DE3821407C2

DE3821407C2 -

Info

Publication number: DE3821407C2
Application number: DE19883821407
Authority: DE
Inventors: Masumi Suzuki; Kyoko Katsuta Jp Imai; Yasushi Mito Jp Nomura
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-06-26
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1992-07-02
Also published as: JPS643563A; DE3821407A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz für Immunoassays gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Immunoassay-Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 12.The invention relates to a reagent for Immunoassays according to the preamble of Claim 1 and an immunoassay method according to the preamble of claim 12.

Immunoassays wurden bisher typischerweise als Radioimmunoassays durchgeführt, wobei eine quantitative Analyse eines Antigens in einer Probe durchgeführt wird und man sich der Antigen-Antikörper-Reaktion eines mit einem Radioisotop mar kierten Antikörpers mit dem Antigen in der Probe bedient. Je doch sind derartige Immunoassays sehr aufwendig. Daher wurde ein einfacheres Verfahren vorgeschlagen, bei dem die quantita tive Analyse unter Verwendung von Mikrokapseln durchgeführt wird.Immunoassays have been typically used as radioimmunoassays carried out, a quantitative analysis of a Antigen is carried out in a sample and you look at the Antigen-antibody reaction of one with a radioisotope mar cated antibody with the antigen served in the sample. Each however, such immunoassays are very expensive. Therefore proposed a simpler procedure in which the quantitative tive analysis performed using microcapsules becomes.

Ein Immunoassay unter Verwendung von Mikrokapseln als Träger zur Durchführung einer Immunoreaktion ist in der JP-OS 56 79 255 beschrieben. Gemäß diesem Stand der Technik wird die Einführung einer fluoreszierenden Substanz oder einer UV-absorbierenden Substanz in Mikrokapseln vorgeschlagen. Ein weiterer Immunoassay unter Verwendung von Mikrokapseln ist in JP-OS 6 11 76 855 beschrieben. Dieser Stand der Technik be schreibt ein Verfahren, bei dem ein chelatbildendes Mittel in Mikrokapseln eingeführt wird, die Mikrokapseln in einer Metall ionen enthaltenden Flüssigkeit dispergiert werden, eine Immunoreaktion eines an die Membranoberfläche der Mikrokapseln gebundenen Antigens mit einem zu bestimmenden Antikörper in einer Probe in Gegenwart eines Komplements zur Lysis der Mikrokapselmembranen durchgeführt wird und die Absorption auf grund des farbbildenden Komplexes, der aus dem aus den Mikro kapseln freigesetzten chelatbildenden Mittel und den Metall ionen gebildet worden ist, mißt.An immunoassay using microcapsules as a carrier to carry out an immunoreaction is in the JP-OS 56 79 255 described. According to this state of the art will introduce a fluorescent substance or a UV-absorbing substance proposed in microcapsules. A another immunoassay using microcapsules is in JP-OS 6 11 76 855. This prior art be writes a method in which a chelating agent in Microcapsules is introduced, the microcapsules in a metal ion-containing liquid are dispersed, a Immunoreaction of one on the membrane surface of the microcapsules bound antigen with an antibody to be determined in a sample in the presence of a complement to the lysis of the Microcapsule membranes are carried out and the absorption on because of the color-forming complex that results from the micro encapsulate released chelating agents and the metal ion has been formed.

JP-OS 61 66 963 beschreibt den gleichen Immunoassay wie in JP-OS 56 79 255, wobei Liposomen mit einem Gehalt an einem chelatbildenden Mittel, wie vorstehend erwähnt, verwendet wer den.JP-OS 61 66 963 describes the same immunoassay as in JP-OS 56 79 255, wherein liposomes containing one chelating agents, as mentioned above, who used the.

In JP-OS 6 11 76 555 werden 6 Arten von chelatbildenden Mitteln, z.B. 5-Br-PAPS, aufgeführt. Untersuchungen im Rahmen der vor liegenden Erfindung haben jedoch ergeben, daß diese chelatbil denden Mittel eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen und es somit schwierig ist, wäßrige Lösungen mit hohen Konzentrationen herzustellen. Außerdem wurde festgestellt, daß die Absorp tionswellenlänge des aus dem chelatbildenden Mittel und den Metallionen gebildeten Komplexes 560 nm oder weniger betrug, so daß die Absorption aufgrund von aus der Blutprobe stammen den Verunreinigungen, wie Hämoglobin und Bilirubin, die gemes senen Werte nachteilig beeinflußt.JP-OS 6 11 76 555 describes 6 types of chelating agents, e.g. 5-Br-PAPS. Investigations in the context of However, lying invention have shown that these chelatbil detergents have a low water solubility and it thus it is difficult to use aqueous solutions with high concentrations to manufacture. It was also found that the Absorp tion wavelength of the chelating agent and the Metal ion formed complex was 560 nm or less, so that the absorption due to come from the blood sample the impurities, such as hemoglobin and bilirubin, the measured its values adversely affected.

