DE3827449A1 - Method for the analytical determination of acetylcyanamide - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Analysenverfahren zur Bestimmung von Acetylcyanamid in einer Matrix und/oder in einem Extrakt, welcher aus dieser Matrix gewonnen wird. Nach dem Verfahren der Erfindung wird Acetylcyanamid in beliebigen Stoffen oder Stoffgemischen bestimmt, bevorzugt erfolgt die Bestimmung in Stoffen biologischer Herkunft.The invention relates to an analytical method for Determination of acetylcyanamide in a matrix and / or in an extract obtained from this matrix. According to the method of the invention, acetylcyanamide is used in any substances or mixtures of substances, the determination is preferably carried out in biological substances Origin.
Acetylcyanamid kann im Zuge des Metabolismus des Cyanamids im Körper von Menschen auftreten, die zu therapeutischen Zwecken mit Cyanamid oder Calciumcyanamid behandelt werden oder die beruflich bedingt mit Cyanamid in Berührung kommen. Im tierischen Organismus ist die Verbindung ein Stoffwechselprodukt, welches beispielsweise von Versuchstieren ausgeschieden wird, an die Cyanamid gezielt verfüttert wurde. Cyanamid wird in zunehmendem Maße im Pflanzenanbau verwendet. Abgesehen von der Felddüngung mit Kalkstickstoff kann Cyanamid entsprechend der DE-OS 31 50 404 zur Brechung der Knospendormanz der Weinrebe oder auch sonstiger Fruchtpflanzen verwendet werden.Acetylcyanamide can in the course of the metabolism of Cyanamids occur in the body of people who are too therapeutic purposes with cyanamide or calcium cyanamide to be treated or for professional reasons with cyanamide come into contact. In the animal organism it is Compound a metabolite which is excreted, for example, by experimental animals the cyanamide was specifically fed. Cyanamide is used in increasingly used in plant cultivation. Except from the field fertilization with calcium cyanamide can cyanamide according to DE-OS 31 50 404 for refraction of Vine buds or other Fruit plants are used.
Aus Gründen des Umweltschutzes ist es wünschenswert, Analysenmethoden zur Bestimmung des Acetylcyanamids beim Menschen und im Tier im Spurenbereich zu entwickeln. Bisher bekannt gewordene Analysenmethoden (Shirota et alii, Drug Metabolism and Disposition 12, 337-344, (1984)) beruhen auf der Messung der Radioaktivität 14C-markierten Acetylcyanamids bzw. dessen N-Benzyl- oder N-(4-Nitro)-benzylderivates mit Hilfe der CIMS (Chemical Ionisation Mass Spectrography) und der UV-Messung der entsprechenden markierten oder unmarkierten Verbindungen. Die direkte Bestimmung kleinster Mengen unmarkierten Acetylcyanamids ist bisher nicht beschrieben worden.For reasons of environmental protection, it is desirable to develop analytical methods for determining acetylcyanamide in humans and animals in the trace range. Previously known analytical methods (Shirota et alii, Drug Metabolism and Disposition 12, 337-344, (1984)) are based on the measurement of the radioactivity 14 C-labeled acetylcyanamide or its N-benzyl- or N- (4-nitro) - benzyl derivatives using CIMS (Chemical Ionization Mass Spectrography) and the UV measurement of the corresponding labeled or unlabeled compounds. The direct determination of the smallest amounts of unlabeled acetylcyanamide has not been described so far.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine hochspezifische, empfindliche Analysenmethode zur quantitativen Bestimmung, aber auch zum Nachweis von Acetylcyanamid zu entwickeln, welche insbesondere dem Metabolismus des Cyanamids in Menschen und in Tieren Rechnung trägt und das auch zur Bestimmung von Cyanamid im Pflanzengewebe, in Mikroorganismen und in biologischen Stoffwechselprodukten geeignet ist.The object of the present invention was therefore underlying, a highly specific, sensitive Analysis method for quantitative determination, but also for the detection of acetylcyanamide to develop which especially the metabolism of cyanamide in humans and takes into account in animals and also for determination of cyanamide in plant tissue, in microorganisms and is suitable in biological metabolic products.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Acetylcyanamid in einer Matrix und/oder in einem Extrakt, welcher aus der Matrix gewonnen wird, durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC) an einer Austauscher- oder Umkehrphase abtrennt und spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 220 nm bestimmt.The object is achieved in that Acetylcyanamide in a matrix and / or in an extract, which is obtained from the matrix by High-resolution liquid chromatography (HPLC) on one Exchanger or reverse phase and spectrophotometric at a wavelength of 220 nm certainly.