden, die wahlweise in den Beleuchtungsstrahlengang zwischen der ersten Ablenkeinheit 41 und der zweiten Ablenkeinheit 43 einbringbar, also positionierbar, oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist. In dem in 1 gezeigten Beispiel kann die periodische Blendenanordnung 40 an der Position des zweiten Zwischenbild ZB2 in den Beleuchtungsstrahlengang eingeführt werden.According to the invention is a periodic diaphragm arrangement 40 available, which is optionally in the illumination beam path between the first deflection unit 41 and the second deflector 43 can be introduced, ie positioned, or removed from the illumination beam path. In the in 1 The example shown can be the periodic diaphragm arrangement 40 at the position of the second intermediate image ZB2 are introduced into the illumination beam path.

In einer alternativen Ausgestaltung kann im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik 44 wieder ein erstes Zwischenbild ZB1 gebildet sein, wobei die Scanoptik 44 Licht aus dem ersten Zwischenbild ZB1 in ein kollimiertes Strahlenbündel überführt. Die Abbildungsoptik 42 wäre bei dieser Variante dergestalt angeordnet, dass sie das von der zweiten Ablenkeinheit 43 kommende kollimierte Strahlenbündel in ein zweites Zwischenbild ZB2 fokussiert, welches dann zwischen der Abbildungsoptik 42 und der ersten Ablenkeinheit 41 liegt. Auch bei dieser Variante könnte die erfindungsgemäß vorhandene periodische Blendenanordnung 40 zur Positionierung in dem zweiten Zwischenbild ZB2 vorgesehen sein.In an alternative embodiment, in the illuminating beam path, downstream from the scanning optics 44 again a first intermediate image ZB1 be formed, the scanning optics 44 Light from the first intermediate image ZB1 transferred into a collimated beam. The imaging optics 42 In this variant, it would be arranged in such a way that it does away with the second deflection unit 43 incoming collimated beam in a second intermediate image ZB2 focused, which is then between the imaging optics 42 and the first deflector 41 lies. The periodic diaphragm arrangement present according to the invention could also be used in this variant 40 for positioning in the second intermediate image ZB2 be provided.

Erfindungsgemäß ist außerdem eine Zylinderoptik 20 vorhanden, die in dem Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von der ersten Ablenkeinheit 41 wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist. Durch die Zylinderoptik 20, die im gezeigten Ausführungsbeispiel durch eine Zylinderlinse gebildet ist, kann eine Fokussierung in der zweiten Zwischenbildebene ZB2 in einer Koordinatenrichtung y mindestens teilweise aufgehoben werden.In addition, cylinder optics are in accordance with the invention 20th present, the beam in the illumination beam path upward from the first deflection unit 41 can optionally be positioned in the illuminating beam path or removed from the illuminating beam path. Through the cylinder optics 20th , which is formed in the illustrated embodiment by a cylindrical lens, a focusing in the second intermediate image plane ZB2 in a coordinate direction y at least partially canceled.

In dem in 1 gezeigten Beispiel ist die Zylinderoptik 20 in einem kollimierten Teil des Beleuchtungsstrahlengangs dergestalt positionierbar, dass in der zweiten Zwischenbildebene ZB2 einen Linienfokus gebildet wird, wenn sich die Zylinderoptik 20 im Strahlengang befindet.In the in 1 The example shown is the cylinder optics 20th positionable in a collimated part of the illumination beam path in such a way that in the second intermediate image plane ZB2 a line focus is formed when the cylinder optics 20th is in the beam path.

Besonders vorteilhaft ist die periodische Blendenanordnung 40, die beispielsweise eine lithographische hergestellte Lochblendenmatrix 46 sein kann, auf einer gewölbten Fläche, insbesondere einer Kugelfläche, gebildet, wobei die Krümmung der gewölbten Fläche gleich oder näherungsweise gleich ist wie die Krümmung des zweiten Zwischenbilds ZB2. Die Löcher 45 der Lochblendenmatrix 40 können dabei auf den Positionen eines zweidimensionalen hexagonalen oder quadratischen Gitters positioniert sein. 2 zeigt schematisch eine Lochblendenmatrix 40, bei der sich die Löcher 45 an den Positionen eines 2-dimensionalen hexagonalen Gitters befinden. Die Löcher 45 weisen zweckmäßig einen Durchmesser von 0,5 bis 1,5 mal dem Durchmesser eines Airyscheibchens auf. Dadurch kann ein optimaler Modulationskontrast nach Abbildung des Punktmusters in die Probe 60 erreicht werden.The periodic diaphragm arrangement is particularly advantageous 40 , for example a lithographically manufactured pinhole matrix 46 may be on a curved surface, in particular a spherical surface, wherein the curvature of the curved surface is the same or approximately the same as the curvature of the second intermediate image ZB2 . The holes 45 the pinhole matrix 40 can be positioned on the positions of a two-dimensional hexagonal or square grid. 2 shows schematically a pinhole matrix 40 where the holes 45 are at the positions of a 2-dimensional hexagonal grid. The holes 45 expediently have a diameter of 0.5 to 1.5 times the diameter of an Airy disc. This allows an optimal modulation contrast after imaging the point pattern in the sample 60 can be achieved.