In Proceedings of the 26th Annual Meeting of Japan Society of Clinical Chemistry, Vol. 26, p. 159 (1986) wird ein kolorimetrisches Verfahren zur Eisenbestimmung in Serum von Kleinkindern beschrieben, wobei die Blutserumprobe mit 5-Nitro-PAPS vermischt und der entstehende Eisen- Chelatkomplex kolorimetrisch bestimmt wird.In Proceedings of the 26th Annual Meeting of Japan Society of Clinical Chemistry, vol. 26, p. 159 (1986) becomes a colorimetric method described for the determination of iron in serum of small children, the Blood serum sample mixed with 5-nitro-PAPS and the resulting iron Chelate complex is determined colorimetrically.

In Abstracts of the 35th Annual Meeting of Japan Society of Analytical Chemistry, p. 703 (1986) wird die Synthese von 5-Nitro-PAPS und dessen Reaktionen mit Metallionen aufgeführt. Es wird beschrieben, daß die 5- Nitro-PAPS-Komplexe mit Metallen wie z. B. Ni(II), Co(III), Fe(II), Cu(II) und Zn(II) Absorptionsmaxima von 566 bis 590 nm haben und daß der molekulare Extinktionskoeffizient dieser Komplexe den Wert 10⁵ erreicht.In Abstracts of the 35th Annual Meeting of Japan Society of Analytical Chemistry, p. 703 (1986) is the synthesis of 5-nitro-PAPS and its Reactions with metal ions listed. It is described that the 5- Nitro-PAPS complexes with metals such as B. Ni (II), Co (III), Fe (II), Cu (II) and Zn (II) have absorption maxima of 566 to 590 nm and that the molecular extinction coefficient of these complexes reaches 10⁵.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Immunoassay-Reagenz bereit zustellen, das die Durchführung eines Immunoassays unter Ver wendung von Mikrokapseln mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht, sowie ein entsprechendes Immunoassayverfahren anzugeben.The object of the invention is to prepare an immunoassay reagent to deliver that the execution of an immunoassay under Ver enables the use of microcapsules with high sensitivity, and to indicate a corresponding immunoassay method.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 bzw. 12 gelöst. This object is solved by the features of claims 1 and 12, respectively.

Als Salz von 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopro pylamino)-phenol kann beispielsweise das Natriumsalz (Nitro- PAPS) oder das Dinatriumsalz verwendet werden. Insbesondere wird Nitro-PAPS bevorzugt.As a salt of 2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopro pylamino) phenol, for example, the sodium salt (nitro- PAPS) or the disodium salt can be used. In particular Nitro-PAPS is preferred.

Das erfindungsgemäß verwendete Nitro-PAPS besitzt eine höhere Wasserlöslichkeit als andere chelatbildende Mittel und kann in einer Pufferlösung in einer Konzentration von mehreren 100 Millimol/Liter gelöst werden, Daher kann im Vergleich zu herkömmlichen chelatbildenden Mitteln die Konzentration des chelatbildenden Mittels als in den Mikrokapseln enthaltene Mikrosubstanz erhöht werden. Die Menge dieses aus den Mikro kapseln durch das Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt freige setzten chelatbildenden Mittels kann somit erhöht werden. Die Komplexbildungsreaktion von Nitro-PAPS mit den Metallionen ist äußerst empfindlich. Der molare Extinktionskoeffizient des ge bildeten Komplexes erreicht den Wert 10⁵. Somit ist das erfin dungsgemäß verwendete Nitro-PAPS gegenüber herkömmlichen che latbildenden Mitteln sowohl in Bezug auf Löslichkeit als auch in Bezug auf den molaren Extinktionskoeffizienten überlegen. Daher erhöht sich die Intensität der durch das Antigen-Anti körper-Reaktionsprodukt gebildeten Färbung, was zu einer er höhten Meßempfindlichkeit führt. Somit ist erfindungsgemäß die Bestimmung eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Blutprobe in geringen, nach herkömmlichen Verfahren zum Nach weis nicht ausreichenden Mengen möglich.The nitro-PAPS used according to the invention has a higher water solubility than other chelating agents and can be dissolved in a buffer solution in a concentration of several 100 millimoles / liter. Therefore, compared to conventional chelating agents, the concentration of the chelating agent can be compared to the micro substance contained in the microcapsules increase. The amount of this chelating agent released from the microcapsules released by the antigen-antibody reaction product can thus be increased. The complexation reaction of nitro-PAPS with the metal ions is extremely sensitive. The molar extinction coefficient of the complex formed reaches 10 ⁵ . Thus, the nitro-PAPS used according to the invention is superior to conventional chelating agents both in terms of solubility and in terms of the molar extinction coefficient. Therefore, the intensity of the color formed by the antigen-antibody reaction product increases, which leads to he increased sensitivity. Thus, according to the invention, the determination of an antigen or an antibody in a blood sample is possible in small amounts that are not sufficient according to conventional methods.