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, zur Bestimmung des Acetylcyanamids im menschlichen und tierischen Organismus leicht zugängliche Stoffwechselprodukte zu verwenden. Als besonders geeignet hat sich für die quantitative Analyse der Einsatz von Urin erwiesen, da er keiner weiteren Probenvorbereitung außer seiner Alkalisierung und Behandlung mit Aktivkohle bedarf und somit zur erfindungsgemäßen analytischen Bestimmung herangezogen werden kann. Gegebenenfalls ist bei geringen Konzentrationen des Acetylcyanamids noch eine Anreicherung durch Extraktion aus dessen Lösung erforderlich. Soll Cyanamid in Pflanzen oder Mikroorganismen nach der Analysenmethode der Erfindung bestimmt werden, so kann nach der üblichen Zerkleinerung des Zellmaterials und nach Trennung in Fest- und Flüssiganteil eine Acetylierung in der Flüssigkeit vorgenommen werden, um darin eventuell enthaltenes Cyanamid in Acetylcyanamid zu überführen. Acetylcyanamid kann in der so vorbereiteten Probelösung bestimmt werden. It has proven to be useful for determining the Acetylcyanamids in the human and animal organism to use easily accessible metabolites. As has been particularly suitable for quantitative analysis The use of urine has been proven to be none Sample preparation besides its alkalization and Treatment with activated carbon is necessary and therefore analytical determination according to the invention used can be. If necessary, at low Concentrations of acetylcyanamide another one Enrichment by extraction from its solution required. Should cyanamide in plants or Microorganisms according to the analysis method of the invention can be determined after the usual size reduction of the cell material and after separation into solid and Liquid fraction an acetylation in the liquid be made in order to possibly contain Convert cyanamide to acetylcyanamide. Acetylcyanamide can be determined in the sample solution prepared in this way.
Die Derivatisierung des Cyanamids in Lösungen aus Pflanzen oder Mikroorganismen aber auch aus menschlichem oder tierischem Zellgewebe erfolgt nach bekannten Methoden in alkalischer Lösung mit Essigsäureanhydrid in wäßrig/etherischer Phase. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Analysenmethode auf Acetylcyanamid enthaltende Lösungen anderen Ursprungs anzuwenden.The derivatization of the cyanamide in solutions Plants or microorganisms but also from human or animal cell tissue takes place according to known Methods in alkaline solution with acetic anhydride in aqueous / ethereal phase. Of course it is too possible, the analytical method on acetylcyanamide to use containing solutions of other origin.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Matrix, die beispielsweise das Stoffwechselprodukt Urin sein kann, oder die einer Behandlung zur Gewinnung einer wäßrigen Lösung des Acetylcyanamids unterworfen wurde, durch Zusatz von wäßriger Lauge auf pH 7,5 bis 13 gestellt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Bestimmungsmethode liegt in der Einstellung eines pH-Wertes auf 11 bis 11,5 mit 20%iger Natron- oder Kalilauge. Zur Reinigung und zur Klärung von Trübstoffen werden die alkalischen Lösungen mit Aktivkohlepulver verrührt und durch ein Membranfilter von Feststoffen befreit. Liegt die Konzentration des Acetylcyanamids in der Lösung über 1 mg/kg, so ist sie direkt zur analytischen Bestimmung mittels hochauflösender Flüssigkeitschromatographie und spektralphotometrischer Messung geeignet bzw. wird durch Verdünnen mit Wasser auf die gewünschte Analysen-Konzentration eingestellt. Lösungen, deren Acetylcyanamid-Gehalt unter 1 mg/kg liegt, werden mit Mineralsäure auf pH 0,5 bis 3,5 angesäuert. Bevorzugt wird für die weitere Behandlung der Analysenprobe ein pH zwischen 1,0 und 2,0 durch Zusatz von Schwefelsäure oder Phosphorsäure eingestellt. Selbstverständlich eignen sich auch Salzsäure und andere Halogenwasserstoffsäuren zum Ansäuern. Analysenproben, in denen die Konzentration an Acetylcyanamid unter 1 mg/kg liegt, werden zur Anreicherung einer Flüssig-Flüssig- Extraktion unterworfen. Als Solvens für diese Extraktion sind wasserunlösliche organische Lösemittel geeignet, in denen Acetylcyanamid gut löslich ist. Vorteilhaft haben sich hierbei Ester wie Ethylacetat oder Ether wie Diethylether erwiesen. Die Art der Extraktion kann durch einfaches wiederholtes Ausschütteln oder in einer