DE3810474A1 - Expression vectors - Google Patents

Expression vectors

Info

Publication number
DE3810474A1
DE3810474A1 DE19883810474 DE3810474A DE3810474A1 DE 3810474 A1 DE3810474 A1 DE 3810474A1 DE 19883810474 DE19883810474 DE 19883810474 DE 3810474 A DE3810474 A DE 3810474A DE 3810474 A1 DE3810474 A1 DE 3810474A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
promoter
prh281
vectors
rbs
coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19883810474
Other languages
German (de)
Inventor
Rudolf Dr Hauptmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority to DE19883810474 priority Critical patent/DE3810474A1/en
Publication of DE3810474A1 publication Critical patent/DE3810474A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

Expression vectors in which the distance between the ribosome binding site (RBS) and translation start ATG is adapted to the particular host system, between the RBS and the ATG there are no cytosine and guanine nucleotides, the promoter is adapted to the particular host system, and no superfluous restriction cleavage sites are present in front of the promoter.

Description

Expressionsvektoren enthalten starke, in vielen Fällen regulierbare Promotoren. In Transkriptionsrichtung hinter diesen Promotoren befinden sich meistens mehrere verschiedene, jedoch singuläre Schnittstellen für Restriktionsenzyme, in die die zur Expression zu bringende DNA eingefügt werden kann. Eine Auswahl verschiedener Expressionsvektoren sind bereits bekannt.Expression vectors contain strong, in many cases adjustable promoters. In the direction of transcription there are usually several behind these promoters different but unique interfaces for Restriction enzymes in which to express bringing DNA can be inserted. A selection different expression vectors are already known.

Die Wahl eines geeigneten Vektors ergibt sich aus der zur Transformation vorgesehenen Wirtszelle. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere Bakterienstämme, die über kein Restriktions- oder Modifikationsenzym verfügen, vor allem Stämme von Escherichia coli, z. B. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221(30) oder E. coli K12 Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, ferner Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte humane oder tierische Zellinien. Bevorzugte Wirtszellen sind die gesamten Stämme von E. coli, insbesondere E. coli HB101, E. coli JM101 und E. coli W3110.The choice of a suitable vector results from the host cell intended for transformation. Suitable Hosts are, for example, microorganisms, such as yeasts, e.g. B. Saccharomyces cerevisiae, and in particular Strains of bacteria that have no restriction or Modification enzyme feature, especially strains of Escherichia coli, e.g. B. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101 / LM1035, E. coli JA221 (30) or E. coli K12 strain 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus and others, further cells higher Organisms, especially established human or animal cell lines. Preferred host cells are the entire strains of E. coli, in particular E. coli HB101, E. coli JM101 and E. coli W3110.

Grundsätzlich sind alle Vektoren geeignet, welche die heterologen DNA-Sequenzen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren.Basically, all vectors are suitable which the heterologous DNA sequences in the chosen host replicate and express.

Beispiele für Vektoren, die zur Expression in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bacteriophagen, z. B. Derivate des Bacteriophagen λ, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid co1E1 und seine Derivate, z. B. pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Examples of vectors which are suitable for expression in an E. coli strain are bacteriophages, e.g. B. derivatives of bacteriophage λ , or plasmids, such as in particular the plasmid co1E1 and its derivatives, e.g. B. pMB9, pSF2124, pBR317 or pBR322.

Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replicon und ein Markierungsgen, welches die Selektion und Identifizierung der mit den Expressionsplasmiden transformierten Mikroorganismen auf Grund eines phänotypischen Merkmals ermöglicht. Geeignete Markierungen verleihen dem Mikroorganismus beispielsweise Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen.Suitable vectors contain a complete replicon and a marker gene which the selection and Identification of the expression plasmids transformed microorganisms on the basis of a phenotypic feature. Suitable Markings give the microorganism for example resistance to heavy metals, Antibiotics and the like.