Die Absorptionswellenlängen von zahlreichen Komplexen von Nitro-PAPS mit Metallionen liegen oberhalb von 570 bis 590 nm und können sogar 590 nm oder mehr betragen. Daher kommt es zu weniger Fehlmessungen, die durch aus Blutproben stammende Verunreinigungen, wie Bilirubin oder Hämoglobin, verursacht werden können.The absorption wavelengths of numerous complexes of Nitro-PAPS with metal ions are above 570 to 590 nm and can even be 590 nm or more. That's where it comes from to fewer erroneous measurements by blood samples Contaminants such as bilirubin or hemoglobin can be.

Fig. 1 zeigt eine Eichkurve für Thyroxin (T₄), die in einer Ausführungsform der Erfindung angewandt wird. Figure 1 shows a calibration curve for thyroxine (T ₄ ) used in one embodiment of the invention.

Nitro-PAPS bedeutet, wie bereits erwähnt, 2-(5-Nitro-2-pyri dylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-phenol-natriumsalz. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde Nitro-PAPS der Firma Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan) verwendet.As already mentioned, nitro-PAPS means 2- (5-nitro-2-pyri dylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol sodium salt. Nitro-PAPS from Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan).

2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)- phenol-dinatriumsalz kann ebenfalls als chelatbildendes Mit tel verwendet werden. Das erfindungsgemäß verwendete chelat bildende Mittel wird nachstehend kurz als Nitro-PAPS bezeich net.2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) - phenol disodium salt can also act as a chelating agent tel can be used. The chelate used in the invention educational agent is referred to below as Nitro-PAPS net.

Beispiele für Metallionen, die zusammen mit Nitro-PAPS einen farbbildenden Komplex erzeugen, sind Ni(II)-, Co(II)-, Co(III)-, Fe(II)-, Zn(II)- und Cu(II)-Ionen und dergl.. Das Maximum der Absorptionskurve des Komplexes liegt bei 565 bis 595 nm. Daher kann erfindungsgemäß die Absorption im mittleren Wellenlängenbereich im sichtbaren Bereich gemessen werden. Examples of metal ions that combine with nitro-PAPS color-forming complex are Ni (II) -, Co (II) -, Co (III), Fe (II), Zn (II) and Cu (II) ions and the like. Das The maximum absorption curve of the complex is 565 to 595 nm. Therefore, according to the invention, the absorption in middle wavelength range measured in the visible range will.