Extraktionsapparatur kontinuierlich erfolgen.According to the present invention, a matrix, which are, for example, the metabolic product urine can, or a treatment to obtain a was subjected to aqueous solution of the acetylcyanamide, by adding aqueous lye to pH 7.5 to 13 posed. A preferred embodiment of the The method of determination lies in the setting of a pH to 11 to 11.5 with 20% sodium or Potash lye. For cleaning and clarifying turbid substances the alkaline solutions with activated carbon powder stirred and through a membrane filter of solids exempted. Is the concentration of acetylcyanamide in the solution over 1 mg / kg, it is directly to the analytical determination using high resolution Liquid chromatography and spectrophotometric Measurement is suitable or is diluted with water the desired analysis concentration is set. Solutions whose acetylcyanamide content is less than 1 mg / kg is with mineral acid to pH 0.5 to 3.5 acidified. Preference is given to further treatment pH of the analysis sample is between 1.0 and 2.0 Addition of sulfuric acid or phosphoric acid discontinued. Of course, hydrochloric acid and others are also suitable Hydrogen halides for acidification. Analytical samples, in which the concentration of acetylcyanamide below 1 mg / kg is used to enrich a liquid-liquid Subjected to extraction. As a solvent for this extraction are water-insoluble organic solvents, in which acetylcyanamide is readily soluble. Have an advantage esters such as ethyl acetate or ether such as Proved diethyl ether. The type of extraction can be done by simple repeated shaking or in one Extraction apparatus take place continuously.
Zur weiteren Anreicherung des Acetylcyanamids kann das organische Lösemittel mit einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung extrahiert werden. Die Extraktion kann nach den üblichen Methoden durch wiederholtes Ausschütteln erfolgen. Zur Überführung des Acetylcyanamids aus der organischen in die wäßrige Phase haben sich neben wäßrigen Alkalihydroxiden auch wäßrige Lösungen von Alkalisalzen schwacher Säuren wie beispielsweise Natriumcarbonat oder Natriumhydrogencarbonat in der Praxis besonders bewährt. Zur Einstellung einer für die Bestimmung geeigneten Konzentration wird der wäßrige Extrakt schonend zur Trockne eingedampft und in einer definierten Menge Wasser gelöst, so daß die Konzentration des Acetylcyanamids bei ungefähr 1 mg/kg liegt. Bei der anschließenden Flüssigkeitschromatographie an einer Austauscherphase, vorzugsweise an einer handelsüblichen Trennkolonne AS-3 der Firma Dionex, wird als mobile Phase eine Lösung aus Salzen der Kohlensäure verwendet. Als besonders vorteilhaft für die Abtrennung von Acetylcyanamid an einer Austauscherphase erwies sich ein wäßriges Puffergemisch aus Natriumcarbonat und Natriumhydrogencarbonat. Es ist aber auch möglich, die Flüssigkeitschromatographie des Acetylcyanamids an einer Umkehrphase durchzuführen. Eine geeignete Trennkolonne stellt beispielsweise Nucleosil 5 µ C-18, 250×4,6 der Firma Macherey und Nagel dar. Als mobile Phase eignet sich ein üblicher Phosphatpuffer von pH 6,8 mit Tetrabutylammoniumhydrogensulfat in einem Methanol- Wasser-Gemisch.To further enrich the acetylcyanamide, this can be done organic solvents with a weakly alkaline aqueous solution are extracted. The extraction can by the usual methods by repeated Shake out. To transfer the Acetylcyanamids from the organic to the aqueous phase have in addition to aqueous alkali hydroxides also aqueous Solutions of alkali salts of weak acids such as for example sodium carbonate or Sodium hydrogen carbonate has proven particularly useful in practice. To set a suitable one for the determination The aqueous extract gently becomes a concentration Evaporated to dryness and in a defined amount of water solved so that the concentration of acetylcyanamide at is about 1 mg / kg. In the subsequent Liquid chromatography on an exchange phase, preferably on a commercially available separation column AS-3 from Dionex is a solution as a mobile phase from carbonic acid salts. As special advantageous for the separation of acetylcyanamide one exchange phase turned out to be aqueous Buffer mixture of sodium carbonate and Sodium bicarbonate. But it is also possible that Liquid chromatography of acetylcyanamide on one Reverse phase. A suitable separation column represents, for example, Nucleosil 5 µ C-18, 250 × 4.6 Macherey and Nagel. Suitable as a mobile phase a common phosphate buffer with pH 6.8 Tetrabutylammonium hydrogen sulfate in a methanol Water mixture.