Die erste Ablenkeinheit 41 ist eingerichtet zum Ablenken des Anregungslichts 12 in der Richtung x senkrecht zu der Koordinatenrichtung y, in welcher durch die Zylinderoptik 20 die Fokussierung mindestens teilweise aufgehoben ist. Mit anderen Worten lenkt die erste Ablenkeinheit 41 das Anregungslicht 12 ab in der Richtung x senkrecht zur Erstreckungsrichtung eines durch die Wirkung der Zylinderoptik 20 erzeugten Linienfokus, die parallel ist zur Koordinatenrichtung y. Die Koordinatenrichtungen x, y, z in der zweiten Zwischenbildebene ZB2 sind in 1 zeigt das Koordinatensystem 48. Das Koordinatensystem 49 zeigt die Richtungen der Achsen in der Objektebene 61.The first deflection unit 41 is set up to deflect the excitation light 12 in that direction x perpendicular to the coordinate direction y , in which by the cylinder optics 20th the focus is at least partially removed. In other words, the first deflection unit steers 41 the excitation light 12 off in the direction x perpendicular to the direction of extent of a through the action of the cylinder optics 20th generated line focus that is parallel to the coordinate direction y . The coordinate directions x , y , z in the second intermediate image plane ZB2 are in 1 shows the coordinate system 48 . The coordinate system 49 shows the directions of the axes in the object plane 61 .

Zum Nachweis von von der Probe 60 abgestrahltem Licht, insbesondere von Fluoreszenzlicht 66, ist bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel im descannten Teil des Detektionsstrahlengangs ein Detektor 74 mit einer optional einsetzbaren konfokalen Loch- oder Schlitzblende 73 vorhanden. Als descannter Teil wird dabei der Teil des Detektionsstrahlengangs strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit 41 bezeichnet. Zum Einführen und Entfernen der konfokalen Loch- oder Schlitzblende 73 können mechanische Mittel grundsätzlich bekannter Natur vorhanden sein.For detection of from the sample 60 emitted light, especially fluorescent light 66 , is at the in 1 illustrated embodiment, a detector in the descanned part of the detection beam path 74 with an optionally usable confocal pinhole or slit diaphragm 73 available. The part of the detection beam path downstream from the first deflection unit is used as the descanned part 41 designated. For inserting and removing the confocal pinhole or slit diaphragm 73 mechanical means of a basically known nature can be present.

Zum Leiten des von der Scanoptik 44 kommenden Anregungslichts 12 dient eine reflektierende Komponente 65, welche das Anregungslicht 12 in Richtung einer Tubuslinse 64 und des Mikroskopobjektivs 62 umlenkt, welches das Anregungslicht 12 schließlich in die Objektebene 61, in der sich die Probe 60 befindet, leitet.For guiding the from the scanning optics 44 coming excitation light 12 serves a reflective component 65 which is the excitation light 12 in the direction of a tube lens 64 and the microscope objective 62 which deflects the excitation light 12 finally in the object level 61 in which the sample 60 is located, directs.

Die reflektierende Komponente 65 kann ein Farbteiler zum räumlichen Trennen von Anregungslicht 12 und von der Probe 60 abgestrahltem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht 66, sein. In dem in 1 dargestellten Beispiel ist strahlabwärts von der reflektierenden Komponente eine Kamera 70, beispielsweise eine sCMOS-Kamera, zum Nachweis des von der Probe 60 abgestrahlten Lichts vorhanden. Besonders bevorzugt weist die Kamera 70 einen, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschluss auf. Solch eine Schlitzblendenverschluss wird auch als Rolling Shutter bezeichnet. Zum Ansteuern und Auslesen der Kamera ist bei dem in 1 gezeigten Beispiel eine schematisch dargestellte Steuereinrichtung 90 vorhanden. Die Steuereinrichtung 90 kann eine elektronische Recheneinrichtung grundsätzlich bekannter Art sein, beispielsweise ein PC. Die Steuereinrichtung 90 kann insbesondere dienen zum zueinander synchronisierten, insbesondere periodischen, Ansteuern der ersten Ablenkeinheit 41 und des elektronischen Schlitzblendenverschlusses der Kamera 70. The reflective component 65 can use a color splitter to spatially separate excitation light 12 and from the sample 60 emitted light, especially fluorescent light 66 , be. In the in 1 The example shown is a camera downstream from the reflective component 70 , for example an sCMOS camera, to detect the presence of the sample 60 radiated light present. The camera particularly preferably has 70 an, in particular electronic, slit shutter. Such a slit shutter is also referred to as a rolling shutter. To control and read out the camera, the in 1 Example shown a schematically shown control device 90 available. The control device 90 An electronic computing device can be of a fundamentally known type, for example a PC. The control device 90 can in particular serve for mutually synchronized, in particular periodic, control of the first deflection unit 41 and the camera's electronic slit shutter 70 .