Als Mikrokapseln können beispielsweise aus einem dünnen Lipid film gebildete sphärische Teilchen verwendet werden, z.B. Liposomen. Handelt es sich bei einer zu bestimmenden Substanz um ein Antigen oder einen Antikörper, so werden ein verwandter Antikörper bzw. ein verwandtes Antigen an die Membranoberflä che der Mikrokapseln gebunden, wodurch die Mikrokapseln mar kiert werden. Zur Herstellung derartiger Mikrokapseln kann das Verfahren von Hsia et al., Methods in Enzymology, Bd. 74, Seite 152 angewandt werden. Mikrokapseln mit einem Gehalt an Nitro-PAPS lassen sich erhalten, indem man ein Lipid in einer Nitro-PAPS-Lösung, die eine vorbestimmte Konzentration auf weist, unter Bildung einer großen Anzahl von Lipidteilchen, in denen Nitro-PAPS eingekapselt ist, dispergiert und an schließend die nicht-notwendigen Materialien durch Waschen entfernt. Der bevorzugte Teilchendurchmesser der Mikrokapseln beträgt 0,2 µm bis 1 mm, kann jedoch in einigen Fällen auch außerhalb dieses Bereichs liegen. Die Menge des in die Mikro kapseln eingeführten Nitro-PAPS beträgt üblicherweise 10 Mil limol oder mehr.Microcapsules can, for example, consist of a thin lipid spherical particles, e.g. Liposomes. Is it a substance to be determined to an antigen or an antibody, so be a relative Antibodies or a related antigen to the membrane surface surface of the microcapsules, whereby the microcapsules mar be cated. Can be used to produce such microcapsules the method of Hsia et al., Methods in Enzymology, Vol. 74, Page 152 can be applied. Microcapsules containing Nitro-PAPS can be obtained by placing a lipid in a Nitro-PAPS solution that has a predetermined concentration has, forming a large number of lipid particles, in which Nitro-PAPS is encapsulated, dispersed and on closing the unnecessary materials by washing away. The preferred particle diameter of the microcapsules is 0.2 µm to 1 mm, but can in some cases also are outside this range. The amount of in the micro capsules introduced nitro-PAPS is usually 10 mil lime or more.

Als Mikrokapseln können auch Schaferythrozyten und dergl. ne ben den vorerwähnten Liposomen verwendet werden. Bei sämtlichen Mikrokapseln wird ein Antigen oder ein Antikörper, entspre chend der zu bestimmenden Substanz, an die Membranoberfläche der Mikrokapseln gebunden.Sheep erythrocytes and the like can also be used as microcapsules ben the aforementioned liposomes can be used. With all Microcapsules will correspond to an antigen or an antibody according to the substance to be determined, to the membrane surface of the microcapsules bound.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln können in fester Form be reitgestellt werden, z.B. durch Gefriertrocknen. In diesem Fall werden die Mikrokapseln zum Zeitpunkt der Durchführung eines Immunoassays in Form einer Dispersion in einer wäßrigen Lö sung eingesetzt. Da die Gefriertrocknung zu einer Stabili sierung der Mikrokapseln führt, stellen gefriergetrocknete Mikrokapseln eine bevorzugte Ausführungsform dar.The microcapsules according to the invention can be in solid form be provided, e.g. by freeze drying. In this case the microcapsules at the time of performing a Immunoassays in the form of a dispersion in an aqueous solution solution used. As freeze drying becomes a stabilizer of the microcapsules, freeze-dried Microcapsules represent a preferred embodiment.

Bei der Durchführung eines Immunoassays werden eine große Anzahl von Mikrokapseln, in denen eine Nitro-PAPS-Lösung in hoher Konzentration eingekapselt ist, in einer Flüssigkeit, die die vorstehend beschriebenen Metallionen enthält, disper giert. In diesem Fall liegen die Metallionen außerhalb der Mi krokapseln vor. Es ist auch möglich, die vorstehend erhaltene Dispersion einer Gefriertrocknung zu unterwerfen und das ge friergetrocknete Produkt in Form einer Dispersion in einer wäßrigen Lösung zum Zeitpunkt des Immunoassays einzusetzen.When performing an immunoassay, it will be a great one Number of microcapsules in which a nitro-PAPS solution in high concentration is encapsulated in a liquid containing the metal ions described above, disper yaws. In this case, the metal ions are outside the Mi crocapsules before. It is also possible to use the one obtained above Subjecting the dispersion to freeze drying and the ge freeze dried product in the form of a dispersion in a use aqueous solution at the time of the immunoassay.