Zur Bestimmung von Acetylcyanamid in einer komplexen Matrix wie beispielsweise Urin ist es erforderlich, zwei hintereinander geschaltete Trennsäulen (5 und 6) zu verwenden. Vorteilhafterweise wird für die Trennung eine Säulenschaltung eingesetzt, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. In Fig. 1 stellt (3) ein Vorratsgefäß dar, das die jeweils zu verwendende mobile Phase enthält. Pumpe (1) fördert in Stellung (11) des Schaltventils (8) die mobile Phase bzw. die am Einspritzventil (4) eingebrachte Analysenprobe durch die Trennsäule (5), über die Rückdruckeinrichtung (7) zum Auslaß (13). In Stellung (12) des Schaltventils (8) erfolgt die Förderung durch die Trennsäulen (5) und (6) durch den Suppressor (9) zum Detektor (10) und zum Auslaß (13). Die Pumpe (2) dient zur Förderung der mobilen Phase aus dem Vorratsgefäß (3), in Ventilstellung (12) durch die Rückdruckvorrichtung (7) bzw. in Ventilstellung (11) zur Beschickung der Trennsäule (6), des Suppressors (9) und des Detektors (10) .To determine acetylcyanamide in a complex matrix such as urine, it is necessary to use two columns ( 5 and 6 ) connected in series. A column circuit as shown in FIG. 1 is advantageously used for the separation. In Fig. 1 ( 3 ) represents a storage vessel which contains the mobile phase to be used in each case. In position ( 11 ) of the switching valve ( 8 ), the pump ( 1 ) conveys the mobile phase or the analysis sample introduced at the injection valve ( 4 ) through the separation column ( 5 ), via the back pressure device ( 7 ) to the outlet ( 13 ). In position ( 12 ) of the switching valve ( 8 ), the delivery through the separating columns ( 5 ) and ( 6 ) takes place through the suppressor ( 9 ) to the detector ( 10 ) and to the outlet ( 13 ). The pump ( 2 ) serves to convey the mobile phase from the storage vessel ( 3 ), in the valve position ( 12 ) through the back pressure device ( 7 ) or in the valve position ( 11 ) for feeding the separation column ( 6 ), the suppressor ( 9 ) and of the detector ( 10 ).
Zur Ermittlung der Säulenschaltzeiten wird zunächst nur Trennsäule (5) mit dem Ionenchromatograph verbunden und ein Natrium- Acetylcyanamid-Standard aufgegeben. Man bestimmt die Zeiten zu Beginn (t 1) und zu Ende (t 2) des Acetylcyanamid-Signals. Zur Analyse werden die Trennsäulen (5 und 6) sowie die Rückdruckeinrichtung (7) entsprechend der Anordnung in Fig. 1 eingebaut und die aufbereitete Probelösung bzw. der Standard eingespritzt. Das Schaltventil (8) wird zu den Zeiten (t 1) und (t 2) jeweils betätigt.To determine the column switching times, only the separation column ( 5 ) is first connected to the ion chromatograph and a sodium acetylcyanamide standard is applied. The times at the beginning ( t 1 ) and at the end ( t 2 ) of the acetylcyanamide signal are determined. For analysis, the separating columns ( 5 and 6 ) and the back pressure device ( 7 ) are installed in accordance with the arrangement in FIG. 1 and the prepared sample solution or the standard is injected. The switching valve ( 8 ) is actuated at times ( t 1 ) and ( t 2 ).