Verschiedene Expressionskontrollsequenzen können zur Regulation der Expression eingesetzt werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen stark exprimierter Gene der zu transformierenden Wirtszelle verwendet. Im Falle von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsorganismus sind beispielsweise die Expressionskontrollsequenzen (welche unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) des Lactoseoperons, Tryptophanoperons, Arabinoseoperons und dergleichen, des β-Lactamasegens, die entsprechenden Sequenzen des Phage λN-Gens oder des Phage fd-Schichtproteingens und andere geeignet. Während der Promotor des β-Lactamasegens (β-lac-Gen) bereits in Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die übrigen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden. Vielfach bevorzugt als Expressionskontrollsequenz ist diejenige des Tryptophanoperons (trp po) sowohl von Serratia marcescens als auch aus E. coli und der alkalische Phosphatase-Promotor bzw. deren Hybrid.Various expression control sequences can be used to regulate expression. In particular, expression control sequences of strongly expressed genes of the host cell to be transformed are used. In the case of pBR322 as a hybrid vector and E. coli as the host organism, the expression control sequences (which contain, inter alia, the promoter and the ribosomal binding site) of the lactose operon, tryptophan operon, arabinose operon and the like, the β- lactamase gene, are the corresponding sequences of the phage λ N- Gene or the phage fd layer protein gene and others. While the promoter of the β- lactamase gene ( β -lac gene) is already contained in plasmid pBR322, the other expression control sequences have to be introduced into the plasmid. Often preferred as the expression control sequence is that of tryptophan operon (trp po) both from Serratia marcescens and from E. coli and the alkaline phosphatase promoter or its hybrid.

Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die heterologen erfindungsgemäßen Proteine kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (PL) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist ein besonders effektiver, steuerbarer Promotor. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressor, von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches Allel dieses Repressor-Gens kann in einen Vektor, der eine Protein-Gen-Sequenz enthält, eingefügt werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor aktiviert. Durch die Verwendung dieses Systems ist es möglich, eine Clon-Bank zu etablieren, in der eine funktionelle Protein-Gen-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom- Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-PL-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden.In addition to these particularly common promoters, other microbial promoters have also been developed and used. The gene sequence for the heterologous proteins according to the invention can be used, for example, under the control of the Leftward promoter of the bacteriophage lambda (P L ). This promoter is a particularly effective, controllable promoter. Control is made possible by the lambda repressor, from which neighboring restriction interfaces are known. A temperature sensitive allele of this repressor gene can be inserted into a vector containing a protein gene sequence. If the temperature is increased to 42 ° C, the repressor is deactivated and the promoter activated. Using this system, it is possible to establish a clone bank in which a functional protein gene sequence is placed in the vicinity of a ribosome binding site at varying distances from the lambda P L promoter. These clones can then be checked and selected with the highest yield.

Geeignete Plasmide für heterologe DNA-Sequenzen stellen beispielsweise die Expressionsplasmide pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) und EP-A-0.115-613 - hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983), parpER33 (EP-A-0.115-613) oder pRH100, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen. Das Plasmid pRH100 enthält den regulierbaren Tryptophanpromotor aus Serratia marcescens und eine artifizielle Ribosomenbindungsstelle. Zur Herstellung des Expressionsplasmids pRH100 wurde das Plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) mit der Restriktionsendonuklease HindIII linearisiert und die OligonukleotidsequenzMake suitable plasmids for heterologous DNA sequences for example the expression plasmids pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) and EP-A-0.115-613 - deposited with the DSM under the Number DSM 2773 on December 20, 1983), parpER33 (EP-A-0.115-613) or pRH100, since these vectors are all Contain regulatory elements that lead to a high Expression rate of the cloned genes lead. The plasmid pRH100 contains the regulatable Tryptophan promoter from Serratia marcescens and one artificial ribosome binding site. For the production the expression plasmid pRH100 became the plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) with the restriction endonuclease HindIII linearized and the  Oligonucleotide sequence

eingefügt.inserted.