Wird ein Reagenz für Immunoassays, das die Mikrokapseln mit dem daran gebundenen Antigen oder Antikörper, die Metallionen und ein Reagenz, das die Membranlysis der Mikrokapseln in Ge genwart eines Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukts verursa chen kann, z.B. ein Komplement, enthält, mit einer ein zu be stimmendes Antigen oder Antikörper enthaltenden Probe, z.B. einer Blutprobe,vermischt, so reagiert das Antigen oder der Antikörper an der Membranoberfläche der Mikrokapseln mit dem Antikörper oder dem Antigen in der Probe, und das vorhandene Komplement erkennt zusammen mit diesen das Antigen-Antikör per-Reaktionsprodukt und verursacht die Membranlysis nur von den Mikrokapseln, an denen die Immunoreaktion stattgefunden hat. Als Komplement können beispielsweise tierische Seren, wie Kaninchenserum und dergl., sowie Humanserum verwendet werden. Nach Lysis der Mikrokapselmembranen fließt das in den Mikrokapseln eingekapselte Nitro-PAPS aus und bildet mit den in der Flüssigkeit außerhalb der Mikrokapseln enthaltenen Metallionen einen farberzeugenden Komplex. Da die Menge des auf diese Weise gebildeten Komplexes proportional zur Menge des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers in der Probe ist, wird das Antigen oder der Antikörper quantitativ be stimmt, indem man die Farbänderung im Reaktionsgemisch, die mit der Immunoreaktion einhergeht, mittels eines Absorptions meßgeräts mißt.Will be a reagent for immunoassays that contains the microcapsules the attached antigen or antibody, the metal ions and a reagent that detects the membrane lysis of the microcapsules in Ge presence of an antigen-antibody reaction product can e.g. a complement, containing, with a one to be matching antigen or antibody containing sample, e.g. a blood sample, mixed, the antigen or the reacts Antibodies on the membrane surface of the microcapsules with the Antibody or the antigen in the sample, and the one present Together with these, complement recognizes the antigen antibody per-reaction product and causes membrane lysis only from the microcapsules on which the immunoreaction took place Has. Animal sera, such as rabbit serum and the like, and human serum are used will. After lysis of the microcapsule membranes, this flows into the Microcapsules encapsulated nitro-PAPS and forms with the contained in the liquid outside the microcapsules Metal ions form a color-forming complex. Because the amount of complex formed in this way proportional to the amount of the antigen or antibody to be determined in the sample , the antigen or the antibody is quantitatively true by looking at the color change in the reaction mixture, the associated with the immunoreaction, by means of an absorption measuring device.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Reaktionssystemen unter Verwen dung eines Radioisotops als Markierungssubstanz erfordert das erfindungsgemäße Reaktionssystem unter Verwendung von Mikro kapseln weder die Unterscheidung zwischen Reaktionsprodukt und nicht-umgesetzten Materialien noch ein Abwaschen von nicht umgesetzten Materialien. Daher lassen sich die Wasch- und Pipettierstufen verringern, so daß auch die Fehlermöglichkei ten aufgrund der einzelnen Arbeitsschritte vermindert werden.In contrast to conventional reaction systems under use Use of a radioisotope as a labeling substance requires this reaction system according to the invention using micro do not encapsulate the distinction between reaction product and unreacted materials still do not wash off implemented materials. Therefore, the washing and Reduce pipetting levels so that the possibility of error due to the individual work steps.

Als Reagenz, das das Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt er kennt und die Lysis der Mikrokapselmembranen durchführt, kön nen anstelle von Komplement spezielle Metallsalze, wie Mag nesium- und Calciumsalze, verwendet werden. Dies bedeutet, daß Magnesiumsalze und Calciumsalze die gleiche Aktivität wie Komplement aufweisen und die Mikrokapseln, an denen das Immunoreaktionsprodukt gebildet worden ist, unter Lysis der Membranen angreifen. Da die Anzahl der Mikrokapseln, deren Membranen einer Lysis unterzogen worden sind, proportional zur Menge des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers ist, ist die Menge des aus den Mikrokapseln freigesetzten Nitro-PAPS ebenfalls proportional zur Menge des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers. Das freigesetzte Nitro-PAPS reagiert mit den Metallionen außerhalb der Mikrokapseln unter Bildung eines Komplexes. Der Grad der gebildeten Färbung entspricht der Menge des freigesetzten Nitro-PAPS. Daher läßt sich die Konzentration an Antigen oder Antikörper in der Probe bestim men, indem man vorher eine Eichkurve aufstellt, wobei eine Korrelation zwischen der Konzentration des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers zum Färbungsgrad aufgestellt wird, und durch Vergleich des gemessenen Werts mit der Eichkurve läßt sich für die Probe ein Meßwert ablesen.As a reagent that he the antigen-antibody reaction product knows and performs the lysis of the microcapsule membranes, can Instead of complement, special metal salts such as Mag nesium and calcium salts can be used. This means that Magnesium salts and calcium salts have the same activity as Have complement and the microcapsules on which the Immunoreaction product has been formed under lysis of the Attack membranes. Since the number of microcapsules, whose Membranes have been subjected to lysis, proportional to Amount of antigen or antibody to be determined is the amount of nitro-PAPS released from the microcapsules also proportional to the amount of antigen to be determined or antibody. The released nitro-PAPS reacts with the metal ions outside the microcapsules to form of a complex. The degree of coloring formed corresponds the amount of nitro-PAPS released. Therefore, the Determine the concentration of antigen or antibody in the sample by establishing a calibration curve beforehand, whereby a Correlation between the concentration of the to be determined Antigen or antibody to the degree of staining is set up, and by comparing the measured value with the calibration curve read a measured value for the sample.