Wenn die Kamera 70 nicht benutzt wird, kann die reflektierende Komponente 65 ein einfacher Spiegel sein.When the camera 70 is not used, the reflective component can 65 be a simple mirror.

Das erfindungsgemäße Mikroskop eignet sich insbesondere zum Durchführen von konventioneller konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Hierzu werden sowohl die Zylinderoptik 20 als auch die periodische Blendenanordnung 40 aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt. Das System arbeitet dann wie ein herkömmliches konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Ein Fokus des Anregungslicht 12 wird mithilfe der ersten Ablenkeinheit 41 und der zweiten Ablenkeinheit 43 in der Objektebene 61 und damit über die Probe 60 geführt. Von der Probe 60 auf die Bestrahlung mit dem Anregungslicht 12 hin im Anregungsspot abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht 66, wird von dem Detektionsstrahlengang auf eine konfokale Lochblende 73 abgebildet und mit dem Detektor 74 im descannten Detektionsstrahlengang nachgewiesen. Bei 2- oder 3-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie ist die konfokale Lochblende 73, die auch als konfokales Pinhole bezeichnet werden kann, nicht unbedingt notwendig und kann für diese Verfahrensvarianten aus dem Strahlengang entfernt werden. Der Detektor 74, beispielsweise ein PMT, registriert dabei das von der Probe zurückgestrahlte Licht pixelweise, d. h. zu einem bestimmten Zeitpunkt wird das von dem zu diesem Zeitpunkt mit Anregungslicht 12 beaufschlagten Ort der Probe (Anregungsspot) abgestrahlte Licht gemessen.The microscope according to the invention is particularly suitable for performing conventional confocal laser scanning microscopy. Both the cylinder optics 20th as well as the periodic aperture arrangement 40 removed from the illumination beam path. The system then works like a conventional confocal laser scanning microscope. A focus of the stimulation light 12 is made using the first deflector 41 and the second deflector 43 in the object level 61 and thus about the sample 60 guided. From the rehearsal 60 to the irradiation with the excitation light 12 light emitted in the excitation spot, in particular fluorescent light 66 , is from the detection beam path onto a confocal pinhole 73 mapped and with the detector 74 detected in the descanned detection beam path. In 2- or 3-photon fluorescence microscopy, the confocal pinhole is 73 , which can also be referred to as a confocal pinhole, is not absolutely necessary and can be removed from the beam path for these method variants. The detector 74 , for example a PMT, registers the light reflected back from the sample pixel by pixel, ie at a certain point in time it becomes the excitation light at that point in time 12 acted upon location of the sample (excitation spot) measured light emitted.

Für die SI-Mikroskopie werden sowohl die Zylinderoptik 20 als auch die periodische Blendenanordnung 40 im Beleuchtungsstrahlengang positioniert. Durch die Wirkung der Zylinderoptik 20 wird auf der periodischen Blendenanordnung 40 ein Linienfokus erzeugt, der mit der ersten Ablenkeinheit 41 über die periodische Blendenanordnung 40 und damit in der Objektebene 61 und über die Probe 60 gescannt wird. Das bedeutet, dass ein durch die periodische Blendenanordnung 40 erzeugtes hexagonales Punktmuster im Bereich des Linienfokus in die Objektebene 61 abgebildet wird. Die in diesem Punktmuster angeregte Fluoreszenzstrahlung wird auf die Kamera 70 abgebildet.For SI microscopy, both the cylinder optics 20th as well as the periodic aperture arrangement 40 positioned in the illumination beam path. Through the effect of the cylinder optics 20th is on the periodic diaphragm arrangement 40 a line focus generated with the first deflection unit 41 via the periodic aperture arrangement 40 and thus at the object level 61 and about the sample 60 is scanned. This means that one through the periodic aperture arrangement 40 generated hexagonal point pattern in the area of the line focus in the object plane 61 is mapped. The one in this Point pattern of excited fluorescence radiation is directed to the camera 70 pictured.

Der erste Ablenkeinheit 41 zwischen dem Hauptstrahlteiler (MBS) 22 und der periodischen Blendenanordnung 40 Blendenstruktur scannt in x-Richtung über die periodische Blendenanordnung 40. Die Scanbewegung der ersten Ablenkeinheit 41 ist bevorzugt mit einem Schlitzverschluss (Rolling Shutter) der Kamera 70 synchronisiert, der als elektronische konfokale Blende des Mikroskopsystems fungiert. Die für die SI-Mikroskopie, also den SIM-Algorithmus, notwendige Phasenverschiebung des Punktmusters in der Objektebene 61, also auf der Probe 60, wird mit der zweiten Ablenkeinheit 43 erzeugt.The first deflector 41 between the main beam splitter (MBS) 22nd and the periodic aperture arrangement 40 Diaphragm structure scans in the x-direction over the periodic diaphragm arrangement 40 . The scanning movement of the first deflection unit 41 is preferred with a focal plane shutter (rolling shutter) of the camera 70 synchronized, which acts as the electronic confocal aperture of the microscope system. The phase shift of the point pattern in the object plane required for SI microscopy, i.e. the SIM algorithm 61 , so on the test 60 , is with the second deflection unit 43 generated.