Der pRH100 hat verschiedene Nachteile:The pRH100 has several disadvantages:

  • a) konstanter und nicht optimaler Abstand zwischen ribosomaler Bindungsstelle (RBS) und Translationsstart-ATGa) constant and not optimal distance between ribosomal binding site (RBS) and Translation start ATG
  • b) zwischen RBS und ATG gibt es einige C's und G'sb) there are some C's and G's between RBS and ATG
  • c) die -35 Region des Serratia marcescens trp Promotors ist verglichen mit der E. coli Sequenz nicht optimal (TTGACT statt TTGACA)c) the -35 region of the Serratia marcescens trp promoter is not optimal compared to the E. coli sequence (TTGACT instead of TTGACA)
  • d) die EcoRI-Stelle vor dem Promotor ist überflüssig.d) the EcoRI site in front of the promoter is superfluous.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, diese Nachteile durch neue Expressionsvektoren zu überwindenThe object of the present invention was therefore to achieve this To overcome the disadvantages of new expression vectors

Gelöst wurde die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, indem zunächst ein Satz von Oligonukleotiden mit folgender Sequenz synthetisiert wurde:The one on which the invention is based was solved Task by first creating a set of oligonucleotides was synthesized with the following sequence:

Anschließend wurde in das mit EcoRI und ClaI geschnittene Plasmid pAT153 (großes Fragment) diese synthetische Promotor-DNA ligiert. Komponente E. coli HB101 wurden mit dem entstandenen Plasmid transformiert. Von den entstandenen Kolonien wurden einige ausgesucht, die Plasmid DNA isoliert und der Bereich der eingefügten DNA durch Sequenzieren überprüft. Ein Plasmid wurde ausgewählt und mit pRH281/5 bezeichnet, wobei 5 die Zahl der Nukleotide zwischen der RBS und dem Translationsstart-ATG symbolisiert.Then was in the EcoRI and ClaI plasmid pAT153 (large fragment) cut this synthetic promoter DNA ligated. Component E. coli HB101 were made with the resulting Plasmid transformed. From the resulting colonies some were selected, the plasmid DNA was isolated and the area of the inserted DNA by sequencing checked. A plasmid was selected and with pRH281 / 5, where 5 is the number of nucleotides between the RBS and the translation start ATG symbolizes.

Ausgehend von diesem Expressionsvektor wurde das XhoI-SstI Insert durch folgende Oligonukleotidpaare wie oben beschrieben ersetzt:Based on this expression vector, the XhoI-SstI insert by the following oligonucleotide pairs such as replaced as described above:

Die resultierenden Expressionsvektoren wurden pRH281/6, pRH281/7, pRH281/8 und pRH281/9 benannt.The resulting expression vectors became pRH281 / 6, named pRH281 / 7, pRH281 / 8 and pRH281 / 9.

In einigen Fällen ist es für eine optimale Expression und für die Stabilität des Plasmids nötig, hinter das exprimierte Gen einen Transkriptionsterminator zu setzen (R. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4936-4940). Aus diesem Grund wurde das HindIII-SaII Fragment des pRH281/5 durch Doppelverdau herausgeschnitten. Das fehlende Stück wurde durch ein den phoA Transkriptionsterminator (H. Shuttleworth et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 8689; C. N. Chang et al., Gene 44 (1986), 121-125) enthaltendes Oligonukleotidpaar ersetzt:In some cases it is for optimal expression and necessary for the stability of the plasmid, behind that expressed a transcription terminator (R. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4936-4940). Because of this, that was HindIII-SaII fragment of pRH281 / 5 by double digestion cut out. The missing piece was replaced by a the phoA transcription terminator (H. Shuttleworth et al., Nucl. Acids Res. 14: 8689 (1986); C. N. Chang et al., Gene 44 (1986), 121-125) Oligonucleotide pair replaced:

Nach Transformation von E. coli HB101, Isolierung der Plasmid-DNA einiger Kolonien und deren Sequenzüberprüfung wurde ein Plasmid ausgewählt und mit pRH281/5T bezeichnet.After transformation of E. coli HB101, isolation of the Plasmid DNA from some colonies and their Sequence check, a plasmid was selected and with referred to pRH281 / 5T.