Zum Zeitpunkt des Immunoassays kann erfindungsgemäß eine vor her hergestellte Flüssigkeit verwendet werden, die Metallionen für eine Komplexbildung und das Reagenz, das die Membranlysis der Mikrokapseln hervorrufen kann, z.B. ein Komplement, ein Magnesiumsalz oder ein Calciumsalz, enthält. At the time of the immunoassay, according to the invention, a pre Manufactured liquid used, the metal ions for complex formation and the reagent that membrane lysis that can produce microcapsules, e.g. a complement, a Magnesium salt or a calcium salt contains.

Zum Zeitpunkt des Immunoassays kann auch eine vorher herge stellte Flüssigkeit verwendet werden, die die Mikrokapseln, die Metallionen für die Komplexbildung und das Reagenz, das die Membranlysis der Mikrokapseln hervorrufen kann, enthält. Ferner ist es möglich, diese Flüssigkeit mit einem Gehalt an den drei Komponenten gefrierzutrocknen und zum Zeitpunkt des Immunoassays dieses gefriergetrocknete Produkt in Form einer Dispersion in einer wäßrigen Lösung einzusetzen.At the time of the immunoassay, a previous one can also be given put liquid to be used which the microcapsules the metal ions for complex formation and the reagent that contains the membrane lysis that can cause microcapsules. It is also possible to contain this liquid freeze dry the three components and at the time of Immunoassays this freeze-dried product in the form of a Use dispersion in an aqueous solution.

Nachstehend wird eine Ausführungsform der Erfindung näher er läutert. Zunächst wird eine in Mikrokapseln einzukapselnde Lösung hergestellt. Diese Lösung, die als innere Phase der Mikrokapseln dient, wird hergestellt, indem man Nitro-PAPS in einer Pufferlösung in einer Konzentration von 600 Milli mol/Liter löst. Ein mit einem Antigen oder einem Antikörper markierbares Lipid wird in dieser Nitro-PAPS-Lösung disper giert, um eine große Anzahl von Teilchen mit einem Gehalt an der Nitro-PAPS-Lösung zu erhalten. Die Flüssigkeit im Außen raum der Teilchen (Mikrokapseln) wird wiederholt ersetzt, um die äußere Oberfläche der Teilchen zu waschen. Nach dem Wa schen wird Thyroxin (nachstehend als T₄ bezeichnet)-Antigen gemäß dem Verfahren von Hsia (a.a.O.) an den Membranen ange bracht, um die Membranen zu markieren. Die auf diese Weise hergestellten Mikrokapseln können nach Verdünnen mit einer Pufferlösung als Reagenz für Immunoassays verwendet werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Mikrokapseln als Reagenz für Immunoassays in Form von Granulat oder Tabletten zu verwenden, indem man beispielsweise die Mikrokapseln einer Gefriertrocknung unterwirft.An embodiment of the invention is explained in more detail below. First, a solution to be encapsulated in microcapsules is made. This solution, which serves as the inner phase of the microcapsules, is prepared by dissolving nitro-PAPS in a buffer solution at a concentration of 600 millimoles / liter. A lipid labeled with an antigen or an antibody is dispersed in this nitro-PAPS solution to obtain a large number of particles containing the nitro-PAPS solution. The liquid in the outer space of the particles (microcapsules) is repeatedly replaced to wash the outer surface of the particles. After washing, thyroxine (hereinafter referred to as T ₄ ) antigen is applied to the membranes according to the Hsia (loc. Cit.) Method to label the membranes. The microcapsules produced in this way can be used as a reagent for immunoassays after dilution with a buffer solution. Another possibility is to use the microcapsules as a reagent for immunoassays in the form of granules or tablets, for example by subjecting the microcapsules to freeze drying.