Wird eine Matrix verwendet, die nur einen geringen Anteil störender Substanzen enthält, kann die Bestimmung mit nur einer Trennsäule erfolgen.If a matrix is used that has only a small proportion contains interfering substances, the determination with only one separation column.
Fig. 2 gibt Ionenchromatogramme des Acetylcyanamids, die bei einer Wellenlänge von 220 nm aufgezeichnet wurden, wieder und zeigt die hohe Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Analysenmethode auf. FIG. 2 shows ion chromatograms of acetylcyanamide, which were recorded at a wavelength of 220 nm, and shows the high sensitivity of the analysis method according to the invention.
Der Peak X in Chromatogramm 1 stammt von einem Acetylcyanamid-Standard, die Blindprobe im Chromatogramm 2 zeigt praktisch kein Acetylcyanamid-Signal und Chromatogramm 3 weist das Ergebnis einer nach dem Verfahren der Erfindung analysierten menschlichen Urinprobe aus.The peak X in chromatogram 1 comes from an acetylcyanamide standard, the blank sample in chromatogram 2 shows practically no acetylcyanamide signal and chromatogram 3 shows the result of a human urine sample analyzed according to the method of the invention.
Die hochspezifische und empfindliche Analysenmethode hat sich auch in Gegenwart störender Substanzen, wie sie in den Chromatogrammen 2 und 3 durch starke Peaks nachweisbar sind, bewährt. Die Bestimmungsgrenze für Acetylcyanamid liegt unter 10 µg/kg. Sie wurde aus der 10fachen Standardabweichung der Signalgröße von auf 20 ppb Acetylcyanamid aufgestockten Urinproben errechnet.The highly specific and sensitive analysis method has also proven itself in the presence of interfering substances, as can be detected in chromatograms 2 and 3 by strong peaks. The limit of quantification for acetylcyanamide is below 10 µg / kg. It was calculated from the 10-fold standard deviation of the signal size of urine samples increased to 20 ppb acetylcyanamide.
Säulenanordnung gemäß Fig. 1
Trennsäule (5, 6): As-3 Dionex
Ionenchromatograph: Dionex 2010 i
Suppressor zur Anionenchromatographie (9): Dionex
Integrator: SP 4290 oder äquivalent
Detektor (10): UV Kontron Uvikon 720 LC oder äquivalent
Wellenlänge: 220 nm
Mobile Phase: Natriumcarbonat wäßrige 0,0044 mol/l,
Natriumhydrogencarbonat wäßrig
0,0056 mol/l Volumenverhältnis 1 : 1
Einspritzmenge: 10-100 µl
Durchflußgeschwindigkeit: 2,0 bis 2,3 ml/min.
Column arrangement according to FIG. 1
Separation column ( 5, 6 ): As-3 Dionex
Ion chromatograph: Dionex 2010 i
Anion chromatography suppressor ( 9 ): Dionex
Integrator: SP 4290 or equivalent
Detector ( 10 ): UV Kontron Uvikon 720 LC or equivalent
Wavelength: 220 nm
Mobile phase: sodium carbonate aqueous 0.0044 mol / l, sodium hydrogen carbonate aqueous 0.0056 mol / l volume ratio 1: 1
Injection volume: 10-100 µl
Flow rate: 2.0 to 2.3 ml / min.
HPLC: Beckmann-System Gold oder äquivalent
Trennsäule (5, 6): Nucleosil 5 µ C-18, 250 · 4,6;
Macherey und Nagel oder äquivalent
Integrator: SP 4290 oder äquivalent
Detektor (10): UV Kontron Uvikon 720 LC oder
äquivalent
Wellenlänge: 220 nm
Mobile Phase: 120 ml Methanol, 600 ml Wasser
80 ml Phosphatpuffer pH 6,8, 220 mg
Tetrabutylammoniumhydrogensulfat
Einspritzmenge: 10 bis 100 µl
Durchflußgeschwindigkeit: 0,8 bis 1,2 ml/min.