In analoger Weise wie oben beschrieben wurde aus diesem Plasmid die Reihe pRH281/6T, pRH281/7T, pRH281/8T und pRH281/9T unter Verwendung der Oligonukleotide Trp-9 bis Trp-16 hergestellt. This was described in an analogous manner as described above Plasmid series pRH281 / 6T, pRH281 / 7T, pRH281 / 8T and pRH281 / 9T using the oligonucleotides Trp-9 manufactured up to Trp-16.  

Gemäß der Erfindung erhält man überraschenderweise Vektoren mit Expressionskontrollsequenzen, bei denen der Abstand zwischen ribosomaler Bindungsstelle (RBS) und Translationsstart-ATG variabel ist, zwischen der RBS und dem ATG keine Cytosin- und Guanin-Nukleotide vorliegen, der Promotor dem jeweiligen Wirtssystem angepaßt ist, keine überflüssigen Restriktionsschnittstellen vor dem Promotor vorhanden sind und in einigen Fällen ein Transkriptionsterminator (T) vorhanden ist.According to the invention, surprisingly, one obtains Vectors with expression control sequences in which the distance between ribosomal binding site (RBS) and translation start ATG is variable between the RBS and the ATG no cytosine and guanine nucleotides are present, the promoter to the respective host system is adapted, no unnecessary Restriction sites in front of the promoter are and in some cases a transcription terminator (T) is present.

Diese neuen erfindungsgemäßen Expressionsverfahren weisen folgende, vorteilhafte Eigenschaften auf:These new expression methods according to the invention have the following advantageous properties:

  • a) die originale EcoRI-Stelle von pAT153 wurde zerstört.a) The original EcoRI site of pAT153 was destroyed.
  • b) die -35 Region des Serratia marcescens Promotors ist jener des trp-Promotors aus E. coli angepaßt.b) is the -35 region of the Serratia marcescens promoter adapted that of the trp promoter from E. coli.
  • c) vor der artifiziellen ribosomalen Bindungsstelle befindet sich eine singuläre XhoI-Stelle, die das Einbringen einer anderen RBS erlaubt.c) in front of the artificial ribosomal binding site is a singular XhoI site that the Another RBS allowed.
  • d) das G des Translationsstart-ATG ist die erste Base einer SstI (=SacI) Stelle. Durch Schnitt mit SstI und anschließendem Abbau des 3′ Überhanges entsteht ein gerades Ende, an das eine beliebige cDNA oder ein Gen ligiert werden kann. Beginnt diese DNA mit der ersten Base des zu translatierenden Bereichs, erfolgt eine korrekte Transkription und Translation in E. coli.d) the G of the translation start ATG is the first base an SstI (= SacI) site. By cutting with SstI and then the 3 'overhang is removed straight end to which any cDNA or gene can be ligated. This DNA starts with the first Base of the area to be translated, a correct transcription and translation in E. coli.
  • e) 3′seitig dieser SstI Stelle befinden sich eine singuläre EcoRI, ClaI und HindIII Stelle, die für ein gerichtetes Klonieren einer zu exprimierenden DNA verwendet werden kann. Außerdem können auch die singulären Schnittstellen im Tetracyclin Resistenzgen zu diesem Zweck gebraucht werden.e) on the 3 'side of this SstI site there are singular EcoRI, ClaI and HindIII site, responsible for a directional cloning of a DNA to be expressed can be used. In addition, the singular interfaces in the tetracycline resistance gene be used for this purpose.
  • f) Die Variation /5 bis /9 erlaubt, den optimalen Abstand zwischen RBS und ATG für das jeweilige Gen zu bestimmen. f) The variation / 5 to / 9 allows the optimal Distance between RBS and ATG for the respective gene too determine.  
  • g) Ein Teil der Expressionsvektoren (pRH281/5T) bis pRH281/9T) enthält einen Transkriptionsterminator.g) Part of the expression vectors (pRH281 / 5T) to pRH281 / 9T) contains a transcription terminator.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie einzuschränken.The following examples are intended to illustrate the invention explain without restricting them.