10 ml der auf diese Weise hergestellten Mikrokapseln werden in einer isotonen Lösung von Natriumchlorid mit einer Konzen tration von 0,154 Mol/Liter gelöst. Anschließend wird eine Lösung von Kobaltionen in einer solchen Menge zugesetzt, daß sich eine Kobaltionenkonzentration von 20 Millimol/Liter er gibt. Sodann wird 1 ml Komplement zugesetzt. Das erhaltene Ge misch wird auf 100 ml aufgefüllt. Die Kobaltionenlösung ist hergestellt worden, indem man Kaliumperjodat (KJO₄) als Oxida tionsmittel zu einer CoCl₂-Lösung gibt, um dreiwertige Kobalt ionen zu bilden. Die Flüssigkeit, die die Mikrokapseln, die Metallionen für die Komplexbildung und das Komplement ent hält, wird in einem Behälter aufbewahrt und kann gegebenen falls als flüssiges Reagenz für Immunoassays verwendet werden.10 ml of the microcapsules produced in this way are dissolved in an isotonic solution of sodium chloride with a concentration of 0.154 mol / liter. Then a solution of cobalt ions is added in such an amount that there is a cobalt ion concentration of 20 millimoles / liter. Then 1 ml of complement is added. The mixture obtained is made up to 100 ml. The cobalt ion solution was prepared by adding potassium periodate (KJO ₄ ) as an oxidizing agent to a CoCl ₂ solution to form trivalent cobalt ions. The liquid containing the microcapsules, the metal ions for the complex formation and the complement ent is stored in a container and can optionally be used as a liquid reagent for immunoassays.

Anschließend kann der erfindungsgemäße Immunoassay durchge führt werden, wobei man beispielsweise ein automatisches klini sches Analysengerät verwendet. Zunächst wird eine Serie von Probenbehältern mit einem Gehalt an Serum, in dem das zu be stimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper enthal ten sind, in den Probenteil des Analysengeräts gegeben. Der Reaktionsteil des Analysengeräts befindet sich in einem auf 37°C thermostatisierten Wasserbad. Eine Reihe von Reaktions behältern wird in Abständen in das Bad bewegt. Eine Proben pipettiervorrichtung, eine Reagenzienzufuhrvorrichtung und ein Photometer mit Mehrfachwellenlängen ist in der Nähe des Reaktionsteils vorgesehen. Die Serumprobe wird aus dem Pro benbehälter im Probenteil mittels der Probenpipettiervorrich tung entnommen und dem Reaktionsbehälter in der Reaktionsket te in einer Menge von 3 µl zugeführt. Der Reaktionsbehälter wird sodann an die Reagenzienzugabestelle gebracht und mit 500 µl des auf die vorstehende Weise hergestellten flüssi gen Immunoassay-Reagenz mittels der Reagenzzufuhrvorrich tung versetzt. Anschließend wird das erhaltene Gemisch im Reaktionsbehälter inkubiert, während die Reihe der Reaktions behälter transportiert wird. Nach 30 Minuten kommt der Reak tionsbehälter, der das einer Immunoreaktion unterzogene Reak tionsgemisch enthält, am Meßteil des Photometers zur Mes sung der Lichtintensität an. Das Reaktionsgemisch wird mit Licht bestrahlt. Das durch den Reaktionsbehälter durchgelas sene Licht wird in seine spektralen Komponenten aufgeteilt. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm wird gemes sen. Anschließend werden die Meßergebnisse in einer Rechen einheit berechnet. Sodann wird die T₄-Konzentration in der Probe mit einem Drucker ausgedruckt.The immunoassay according to the invention can then be carried out, for example using an automatic clinical analyzer. First, a series of sample containers containing serum in which the antigen to be determined or the antibody to be determined are contained are placed in the sample part of the analyzer. The reaction part of the analyzer is in a water bath thermostatted to 37 ° C. A number of reaction containers are moved into the bath at intervals. A sample pipetting device, a reagent supply device and a multi-wavelength photometer are provided in the vicinity of the reaction part. The serum sample is taken from the sample container in the sample section by means of the sample pipetting device and fed to the reaction container in the reaction chain in an amount of 3 µl. The reaction container is then brought to the reagent addition point and 500 µl of the liquid immunoassay reagent prepared in the above manner are added by means of the reagent supply device. The mixture obtained is then incubated in the reaction vessel while the row of reaction vessels is being transported. After 30 minutes, the reaction container containing the reaction mixture subjected to an immunoreaction arrives at the measuring part of the photometer for measuring the light intensity. The reaction mixture is irradiated with light. The light transmitted through the reaction vessel is divided into its spectral components. The absorption at a wavelength of 600 nm is measured. The measurement results are then calculated in a computing unit. The T ₄ concentration in the sample is then printed out with a printer.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für eine Eichkurve. Diese Eich kurve wird erhalten, indem man das vorstehende Immunoassay- Verfahren unter Verwendung einer T₄ enthaltenden Probe durch führt und Mikrokapseln mit anti-T₄-Antikörper markiert. Fig. 1 shows an example of a calibration curve. This calibration curve is obtained by performing the above immunoassay method using a sample containing T ₄ and labeling microcapsules with anti-T ₄ antibody.