HPLC: Beckmann system gold or equivalent
Separation column ( 5 , 6 ): Nucleosil 5 µ C-18, 250 x 4.6; Macherey and Nagel or equivalent
Integrator: SP 4290 or equivalent
Detector ( 10 ): UV Kontron Uvikon 720 LC or equivalent
Wavelength: 220 nm
Mobile phase: 120 ml methanol, 600 ml water 80 ml phosphate buffer pH 6.8, 220 mg tetrabutylammonium hydrogen sulfate
Injection volume: 10 to 100 µl
Flow rate: 0.8 to 1.2 ml / min.
Eine Urinprobe wird mit entionisiertem Wasser auf ungefähr 1 mg/l Acetylcyanamid verdünnt. 150 ml dieser Lösung werden mit 20%iger Natronlauge auf pH 11 bis 11,5 gestellt und 2,5 bis 3 g Aktivkohle zugesetzt. Die Analysenprobe wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und durch ein 0,45 µm Membranfilter von der Aktivkohle abgetrennt. Die Aktivkohle wird mit 25 ml 0,01 m Natronlauge gewaschen, Filtrat und Waschflüssigkeit vereinigt und auf 200 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt.A urine sample is made up with deionized water diluted approximately 1 mg / l acetylcyanamide. 150 ml of this Solution are adjusted to pH 11 to 11.5 with 20% sodium hydroxide solution provided and 2.5 to 3 g of activated carbon added. The Analysis sample is stirred for 30 minutes at room temperature and through a 0.45 µm membrane filter from the activated carbon separated. The activated carbon becomes 0.01 m with 25 ml Washed sodium hydroxide solution, filtrate and washing liquid combined and to 200 ml with deionized water replenished.
Als Vergleichslösung wird ein Standard von ungefähr 20 mg Natrium-Salz des Acetylcyanamids in 1000 ml Wasser verwendet. Dieser Standard wird im Volumenverhältnis 1 : 10 mit Wasser verdünnt und 50 µl hiervon in die Trennsäule (5) eingespritzt, die mit dem Ionenchromatographen verbunden ist. Es werden die Zeiten zu Beginn (t 1) und zu Ende (t 2) des Acetylcyanamid-Signals gemessen. A standard of approximately 20 mg of sodium salt of acetylcyanamide in 1000 ml of water is used as the comparison solution. This standard is diluted 1:10 with water in a volume ratio and 50 μl of it is injected into the separation column ( 5 ), which is connected to the ion chromatograph. The times at the beginning ( t 1 ) and end ( t 2 ) of the acetylcyanamide signal are measured.
Zur Durchführung der Analyse der Urinprobe werden alle Apparate gemäß dem Schaltplan der Fig. 1 verbunden. 50 µl der vorbereiteten Urinprobe werden eingespritzt und das Schaltventil zu den Zeiten (t 1) und (t 2) umgestellt. Die Durchflußgeschwindigkeit der mobilen Phase beträgt 2,0 bis 2,3 ml/min. Die Messung der Konzentration des Acetylcyanamids erfolgt bei einer Wellenlänge von 220 nm.To carry out the analysis of the urine sample, all apparatus are connected in accordance with the circuit diagram in FIG . 50 µl of the prepared urine sample are injected and the switching valve is switched at times ( t 1 ) and ( t 2 ). The flow rate of the mobile phase is 2.0 to 2.3 ml / min. The concentration of the acetylcyanamide is measured at a wavelength of 220 nm.
Die Messung wird unter wechselseitiger Aufgabe des Standards und der Urinprobe mehrfach wiederholt.The measurement is carried out under the mutual task of Standards and the urine sample repeated several times.
Die Auswertung der Messung erfolgt nach der GleichungThe measurement is evaluated according to the equation
ppm Acy = Konzentration des Acetylcyanamids
CS = Konzentration des Natriumacetylcyanamids im Standard
F = Verdünnungs- oder Konzentrations-Faktor der Probelösung
HPr = Höhe des Peaks der Probe bzw. Fläche des Peaks
HS = Höhe des Peaks des Standards bzw. Fläche des Peaks
ppm Acy = concentration of acetylcyanamide
CS = concentration of sodium acetyl cyanamide in the standard
F = dilution or concentration factor of the sample solution
HPr = height of the peak of the sample or area of the peak
HS = height of the peak of the standard or area of the peak
150 ml einer Urinprobe werden mit 20%iger Natronlauge auf pH 11 bis 11,5 gestellt. Eine eventuell auftretende weiße Fällung bleibt unbeachtet. Die Lösung wird mit 2,5 bis 3 g Aktivkohle 30 Minuten lang gerührt und anschließend durch ein 0,45 µm Membranfilter von der Aktivkohle abgetrennt. Nach zweimaliger Wiederholung der Behandlung mit Aktivkohle wird diese zweimal mit je 5 ml 0,01 m Natronlauge gewaschen und die vereinigten Filtrate mit Schwefelsäure auf pH 1,3 bis 1,4 gestellt. Genau 100 ml dieser Lösung werden dreimal mit je 100 ml Essigsäureethylester extrahiert.150 ml of a urine sample are mixed with 20% sodium hydroxide solution adjusted to pH 11 to 11.5. A possibly occurring white precipitation is ignored. The solution comes with 2.5 to 3 g of activated carbon stirred for 30 minutes and then through a 0.45 µm membrane filter from the Activated carbon separated. After repeating the Treatment with activated carbon is carried out twice with 5 ml each Washed 0.01 M sodium hydroxide solution and the combined filtrates adjusted to pH 1.3 to 1.4 with sulfuric acid. Exactly 100 ml of this solution are three times with 100 ml Extracted ethyl acetate.
Die von der wäßrigen Lösung getrennten und vereinigten Essigesterphasen werden dreimal mit je 5 ml 0,05 m wäßriger Natriumcarbonatlösung extrahiert, die wäßrigen Lösungen vereint und bei einer Badtemperatur von maximal 40°C im Vakuum am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft.The separated and combined from the aqueous solution Ethyl ester phases are three times with 5 ml 0.05 m extracted aqueous sodium carbonate solution, the aqueous Solutions combined and at a bath temperature of maximum 40 ° C in a vacuum on a rotary evaporator to dryness evaporated.
Der Rückstand wird in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst und gegebenenfalls mit entionisiertem Wasser auf eine ungefähre Acetylcyanamidkonzentration von 1 mg/l verdünnt. 50 µl dieser Lösung werden in den Ionenchromatographen eingespritzt und Bestimmung und Berechnung analog zu Beispiel 1 durchgeführt. The residue is dissolved in 10 ml of deionized water and optionally with deionized water on a approximate acetylcyanamide concentration of 1 mg / l diluted. 50 µl of this solution are in the Ion chromatograph injected and determination and Calculation carried out analogously to Example 1.
Ungefähr 10 ml einer Cyanamid enthaltenden Lösung werden mit 4 ml 40%iger Natronlauge alkalisiert und die Lösung mit 10 ml Diethylether überschichtet. Es werden 1 ml Essigsäureanhydrid in 10 ml Diethylether hinzugefügt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Diethylether wird im Rotationsverdampfer abgezogen und die zurückbleibende wäßrige Lösung, deren pH-Wert bei ungefähr 11,5 liegen soll, mit 2 g Aktivkohle 30 Minuten verrührt. Von der Aktivkohle wird abfiltriert, die Kohle zweimal mit je 5 ml 0,01 m Natronlauge gewaschen und die vereinigten wäßrigen Phasen mit halbkonzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 gestellt.Approximately 10 ml of a solution containing cyanamide alkalized with 4 ml of 40% sodium hydroxide solution and the solution covered with 10 ml of diethyl ether. 1 ml Acetic anhydride added in 10 ml of diethyl ether and shaken for one hour at room temperature. The Diethyl ether is removed in a rotary evaporator and the remaining aqueous solution, whose pH at should be around 11.5, with 2 g of activated carbon for 30 minutes stirred. The charcoal is filtered off, the charcoal washed twice with 5 ml of 0.01 M sodium hydroxide solution and the combined aqueous phases with semi-concentrated Adjusted sulfuric acid to pH 1.
Die saure Lösung wird in Analogie zu Beispiel 2 extrahiert, weiterbehandelt und beispielsweise an einer Umkehrphase unter HPLC-Bedingungen abgetrennt und spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 220 nm bestimmt.The acidic solution is analogous to Example 2 extracted, further processed and for example on one Reverse phase separated under HPLC conditions and spectrophotometric at a wavelength of 220 nm certainly.
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