Auf diese Weise werden mit der Kamera 70 mindestens drei Teilbilder der Probe bei jeweils unterschiedlicher Phasenlage des Punktmusters aufgenommen. Diese Teilbilder werden sodann zur Gewinnung des endgültigen Bilds in einem numerischen Algorithmus miteinander verrechnet. Dieses kann beispielsweise mithilfe des von Schropp et al. vorgeschlagenen Algorithmus erfolgen ( M. Schropp et al.: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23 -36 ).This will be with the camera 70 at least three partial images of the sample recorded with each different phase position of the point pattern. These partial images are then offset against one another in a numerical algorithm to obtain the final image. This can be done, for example, using the method described by Schropp et al. proposed algorithm ( M. Schropp et al .: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23 -36 ).

Mit der zweiten Ablenkeinheit 43 kann außerdem ein beleuchteter Bereich der Probe 60 innerhalb eines Sehfelds der Kamera 70 in einer gewünschten Weise verschoben werden (Panning).With the second deflection unit 43 can also be an illuminated area of the sample 60 within a field of view of the camera 70 be moved in a desired way (panning).

Die Kombination der Konfokalität, die durch die Synchronisierung der Bewegung der ersten Ablenkeinheit 41 mit dem Schlitzblendenverschluss (Rolling Shutter ) der Kamera 70 erreicht wird, mit der strukturierten Beleuchtung ermöglicht im Vergleich mit bisherigen SIM-Systemen eine verbesserte Auflösung auch in größeren Eindringtiefen.The combination of confocality created by synchronizing the movement of the first deflector 41 using the camera's rolling shutter 70 is achieved, with the structured lighting enables an improved resolution compared to previous SIM systems, even at greater depths of penetration.

Die Steuereinheit 90, welche die erste Ablenkeinheit 41, die zweite Ablenkeinheit 43 und die Bildaufnahme steuert, kann außerdem dafür sorgen, dass bei einer Aufnahme eines bestimmten Bereichs der Probe 60 der in die Probe 60 abgebildete Auslesebereich der Kamera 70 mit demjenigen Bereich übereinstimmt, über welchen das Bild der periodischen Blendenanordnung 40 mithilfe der Scaneinrichtung über die Probe 60 bewegt wird.The control unit 90 , which is the first deflector 41 , the second deflector 43 and controls the image acquisition, can also ensure that when a certain area of the sample is acquired 60 the one in the sample 60 pictured readout area of the camera 70 coincides with that area over which the image of the periodic diaphragm arrangement 40 over the sample using the scanning device 60 is moved.

Im Vergleich zum Stand der Technik, insbesondere gegenüber Schropp et al., ergeben sich damit eine Reihe von Vorteilen. Die erste Ablenkeinheit 41 und die zweite Ablenkeinheit 43 können, wie oben beschrieben, sowohl zum sehr schnellen Schieben der räumlichen Phase, als auch zur Abbildung bestimmter Regions-of-Interest (ROI) genutzt werden, d.h. zur Auswahl von bestimmten Regionen in der Probe, oder zum Panning für die Abbildung größerer Bereiche. Zudem kann auch bei vergleichsweise moderater Leistung der verwendeten Laser eine sehr schnelle Aufnahme der hochaufgelösten Daten erreicht werden.In comparison with the prior art, in particular with respect to Schropp et al., This results in a number of advantages. The first deflection unit 41 and the second deflector 43 can, as described above, be used both for shifting the spatial phase very quickly and for imaging certain regions of interest (ROI), ie for selecting certain regions in the sample, or for panning for imaging larger areas. In addition, the high-resolution data can be recorded very quickly even with a comparatively moderate power of the laser used.

Das erfindungsgemäße Mikroskop 300 erlaubt noch die weitere vorteilhafte Verfahrensvariante einer schnellen konfokaler Mikroskopie. Hierzu wird die Zylinderoptik 20 im Beleuchtungsstrahlengang positioniert, die periodische Blendenanordnung 40 aber wird aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt. Mithilfe der ersten Ablenkeinheit 41 kann dann ein Linienfokus über die Probe 60 gescannt werden. Die Bewegung dieses Linienfokus kann vorteilhaft wieder mit der Bewegung des Schlitzverschlusses (Rolling Shutter) der Kamera 70 synchronisiert werden. Der Schlitzverschluss der Kamera 70 dient dann als konfokale Schlitzblende. Alternativ kann das von der Probe 60 abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht 66, mit dem Detektor 74 nachgewiesen werden, wobei vor dem Detektor 74 eine konfokale Schlitzblende 73 angeordnet sein kann.The microscope according to the invention 300 allows the further advantageous variant of the method of rapid confocal microscopy. For this purpose the cylinder optics 20th positioned in the illumination beam path, the periodic aperture arrangement 40 but is removed from the illumination beam path. Using the first deflector 41 can then have a line focus over the sample 60 scanned. The movement of this line focus can be advantageous again with the movement of the focal plane shutter (rolling shutter) of the camera 70 be synchronized. The camera's focal plane shutter 70 then serves as a confocal slit diaphragm. Alternatively, this can be from the sample 60 emitted light, especially fluorescent light 66 , with the detector 74 be detected, being in front of the detector 74 a confocal slit diaphragm 73 can be arranged.