Erfindungsgemäß kann ein chelatbildendes Mittel in hoher Kon zentration in Mikrokapseln unter Verwendung von Nitro-PAPS als chelatbildendem Mittel eingekapselt werden. Eine Wellen länge von 590 nm oder mehr kann als Meßwellenlänge für einen Komplex von Nitro-PAPS und Metallionen angewandt werden. Daher lassen sich Meßfehler aufgrund von Verunreinigungen vermindern und die Empfindlichkeit des Immunoassays verbes sern.According to the invention, a chelating agent in high con concentration in microcapsules using Nitro-PAPS be encapsulated as a chelating agent. A waves length of 590 nm or more can be used as a measuring wavelength for a Complex of nitro-PAPS and metal ions can be applied. Therefore, measurement errors due to contamination decrease and the sensitivity of the immunoassay verbes ser.

Claims

1. Reagent for immunoassays, containing microcapsules which have a membrane labeled with an antigen or an antibody and, as a chelating agent, a 2- (2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) substituted in the 5-position. phenol, characterized in that the chelating agent is a salt of 2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol.

2. Reagent according to claim 1, characterized in that it is for the salt around 2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5- (N-pro pyl-N-sulfopropylamino) phenol sodium salt (Nitro-PAPS) acts.

3. Reagent according to claim 1, characterized in that it the microcapsules are liposomes.

4. Reagent according to claim 1, characterized in that the Microcapsules in solid form or in the form of a dispersion be in a liquid.

5. Reagent according to claim 1, characterized in that the Microcapsules are freeze-dried.

6. Reagent according to claim 1, characterized in that it additionally metal ions, which form a color complexes together with salt are able, and contains a reagent capable of membrane lysis the microcapsules in the presence of an antigen-antibody To produce reaction product.

7. Reagent according to claim 6, characterized in that the Microcapsules and the metal ions in the same liquid are included or in the form of a freeze-dried Product.

8. Reagent according to claim 6, characterized in that the Metal ions and the reagent that has the ability the membrane lysis of the microcapsules in the presence of an anti gene-antibody reaction product in which same liquid are contained.

9. Reagent according to claim 6, characterized in that the Microcapsules, the metal ions and the reagent that are in the Are able to present the membrane lysis of the microcapsules an antigen-antibody reaction product, in the same liquid or in the form of a freezer dried product are included.

10. Reagent according to claim 6, characterized in that the Metal ion from the group Ni (II) -, Co (II) -, Co (III) -, Fe (II), Zn (II) and Cu (II) ions is selected.

11. Reagent according to claim 6, characterized in that the Reagent that counteracts the membrane lysis of the microcapsules were in the antigen-antibody reaction product It is made from complements, magnesium salts and calcium salt is selected.

12. Immunoassay method, comprising the following steps:

- Mixing of (a) microcapsules which have a membrane labeled with an antigen or an antibody and as a chelating agent a 2- (2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol substituted in the 5-position contain, (b) metal ions capable of forming a color-generating complex together with the chelating agent, (c) reagent which can cause membrane lysis of the microcapsules in the presence of an antigen-antibody reaction product, and (d) sample with a content of an antibody or antigen to be determined,
Release of the chelating agent from the microcapsules by the reagent in the presence of the antigen-antibody reaction product formed and
- Measuring the color-generating complex formed from the chelating agent and the metal ions

characterized in that a salt is used as the chelating agent of 2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol used.

13. The method according to claim 12, characterized in that an antibody or an antigen in a blood sample titative by measuring the light absorption at a wave length of 590 nm or more is determined.