Beispiel 1Example 1 Herstellung der Expressionsvektoren pRH281/n (n= 5, 6, 7, 8, 9)Generation of the expression vectors pRH281 / n (n = 5, 6, 7, 8, 9)

Es wurde ein Satz von Oligonukleotiden mit folgender Sequenz synthetisiert:There was a set of oligonucleotides with the following Sequence synthesized:

Jeweils 100 pMol der Oligonukleotide Trp-2, Trp-3, Trp-4 und Trp-5 wurden in 10 µl phosphoryliert. Nach der Reaktion wurden äquimolare Mengen (je 100 pMol) Trp-1 und Trp-2, Trp-3 und Trp-4 sowie Trp-5 und Trp-6 vereint, auf 100°C erhitzt und durch langsames Abkühlen hybridisiert. Die Oligonukleotidpaare wurden vereint und in 55 µl ligiert. pAT153 wurde mit EcoRI und ClaI doppelt geschnitten und das große Vektorfragment isoliert. 50 ng pAT153 Fragment wurden mit 20 pMol synthetischer Promotor DNA in 20 µl ligiert. Kompetente E. coli HB101 wurden mit dem entstandenen Plasmid transformiert. Von den entstandenen Kolonien wurden einige ausgesucht, die Plasmid DNA isoliert und der Bereich der eingefügten DNA durch Sequenzieren überprüft. Ein Plasmid wurde ausgewählt und mit pRH281/5 bezeichnet, wobei 5 die Zahl der Nukleotide zwischen der RBS und dem Translationsstart-ATG symbolisiert.100 pmoles of the oligonucleotides Trp-2, Trp-3, Trp-4 and Trp-5 were phosphorylated in 10 ul. To equimolar amounts (each 100 pmol) Trp-1 and Trp-2, Trp-3 and Trp-4 and Trp-5 and Trp-6 united, heated to 100 ° C and by slow cooling hybridizes. The oligonucleotide pairs were combined  and ligated in 55 µl. pAT153 was developed with EcoRI and ClaI double cut and the big vector fragment isolated. 50 ng pAT153 fragment was mixed with 20 pmol synthetic promoter DNA ligated in 20 ul. Competent E. coli HB101 were created with the resulting Plasmid transformed. From the resulting colonies some were selected, the plasmid DNA was isolated and the area of the inserted DNA by sequencing checked. A plasmid was selected and with pRH281 / 5, where 5 is the number of nucleotides between the RBS and the translation start ATG symbolizes.

Ausgehend von diesem Expressionsvektor wurde das XhoI-SstI Insert durch folgende Oligonukleotidpaare wie oben beschrieben ersetzt:Based on this expression vector, the XhoI-SstI insert by the following oligonucleotide pairs such as replaced as described above:

Die resultierenden Expressionsvektoren wurden pRH281/6, pRH281/7, pRH281/8 und pRH281/9 benannt. The resulting expression vectors became pRH281 / 6, named pRH281 / 7, pRH281 / 8 and pRH281 / 9.  

Beispiel 2Example 2 Herstellung der Expressionsvektoren pRH281/n T (n= 5, 6, 7, 8, 9)Generation of the expression vectors pRH281 / n T (n = 5, 6, 7, 8, 9)

Das HindIII-SalI Fragment des pRH281/5 wurde durch Doppelverdau herausgeschnitten. Das fehlende Stück wurde durch ein den phoA Transkriptionsterminator (H. Shuttleworth et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 8689; C. N. Chang et al., Gene 44 (1986), 121-125) enthaltendes Oligonukleotidpaar ersetzt:The HindIII-SalI fragment of pRH281 / 5 was by Double digest cut out. The missing piece was through a phoA transcription terminator (H. Shuttleworth et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 8689; Chang Chang, N.N., 1986, Gene 44: 121-125. containing oligonucleotide pair replaced:

10 pMol des hybridisierten Oligonukleotidpaares wurden mit 100 ng HindIII-SalI doppelt geschnittenen pRH281/5 Vektorteil in 20 µl ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101, Isolierung der Plasmid-DNA einiger Kolonien und deren Sequenzüberprüfung wurde ein Plasmid ausgewählt und mit pRH281/5T bezeichnet.10 pmoles of the hybridized oligonucleotide pair were with 100 ng HindIII-SalI double-cut pRH281 / 5 Vector part ligated in 20 µl. After transforming E. coli HB101, isolation of the plasmid DNA of some Colonies and their sequence verification became a plasmid selected and designated pRH281 / 5T.

In analoger Weise wie oben beschrieben wurde aus diesem Plasmid die Reihe pRH281/6T, pRH281/7T, pRH281/8T und pRH281/9T unter Verwendung der Oligonukleotide Trp-9 bis Trp-16 hergestellt.This was described in an analogous manner as described above Plasmid series pRH281 / 6T, pRH281 / 7T, pRH281 / 8T and pRH281 / 9T using the oligonucleotides Trp-9 manufactured up to Trp-16.

Claims (13)

1. Vektoren mit Expressionskontrollsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen ribosomaler Bindungsstelle (RBS) und Translationsstart-ATG dem jeweiligen Wirtssystem angepaßt ist,
daß zwischen der RBS und dem ATG keine Cytosin- und Guanin-Nukleotide vorliegen,
daß der Promotor dem jeweiligen Wirtssystem angepaßt ist und
daß keine überflüssigen Restriktionsschnittstellen vor dem Promotor vorhanden sind.1. vectors with expression control sequences, characterized in that the distance between the ribosomal binding site (RBS) and the translation start ATG is adapted to the respective host system,
that there are no cytosine and guanine nucleotides between the RBS and the ATG,
that the promoter is adapted to the respective host system and
that there are no unnecessary restriction sites in front of the promoter. 2. Vektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand in den Grenzen von 5 bis 9 Nukleotiden variabel ist.2. Vectors according to claim 1, characterized in that the distance in the limits of 5 to 9 Nucleotides is variable. 3. Vektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor dem E. coli System angepaßt ist.3. Vectors according to claim 1, characterized in that the promoter is adapted to the E. coli system. 4. Vektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der trp-Promotor ist.4. Vectors according to claim 1, characterized in that the promoter is the trp promoter. 5. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es pRH281/n ist.5. Vector according to claim 1, characterized in that it is pRH281 / n . 6. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß n 5, 6, 7, 8 oder 9 ist. 6. Vector according to claim 5, characterized in that n is 5, 6, 7, 8 or 9. 7. Vektoren mit Expressionskontrollsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen ribosomaler Bindungsstelle (RBS) und Translationsstart-ATG dem jeweiligen Wirtssystem angepaßt ist,
daß zwischen der RBS und dem ATG keine Cytosin- und Guanin-Nukleotide vorliegen,
daß der Promotor dem jeweiligen Wirtssystem angepaßt ist,
daß keine überflüssigen Restriktionsschnittstellen vor dem Promotor vorhanden sind und
daß sie einen Transkriptionsterminator (T) enthalten.7. vectors with expression control sequences, characterized in that the distance between the ribosomal binding site (RBS) and translation start ATG is adapted to the respective host system,
that there are no cytosine and guanine nucleotides between the RBS and the ATG,
that the promoter is adapted to the respective host system,
that there are no unnecessary restriction sites in front of the promoter and
that they contain a transcription terminator (T). 8. Vektoren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand in den Grenzen von 5 bis 9 Nukleotiden variabel ist.8. Vectors according to claim 7, characterized in that the distance in the limits of 5 to 9 Nucleotides is variable. 9. Vektoren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor dem E. coli System angepaßt ist.9. Vectors according to claim 7, characterized in that the promoter is adapted to the E. coli system. 10. Vektoren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der trp-Promotor ist.10. Vectors according to claim 7, characterized in that the promoter is the trp promoter. 11. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es pRH281/n T ist.11. Vector according to claim 7, characterized in that it is pRH281 / n T. 12. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß n 5, 6, 7, 8, oder 9 ist.12. Vector according to claim 11, characterized in that n is 5, 6, 7, 8 or 9. 13. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Transkriptionsterminator aus dem phoA-System stammt.13. Vector according to claim 7, characterized in that the transcription terminator from the phoA system comes from.
DE19883810474 1988-03-26 1988-03-26 Expression vectors Withdrawn DE3810474A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19883810474 DE3810474A1 (en) 1988-03-26 1988-03-26 Expression vectors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19883810474 DE3810474A1 (en) 1988-03-26 1988-03-26 Expression vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE3810474A1 true DE3810474A1 (en) 1989-10-05