Weil die Abbildung der ersten Ablenkeinheit 41 und der zweiten Ablenkeinheit 43 aufeinander das übertragbare Feld entlang des Linienfokus begrenzt, muss die zweite Ablenkeinheit 43 zum Panning betätigt werden, um das volle Sehfeld zu scannen.Because the image of the first deflection unit 41 and the second deflector 43 limit the transmittable field along the line focus to each other, the second deflection unit 43 used to panning to scan the full field of view.

Mit diesem Betriebsmodus wird eine schnelle konfokale Bildgebung jedoch ohne Verbesserung der Auflösung erreicht. Weil dabei aber eine Phasenschiebung und anschließende Verrechnung der Bilder nicht notwendig ist, sondern die durch die Kamera 70 aufgenommenen Bilddaten direkt ausgegeben werden können, kann die Bildrate gegenüber dem Betriebsmodus der konfokalen SIM um einen Faktor drei gesteigert werden.With this operating mode, however, fast confocal imaging is achieved without improving the resolution. Because, however, a phase shift and subsequent calculation of the images is not necessary, but rather done by the camera 70 recorded image data can be output directly, the frame rate can be increased by a factor of three compared to the operating mode of the confocal SIM.

BezugszeichenlisteList of reference symbols

1010
LichtquelleLight source
1212
AnregungslichtExcitation light
2020th
Zylinderoptik Cylinder optics
2222nd
Hauptstrahlteiler (MBS)Main beam splitter (MBS)
4040
periodische Blendenanordnungperiodic diaphragm arrangement
4141
erste Ablenkeinheitfirst deflection unit
4242
Abbildungsoptik (Hohlspiegel)Imaging optics (concave mirror)
4343
zweite Ablenkeinheitsecond deflection unit
4444
ScanoptikScanning optics
4545
Löcher der LochblendenmatrixHoles of the pinhole matrix
4646
LochblendenmatrixPinhole matrix
4747
HohlspiegelConcave mirror
4848
KoordinatensystemCoordinate system
4949
KoordinatensystemCoordinate system
6060
Probesample
6161
ObjektebeneObject level
6262
MikroskopobjektivMicroscope objective
6363
Pupillenebene (hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs 62)Pupil plane (rear focal plane of the microscope objective 62 )
6464
TubuslinseTube lens
6565
Farbteiler oder SpiegelColor divider or mirror
6666
FluoreszenzlichtFluorescent light
7070
Kameracamera
7373
konfokale Loch- oder Schlitzblendeconfocal pinhole or slit diaphragm
7474
Detektordetector
9090
SteuereinrichtungControl device
100100
Beleuchtungs- und ScanmodulLighting and scanning module
200200
MikroskopstativMicroscope stand
300300
Mikroskop,Microscope,
PE1PE1
erste Pupillenebenefirst pupil level
PE2PE2
zweite Pupillenebenesecond pupil level
xx
erste Koordinatenrichtungfirst coordinate direction
yy
zweite Koordinatenrichtungsecond coordinate direction
zz
dritte Koordinatenrichtungthird coordinate direction
ZB1ZB1
erstes Zwischenbildfirst intermediate image
ZB2ZB2
zweites Zwischenbildsecond intermediate image

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturPatent literature cited

  • DE 102014017001 A1 [0001, 0025, 0029, 0031, 0040]DE 102014017001 A1 [0001, 0025, 0029, 0031, 0040]

Zitierte Nicht-PatentliteraturNon-patent literature cited

  • S. Wäldchen et al.: Scientific Reports 5, Article number: 15348 (2015) [doi:10.1038/srep15348] [0004]S. Wäldchen et al .: Scientific Reports 5, Article number: 15348 (2015) [doi: 10.1038 / srep15348] [0004]
  • T. Wilson et al. (Opt. Lett. 22, p. 1905) [0004]T. Wilson et al. (Opt. Lett. 22, p. 1905) [0004]
  • Gustafsson et al. (biophysj 94, p. 4957) [0004]Gustafsson et al. (biophysj 94, p. 4957) [0004]
  • M. Schropp et al.: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23 -36 [0035, 0059]M. Schropp et al .: Journal of Microscopy, Vol. 256, Issue 1, 2014, p. 23-36 [0035, 0059]
  • Schropp et al: Photonics 2017, 4, 33 [0041]Schropp et al: Photonics 2017, 4, 33 [0041]

Claims (28)

Mikroskop, mit einer Lichtquelle (10) zum Bereitstellen von Anregungslicht (12), mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv (62) zum Leiten des Anregungslichts (12) in eine Objektebene (61), mit einem Detektionsstrahlengang zum Leiten von von einer Probe (60) in der Objektebene (61) abgestrahltem Licht, insbesondere von Fluoreszenzlicht (66), auf eine Kamera (70) oder einen Detektor (74), mit einer Scaneinrichtung (41, 43, 44) zum Scannen des Anregungslichts (12) in der Objektebene (61), wobei die Scaneinrichtung eine erste Ablenkeinheit (41) zum Ablenken des Anregungslichts (12) in einer ersten Koordinatenrichtung (x) und eine zweite Ablenkeinheit (43) zum Ablenken des Anregungslichts (12) in einer zweiten Koordinatenrichtung (y) aufweist, wobei die zweite Ablenkeinheit (43) im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit (41) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zylinderoptik (20) wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von der ersten Ablenkeinheit (41) positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist und dass eine periodische Blendenanordnung (40) wahlweise in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der ersten Ablenkeinheit (41) und der zweiten Ablenkeinheit (43) positionierbar oder aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist.Microscope, with a light source (10) for providing excitation light (12), with an illumination beam path with a microscope objective (62) for guiding the excitation light (12) into an object plane (61), with a detection beam path for guiding a sample (60) ) light emitted in the object plane (61), in particular from fluorescent light (66), to a camera (70) or a detector (74), with a scanning device (41, 43, 44) for scanning the excitation light (12) in the object plane (61), the scanning device having a first deflection unit (41) for deflecting the excitation light (12) in a first coordinate direction (x) and a second deflection unit (43) for deflecting the excitation light (12) in a second coordinate direction (y), wherein the second deflection unit (43) is arranged in the illumination beam path downstream from the first deflection unit (41), characterized in that a cylinder optic (20) optionally beam in the illumination beam path can be positioned upstream of the first deflection unit (41) or removed from the illumination beam path and that a periodic diaphragm arrangement (40) can optionally be positioned in the illumination beam path between the first deflection unit (41) and the second deflection unit (43) or removed from the illumination beam path. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Ablenkeinheit (41) und/oder die zweite Ablenkeinheit (43) durch Scannerspiegel gebildet ist oder sind.Microscope after Claim 1 , characterized in that the first deflection unit (41) and / or the second deflection unit (43) is or are formed by scanner mirrors. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Ablenkeinheit (41) und die zweite Ablenkeinheit (43) jeweils in Ebenen (PE1, PE2) angeordnet sind, die zur hinteren Brennebene (62) eines Mikroskopobjektivs (62) optisch konjugiert sind (Pupillenebenen).Microscope after Claim 1 or 2 , characterized in that the first deflection unit (41) and the second deflection unit (43) are each arranged in planes (PE1, PE2) which are optically conjugated to the rear focal plane (62) of a microscope objective (62) (pupil planes). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Scaneinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der ersten Ablenkeinheit (41) und der zweiten Ablenkeinheit (43) eine Scanoptik (44) zum Bereitstellen einer Pupillenebene (PE1) aufweist.Microscope according to one of the Claims 1 to 3 characterized in that the scanning device has scanning optics (44) for providing a pupil plane (PE1) in the illumination beam path downstream from the first deflection unit (41) and the second deflection unit (43). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der ersten Ablenkeinheit (41) und der zweiten Ablenkeinheit (43) eine Abbildungsoptik (42) vorhanden ist, welche die erste Ablenkeinheit (41) auf die zweite Ablenkeinheit (43) abbildet.Microscope according to one of the Claims 1 to 4th , characterized in that imaging optics (42) are present between the first deflection unit (41) and the second deflection unit (43) which images the first deflection unit (41) onto the second deflection unit (43). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsoptik (42) durch einen, insbesondere sphärischen, oder torischen, Hohlspiegel (47) gebildet ist.Microscope according to one of the Claims 1 to 5 , characterized in that the imaging optics (42) is formed by a, in particular spherical, or toric, concave mirror (47). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik (44) ein erstes Zwischenbild (ZB1) gebildet ist, welches die Scanoptik (44) in ein, insbesondere gekrümmtes, zweites Zwischenbild (ZB2) abbildet, wobei das zweite Zwischenbild (ZB2) zwischen der zweiten Ablenkeinheit und der Abbildungsoptik (42) liegt, und dass die Abbildungsoptik (42) dergestalt angeordnet ist, dass sie ein von der ersten Ablenkeinheit (41) kommendes kollimiertes Strahlenbündel in das zweite Zwischenbild (ZB2) fokussiert.Microscope according to one of the Claims 1 to 6th , characterized in that a first intermediate image (ZB1) is formed in the illuminating beam path downstream of the scanning optics (44), which the scanning optics (44) images in a, in particular curved, second intermediate image (ZB2), the second intermediate image (ZB2) between the second deflection unit and the imaging optics (42), and that the imaging optics (42) are arranged such that they focus a collimated beam coming from the first deflection unit (41) into the second intermediate image (ZB2). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang strahlabwärts von der Scanoptik (44) ein erstes Zwischenbild (ZB1) gebildet ist, dass die Scanoptik (44) Licht aus dem ersten Zwischenbild (ZB1) in ein kollimiertes Strahlenbündel überführt und dass die Abbildungsoptik (42) dergestalt angeordnet ist, dass sie das von der zweiten Ablenkeinheit (43) kommende kollimierte Strahlenbündel in ein zweites Zwischenbild (ZB2) fokussiert, welches zwischen der Abbildungsoptik (42) und der ersten Ablenkeinheit (41) liegt.Microscope according to one of the Claims 1 to 6th , characterized in that a first intermediate image (ZB1) is formed in the illumination beam path downstream from the scanning optics (44), that the scanning optics (44) converts light from the first intermediate image (ZB1) into a collimated beam and that the imaging optics (42) are designed in this way is arranged so that it focuses the collimated beam coming from the second deflection unit (43) into a second intermediate image (ZB2) which lies between the imaging optics (42) and the first deflection unit (41). Mikroskop nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die periodische Blendenanordnung (40) an der Position des zweiten Zwischenbilds (ZB2) in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar ist.Microscope after Claim 7 or 8th , characterized in that the periodic diaphragm arrangement (40) can be introduced into the illumination beam path at the position of the second intermediate image (ZB2). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich die periodische Blendenanordnung (40) auf einer gewölbten Fläche, insbesondere einer Kugelfläche, befindet, wobei die Krümmung der gewölbten Fläche gleich oder näherungsweise gleich ist wie die Krümmung des zweiten Zwischenbilds (ZB2).Microscope according to one of the Claims 1 to 9 , characterized in that the periodic diaphragm arrangement (40) is located on a curved surface, in particular a spherical surface, the curvature of the curved surface being the same or approximately the same as the curvature of the second intermediate image (ZB2). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die periodische Blendenanordnung (40) eine Lochblendenmatrix (46) ist.Microscope according to one of the Claims 1 to 10 , characterized in that the periodic diaphragm arrangement (40) is a perforated diaphragm matrix (46). Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lochblendenmatrix (46) lithographisch hergestellt ist.Microscope after Claim 11 , characterized in that the pinhole matrix (46) is produced lithographically. Mikroskop nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Löcher (45) der Lochblendenmatrix (40) auf den Positionen eines zweidimensionalen hexagonalen oder quadratischen Gitters positioniert sind.Microscope after Claim 11 or 12 , characterized in that the holes (45) of the pinhole matrix (40) are positioned on the positions of a two-dimensional hexagonal or square grid. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Löcher einen Durchmesser von 0,5 bis 1,5 mal dem Durchmesser eines Airyscheibchens aufweisen.Microscope according to one of the Claims 1 to 13th , characterized in that the holes have a diameter of 0.5 to 1.5 times the diameter of an Airy disc. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zylinderoptik (20) mindestens eine Zylinderlinse (20) oder einen zylindrischen Hohlspiegel aufweist.Microscope according to one of the Claims 1 to 14th , characterized in that the cylinder optics (20) has at least one cylinder lens (20) or a cylindrical concave mirror. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zylinderoptik (20) eine Fokussierung in der zweiten Zwischenbildebene (ZB2) in einer Koordinatenrichtung (y) mindestens teilweise aufhebt.Microscope according to one of the Claims 1 to 15th , characterized in that the cylinder optics (20) at least partially cancel a focus in the second intermediate image plane (ZB2) in a coordinate direction (y). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zylinderoptik (20) in einen kollimierten Teil des Beleuchtungsstrahlengangs positionierbar ist.Microscope according to one of the Claims 1 to 16 , characterized in that the cylinder optics (20) can be positioned in a collimated part of the illumination beam path. Mikroskop nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Ablenkeinheit (41) zum variablen Ablenken des Anregungslichts (12) in einer Richtung (x) quer, insbesondere senkrecht, zu der Koordinatenrichtung (y), in welcher durch die Zylinderoptik (20) die Fokussierung mindestens teilweise aufgehoben ist, eingerichtet ist.Microscope after Claim 16 or 17th , characterized in that the first deflection unit (41) for the variable deflection of the excitation light (12) in a direction (x) transverse, in particular perpendicular, to the coordinate direction (y) in which the focus is at least partially canceled by the cylinder optics (20) is, is set up. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Detektionsstrahlengang, insbesondere in einem descannten Teil, ein Detektor (74) mit einer konfokalen Loch- oder Schlitzblende (73) vorhanden ist.Microscope according to one of the Claims 1 to 18th , characterized in that a detector (74) with a confocal perforated or slit diaphragm (73) is present in the detection beam path, in particular in a descanned part. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Farbteiler (65) zum räumlichen Trennen von Anregungslicht (12) und von einer Probe (60) abgestrahltem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht (66), vorhanden ist und dass im Detektionsstrahlengang strahlabwärts von dem Farbteiler (65) eine Kamera (70) vorhanden ist.Microscope according to one of the Claims 1 to 19th , characterized in that there is a color splitter (65) for spatially separating excitation light (12) and light emitted by a sample (60), in particular fluorescent light (66), and that a camera (65) is present in the detection beam path downstream from the color splitter (65). 70) is available. Mikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Kamera (70) einen, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschluss aufweist.Microscope after Claim 20 , characterized in that the camera (70) has an, in particular electronic, slit shutter. Mikroskop nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuereinrichtung (90) vorhanden ist zum zueinander synchronisierten, insbesondere periodischen, Ansteuern der ersten Ablenkeinheit (41) und eines, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschlusses der Kamera (70).Microscope after Claim 20 or 21st , characterized in that a control device (90) is present for mutually synchronized, in particular periodic, control of the first deflection unit (41) and an, in particular electronic, slit shutter of the camera (70). Verfahren zur Mikroskopie dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 22 verwendet wird.Method for microscopy, characterized in that a microscope according to one of the Claims 1 to 22nd is used. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zum Durchführen von SI-Mikroskopie die Zylinderoptik (20) und die periodische Blendenanordnung (40) im Beleuchtungsstrahlengang positioniert werden, dass ein durch die periodische Blendenanordnung (40) erzeugtes Punktmuster in die Objektebene (61) abgebildet wird, dass mit der Zylinderoptik (20) ein Linienfokus erzeugt wird, der mit der ersten Ablenkeinheit (41) über die periodische Blendenanordnung (40) gescannt wird, dass die für die SI-Mikroskopie notwendige Phasenverschiebung des Punktmusters in der Objektebene (61) mit der zweiten Ablenkeinheit (43) erzeugt wird, dass mit einer Kamera (70) mindestens drei Teilbilder mit unterschiedlicher Phasenlage des Punktmusters aufgenommen werden und dass die drei Teilbilder miteinander verrechnet werden.Procedure according to Claim 23 , characterized in that for performing SI microscopy, the cylinder optics (20) and the periodic diaphragm arrangement (40) are positioned in the illumination beam path that a point pattern generated by the periodic diaphragm arrangement (40) is imaged in the object plane (61) that with the cylinder optics (20) a line focus is generated which is scanned with the first deflection unit (41) over the periodic diaphragm arrangement (40) that the phase shift of the point pattern in the object plane (61) necessary for SI microscopy with the second deflection unit ( 43) is generated that at least three partial images with different phase positions of the point pattern are recorded with a camera (70) and that the three partial images are offset against one another. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kamera (70) einen, insbesondere elektronischen, Schlitzblendenverschluss aufweist, der synchronisiert mit der ersten Ablenkeinheit (41) angesteuert wird.Procedure according to Claim 24 , characterized in that the camera (70) has an, in particular electronic, slit shutter, which is controlled synchronized with the first deflection unit (41). Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass mit der zweiten Ablenkeinheit (43) ein beleuchteter Bereich der Probe (60) innerhalb eines Sehfelds der Kamera (70) verschoben wird (Panning).Procedure according to Claim 24 or 25th , characterized in that the second deflection unit (43) is used to displace an illuminated region of the sample (60) within a field of view of the camera (70) (panning). Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zum Durchführen von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie die Zylinderoptik (20) und die periodische Blendenanordnung (40) aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt werden und dass von der Probe (60) abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht (66), mit dem Detektor (74) nachgewiesen wird, wobei vor dem Detektor (74) insbesondere eine konfokale Lochblende (73) angeordnet ist.Procedure according to Claim 23 , characterized in that, for performing confocal laser scanning microscopy, the cylinder optics (20) and the periodic diaphragm arrangement (40) are removed from the illumination beam path and that light emitted from the sample (60), in particular fluorescent light (66), with the Detector (74) is detected, in front of the detector (74) in particular a confocal pinhole (73) is arranged. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zum Durchführen von schneller konfokaler Mikroskopie die Zylinderoptik (20) im Beleuchtungsstrahlengang positioniert wird, dass die periodische Blendenanordnung (40) aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt wird und dass von der Probe (60) abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht (66), mit dem Detektor (74) nachgewiesen wird, wobei vor dem Detektor (74) eine konfokale Schlitzblende (73) angeordnet ist, oder dass von der Probe (60) abgestrahltes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht (66), mit der Kamera (70) nachgewiesen wird, wobei ein, insbesondere elektronischer, Schlitzblendenverschluss der Kamera (70) als konfokale Schlitzblende wirkt.Procedure according to Claim 23 , characterized in that for performing fast confocal microscopy the cylinder optics (20) is positioned in the illuminating beam path, that the periodic diaphragm arrangement (40) is removed from the illuminating beam path and that light emitted by the sample (60), in particular fluorescent light (66), is detected with the detector (74), a confocal slit diaphragm (73) being arranged in front of the detector (74), or that light emitted by the sample (60), in particular fluorescent light (66), is detected with the camera (70) wherein an, in particular electronic, slotted shutter of the camera (70) acts as a confocal slotted shutter.
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