Family

ID=6350878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19883810474 Withdrawn DE3810474A1 (en) 1988-03-26 1988-03-26 Expression vectors

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE3810474A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0496327A1 (en) * 1991-01-22 1992-07-29 Grünenthal GmbH Polypeptides with prourokinase activity, plasmids coding therefor and process for their preparation and use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0496327A1 (en) * 1991-01-22 1992-07-29 Grünenthal GmbH Polypeptides with prourokinase activity, plasmids coding therefor and process for their preparation and use

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69636032T2 (en) PLASMIDE FOR THE ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACIDS AND METHOD OF USE
DE60221801T2 (en) CPG-FREE SYNTHETIC GENES AND BACTERIAL PLASMIDES
EP0753580A2 (en) Cell-specific gene therapy, using the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 promoter
DD212532A5 (en) METHOD FOR STABILIZING AND SELECTION OF HOST CELLS CONTAINING RECOMBINANT DNA
EP0373365B1 (en) Method for the expression of a recombinant gene
EP0460673A1 (en) DNA encoding recombinant restriction enzyme Sau3AI
DE3332264C2 (en)
DE3810474A1 (en) Expression vectors
DE69333953T2 (en) PROMOTER OF THE TRANSALDOLASE GENE OF K. LACTIS AND ITS USE
DE60014640T2 (en) GENETIC CASCADE REGULATED EXPRESSION OF CLONED GENES
EP0285152B1 (en) Recombinant dna for the repressive and inducible expression of heterogeneous genes
DE3819463A1 (en) EXPRESSION VECTORS FOR THE PRODUCTION OF UNFUSIONED PROTEINS IN MICROORGANISMS
EP0316378B1 (en) Expression vector for adjustable expression of exogenous genes in prokaryotes
DE69916081T2 (en) NON-HOMOLOGUES YARROWIA LIPOLYTICA TRANSFORMATION PROCESS
EP0536192B1 (en) New promoter region
EP0244627A2 (en) Expression vectors for the production of polypeptides
EP0299303B1 (en) Eucaryotic expression vectors with multimeric enhancer subelements, process for their preparation and use
DE69333907T2 (en) PROMOTOR OF THE GENE OF THE K.LACTIS RP28 RIBOSOMAL PROTEIN AND APPLICATION THEREOF
EP0198415B1 (en) Alteration of the dna sequence between the shine-dalgarno sequence and the start codon of the trp operon to increase the expression of proteins
DE3640550C2 (en)
DE69629767T2 (en) Promoter and its use in the expression process
EP0334283B1 (en) Process for the selection of large dna segments
DE3838377A1 (en) EXPRESSION ENHANCERS AND THE USE THEREOF FOR INCREASING THE YIELD IN EXPRESSION OF RECOMBINANT GENES
EP0451792B1 (en) Regulated gene expression in streptomycetes
DE60315179T2 (en) A method of inserting a nucleic acid into a prokaryotic or eukaryotic cell by homologous recombination

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination