DE3801562A1

DE3801562A1 - Process for the preparation of proteins

Info

Publication number: DE3801562A1
Application number: DE19883801562
Authority: DE
Inventors: Andrea Dipl Stecher-Schilling; Rolf-Guenter Werner; William Dipl Biol Dr Werz; Hans Prof Dr Zaehner; Axel Prof Dipl Chem Dr Zeeck
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1988-01-20
Filing date: 1988-01-20
Publication date: 1989-08-03

Abstract

Method for increasing the production of protein, in particular t-PA, in cultures of cells producing this protein, wherein a substance which induces the production of the protein is added to the cell culture, characterised in that the substance used for protein induction is thioglycolic acid, thiodiglycolic acid, L-cysteine, glutathione, butyrylcholine bromide, butyrylcholine chloride, nonactin acid, furan fatty acid, ascorbic acid, aphidicolin, 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-one, fusaric acid, mevalonic acid, trans-anhydromevalonic acid, anhydromevalonic acid lactone, cis-anhydromevalonic acid lactone, D- alpha -hydroxy-substituted (C3 or C4) aliphatic mono- or dicarboxylic acid or salts thereof.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, insbesondere Plasminogenaktivatoren wie z. B. t-PA (tissue plasminogen aktivator) und deren Mutanten, insbesondere eine Methode zur Steigerung der Produktivität von Zellkulturen (z. B. CHO-Zellen) für die Synthese von Proteinen.The invention relates to a process for the preparation of proteins, in particular plasminogen activators such. B. t-PA (tissue plasminogen activator) and its mutants, in particular a method for increasing the productivity of Cell cultures (eg CHO cells) for the synthesis of proteins.

Plasminogenaktivatoren sind eine Klasse von Serinproteasen, die das Proenzym Plasminogen durch Spaltung der Peptidbindung zwischen Arg-560 und Val-561 zum aktiven Enzym Plasmin aktivieren. Plasmin seinerseits ist die letzte Stufe des Fibrinolysesystems der Blutbahn, das das Fibringerüst eines Thrombus in lösliche Peptide spaltet.Plasminogen activators are a class of serine proteases, the proenzyme plasminogen by cleavage of the peptide bond between Arg-560 and Val-561 to the active enzyme plasmin activate. Plasmin in turn is the final stage of the Fibrinolytic system of the bloodstream containing the fibrin skeleton of a Thrombus splits into soluble peptides.

Bei pathogenischen Störungen, wie die Koronarerkrankung, werden Blutgerinnsel nicht schnell genug aufgelöst, um eine ausreichende Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff zu gewährleisten. Die Folge des Verschlusses der Koronararterien durch ein Blutgerinnsel ist ein Infarkt, wobei durch Sauerstoffunterversorgung des Herzmuskels die Nekrose des betroffenen Gewebes erfolgt.In pathogenic disorders, such as coronary disease, Blood clots are not dissolved fast enough to one to ensure adequate supply of oxygen to the tissue. The consequence of occlusion of the coronary arteries through a blood clot is an infarction, whereby by oxygen deficiency of the heart muscle the necrosis of the affected Tissue is done.

Eine rasche Rekanalisation der Gefäße kann die Durchblutung des Herzmuskels in kürzester Zeit sicherstellen und so das Absterben ganzer Muskelpartien des Herzens verhindern.A rapid recanalization of the vessels can increase the blood flow of the heart muscle in the shortest possible time and so on Prevent death of entire muscle parts of the heart.

Bei der Therapie werden bislang Streptokinase und Urokinase eingesetzt. Eigenschaften von t-PA bieten jedoch einige Vorteile gegenüber jenen bekannten Plasminogenaktivatoren: die fibrinspezifische lokale Lyse, keine systemischen lytischen Effekte durch Fibrinogenabbau, hohe Reperfusionsraten und keine Antikörperbildung.In the treatment so far Streptokinase and urokinase used. However, features of t-PA offer some advantages towards those known plasminogen activators: the fibrin specific local lysis, no systemic lytic Effects of fibrinogen degradation, high reperfusion rates and no antibody formation.

t-PA ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 65.000 Dalton, das als einkettiges und zweikettiges Enzym vorkommt und aus 527 Aminosäuren zusammengesetzt ist.t-PA is a glycoprotein with a molecular weight of approx. 65,000 daltons, as a single-chain and two-chain enzyme occurs and is composed of 527 amino acids.

Die Affinität von t-PA für Plasminogen ist in Gegenwart von Fibrin um ein 100faches größer als in dessen Abwesenheit. Diese hohe Affinität von t-PA für Plasminogen in Gegenwart von Fibrin sichert die effektive Aktivierung, ohne freies Plasminogen in der Peripherie zu aktivieren.The affinity of t-PA for plasminogen is in the presence of Fibrin is 100 times larger than in its absence. This high affinity of t-PA for plasminogen in the presence Fibrin assures the effective activation without free Activate plasminogen in the periphery.

Humanes t-PA wurde zuerst aus Uteri in reiner Form gewonnen. In anderen Geweben und Zellen, z. B. endothelialen Zellen einschließlich arteriell und venös endothelialen Zellen, konnte gleichfalls t-PA nachgewiesen werden. Die gebildeten t-PA-Mengen sind jedoch so gering, daß ihre kommerzielle Gewinnung unmöglich ist.Human t-PA was first obtained from Uteri in pure form. In other tissues and cells, e.g. B. endothelial cells including arterial and venous endothelial cells, could also be detected t-PA. The educated However, t-PA levels are so low that their commercial recovery is impossible.

Eine weitere natürliche Quelle für t-PA ist die Zellkultur. Mehrere Zell-Linien wurden auf eine mögliche t-PA-Produktion untersucht (Gronow M. et al., Trends in Biotechnology 1: 26-29, 1983). Aus einer humanen Zell-Linie, den Bowes-Melanoma- Zellen, konnten größere Mengen an t-PA für begrenzte klinische Studien sowie zur Aufklärung der Struktur gewonnen werden (Wallen et al., European Journal of Biochemistry 132: 681-686, 1983).Another natural source of t-PA is cell culture. Several cell lines were targeted for a possible t-PA production (Gronow M. et al., Trends in Biotechnology 1: 26-29, 1983). From a human cell line, the Bowes melanoma Cells could produce larger amounts of t-PA for limited gained clinical studies and to elucidate the structure Wallen et al., European Journal of Biochemistry 132: 681-686, 1983).

Für die Großproduktion von t-PA zur breiten, klinischen Anwendung sind diese Ausbeuten allerdings zu gering. Erst die Gentechnik machte es möglich, größere Mengen rekombinantes t-PA für den therapeutischen Einsatz herzustellen. For large-scale production of t-PA for broad, clinical use However, these yields are too low. First the Genetic engineering made it possible to produce larger amounts of recombinant to produce t-PA for therapeutic use.

1983 wurde das t-PA kloniert und die Aminosäuresequenz ermittelt (Pennica, Nature 301: 214-221, 1983).In 1983, the t-PA was cloned and the amino acid sequence determined (Pennica, Nature 301: 214-221, 1983).

Versuche, um t-PA aus E. coli, in dem die genetischen Informationen für t-PA aus Melanoma-Zellen integriert wurden, zu erhalten, waren nicht erfolgreich, da das resultierende Protein nicht glykosyliert ist und damit dem nativen t-PA nicht entspricht.Attempts to obtain t-PA from E. coli, in which the genetic information for t-PA from melanoma cells were not successful because the resulting protein is not glycosylated and therefore not the native t-PA equivalent.

Aus diesem Grund haben verschiedene Forschungsgruppen für die Produktion von humanem t-PA permanente Säugetier-Zell- Linien von verschiedenen Quellen ausgesucht. Einige von diesen Zell-Linien sind humane ZelL-Linien mit angeblich verbesserter Ausbeute von t-PA. Eine andere Zell-Linie ist die normale chinesische Hamsterovarzelle.For this reason, various research groups have for the production of human t-PA permanent mammalian cell Lines selected from various sources. Some of these Cell lines are human ZelL lines with supposedly improved Yield of t-PA. Another cell line is the normal Chinese hamster ovary.

In der Europäischen Offenlegungsschrift 00 93 619 ist die Herstellung von t-PA von transformierten chinesischen Hamsterovarzellen (CHO-Zellen) beschrieben. Das resultierende t-PA (r-tPA) unterscheidet sich in keiner Weise vom natürlich vorkommenden t-PA.In the European Patent Application 00 93 619 is the production of t-PA from transformed Chinese hamster ovaries (CHO cells). The resulting t-PA (r-tPA) in no way differs from the natural one occurring t-PA.

In mehreren Publikationen sind Mutanten der t-PA und deren Herstellung beschrieben, z. B. in EP-A 2 41 208, 2 41 209, 2 41 210, 2 40 334, 2 34 051, 2 33 013, 2 31 624, 2 25 286, 2 13 794, 2 01 153, 1 99 574, 1 96 920 und DE-A 37 08 681.In several publications are mutants of t-PA and their Production described, for. In EP-A 2 41 208, 2 41 209, 2 41 210, 2 40 334, 2 34 051, 2 33 013, 2 31 624, 2 25 286, 2 13 794, 2 01 153, 1 99 574, 1 96 920 and DE-A 37 08 681.

In der vorliegenden Anmeldung werden alle t-PA-Derivate Mutanten genannt, gleichgültig, ob sie eine odere mehrere Aminosäuren enthalten, sich von der Aminosäure in der gleichen Stellung im in der Natur vorkommenden t-PA unterscheiden oder worin eine oder mehrere Aminosäuren, die im natürlichen t-PA vorkommen, in diesen "Mutanten" nicht enthalten sind. Ein t-PA, worin viele Aminosäurereste des natürlich vorkommenden t-PA abwesend sind, wie z. B. in EP-A-1 96 920, wird manchmal "degraded species" genannt. In the present application, all t-PA derivatives become mutants regardless of whether they have one or more Amino acids contain themselves from the amino acid in the same Differ in position in naturally occurring t-PA or in which one or more amino acids found in the natural t-PA, not included in these "mutants" are. A t-PA wherein many amino acid residues of the natural absent occurring t-PA, such. In EP-A-1 96 920, is sometimes called "degraded species".

In der EP-A 1 99 574 z. B. ist ein t-PA Mutant beschrieben, das in der Stellung 270 bis 279 gewisse Aminosäuren besitzt, die sich aber von der Aminosäure der entsprechenden Stellung im natürlichen t-PA unterscheiden.In EP-A 1 99 574 z. For example, a t-PA mutant is described which has certain amino acids in position 270 to 279 but which differ from the amino acid of the corresponding position in natural t-PA.

In der DE-A 37 08 681 hat die Anmelderin einige t-PA dargestellt, die in Stellung 117 eine Aminosäure besitzen, die sich von der Aminosäure in der entsprechenden Stellung beim natürlichen t-PA unterscheiden, wobei das mutante t-PA im Gegensatz zum natürlichen t-PA in dieser Stellung nicht glykosiliert ist.In DE-A 37 08 681, the Applicant has shown some t-PA that have an amino acid at position 117 that differ from the amino acid in the corresponding position in natural t-PA, the mutant t-PA, in contrast to natural t-PA is not glycosylated in this position.

In vielen Publikationen ist der Einfluß von verschiedenen Substanzen auf die Produktivität von Zellkulturen für die Synthese von Proteinen beschrieben worden.In many publications the influence of different ones is Substances on the productivity of cell cultures for the Synthesis of proteins has been described.

Bei verschiedenen Zellsystemen wird von einem Zusammenhang zwischen intrazellulärem c-AMP-Spiegel und der t-PA-Synthese berichtet (siehe z. B. Kooistra et al. in Thrombosis and Haemostasis, 54(1): 192, Abstract P 11 33), Dibutyryl c-AMP die Produktion von t-PA in humanen endothelialen Zellen um das 2- bis 3fache erhöht, aber keinen Einfluß auf die Synthese von t-PA in Bowes-Melanoma-Zellen aufweist. In Nierenzellen wurde die t-PA-Synthese durch Phosphodiesterase- Inhibitoren gesteigert (Journal of Cell Biology 91: 195-200, 1981). Andererseits hemmt c-AMP die t-PA-Synthese in Makrophagen (Vassalli et al., Cells, 8: 271-281, 1976) und ist indifferent in Teratocarcinoma-Zellen (Nishimune et al., Experimental Cell Research 146: 439-444, 1983).In different cell systems is of a context between intracellular c-AMP level and t-PA synthesis (see, for example, Kooistra et al., in Thrombosis and Haemostasis, 54 (1): 192, Abstract P 11 33), dibutyryl c-AMP the production of t-PA in human endothelial cells increased by 2 to 3 times, but no influence on has the synthesis of t-PA in Bowes melanoma cells. In Kidney cells has undergone t-PA synthesis by phosphodiesterase Inhibitors increased (Journal of Cell Biology 91: 195-200, 1981). On the other hand, c-AMP inhibits t-PA synthesis in macrophages (Vassalli et al., Cells, 8: 271-281, 1976) and is indifferent in teratocarcinoma cells (Nishimune et al., Experimental Cell Research 146: 439-444, 1983).

Buttersäure induziert die Synthese von t-PA in Teratocarcinomia- Zellen (Nishimune - siehe oben), zeigt aber in renalen Tumorzellen eine inhibitorische Wirkung auf (Nelson et al. Proc. Am. Ass. for Cancer Research, 26 : 35, 1985), und von einer indifferenten Wirkung in embryonalen Lungenzellen wurde von Brouty-Boye et al. Biotechnology 12 : 10, 1984, berichtet. Butyric acid induces the synthesis of t-PA in teratocarcinoma Cells (Nishimune - see above), but shows in renal Tumor cells have an inhibitory effect (Nelson et al. Proc. At the. Ass. For Cancer Research, 26: 35, 1985), and of an indifferent effect in embryonic lung cells was reported by Brouty-Boye et al. Biotechnology 12: 10, 1984, reported.

In humanen Endothelzellen kann die t-PA-Synthese durch Thrombin (Levin et al., Thrombosis and Haemostasis, 56(2): 115-119, 1986), Alkohol (Laug, Jama, 250 (6): 772-776, 1983 B), Vitamin C und Vitamin A (Inada et al., Biochemical and Biophysical Communications 130 (1): 182-187, 1985) stimuliert werden. Die t-PA-Sekretion in bovinen Endothelzellen wird jedoch durch Thrombin (Loskutoff, Journal of Clinical Investigations, 64: 329-332, 1979) und Endotoxin (Crutchley et al., Journal of Biological Chemistry, 261 (1): 154-159, 1986) gehemmt.In human endothelial cells, the t-PA synthesis by Thrombin (Levin et al., Thrombosis and Haemostasis, 56 (2)): 115-119, 1986), alcohol (Laug, Jama, 250 (6): 772-776, 1983 B), Vitamin C and Vitamin A (Inada et al., Biochemical and Biophysical Communications 130 (1): 182-187, 1985) become. The t-PA secretion in bovine endothelial cells however, is produced by thrombin (Loskutoff, Journal of Clinical Investigations, 64: 329-332, 1979) and endotoxin (Crutchley et al., Journal of Biological Chemistry, 261 (1): 154-159, 1986) inhibited.

Die t-PA-Sekretion aus dem Schwein-Endothel wird durch Heparin vermittelt (Marchwardt et al., Thrombosis Research, 8: 217-223, 1976), bei den humanen embryonalen Lungenzellen hat Heparin allerdings einen minimalen Effekt.The porcine endothelial t-PA secretion is heparinized (Marchwardt et al., Thrombosis Research, 8: 217-223, 1976) in human embryonic lung cells Heparin, however, has a minimal effect.

Die t-PA-Synthese wurde weiterhin durch Concanavalin A in embryonalen Lungenzellen (Brouty-Boye - siehe oben) und Epithelzellen (Electricwala et al., Thrombosis and Haemostasis, 53: 200-203, 1985), 5-Azacytidin in Epithelzellen (Electricwala - siehe oben) und Melanoma-Zellen (Silagi et al., Biological Medicine, 57: 418, 1984), Tizabrine in Melanoma-Zellen (Roba et al., Thrombosis and Haemostasis 50(1): 83, 1983) und Aphidicolin in Hepatoma-Zellen (Orfanoudakis et al., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336 (9): 832, 1985) positiv beeinflußt.The t-PA synthesis was further enhanced by concanavalin A in embryonic lung cells (Brouty-Boye - supra) and epithelial cells (Electricwala et al., Thrombosis and Haemostasis, 53: 200-203, 1985), 5-azacytidine in epithelial cells (Electricwala see above) and melanoma cells (Silagi et al., Biological Medicine, 57: 418, 1984), Tizabrine in melanoma cells (Roba et al., Thrombosis and Haemostasis 50 (1): 83, 1983) and aphidicolin in hepatoma cells (Orfanoudakis et al., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336 (9): 832, 1985) affected.

In der Europäischen Offenlegungsschrift 02 19 270 wird beschrieben, daß eine Kombination von Heparin und Endothelialzellwachstumsfaktor (ECGF) die Produktion von t-PA und einkettigem Urokinaseplasminogenaktivator aus normalen humanen diploiden Lungenfibroblastzellen in serumfreiem Medium erhöht.European Published Patent Application 02 19 270 describes that a combination of heparin and endothelial cell growth factor (ECGF) The production of t-PA and single-chain Urokinase plasminogen activator from normal human diploid pulmonary fibroblast cells in serum-free medium elevated.

Über den Einfluß von Buttersäure auf chinesische Hamsterovarzellen wurde von Storrie et al:, Journal of Cell Physiology, 94: 69-76, 1978, and Wright, Experimental Cell Research, 78: 456-460, 1978, berichtet. Jene Untersuchungen wurden allerdings mit nicht transformierten Zell-Linien durchgeführt und die Ergebnisse wurden im Großen und Ganzen auf die Änderungen der Morphologie und Wachstumsrate der Zellen gerichtet.On the influence of butyric acid on Chinese hamster ovaries was reported by Storrie et al., Journal of Cell Physiology, 94: 69-76, 1978, and Wright, Experimental Cell Research, 78: 456-460, 1978, reported. Those investigations were, however, with untransformed cell lines performed and the results were broadly on the changes in morphology and growth rate of Directed to cells.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur Steigerung der Produktion von Proteinen in Kulturen von diesen Proteinen produzierenden Zellen, wobei man der Zellkultur eine Substanz, die die Produktion des Proteins induziert, zusetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Proteininduzierende Substanz Thioglykolsäure, Thiodiglykolsäure, L-Cystein, Glutathion, Butyrylcholinbromid, Butyrylcholinchlorid, Nonactinsäure, Furanfettsäure, Ascorbinsäure, Aphidicolin, 6-Hydroxy-4,6-Dimethyl-3-hepten-2-on, Fusarinsäure, Mevalonsäure, Transanhydromevalonsäure, Anhydromevalonsäurelacton, cis-Anhydromevalonsäurelacton oder D-α-hydroxysubstituierte (C₃ oder C₄) aliphatische Mono- oder Di-carbonsäure oder deren Salze verwendet.The present invention relates to a method for increasing the production of proteins in cultures of cells producing these proteins, wherein a substance which induces the production of the protein is added to the cell culture, characterized in that the protein-inducing substance is thioglycolic acid, thiodiglycolic acid, L Cysteine, glutathione, butyrylcholine bromide, butyrylcholine chloride, nonactic acid, furan fatty acid, ascorbic acid, aphidicolin, 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-one, fusaric acid, mevalonic acid, transanhydromevalonic acid, anhydromevalonic acid lactone, cis-anhydromevalonic acid lactone or D- α Hydroxysubstituierte (C₃ or C₄) aliphatic mono- or di-carboxylic acid or salts thereof.

Als Proteine kommen vorzugsweise die Plaminogenaktivatoren, insbesondere t-PA und deren Mutante, in Betracht. Die Wirkung der Methode ist jedoch unabhängig von den Proteinen und der für diese Proteine codierenden DNA und kann daher, an CHO-Zellen appliziert, die zur Exprimierung jeden fremden Proteins transformiert werden.As proteins preferably the Plaminogenaktivatoren, in particular t-PA and its mutant, into consideration. The However, the effect of the method is independent of the proteins and the DNA coding for these proteins and can therefore, applied to CHO cells that are used to express any foreign Proteins are transformed.

Mutante t-PA sind Derivate von t-PA, die eine oder mehrere Aminosäurereste besitzen, die sich von den Aminosäureresten in der entsprechenden Stellung des natürlichen t-PA unterscheiden, oder in dem eine oder mehrere Aminosäurereste des natürlichen t-PA nicht vorkommen. Einige solcher t-PA- Mutanten sind in der Literatur, insbesondere in den oben erwähnten Patentanmeldungen, beschrieben, insbesondere in EP-A 1 99 574 und DE-A 37 08 681. Mutant t-PA are derivatives of t-PA that have one or more Possess amino acid residues that are different from the amino acid residues differ in the corresponding position of natural t-PA, or in which one or more amino acid residues of the natural t-PA does not occur. Some such t-PA Mutants are in the literature, especially in the above mentioned patent applications, in particular in EP-A 1 99 574 and DE-A 37 08 681.

Die Methode der Erfindung wird vorzugsweise mit transformierten CHO-Zellen durchgeführt.The method of the invention is preferably transformed with CHO cells performed.

Außerdem wurde gefunden, daß die C₃-C₅ aliphatische Monocarbonsäuren und deren Salze die Produktion von t-PA und deren Mutante in Kulturen von transformierten CHO-Zellen steigern können.It has also been found that the C₃-C₅ aliphatic monocarboxylic acids and their salts the production of t-PA and their mutant in cultures of transformed CHO cells can increase.

Als bevorzugte Protein-produktionssteigernde Substanzen kommen Thioglykolsäure, Nonactinsäure, Buttersäure und Propionsäure in Frage.As preferred protein production enhancing substances come thioglycolic acid, nonactic acid, butyric acid and Propionic acid in question.

Die Protein-Produktion steigernden Substanzen sind Handelsprodukte oder literaturbekannte Produkte oder können durch bekannte Methoden hergestellt werden.The protein production enhancing substances are commercial products or literature-known products or can by Known methods are produced.

Die Verbindungen Butyrylcholinbromide und -chloride, Fusarinsäure, Mavalonsäurelacten sind Handelsprodukte und z. B. bei der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, erhältlich.The compounds butyrylcholine bromides and chlorides, Fusaric acid, mavalonic acid lactones are commercial products and z. At Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, available.

Nonactinsäure und Verfahren zu deren Herstellung ist in z. B. Helv. Chim. Acta, Vol. XLV, (1962), No. 15-16, S. 129-138; Tetrahydron, Vol. 36, No. 1, S. 46-49 und J. Org. Chem., 1980, 45, S. 4259-4260 beschrieben.Nonactic acid and process for their preparation is in z. B. Helv. Chim. Acta, Vol. XLV, (1962), no. 15-16, pp. 129-138; Tetrahydron, Vol. 36, no. 1, pp. 46-49 and J. Org. Chem., 1980, 45, p. 4259-4260.

Verschiedene Publikationen beschreiben die Furanfettsäuren, z. B. Lipids, 1977, 12 (10), 828-36, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1976, (16), S. 630-1, Lipids, 1975, 10 (11), S. 695- 702, und Fette, Seifen, Anstrichmittel, No. 8, 1986, S. 290- 292.Various publications describe the furan fatty acids, z. Lipids, 1977, 12 (10), 828-36, J. Chem. Soc. Commun. 1976, (16), p. 630-1, Lipids, 1975, 10 (11), p. 695- 702, and fats, soaps, paints, no. 8, 1986, p. 290- 292nd

Nutzbare Säuren dieses Types sind auch durch Umsetzung gemäß folgendem Reaktionsschema herstellbar: Useful acids of this type are also by reaction according to preparable following reaction scheme:

wobei m = 2 bis 5, vorzugsweise 4, n = 7 bis 12, vorzugsweise 8 oder 10, undwhere m = 2 to 5, preferably 4, n = 7 to 12, preferably 8 or 10, and

Die Herstellung der Verbindungen 2 und 6 ist in Voß et al., Helv. Chim. Acta, 1983, 66, 2294, beschrieben.The preparation of compounds 2 and 6 is in Voss et al., Helv. Chim. Acta, 1983, 66, 2294.

Vorzugsweise ist m 4 und n 8 oder 10Preferably, m is 4 and n is 8 or 10

Die Herstellung von Trans-anhydromavalonsäure ist von H. Dieckmann in "Die Isolierung und Darstellung von trans- 5-hydroxy-3-methyl-pentan-2-säure", Archiv für Mikrobiologie, 62, 322-327 (1986) beschrieben. Die Verbindungen Anhydromavalonsäurelacten und cis-Anhydromavalonsäurelacten und ihre Herstellung sind von Keder et al. in "Die Bildung von /₂-Anhydronmavalonsäurelacten durch verschiedene Pilze", Biochem. Zeitschrift, 341, 378-386 (1965) beschrieben.The preparation of trans-anhydromavalonic acid is of H. Dieckmann in "The isolation and presentation of trans- 5-hydroxy-3-methylpentan-2-acid ", Archive for Microbiology, 62, 322-327 (1986). The compounds anhydromavalonic acid lactones and cis-anhydromavalonic acid lactones and their preparation is described by Keder et al. in "The formation of / ₂-Anhydronmavalonsäurelacten by different fungi ", Biochem. Journal, 341, 378-386 (1965).

Die Verbindung 6-Hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on ist durch Verfahren nach dem Stand der Technik herstellbar. Sie ist auch ein Naturstoff und isolierbar aus Capiscum annuns var angulosum, wie in C.A. 97: 1 59 552 f und Eiyo to Shokuryo 1982, 35 (2) 95-101, beschrieben. Diese Verbindung ist ebenfalls in der Dissertation "Neue Sekundärstoffe aus Streptomycesten: Isolierung und Strukturaufklärung der Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazomycins" von Grote, R., Universität Göttingen, 1987, beschrieben, sowie ihre Herstellung durch die Züchtung von Streptomyces olivaceus (Stamm Tü 3082, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen am 23. November 1987 gemäß Budapester Vertrag unter der Nr. 4309) und Isolierung. Sie hat folgendes NMR- Spektrum:The compound is 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-one preparable by methods of the prior art. you is also a natural substance and isolable from Capiscum annuns var angulosum as described in C.A. 97: 1 59 552 f and Eiyo to Shokuryo 1982, 35 (2) 95-101. This connection is also in the dissertation "New secondary metabolites from streptomycetes: Isolation and structure elucidation of colabomycins, Pyrrolame and Pyridazomycin "by Grote, R., University Göttingen, 1987, and their preparation by the breeding of Streptomyces olivaceus (strain Tü 3082, deposited with the German Collection of Microorganisms on November 23, 1987 according to the Budapest Treaty under No. 4309) and insulation. She has the following NMR Spectrum:

C₉H₁₆O₂ (156.23)C₉H₁₆O₂ (156.23)

EI-MS: m/e = 138 (M⁺-H₂O, Hochauflösung, C₉H₁₄O, 6%); 123 (M⁺-CH₅O, 8%); 98 (Hochauflösung, C₆H₁₀O, 48%); 83 (100%)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1.27 (s, 7-H₃ u. 8-H₃); 1.43 (s, breit, HO, tauscht mit MeOD aus); 2.21 (s, 1-H₃); 2.35 (d. J = 1.3 Hz, 9-H₃); 2.32 (s, breit, 5-H₂); 6.13 (s, breit, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃): δ = 22.0 (o, C-9); 30.0 (o, 2C, C-7 u. C-8); 32.0 (o, C-1); 54.4 (u, C-5); 71.1 (u, C-6); 127.2 (o, C-3); 155.1 (u, C-4); 198.6 (u, C-2) ppmEI-MS: m / e = 138 (M⁺-H₂O, high-resolution, C₉H₁₄O, 6%); 123 (M⁺-CH₅O, 8%); 98 (high resolution, C₆H₁₀O, 48%); 83 (100%)
1 H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1.27 (s, 7-H₃ and 8-H₃); 1.43 (s, wide, HO, exchanges with MeOD); 2.21 (s, 1-H₃); 2.35 (i.e., J = 1.3Hz, 9-H₃); 2.32 (s, broad, 5-H₂); 6.13 (s, broad, 3-H) ppm
13 C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃): δ = 22.0 (o, C-9); 30.0 (o, 2C, C-7 and C-8); 32.0 (o, C-1); 54.4 (u, C-5); 71.1 (u, C-6); 127.2 (o, C-3); 155.1 (u, C-4); 198.6 (u, C-2) ppm

Als Salze der genannten Säuren kommen insbesondere Salze der Alkalimetalle, vorzugsweise der Natrium- und Kaliumsalze, in Frage.Salts of the acids mentioned are, in particular, salts of Alkali metals, preferably the sodium and potassium salts, in Question.

Die Methode der Erfindung kann in serumhaltigem oder vorzugsweise in serumfreiem Medium durchgeführt werden.The method of the invention may be used in serum-containing or preferably be carried out in serum-free medium.

Wenn die Methode in serumhaltigen Medium durchgeführt wird, ist die Verwendung von z. B. Thioglykolsäure, Nonactinsäure oder Furanfettsäure oder deren Salze bevorzugt.If the method is carried out in serum-containing medium, is the use of z. B. thioglycolic acid, nonactic acid or furan fatty acid or salts thereof.

Falls die Methode in serumfreiem Medium durchgeführt wird, wird man vorzugsweise eine C₃-C₅ aliphatische Monocarbonsäure, insbesondere Buttersäure oder Propionsäure, oder deren Salze verwenden.If the method is carried out in serum-free medium, it is preferable to use a C₃-C₅ aliphatic monocarboxylic acid, in particular butyric acid or propionic acid, or their salts use.

Es wurde gefunden, daß die Protein-Produktion steigernde Verbindung ihre Wirksamkeit bei Konzentrationen von 10 µM bis 500 mM, z. B. 1 mM bis 10 mM, aufzeigt. Die (C₃-C₅) aliphatische Monocarbonsäure, Thioglykolsäure, Thiodiglykolsäure, L-Cystein und Glutathion oder deren Salze sind insbesondere bei 1 mM bis 10 mM wirksam.It was found that increasing the protein production Compound their effectiveness at concentrations of 10 μM to 500 mM, z. 1mM to 10mM. The (C₃-C₅) aliphatic monocarboxylic acid, thioglycolic acid, thiodiglycolic acid, L-cysteine and glutathione or their salts are especially effective at 1 mM to 10 mM.

Die Protein-Produktion steigernden Substanzen können am entsprechenden Tage der Kultivierung zugesetzt werden, z. B. am Tag 0, das heißt am Anfang der Kultivierung, bis zum Ende des dritten Tages der Kultivierung.The protein production enhancing substances may be on the corresponding days of cultivation are added, for. B. on day 0, that is, at the beginning of cultivation, until the end the third day of cultivation.

Man kann auch die Protein-Produktion steigernde Substanz bei mehrfachen Applikationen verwenden. Also kann man in Anwesenheit einer Substanz die Zellen kultivieren, die Zellen von der Kultur entfernen, dann wieder in neues Kultivierungsmedium geben und in Anwesenheit von einer Protein-Produktion steigernden Substanz kultivieren. Bei dieser Mehrfachapplikation zeigen insbesondere C₃-C₅ aliphatischen Monocarbonsäuren oder deren Salze, vorzugsweise Buttersäure und Thioglykolsäure oder deren Salze, einen Steigerungseffekt.One can also use the protein production enhancing substance use multiple applications. So you can be in attendance a substance that cells cultivate, the cells Remove from culture, then back into new culture medium give and in the presence of a protein production cultivate the increasing substance. In this multiple application in particular C₃-C₅ aliphatic Monocarboxylic acids or their salts, preferably butyric acid and thioglycolic acid or its salts, a boosting effect.

Bei Mehrfachapplikation ist es nicht nötig, daß man die gleiche Substanz für alle Applikationen verwendet, sondern man kann eine der Substanzen in einer Applikation und eine andere in einer weiteren Applikation verwenden. Dieser Mehrfachapplikation zeigt ebenfalls auch einen Steigerungseffekt, wie insbesondere die Verwendung von Aphidicolin in einer Applikation und eine der anderen Substanzen, z. B. Buttersäure, Propionsäure, Butyrylcholinchlorid oder Butyrylcholinbromid oder deren Salze, in einer weiteren Applikation belegen.With multiple application, it is not necessary that the same substance used for all applications, but You can use one of the substances in one application and one use others in another application. This multiple application also shows a boost effect, in particular the use of aphidicolin in an application and one of the other substances, eg. B. butyric acid, Propionic acid, butyrylcholine chloride or butyrylcholine bromide or their salts, in another application occupy.

Man kann auch Kombinationen von zwei oder mehr Substanzen verwenden. Bevorzugt verwendet man nicht mehr als eine Substanz, die als Zellwachstum hemmt. Man kann z. B. eine C₃- C₅ aliphatische Monocarbonsäure, vorzugsweise Buttersäure und Thioglykolsäure, oder deren Salze verwenden, wobei die Monocarbonsäure oder deren Salz als 2. Substanz der Zellkultur bevorzugt zugegeben wird.You can also use combinations of two or more substances use. It is preferable not to use more than one substance which inhibits cell growth. You can z. B. a C₃- C₅ aliphatic monocarboxylic acid, preferably butyric acid and thioglycolic acid, or use their salts, wherein the Monocarboxylic acid or its salt as 2nd substance of cell culture is preferably added.

Transformierte chinesische Hamsterovarzellen bedeuten CHO- Zellen, die mit einem für einen erwünschten Proteine codierendem Vektor transformiert sind, wobei sie unter Züchtung das Protein synthetisieren und exprimieren können.Transformed Chinese hamster ovaries mean CHO Cells encoding a protein encoding a desired protein Vector are transformed, taking them under cultivation synthesize and express the protein.

Als transformierte chinesische Hamsterovarzellen kann man z. B. die Zellen, die in den Europäischen Patentanmeldungen 00 93 619 und 01 99 574 und der Deutschen Patentanmeldung 37 08 681 beschrieben sind, verwenden. Durch Kultivierung dieser transformierten CHO-Zellen können t-PA (EP-A 00 93 619) und gewisse t-PA-Mutanten (EP-A 01 99 574 und DE-A 37 08 681) hergestellt werden. Die Transformation von CHO-Zellen mit Vektoren, wobei die Zellen andere Proteine exprimieren werden, erfolgt durch literaturbekannte Technik wie z. B. in den oben erwähnten Europäischen und Deutschen Patentanmeldungen. As transformed Chinese hamster ovaries you can z. As the cells described in the European patent applications 00 93 619 and 01 99 574 and the German patent application 37 08 681, use. By cultivating this transformed CHO cells can produce t-PA (EP-A 00 93 619) and certain t-PA mutants (EP-A 01 99 574 and DE-A 37 08 681) getting produced. The transformation of CHO cells with Vectors, whereby the cells will express other proteins, done by literature known technique such. Tie above-mentioned European and German patent applications.

Als Wirtszelle kann man die unter dem Kennzeichen CHO-Kl- Zelle, die 1957 von Puck aus Biopsie-Material isoliert wurde und 1970 vom American Type Culture Collection (ATCC) unter der Bezeichnung CCL-61 aufgenommen wurde, verwenden. Diese Zellinie ist vom ATCC am 23. Dezember 1987 gemäß Budapester Vertrag unter der Nr. CRL 9618 erneut hinterlegt worden.As the host cell, one can use the CHO label Cell isolated from biopsy material by Puck in 1957 and 1970 by the American Type Culture Collection (ATCC) the term CCL-61 was used. These Cell line is from the ATCC on December 23, 1987 according to Budapest Contract has been re-deposited under No. CRL 9618.

Man kann die für das erwünschte Protein codierende DNA-Sequenz durch die schon literaturbekannte Technik, wie z. B. in verschiedenen der oben erwähnten Patentanmeldungen, herstellen. Vektoren, die diese Sequenz und auch kontrollierende Sequenzen aufweisen, können nach an und für sich bekannten Methoden konstruiert werden, z. B. unter Verwendung von E.coli K 12 294 (ATCC 31 446) und E. coli X 1776 (ATCC 31 537), die vom ATCC am 23. Dezember 1987 gemäß Budapester Vertrag unter den Nummern 53 704 und 53 705 hinterlegt worden sind, wie z. B. die Plasmide pETPER und pETPFR, die in EP-A 0 93 619 beschrieben sind. Die CHO-Zellen können durch die durch EP-A 0 93 619, DE-A 37 08 681, EP-A 01 17 059 und EP-A 1 99 574 oder andere literaturbekannte Methoden transformiert werden.One can select the DNA sequence coding for the desired protein by the already literature known technique, such. In various of the above-mentioned patent applications. Vectors that control this sequence and also Sequences, according to known per se Methods are constructed, for. B. using E. coli K 12 294 (ATCC 31 446) and E. coli X 1776 (ATCC 31 537), those of the ATCC on December 23, 1987 according to the Budapest Treaty deposited under the numbers 53 704 and 53 705 are, such. For example, the plasmids pETPER and pETPFR, which in EP-A 0 93 619 are described. The CHO cells can pass through EP-A 0 93 619, DE-A 37 08 681, EP-A 01 17 059 and EP-A 1 99 574 or other methods known from the literature become.

Der Vektor für die t-PA-Produktion wurde in einem Subklon, CHO-Kl-DUX B11, integriert (Urlaub et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 77: 4216-4220, 1980). Diese Zell-Linie, eine Dihydrofolat Reduktase negative Mutante (DHFR-), ist für eine DHFR-abhängige Selektion der tranfizierten Zellklone geeignet. Der Vektor für die humane c-DNA kann ein bekannter Plasmid-Vektor pBR-322 oder deren Abkömmling von Escherichia coli sein. Die Promotorregion für das in Frage kommende Gen und für das DHFR-Gen stammt aus SV 40 und die Terminationsregion für beide Gene von einem Hepatitis B-Oberflächenantigen. In den Beispielen wurden CHO-Kl-DUX-B11-Zellen, die durch die Plasmide pETPER oder pEPEFR transformiert sind, verwendet. (siehe EP-A 01 17 059). The vector for t-PA production was in a subclone, CHO-Kl-DUX B11, integrated (Urlaub et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 77: 4216-4220, 1980). This cell line, a dihydrofolate reductase negative mutant (DHFR-), is responsible for DHFR-dependent selection transfected cell clones suitable. The vector for the humane c-DNA may be a known plasmid vector pBR-322 or its Be descendants of Escherichia coli. The promoter region for the candidate gene and for the DHFR gene is derived SV 40 and the termination region for both genes of one Hepatitis B surface antigen. In the examples were CHO-Kl-DUX-B11 cells produced by the plasmids pETPER or pEPEFR transformed. (see EP-A 01 17 059).

Als serumfreies Medium stehen verschiedene bekannte Produkte zur Verfügung (siehe z. B. BMFT-Statusseminar 12, 13. November 1985, Bundesministerium für Forschung und Technologie, 5300 Bonn 2, Seite 111-120). Im folgenden Beispiel wird ein nachseziertes DMEM/Ham's F 12 Medium (1 : 1) (Gibco) als serumfreies Medium verwendet. Als Zusatz wird fötales Kälberserum (FKS) in einer Konzentration von 7,5% oder 1-2% verwendet.The serum-free medium are various known products available (see eg BMFT status seminar 12, 13 November 1985, Federal Ministry of Research and Technology, 5300 Bonn 2, page 111-120). The following example becomes post-seeded DMEM / Ham's F12 medium (1: 1) (Gibco) as serum-free Medium used. As an addition, fetal calf serum (FCS) at a concentration of 7.5% or 1-2%.

Die Zellkulturen werden bei 37°C in einem Hereaus-Brutschrank inkubiert und mit einem Kohlendioxid-Luftgemisch von 7,5% CO₂ in einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100% belüftet. Je nach Verfahrensansatz werden unterschiedliche Kulturgefäße benutzt: Spinnergefäße für 100-1000 ml Medium, Roux-Schalen (Nunc) 175 cm² (70-100 ml Medium), 75 cm² (30-50 ml Medium), 25 cm² (7-10 ml Medium) und Mehrfachkulturschalen von Costar mit 2 cm² für 1 ml Kulturen. Für die Stammhaltung werden die Zellen in einer Dichte von 0,2-0,3 × 10⁶ Zellen/ml eingesetzt und alle 2-3 Tage subkloniert.The cell cultures are stored at 37 ° C in a Hereaus incubator incubated and with a carbon dioxide-air mixture of 7.5% CO₂ aerated in a relative humidity of 100%. Depending on the method approach, different Culture vessels used: Spinner vessels for 100-1000 ml medium, Roux dishes (Nunc) 175 cm² (70-100 ml medium), 75 cm² (30-50 ml of medium), 25 cm² (7-10 ml of medium) and multiple culture dishes from Costar with 2 cm² for 1 ml cultures. For the stem will be the cells in a density of 0.2-0.3 x 10⁶ cells / ml and subcloned every 2-3 days.

Die Protein-Produktion stimulierenden Substanzen können zu den verschiedenen Zeitpunkten jeweils in einer 1 : 100 Verdünnung zugegeben werden, d. h. sie wurden zuerst in Medium gelöst oder, wenn sie schwerlöslich sind, erst in Äthylalkohol gelöst und danach in Medium zugesetzt und dann das diese Substanz enthaltende Medium dem zellenthaltenden Medium im Verhältnis 1 : 100 v/v zugegeben.The protein production stimulating substances can too each time in a 1: 100 dilution be added, d. H. they were first dissolved in medium or, if they are sparingly soluble, first in ethyl alcohol dissolved and then added in medium and then this Substance-containing medium the cell-containing medium in Ratio 1: 100 v / v added.

In den folgenden Beispielen wurden, um die Stimulierung der t-PA-Synthese hervorzurufen, Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen und in Plastikröhrchen (Falcon) 10 Min. bei 1000×g in einer Beckmann T 3-6 Zentrifuge abzentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet mit frischem Medium resuspendiert. In the following examples, to stimulate t-PA synthesis, cells were removed from an exponentially growing culture and spun down in plastic tubes (Falcon) for 10 min at 1000 x g in a Beckman T 3-6 centrifuge. After decanting the supernatant, the cell pellet was resuspended in fresh medium.

Für die Produktion von t-PA in serumhaltigem Medium wurde als frisches Medium F12/DMEM + 7,5% FKS + Gentamycin verwendet. Die resultierende Suspension kann in 2 cm² 24 Wells-Platten bei einer Zelldichte von 0,2-0,3 × 10⁶ Zellen/ml angesetzt werden.For the production of t-PA in serum-containing medium was used as fresh medium F12 / DMEM + 7.5% FCS + gentamycin. The resulting suspension can be in 2 cm² 24 Wells plates at a cell density of 0.2-0.3 × 10⁶ Cells / ml are used.

Für die Produktion von t-PA in serumfreiem Medium wurden die Zellen zuvor 3-4 Tage in einem Medium von 1-2% FKS adaptiert, wieder abzentrifugiert und das Zellpellet in serumfreiem Medium resuspentiert und anschließend in 2 cm² 24 Wells-Platten in einer Zelldichte von 0,4-0,5 × 10⁶ Zellen/ml überführt.For the production of t-PA in serum-free medium, the Cells previously adapted for 3-4 days in a medium of 1-2% FCS, centrifuged again and the cell pellet in serum-free Medium resuspended and then in 2 cm² 24 Wells plates in a cell density of 0.4-0.5 × 10⁶ Transferred cells / ml.

Quantitative t-PA determinations

Aliquots von Zellüberständen und Zellextrakten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten abgenommen bzw. hergestellt. Die Messung der Proben erfolgte entweder sofort oder nach Aufbewahrung bei -20°C mit folgenden Methoden:Aliquots of cell supernatants and cell extracts became taken or produced at different times. The Samples were taken either immediately or after storage at -20 ° C with the following methods:

determination method 1 - Direct Chromogenic Assay (DCA)

Von dem synthetischen Peptidsubstrat S-2288 (D-H-Ile-Pro- Arg-p-Nitroanilin) der Firma Kabi Diagnostica wird durch das t-PA p-Nitroanilin als Reaktionsprodukt gebildet. Die Aktivität von t-PA ist zur Bildung von p-Nitroanilin proportional, die bei 405 mn, 37°C, gemessen wird.Of the synthetic peptide substrate S-2288 (D-H-Ile-Pro Arg-p-nitroaniline) from the company Kabi Diagnostica is by the t-PA p-nitroaniline formed as a reaction product. The activity of t-PA is proportional to the formation of p-nitroaniline, which is measured at 405 mn, 37 ° C.

Die spektrophotometrische Bestimmung der Enzymkinetik wurde mit einem ACP-5010-Analysengerät der Firma Eppendorf automatisch durchgeführt. The spectrophotometric determination of the enzyme kinetics was with an ACP-5010 analyzer from Eppendorf automatically carried out.

Die Aktivität des Enzyms wurde anhand dieses vorgegebenen Standards berechnet. Eine t-PA-Standardreihe von 1-15 µg/ml wurde mit einem Laborstandard hergestellt, der zu 72% aus 1-kettigem Material besteht.The activity of the enzyme was determined by this Standards calculated. A t-PA standard series of 1-15 μg / ml was made with a laboratory standard that was 72% off 1-chained material.

Die Substratlösung (100 mM Tris/106 mM NaCl) wurde in einer Konzentration von 50 mM eingesetzt.The substrate solution (100 mM Tris / 106 mM NaCl) was in a Concentration of 50 mM used.

2 - ELISA

Mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) wurden die t-PA-Proben des Überstandes und des Zellextraktes quantitativ bestimmt. Als Standard diente ein Laborstandard in einer Konzentrationsreihe von 0,038-5 µg/ml. Die Proben wurden 1 : 10 bis 1 : 1000 vorverdünnt.With the help of an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) were the t-PA samples of the supernatant and the cell extract determined quantitatively. The standard was a laboratory standard in a concentration range of 0.038-5 μg / ml. Samples were prediluted 1:10 to 1: 1000.

Characterization of the transformed CHO cells cell growth

Die CHO-Zellen werden mit 0,2-0,3 × 10⁶ Zellen/ml in Kulturschalen (in Medium mit 7.5% FKS) angeimpft und vermehren sich zu Anfang sehr langsam. Erst nach einer lag-Phase von 24 h beginnt das logarithmische Zellwachstum. Bei einer Zelldichte von 1,3 ± 0,04 × 10⁶ Zellen/ml treten am 4. Tag die ersten nicht vitalen Zellen in der Kultur auf; ihr Anteil an der Gesamtzellzahl beträgt 13,2 ± 1,3%. Die maximale Zelldichte wird am 5. Tag mit 1,8 ± 0,05 × 10⁶ Zellen/ml erreicht (Abb. 1).The CHO cells are inoculated with 0.2-0.3 × 10⁶ cells / ml in culture dishes (in medium with 7.5% FCS) and multiply very slowly in the beginning. Only after a lag phase of 24 h does the logarithmic cell growth begin. At a cell density of 1.3 ± 0.04 x 10⁶ cells / ml, the first non-vital cells in the culture appear on the 4th day; their share of the total cell count is 13.2 ± 1.3%. The maximum cell density is reached on the 5th day at 1.8 ± 0.05 x 10⁶ cells / ml ( Fig. 1).

Die Zahl der lebenden Zellen stellt nach 7 Tagen noch 72 ± 3% der gesamten Zellmasse dar. The number of living cells is still 72 ± after 7 days 3% of the total cell mass.

Die stationäre Phase, die sich an das exponentielle Zellwachstum anschließt, wird von verschiedenen Faktoren eingeleitet. Durch eine hohe Populationsdichte und Verbrauch essentieller Nährstoffe teilen sich die Zellen nicht weiter. Die Dauer der stationären Phase variiert stark und ist abhängig von Medienkomponenten wie Serum. Eine Anhäufung von Säuren und toxischen Stoffwechselprodukten sowie Veränderungen von Milieufaktoren (saurer pH, niedriger O₂-Partialdruck, mangelnde Durchlüftung), bedingen ebenfalls das Absterben der Zellen.The stationary phase, responsive to the exponential cell growth is initiated by various factors. Due to a high population density and consumption Essential nutrients do not divide the cells any further. The duration of the stationary phase varies greatly and is dependent of media components such as serum. An accumulation of Acids and toxic metabolites as well as changes Milieufaktoren (acidic pH, low O₂ partial pressure, lack of ventilation), also cause dying the cells.

t-PA production in CHO cells

Zwischen Zellwachstum und t-PA-Synthese besteht eine lineare Beziehung.There is a linear between cell growth and t-PA synthesis Relationship.

Der Zeitverlauf der t-PA-Produktion zeigt 2 Phasen. In der 1. Phase steigt die t-PA-Konzentration im Überstand stetig an. In der 2. Phase kommt die Enzymsynthese praktisch zum Stillstand und die t-PA-Konzentration in Medium bleibt annähernd konstant (Abb. 2A). Die maximale t-PA-Konzentration am 4. Tag beträgt 11,1 ± 0,7 µg/ml im Elisa. Die gemessenen t-PA-Konzentrationen liegen mit dem chromogenen assay etwas höher, was vermutlich durch 2-kettiges t-PA verursacht wird, mit der Elisa-Methode jedoch verlaufen die Kurven mit beiden Nachweismethoden bis zum 4. Tag parallel.The time course of t-PA production shows 2 phases. In the 1st phase, the t-PA concentration in the supernatant increases steadily on. In the second phase, the enzyme synthesis comes to practical Standstill and the t-PA concentration in medium remains approximate constant (Fig. 2A). The maximum t-PA concentration on the 4th day is 11.1 ± 0.7 μg / ml in Elisa. The measured t-PA concentrations are slightly higher with the chromogenic assay higher, which is probably caused by 2-chain t-PA, however, with the Elisa method, the curves run with both Detection methods parallel until the 4th day.

Die intrazelluläre t-PA-Konzentration verläuft ebenfalls parallel zum Zellwachstum und ist relativ gering bezogen auf die gesamte synthetisierte t-PA-Menge. Am 4. Tag beträgt deren Anteil 7% an der Gesamtaktivität (Abb. 2B).The intracellular t-PA concentration also proceeds parallel to cell growth and is relatively low in terms of the total synthesized t-PA amount. On the 4th day is their share is 7% of total activity (Figure 2B).

Wie Abb. 3A zeigt, steigt die t-PA-Synthese, bezogen auf die Zellzahl, bis zum 4. Tag leicht an; mit der Elisa-Methode wird ein Maximum von 8,1 ± 1,2 µg t-PA/1 × 10⁶ Zellen bestimmt. Zellulär gebundenes t-PA wurde nur mit der Elisa-Methode bestimmt, da diese geringen t-PA-Konzentrationen (< 1 µg) mittels DCA nicht zu bestimmen sind.As shown in Fig. 3A, the t-PA synthesis increases with respect to the Cell number, lightly on until the 4th day; with the Elisa method a maximum of 8.1 ± 1.2 μg t-PA / 1x10⁶ cells is determined. Cellular bound t-PA was only using the Elisa method determined, because these low t-PA concentrations (<1 μg) can not be determined by DCA.

Der intrazelluläre t-PA-Gehalt, bezogen auf die Zellzahl, ist während der log-Phase des Zellwachstums etwas höher und liegt zwischen 500 und 900 ng t-PA / 1 × 10⁶ Zellen, ab dem 4. Tag liegt der t-PA-Wert bei ca. 450 ng / 1 × 10⁶ Zellen (Abb. 3B).The intracellular t-PA content, based on the number of cells, is slightly higher and higher during the log phase of cell growth is between 500 and 900 ng t-PA / 1 x 10⁶ cells On the 4th day, the t-PA value is about 450 ng / 1 × 10⁶ Cells (Fig. 3B).

Influence of serum and serum factors in the medium on cell growth and t-PA production in CHO cells

Die Zellen wurden mit 0,25 × 10⁶ Zellen/ml und verschiedenen Serumkonzentrationen in Medium angesetzt.The cells were incubated at 0.25 x 10⁶ cells / ml and different Serum concentrations in medium.

Eine Serumkonzentration unter 5% im Medium wirkt sich auf die Zellteilung gleichfalls negativ aus, die Produktivität wird hingegen nur gering beeinflußt.A serum concentration below 5% in the medium has an effect cell division is also negative, productivity however, is only slightly affected.

Der Einfluß der Serumkonzentration in Medium auf das Zellwachstum und die t-PA-Produktion nach 48 h-Inkubation der Zellen ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte sind in % der maximalen Werte (7,5% FKS in Medium) angegeben. Der Maximalwert für die Zellzahl liegt bei 0,56 ± 0,03 × 10⁶ Zellen und für die t-PA-Konzentration 5,7 ± 0,5 µg/ml. Die t-PA-Bestimmungen wurden mittels DCA durchgeführt (Mittelwert ± SE, n = 4). The influence of serum concentration in medium on cell growth and t-PA production after 48 h incubation of the cells is shown in Table 1. The values are given in% of the maximum values (7.5% FCS in medium). The maximum value for the cell number is 0.56 ± 0.03 x 10⁶ cells and for the t-PA concentration 5.7 ± 0.5 μg / ml. The t-PA determinations were performed by DCA (mean ± SE, n = 4).

Tabelle 1 Table 1

Cell culture in serum-free medium

Die Zellen wurden in serumfreiem Medium in einer Zelldichte von 0,4-0,5 × 10⁶ Zellen/ml angesetzt. Die Zellen teilen sich bis zum 4. Tag, ohne die höchste Lebendzellzahl wird ebenfalls am 4. Tag mit 1,0 ± 0,2 × 10⁶ Zellen/ml erreicht (Abb. 4).The cells were in serum-free medium in a cell density of 0.4-0.5 × 10⁶ cells / ml. The cells divide until the 4th day, without the highest number of living cells also reached on the 4th day at 1.0 ± 0.2 x 10⁶ cells / ml (Fig. 4).

t-PA production in serum-free medium

Die t-PA-Konzentration im Überstand steigt bis zum 7. Tag ständig an und erreicht mit der Elisa-Methode ein Maximum von 13,6 ± 0,54 µg/ml. Die, mittels DCA ermittelten t-PA- Werte, liegen am 1.-3. Tag unter, und ab dem 4. Tag über den t-PA-Werten, die mittels Elisa bestimmt wurden (Abb. 5).The t-PA concentration in the supernatant increases until the 7th day constantly and reaches a maximum with the Elisa method of 13.6 ± 0.54 μg / ml. The, determined by DCA t-PA Values, are on the 1st-3rd. Day under, and from the 4th day over the t-PA values determined by Elisa (Figure 5).

Die t-PA Synthese pro Zelle ist in serumfreiem Medium ungefähr gleich hoch wie in Medium mit Serum und liegt zwischen 7,2 ± 3,6 und 10,3 ± 2,8 µg/ 1 × 10⁶ Zellen (Elisa) (Abb. 6).The t-PA synthesis per cell is in serum-free medium about the same as in medium with serum and lies between 7.2 ± 3.6 and 10.3 ± 2.8 μg / 1 x 10⁶ cells (Elisa) (Fig. 6).

Der prozentuale Anteil von t-PA in serumfreiem Medium an der Gesamtproteinmenge des Überstandes liegt zwischen 10,9 ± 1,0 und 12,5 ± 1,4%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Die t-PA-Werte wurden mittels Elisa bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 4).The percentage of t-PA in serum-free medium in total supernatant protein is between 10.9 ± 1.0 and 12.5 ± 1.4%. The results are shown in Table 2. The t-PA values were determined by Elisa (mean ± SE, n = 4).

Tabelle 2 Table 2

Effect of aliphatic monocarboxylic acids

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen in Medium mit 7,5% FKS durch verschiedenen aliphatischen Monocarbonsäuren sind in Tabelle 3 angegeben. Alle Säuren wurden in einem Konzentrationsbereich von 10 mM bis 500 mM verwendet. Der optimale Dosisbereich für alle Monocarbonsäuren liegt zwischen 1 bis 10 mM. Die Wirksamkeit der Säuren hängt von der Kettenlänge ab.Increase of t-PA production in CHO cells in medium with 7.5% FCS by various aliphatic monocarboxylic acids are given in Table 3. All acids were in one Concentration range from 10 mM to 500 mM used. The optimal dose range for all monocarboxylic acids is in between 1 to 10 mM. The effectiveness of the acids depends on the Chain length from.

Alle wirksamen Monocarbonsäuren hemmen das Zellwachstum. Propion-, Butter-, Isobutter- und Isovaleriansäuren sind in einem größeren Konzentrationsbereich wirksam, da die konzentrationsabhängige Inhibition des Primärstoffwechsels, die zur Hemmung des Zellwachstums führt, sich mit der Steigerung der t-PA-Synthese überlagert.All effective monocarboxylic acids inhibit cell growth. Propionic, butyric, isobutyric and isovaleric acids are in a larger concentration range, since the concentration-dependent Inhibition of primary metabolism, the inhibition of cell growth leads to increase superimposed on the t-PA synthesis.

Die Werte in Tabelle 3 beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben. Die t-PA-Bestimmung erfolgte mittels DCA (Mittelwert ± SE, n = 3-24). Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Daten für die einzelnen Proben sind in Klammern angegeben.The values in Table 3 relate to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%). The t-PA determination was carried out by DCA (mean ± SE, n = 3-24). The maximum value refers to a single sample. Data for each sample are shown in parentheses.

Tabelle 3 Table 3

Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge von 3 bis 4 Tagen, wobei die Monocarbonsäuren am Tag 0 bis Tag 3 der Kultivierung zugegeben worden sind, wie unten in Tabelle 3A dargestellt. Daten für die einzelnen Proben sind in Klammern angegeben.The average values refer to several production runs from 3 to 4 days, wherein the monocarboxylic acids on Day 0 to day 3 of cultivation have been added as shown below in Table 3A. Data for the individual Samples are given in parentheses.

Tabelle 3A Table 3A

In Abb. 7 ist der zeitliche Verlauf der t-PA-Produktionssteigerung in Medium mit 7,5% FKS durch C3-C5-Monocarbonsäuren dargestellt. Nach 24 h ist schon eine Stimulierung der t-PA-Produktion von 18,1 ± 5,7% (C4) bis 24,8 ± 0,5% (C5) nachweisbar. Bei Isobuttersäure zeigte sich eine Produktionssteigerung erst nach 48 h. Eine maximale Steigerung der t-PA-Produktion wurde für die C3- und die C4-Carbonsäure am 3. Tag erreicht, mit 37,2 ± 5,1% für Na-Butyrat. Die Produktionssteigerung ist für die Butter- und Isobuttersäure nur kurzzeitig, ein Effekt ist am 4. Tag nicht mehr zu beobachten. Die steigernde Wirkung von Propionsäure und Isovaleriansäure hingegen ist am 4. Tag noch vorhanden und manifestiert sich in einer Steigerung der t-PA-Produktion um 31,8% für C3 und 8,5% für C5. Figure 7 shows the time course of the t-PA production increase in medium with 7.5% FCS by C3-C5 monocarboxylic acids shown. After 24 h is already a stimulation of t-PA production from 18.1 ± 5.7% (C4) to 24.8 ± 0.5% (C5) detectable. With isobutyric acid showed an increase in production only after 48 h. A maximum increase in the t-PA production was reported for the C3 and C4 carboxylic acids on Day 3 reached, with 37.2 ± 5.1% for Na butyrate. The production increase is for butter and isobutyric acid only briefly, an effect is no longer observed on the 4th day. The enhancing effect of propionic acid and isovaleric acid however, on the 4th day is still present and manifest translate into an increase in t-PA production 31.8% for C3 and 8.5% for C5.

Die Effekte sind außerdem vom physiologischen Zustand der Zelle abhängig. Während des exponentiellen Wachstums sind die Zellen für eine Stimulierung am empfindlichsten.The effects are also from the physiological state of Cell dependent. During the exponential growth are the cells are most sensitive to stimulation.

In Tabelle 4 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO- Zellen in Medium mit 7,5% FKS durch C₃-C₅-Monocarbonsäuren in Abhängigkeit vom Applikationstag der Carbonsäuren nach 48 h Wachstum der Zellen in Medium mit 7,5% FKS dargestellt. Die Konzentration war für Buttersäure und Isovaleriansäure 1 mM und für Propionsäure und Isovaleriansäure 5 mM. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, 3 = 3-5). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.Table 4 shows the increase in t-PA production in CHO Cells in medium with 7.5% FCS by C₃-C₅ monocarboxylic acids depending on the day of application of the carboxylic acids 48 h growth of cells in medium with 7.5% FCS shown. The concentration was for butyric acid and isovaleric acid 1 mM and for propionic acid and isovaleric acid 5 mM. The Values refer to 1 ml of cell supernatant and are in% compared (0%) (mean ± SE, 3 = 3-5). The t-PA determination was performed by DCA.

Tabelle 4 Table 4

Effects of butyric acid on t-PA production in CHO cells

Der Stimulierungseffekt ist an einer Steigerung sowohl der intrazellulären t-PA-Konzentration als auch der extrazellulären t-PA-Konzentration zu verfolgen.The stimulating effect is due to an increase in both the intracellular t-PA concentration as well as the extracellular to track t-PA concentration.

Wie aus Abb. 8 hervorgeht, ist die Zunahme des intrazellulären t-PA-Gehaltes in Butyrat-behandelten Kulturen nach 24 h-Inkubationen gegenüber der Kontrolle am größten (43,8 ± 9,8%). Im Überstand fällt die prozentuale Steigerung nach 24 h etwas geringer aus mit durchschnittlich 19,2% (DCA und Elisa) gegenüber den Kontrollwerten. Dieser Effekt hält im Überstand 72 h an.As can be seen in Figure 8, the increase in intracellular t-PA content in butyrate-treated cultures is highest after 24 h incubation versus control (43.8 ± 9.8%). In the supernatant, the percentage increase after 24 h is slightly lower with an average of 19.2% (DCA and Elisa) compared to the control values. This effect lasts for 72 hours in the supernatant.

In Abb. 9A-C ist die t-PA-Synthese, bezogen auf die Zellzahl dargestellt, und sie zeigen, daß die Stimulierung der t-PA- Synthese durch Na-Butyrat trotz der Hemmung des Zellwachstums über 7 Tage anhält. Während der ersten 4 Tage nimmt die Enzymsynthese pro Zelle stetig zu. Die t-PA-Konzentration steigt von 7,5 ± 1 µg bis 28,9 ± 5,3 µg t-PA/ 1 × 10⁶ Zellen (Elisa) im Überstand an (Abb. 8A). Mit der DCA-Methode wird ein maximaler t-PA-Gehalt von 47,4 ± 7,4 µg t-PA/1 × 10⁶ Zellen bestimmt (Abb. 9B). Gleichzeitig nimmt der in trazelluläre t-PA-Gehalt ab und fällt von 1,5±0,2 µg t-PA/ 1×10⁶ Zellen am 5. Tag ab (Abb. 9C). Figure 9A-C depicts t-PA synthesis by cell number and shows that stimulation of t-PA synthesis by Na-butyrate persists despite inhibition of cell growth for 7 days. During the first 4 days, the enzyme synthesis per cell increases steadily. The t-PA concentration increases from 7.5 ± 1 μg to 28.9 ± 5.3 μg t-PA / 1 × 10⁶ cells (Elisa) in the supernatant ( Figure 8A). The DCA method determines a maximum t-PA content of 47.4 ± 7.4 μg t-PA / 1 × 10⁶ cells ( Figure 9B). At the same time, it decreases in tracellular t-PA content and decreases from 1.5 ± 0.2 μg t-PA / 1 × 10⁶ cells on the 5th day ( Figure 9C).

In Tabelle 5 ist die Stimulierung der t-PA-Synthese durch Na-Butyrat in Medium mit 7,5% FKS bezogen auf die Zellzahl angegeben. Na-Butyrat wurde am Tag 0 in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Werte an den Tagen 1-4 sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen. Der t-PA-Gehalt im Überstand und im Zellextrakt wurde mittels Elisa bestimmt. (Mittelwert ± SE, n = 5-10). Table 5 shows stimulation of t-PA synthesis by Na-butyrate in 7.5% FCS medium by cell number. Na-butyrate was added on day 0 at a concentration of 1 mM. The values on days 1-4 are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 × 10⁶ cells. The t-PA content in the supernatant and in the cell extract was determined by Elisa. (Mean ± SE, n = 5-10).

Tabelle 5 Table 5

Eine optimale Produktionssteigerung wurde erreicht, wenn Na-Butyrat während des exponentiellen Wachstums der Zelle zugegeben wurde. Der maximale Effekt von Na-Butyrat tritt bei einem Applikationszeitraum von Tag 0 bis 2 immer am 3. Tag auf (Abb. 10).Optimum production increase was achieved when Na-butyrate was added during the exponential growth of the cell. The maximum effect of Na-butyrate always occurs on the 3rd day with an application period from day 0 to 2 ( Fig. 10).

Durch eine Applikation von Na Butyrat alle 2-3 Tage nach Mediumwechsel in derselben Zellpopulation konnte die t-PA-Produktion über längere Zeit auf einen höheren Niveau gehalten werden.By application of Na butyrate every 2-3 days after change of medium in the same cell population could t-PA production kept at a higher level for a longer period of time become.

In Tabelle 6 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO- Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, dargestellt. 1 mM Na-Butyrat wurde bei jedem Mediumwechsel bzw. nur am Tag 0 zugegeben. Die Werte von 2, 4, 7 bzw. 9 Tagen nach Mediumwechsel sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand. Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt (Mittelwert ± SE, n = 3).Table 6 shows the increase in t-PA production in CHO cells cultured in 7.5% FCS medium. 1 mM Na-butyrate was added at each change of medium or only on day 0. The values of 2, 4, 7 and 9 days after change of medium are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 ml of cell supernatant. The t-PA determination was performed by DCA (mean ± SE, n = 3).

Mediumwechsel, TagChange of medium, day Applikation, Tag 0, 2, 4, 7Application, day 0, 2, 4, 7 22 33,0 ± 5,433.0 ± 5.4 44 107,4 ± 7,6107.4 ± 7.6 77 96,6 ± 5,896.6 ± 5.8 99 62,0 ± 4,862.0 ± 4.8

Effects of butyric acid on t-PA production in CHO cell in serum-free medium

Im Gegensatz zu dem Kurzzeiteffekt der Butyrat-stimulierten t-PA-Synthese in serumhaltigem Medium hält der Effekt in serumfreiem Medium länger an und beträgt 1 Tag nach Applikation von Na-Butyrat 44,1 ± 7,1% gegenüber der Kontrolle. Eine maximale Steigerung wurde 3 Tage nach Applikation von Na-Butyrat erreicht mit 143,3 ± 12,8%. Der Steigerungseffekt ist noch 6 Tage nach Na-Butyrat-Zugabe mit 49,9 ± 7,0% nachzuweisen (Abb. 11 und 12).In contrast to the short-term effect of butyrate-stimulated t-PA synthesis in serum-containing medium, the effect lasts longer in serum-free medium and is 44.1 ± 7.1% over the control one day after application of Na-butyrate. Maximum increase was achieved 3 days after application of Na-butyrate with 143.3 ± 12.8%. The increase effect is still to be detected 6 days after addition of Na-butyrate at 49.9 ± 7.0% ( Figures 11 and 12).

Die t-PA-Synthese, bezogen auf 1 × 10⁶ Zellen, ist in serumfreien Medium ebenfalls höher als in serumhaltigem Medium und steigt auf über 50 µg/ 1 × 10⁶ Zellen (Abb. 13).The t-PA synthesis, based on 1 × 10⁶ cells, is serum-free Medium also higher than in serum-containing medium and increases to over 50 μg / 1 × 10⁶ cells (Figure 13).

Effects of Propionic Acid

Die C3-Carbonsäure zeigt sehr ähnliche Effekte auf die t-PA- Synthese wie die Buttersäure. Die prozentuale Steigerung fällt jedoch ca. 14% niedriger aus und für die t-PA-Stimulierung sind höhere Konzentrationen (5-10 mM) notwendig. Weiterhin hemmt Propionsäure in geringerem Maße das Zellwachstum und führt daher zu einer längeranhaltenden Steigerung der t-PA-Synthese.The C3 carboxylic acid shows very similar effects on the t-PA Synthesis like butyric acid. The percentage increase However, it is about 14% lower and for t-PA stimulation higher concentrations (5-10 mM) are necessary. Furthermore, propionic acid inhibits cell growth to a lesser extent and therefore leads to a longer-lasting increase the t-PA synthesis.

Eine Stimulierung der t-PA-Synthese durch Propionsäure scheint, im Gegensatz zur Buttersäure, sehr spezifisch zu sein, da in serumfreiem Medium der extrazelluläre Proteingehalt gegenüber der Kontrolle nur gering erhöht wurde und der Einbau von (³H)-Leucin nur geringfügig gesteigert wurde.A stimulation of t-PA synthesis by propionic acid seems, in contrast to butyric acid, very specific too be because in serum-free medium, the extracellular protein content compared to the control was only slightly increased and the Incorporation of (3 H) -leucine was only slightly increased.

Effects of dicarboxylic acids, hydroxycarboxylic acids and ketocarboxylic acids on t-PA production in CHO cells

Hydroxycarbonsäuren, wie Milchsäure, Glycerinsäure, Apfelsäure und Weinsäure zeigen nur eine leichte Steigerung der t-PA-Synthese, die zwischen 6 und 10% lag, wobei die Weinsäure in einer Konzentration von 10 mM die t-PA-Synthese am besten stimulierte (10,3 ± 2,9% gegenüber der Kontrolle). Die Zellteilung wird von Hydroxycarbonsäuren nicht beeinflußt, und der Effekt auf die t-PA-Synthese ist noch nach 96 h nachzuweisen.Hydroxycarboxylic acids, such as lactic acid, glyceric acid, malic acid and tartaric acid show only a slight increase in t-PA synthesis, which was between 6 and 10%, with the tartaric acid in a concentration of 10 mM the t-PA synthesis on best stimulated (10.3 ± 2.9% compared to the control). Cell division is not affected by hydroxycarboxylic acids, and the effect on t-PA synthesis is still behind 96 h to prove.

Effects of ascorbic acid

Die Wirkung der Ascorbinsäuren bei 10 mM auf die t-PA-Produktion hält 72 h an und zeigt bei einer Applikation am Tag 0 eine 15,2 ± 3,1% Steigerung der t-PA-Synthese nach 24 h (Abb. 14). The effect of ascorbic acids at 10 mM on t-PA production lasts for 72 h and shows a 15.2 ± 3.1% increase in t-PA synthesis after 24 h when applied on day 0 ( Figure 14). ,

Effects of long-chain fatty acids on t-PA production in CHO cells

Es wurde gefunden, daß auch langkettige Fettsäuren wie Nonactinsäure mit 10C-Atomen und Furanfettsäuren eine Steigerung hervorrufen konnten (Tabelle 7). In diesem Beispiel wurde eine Furanfettsäure gemäß Formula 4, in der m = 4 und n = 8, verwendet.It was also found that long-chain fatty acids such as 10C-atom nonactic acid and furan fatty acids could cause an increase (Table 7). In this example, a furan fatty acid according to Formula 4, in which m = 4 and n = 8, was used.

In serumfreiem Medium war jedoch keine Steigerung der t-PA- Synthese bzw. der Proteinsynthese nachzuweisen.In serum-free medium, however, no increase in t-PA To prove synthesis or protein synthesis.

Die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch langkettige Fettsäuren ist in Tabelle 8 dargestellt. Die Zellen wurden in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Die Säuren wurden in einem Konzentrationsbereich von 10 µM bis 10 mM getestet, wobei eine Konzentration von 1 mM optimal war. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-9). Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Die t-PA- Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.The increase of t-PA production in CHO cells by long-chain fatty acids is shown in Table 8. The cells were cultured in medium with 7.5% FCS. The acids were tested in a concentration range of 10 μM to 10 mM, with a concentration of 1 mM being optimal. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4-9). The maximum value refers to a single sample. The t-PA determination was performed by DCA.

Tabelle 7 Table 7

Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge von 4 Tagen, wobei die Säuren am Tag 0 zugegeben wurden, wie in Tabelle 8A dargestellt. Daten für die Einzelproben sind in Klammern angegeben.The average values refer to several production runs of 4 days, with the acids added on day 0 were as shown in Table 8A. Data for the individual samples are given in brackets.

Tabelle 7A Table 7A

Effects of thiols and sulfides on t-PA production in CHO cells

Vier schwefelhaltige Verbindungen, die Derivate oder Substitutionsprodukte von Carbonsäuren darstellen, zeigten eine Steigerung der t-PA-Produktion zwischen 16% und 31,2%, ohne das Zellwachstum negativ zu beeinflussen (Tabelle 8). Die substituierten Carbonsäuren zeigten ihre optimale Wirkung im gleichen Konzentrationsbereich (1-10 mM) wie die anderen wirksamen Carbonsäuren. Nur Glutathion war in einem niedrigerem Konzentrationsbereich von 1-10 µM effektiv. Thioglykolsäure erwies sich als bevorzugter Stimulator der t-PA- Synthese in CHO-Zellen.Four sulfur-containing compounds, derivatives or substitution products of carboxylic acids showed one Increase in t-PA production between 16% and 31.2%, without negatively affecting cell growth (Table 8). The substituted carboxylic acids showed their optimal effect in same concentration range (1-10 mM) as the others effective carboxylic acids. Only glutathione was in a lower one Concentration range of 1-10 μM effective. thioglycolic proved to be a preferred stimulator of the t-PA Synthesis in CHO cells.

In diesem Beispiel wurden die Zellen in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Alle Substanzen wurden in einem Konzentrationsbereich von 1 µM bis 10 mM getestet. Die Werte in Tabelle 9 beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 6-19). In this example, the cells were cultured in 7.5% FCS medium. All substances were tested in a concentration range of 1 μM to 10 mM. The values in Table 9 relate to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 6-19).

Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Die Konzentration der Substanz ist in Klammern angegeben.The maximum value refers to a single sample. The t-PA determination was performed by DCA. The concentration the substance is given in parentheses.

Tabelle 8 Table 8

Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge von 3 Tagen, wobei die Substanzen vom Tag 0 bis Tag 2 zugegeben worden sind wie in Tabelle 9A angegeben. Daten für die einzelnen Proben sind in Klammern dargestellt. The average values refer to several production runs of 3 days, with the substances from day 0 to Day 2 were added as indicated in Table 9A. dates for each sample are shown in parentheses.

Tabelle 8A Table 8A

Die Vorteile von Thiocarbonsäuren gegenüber Monocarbonsäuren ist das Fehlen eines inhibitorischen Effekts auf die Zellproliferation, jedoch konnte die Produktion von t-PA mit diesen Substanzen nicht weiter gesteigert werden als mit Buttersäure. Die Dauer des Steigerungseffektes ist ebenso kurz und erreicht den Maximalwert nach 24 h für Thioglykolsäure und nach 48 h für Cystein. Nach 4 Tagen Inkubation der Zellen ist der Effekt für die t-PA-Produktion nur noch gering (Abb. 15).The advantages of thiocarboxylic acids over monocarboxylic acids is the lack of an inhibitory effect on cell proliferation, but the production of t-PA with these substances could not be increased further than with butyric acid. The duration of the increase effect is also short and reaches the maximum value after 24 h for thioglycolic acid and after 48 h for cysteine. After 4 days incubation of the cells, the effect on t-PA production is only slight ( Figure 15).

In serumfreiem Medium ist die stimulierende Wirkung auf die t-PA-Synthese aber geringer als in Medium mit Serum, da alle Substanzen die Zellteilung zwischen 10% und 20% hemmen.In serum-free medium, the stimulating effect on the t-PA synthesis but less than in medium with serum, since all Substances inhibit cell division between 10% and 20%.

Effects of thioglycolic acid

Die t-PA-Produktion ist nach der Thioglykolsäure-Behandlung 72 h erhöht und vom Applikationstag unabhängig. Die prozentuale Steigerung der Enzymsynthese ist jeweils nach 24 h am höchsten und fällt dann kontinuierlich ab. The t-PA production is after the thioglycolic acid treatment Increased 72 h and independent of the application date. The percentage Increased enzyme synthesis is always after 24 h am highest and then drops off continuously.

In Tabelle 9 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO- Zellen, die 24-96 h in Medium mit 7,5% FKS und 1 mM Thioglykolsäure kultiviert wurden, in Abhängigkeit vom Applikationstag, dargestellt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-6). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.Table 9 shows the increase in t-PA production in CHO cells cultured for 24-96 h in medium with 7.5% FCS and 1 mM thioglycolic acid, depending on the application date. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4-6). The t-PA determination was performed by DCA.

Tabelle 9 Table 9

Die t-PA-Produktion kann durch eine zweifache Applikation von Thioglykolsäure gegenüber der einfachen Applikation erhöht werden (Abb. 16).The t-PA production can be increased by a double application of thioglycolic acid compared to the simple application ( Figure 16).

In Abb. 17A (DCA) und Abb. 17B (Elisa) ist der Verlauf der t-PA-Synthese bezogen auf 1 × 10⁶ Zellen dargestellt. Die t-PA-Synthese ist durch 1 mM Thioglykolsäure die ersten 3 Tage (DCA) gegenüber der Kontrolle erhöht. Die im Elisa ermittelten t-PA-Werte bleiben hingegen über den ganzen Zeitraum erhöht. Die Steigerungsrate beträgt am 4. Tag noch ca. 35%. Der intrazelluläre t-PA-Gehalt pro Zelle wird durch Thioglykosäure ebenfalls erhöht. Die maximale intrazelluläre t-PA-Konzentration beträgt 1,1 ± 0,1 µg/1 × 10⁶ Zellen nach 24 h und fällt innerhalb 96 h ungefähr auf die Hälfte der ursprünglichen Konzentration herab (Abb. 17C). Fig. 17A (DCA) and Fig. 17B (Elisa) show the course of the t-PA synthesis with respect to 1 × 10⁶ cells. The t-PA synthesis is increased by 1 mM thioglycolic acid the first 3 days (DCA) over the control. By contrast, the t-PA values determined in Elisa remain elevated over the entire period. The rate of increase is about 35% on the 4th day. The intracellular t-PA content per cell is also increased by thioglycosic acid. The maximum intracellular t-PA concentration is 1.1 ± 0.1 μg / 1 × 10⁶ cells after 24 h and falls within approximately 96 h to approximately half of the original concentration ( Figure 17C).

Die extrazelluläre t-PA-Konzentration ist am 5. Tag 10,7% gegenüber der Kontrolle gesteigert. Die prozentuale Steigerung der t-PA-Synthese durch Thioglykolsäure ist in serumfreiem Medium etwas geringer, da die Zellteilung leicht gehemmt wird (10-20%).The extracellular t-PA concentration is 10.7% on the 5th day increased compared to the control. The percentage increase The t-PA synthesis by thioglycolic acid is in serum-free Medium slightly lower, as cell division slightly inhibited will (10-20%).

Effects of derivatives of monocarboxylic acids on t-PA production in CHO cells

In der Gruppe der C4-Carbonsäurederivate wurden weitere Substanzen gefunden, die eine Wirkung auf die t-PA-Synthese in CHO-Zellen zeigen. Zu diesen Substanzen zählen in erster Linie Butyrylcholinbromid (BCB) und -Chlorid (BCC), die die t-PA-Produktion zwischen 30% und 40% steigern. Diese C4-Derivate zeigen in jeder Hinsicht die gleichen Effekte wie Na-Butyrat und sind im gleichen Konzentrationsbereich wirksam.In the group of C4-carboxylic acid derivatives were other substances found that have an effect on t-PA synthesis in CHO cells show. These substances count first Butyrylcholine bromide (BCB) and chloride (BCC), which are the Increase t-PA production by between 30% and 40%. These C4 derivatives show in every way the same effects as Na-butyrate and are effective in the same concentration range.

In Tabelle 10 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch die zwei oben erwähnten Derivate der Monocarbonsäuren dargestellt. Die Zellen wurden in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Alle Substanzen wurden in einem Konzentrationsbereich von 10 µM bis 10 mM getestet. Die Werte sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand (Mittelwert ± SE, n = 4-15). Die Werte, die sich auf die Einzelproben beziehen, sind in Klammern angegeben. Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Table 10 shows the increase in t-PA production in CHO cells by the two derivatives of monocarboxylic acids mentioned above. The cells were cultured in medium with 7.5% FCS. All substances were tested in a concentration range of 10 μM to 10 mM. The values are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 ml of cell supernatant (mean ± SE, n = 4-15). The values relating to the individual samples are given in parentheses. The maximum value refers to a single sample. The t-PA determination was performed by DCA.

Tabelle 10 Table 10

Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge von 4 Tagen wie in Tabelle 10A dargestellt. Werte für die Einzelproben sind in Klammern angegeben.The average values refer to several production runs of 4 days as shown in Table 10A. values for the individual samples are given in brackets.

Tabelle 10A Table 10A

Combined effects of various t-PA synthesis stimulators

Bei Verwendung von Substanzkombinationen sollte mindestens eine Substanz die Eigenschaft besitzen, daß sie das Zellwachstum nicht hemmt.When using substance combinations at least a substance that has the property of promoting cell growth does not inhibit.

Eine erhöhte Ausbeute wurde z. B. bei einer Kombination von Thioglykolsäure und Buttersäure erreicht. Eine wichtige Rolle kann dabei der Applikationszeitraum der einzelnen Substanzen spielen, wobei z. B. Buttersäure immer als 2. Substanz zugegeben wurde, um die inhibitorische Wirkung auf das Zellwachstum zu verringern.An increased yield was z. B. in a combination of Reached thioglycolic acid and butyric acid. An important The role of the application period of the individual substances play, where z. As butyric acid always as 2nd substance was added to the inhibitory effect on the Reduce cell growth.

Bei einer gleichzeitigen Applikation der Substanzen am Tag 0 wird der Effekt von der Buttersäure nicht erhöht.With a simultaneous application of the substances on day 0 the effect of butyric acid is not increased.

Für die Kombination Buttersäure und Thioglykolsäure ist der Effekt additiv. Als Steigerungseffekt konnte maximal 70% erreicht werden.For the combination of butyric acid and thioglycolic acid is the Effect additive. The maximum effect achieved was 70% become.

In serumfreiem Medium konnten die Effekte von Buttersäure durch eine weitere Substanz nicht weiter gesteigert werden.In serum-free medium, the effects of butyric acid not further increased by another substance.

Die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die 3 Tage in Medium mit 7,5% FKS kultiviert werden, ist in Tabelle 11 dargestellt. 1 mM Thioglykolsäure (TG) und 1 mM Buttersäure wurden in Kombination zu verschiedenen Zeitpunkten den Zellen zugesetzt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-8). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. The increase in t-PA production in CHO cells cultured for 3 days in 7.5% FCS medium is shown in Table II. 1 mM thioglycolic acid (TG) and 1 mM butyric acid were added to the cells in combination at various times. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4-8). The t-PA determination was performed by DCA.

Tabelle 11 Table 11

Effects of Aphidicolin

Aphidicolin, ein Diterpen aus Cephalosporium aphidicola, hemmt spezifisch die DNA alpha-Polymerase und stimuliert die t-PA-Synthese in CHO-Zellen in einer Konzentration von 1 bis 10 µM. Nach 24 h ist die t-PA-Ausbeute um 44,9 ± 13,9% gesteigert.Aphidicolin, a diterpene from Cephalosporium aphidicola, specifically inhibits the DNA alpha-polymerase and stimulates the t-PA synthesis in CHO cells at a concentration of 1 to 10 μM. After 24 h, the t-PA yield is increased by 44.9 ± 13.9%.

Aphidicolin zeigte eine Stimulierung der t-PA-Synthese in CHO-Zellen. Es kann die DNA-Synthese reversibel hemmen, dabei wird die RNA- und Proteinsynthese nicht beeinflußt. Aphidocolin eignet sich also einerseits, die t-PA-Synthese zu stimulieren und andererseits die Zellen zu synchronisieren. Der Effekt von Aphidicolin auf die t-PA-Synthese bei längerer Inkubation der Zellen in Medium mit Aphidicolin ist oben beschrieben. Dieser Passus umschreibt Arbeiten mit CHO-Zellen die 24 h dem Aphidicolin ausgesetzt waren und anschließend in Medium ohne Aphidicolin weiterkultiviert wurden. Die Phasen des Zellzyklus und der Einbau von [³H]-Thymidin während der 24 h-Markierung und danach wurden analysiert, um die Hemmung der DNA-Synthese und eine Wiederaufnahme der Synthese nach Entfernen des Aphidicolin zu verfolgen. Weiterhin wurde die RNA-, Protein- und die t-PA-Synthese bestimmt.Aphidicolin showed a stimulation of t-PA synthesis in CHO cells. It can reversibly inhibit DNA synthesis, thereby the RNA and protein synthesis is not affected. On the one hand, aphidocolin is therefore suitable for t-PA synthesis on the other hand to synchronize the cells. The effect of aphidicolin on t-PA synthesis prolonged incubation of cells in medium containing aphidicolin described above. This passage describes work with CHO cells exposed to aphidicolin for 24 hours and subsequently further cultivated in medium without aphidicolin were. The phases of the cell cycle and the incorporation of [3 H] -thymidine during the 24 h labeling and thereafter analyzed the inhibition of DNA synthesis and a Resumption of synthesis after removal of aphidicolin to pursue. Furthermore, the RNA, protein and the t-PA synthesis determined.

cell growth

Das Zellwachstum war durch Aphidicolin (1 µM) nach einer 24 h-Behandlung leicht gehemmt (5-10%). Beim Mediumwechsel wurden die Aphidicolin-behandelten Kulturen jedoch wieder auf die gleiche Zellzahl wie die Kontrollkulturen gesetzt.Cell growth was mediated by aphidicolin (1 μM) 24 h treatment slightly inhibited (5-10%). When changing media However, the Aphidicolin-treated cultures were again set to the same cell number as the control cultures.

t-PA synthesis

Die t-PA-Synthese war in 1 µM Aphidicolin-synchronisierten Zellen stimuliert. Ein Effekt war noch 96 h nach Mediumwechsel zu sehen.The t-PA synthesis was aphidicolin-synchronized in 1 μM Stimulates cells. One effect was still 96 h after medium change to see.

Die Steigerung der t-PA Produktion in 1 µM Aphidicolin-behandelten CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, ist in Tabelle 12 angegeben. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.The increase in t-PA production in 1 μM aphidicolin-treated CHO cells cultured in medium with 7.5% FCS is given in Table 12. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4). The t-PA determination was performed by DCA.

Zeit (h nach Mediumwechsel)Time (h after change of medium) % Steigerung der t-PA-Synthese% Increase in t-PA synthesis 2424 40,2 ± 6,740.2 ± 6.7 4848 59,9 ± 11,159.9 ± 11.1 7272 32,8 ± 6,432.8 ± 6.4 9696 14,7 ± 1,314.7 ± 1.3

In Abb. 18 ist der zeitliche Verlauf der t-PA-Synthesesteigerung in serumfreiem Medium dargestellt. Der Effekt erreicht ein Maximum 48 h nach Mediumwechsel. Fig. 18 shows the time course of the t-PA synthesis increase in serum-free medium. The effect reaches a maximum 48 h after medium change.

Die t-PA-Konzentration in serumfreiem Medium wurde nach 96, 120 und 144 h auch mittels Elisa bestimmt, die gegenüber den Kontrollwerten wesentlich höher lagen als die im DCA ermittelten Werte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben. Der Test wurde mit 1 µM Aphidicolin-behandelten CHO-Zellen, die in serumfreiem Medium kultiviert wurden, durchgeführt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels Elisa durchgeführt.The t-PA concentration in serum-free medium was also determined by Elisa after 96, 120 and 144 h, which were significantly higher than the values determined in the DCA compared to the control values. The results are shown in Table 13. The assay was performed with 1 μM aphidicolin-treated CHO cells cultured in serum-free medium. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4). The t-PA determination was performed by Elisa.

Zeit (h nach Mediumwechsel)Time (h after change of medium) % Steigerung der t-PA-Synthese% Increase in t-PA synthesis 9696 36,7 ± 6,236.7 ± 6.2 120120 42,0 ± 8,842.0 ± 8.8 144144 51,3 ± 10,251.3 ± 10.2

Eine erhöhte intrazelluläre t-PA-Konzentration konnte nur während der 24 h-Inkubation mit Aphidicolin beobachtet werden und war ca. 30% erhöht.An increased intracellular t-PA concentration could only during the 24 h incubation with aphidicolin and was about 30% higher.

Buttersäure, Propionsäure, Butyrylcholinchlorid und -bromid konnten in diesem System die t-PA-Produktion noch weiter steigern. Die Stimulierung war sowohl in serumfreiem als auch in serumreichem Medium erfolgreich, wobei ein zusätzlicher Steigerungseffekt in serumfreiem Medium nur bei Applikation der Substanzen nach einer 24 h-Anpassung der Zellen an diese Mediumbedingung erreicht wurde.Butyric acid, propionic acid, butyrylcholine chloride and bromide In this system, the t-PA production could go even further increase. Stimulation was both serum-free and also successful in serum-rich medium, with an additional Increasing effect in serum-free medium only at Application of the substances after a 24 h adjustment of Cells to this medium condition was reached.

Tabelle 14 zeigt die prozentuale Steigerung der t-PA-Produktion in Aphidicolin-behandelten Kulturen nach Applikation von Na-Butyrat. Na-Butyrat steigert die t-PA-Synthese um weitere 14% nach 96 h.Table 14 shows the percentage increase in t-PA production in aphidicolin-treated cultures after administration of Na-butyrate. Na-butyrate enhances t-PA synthesis another 14% after 96 h.

Der Test wurde mit 1 µM Aphidicolin-behandelten CHO-Zellen, die mit und ohne Na-Butyrat kultiviert wurden, in serumfreier Kultur durchgeführt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels Elisa durchgeführt. The assay was performed with 1 μM aphidicolin-treated CHO cells cultured with and without Na-butyrate in serum-free culture. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4). The t-PA determination was performed by Elisa.

Tabelle 14 Table 14

Effects of 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-one (DHO)

Die t-PA Produktion ist nach der Behandlung mit der obigen Verbindung nach 144 h erhöht. Für die Stimulierung der t-PA-Synthese waren Konzentrationen im micromolar Bereich wirksam z. B. bis 100 µM.The t-PA production is after treatment with the above Connection increased after 144 h. For the stimulation of t-PA synthesis were concentrations in the micromolar range effective z. B. to 100 uM.

In Abb. 19 ist die Steigerung der t-PA Produktion in CHO- Zellen, die bis zu 168 h in serumfreiem Medium und 7 mM bis 7 µM DHO kultiviert wurden, dargestellt. Die Werte wurden mittels DCA durchgeführt. In Abb. 20 sind die entsprechenden Werte, die mittels Elisa durchgeführt wurden, angegeben. Figure 19 shows the increase in t-PA production in CHO cells cultured up to 168 h in serum-free medium and 7 mM to 7 μM DHO. The values were carried out by means of DCA. Fig. 20 shows the corresponding values, which were carried out by Elisa.

Zellkulturen, die durch die oben beschriebene Methode hergestellt wurden, können in bekannter Weise umgearbeitet werden, um das t-PA zu isolieren, z. B. nach der Produktionsphase wird das Kulturmedium von der Zellmasse abgetrennt und der Zellüberstand durch Ultrafiltration und chromatographische Schritte gereinigt.Cell cultures prepared by the method described above were, can be reworked in a known manner, to isolate the t-PA, e.g. B. after the production phase the culture medium is separated from the cell mass and the cell supernatant by ultrafiltration and chromatographic Steps cleaned.

Das isolierte t-PA kann danach in pharmazeutische Präparate formuliert werden, z. B. als Lösung oder Lyophilisat. The isolated t-PA can then be converted into pharmaceutical preparations be formulated, for. B. as a solution or lyophilisate.

Man kann die obigen Beispiele unter Austausch der t-PA produzierten CHO-Zellen durch transformierte CHO-Zellen, die andere Proteine exponieren, z. B. t-PA-Mutanten oder andere pharmakologisch wirksame Proteine, wiederholen, wie z. B. in den oben genannten Europäischen und Deutschen Patentanmeldungen, insbesondere die CHO-Zellen in EP-A 1 99 574 und 1 96 920 sowie in DE-A 37 08 681. The above examples can be produced by replacing the t-PA CHO cells by transformed CHO cells, the expose other proteins, e.g. T-PA mutants or others pharmacologically active proteins, repeat, such as. In the above-mentioned European and German patent applications, in particular the CHO cells in EP-A 1 99 574 and 1 96 920 and in DE-A 37 08 681.

Fig. 1

Zellwachstum der CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, die Zellzahlen beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand, Gesamtzellzahl , vitale Zellen (-∇-), nicht vitale Zelle (--), (Mittelwert ± SE, n = 14-47).Cell growth of CHO cells cultured in medium with 7.5% FCS, the cell counts are based on 1 ml cell supernatant, total cell number, vital cells (-∇-), non-vital cell (-), (mean ± SE, n = 14-47).

Fig. 2

t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden.t-PA production in CHO cells in medium containing 7.5% FCS were cultivated.

A. Time course of extracellular t-PA concentration. The t-PA values refer to 1 ml of cell supernatant and were determined by means of DCA (- ○ -) and Elisa (-⚫-) (mean ± SE, n = 7-47).
B. Time course of the intracellular t-PA concentration. The t-PA values refer to 1 ml of cell suspension and were determined by Elisa (-∎-) (mean ± SE, n = 4).

Fig. 3

t-PA-Synthese in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden.t-PA synthesis in CHO cells cultured in medium with 7.5% FCS were.

A. Extracellular t-PA concentration. The t-PA values refer to 1 × 10⁶ cells and were determined by means of DCA (-Δ-) and Elisa (- ▲ -) (mean ± SE, n = 7-47).
B. Intracellular t-PA concentration. The t-PA values refer to 1 × 10⁶ cells and were determined by Elisa (-∎-) (mean ± SE, n = 4).

Fig. 4

Zellwachstum der CHO-Zellen, die in serumfreiem Medium kultiviert wurden. Die Zellzahlen beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand, Gesamtzellzahl (-▲-), vitale Zellen (-∆-), nicht vitale Zellen (--), (Mittelwert ± SE, n = 4-6).Cell growth of CHO cells cultured in serum-free medium. The cell counts refer to 1 ml cell supernatant, total cell count (- ▲ -), vital cells (-Δ-), non-vital cells (-), (mean ± SE, n = 4-6).

Fig. 5

t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die in serumfreiem Medium kultiviert wurden. Die t-PA-Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und wurden mittels DCA (-○-) und Elisa (-⚫-) bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 4-6).t-PA production in CHO cells cultured in serum-free medium. The t-PA values refer to 1 ml of cell supernatant and were determined by means of DCA (- ○ -) and Elisa (-⚫-) (mean ± SE, n = 4-6).

Fig. 6

t-PA-Synthese in CHO-Zellen, die in serumfreiem Medium kultiviert wurden. Die t-PA-Werte beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen und wurden mittels DCA (-○-) und Elisa (-⚫-)⚫ bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 4-6).t-PA synthesis in CHO cells cultured in serum-free medium. The t-PA values refer to 1 × 10⁶ cells and were determined by means of DCA (- ○ -) and Elisa (--⚫-) ((mean ± SE, n = 4-6).

Fig. 7

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch C3-C5- Monocarbonsäuren in Abhängigkeit von der Zeit. Die Zellen wurden in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Die Konzentration für Buttersäure (-∎-) und Isobuttersäure (-⚫-) war 1 mM und für Propionsäure (-○-) und Isovaleriansäure (--) 5 mM. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) ohne Zugabe von Säuren angegeben (Mittelwert ± SE, n = 11-24). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Increase in t-PA production in CHO cells by C3-C5 monocarboxylic acids as a function of time. The cells were cultured in medium with 7.5% FCS. The concentration of butyric acid (-∎-) and isobutyric acid (-⚫-) was 1 mM and for propionic acid (- ○ -) and isovaleric acid (-) 5 mM. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) without the addition of acids (mean ± SE, n = 11-24). The t-PA determination was performed by DCA.

Fig. 8

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch Na-Butyrat. Na-Butyrat wurde am Tag 0 in einer Konzentration von 1 mM den Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, zugegeben. Die Werte sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand [DCA (-∎-) und Elisa (--)] bzw. auf 1 ml Zellsuspension [Elisa (-⊲-)], (Mittelwert ± SE, n = 5-14).Increase of t-PA production in CHO cells by Na-butyrate. Na-butyrate was added on day 0 at a concentration of 1 mM to the cells cultured in 7.5% FCS medium. The values are given in% compared to the control (0%) and relate to 1 ml of cell supernatant [DCA (-∎-) and Elisa (-)] or to 1 ml of cell suspension [Elisa (-⊲-)], ( Mean ± SE, n = 5-14).

Fig. 9

Einfluß von Na-Butyrat auf die t-PA-Synthese in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden. Na-Butyrat wurde am Tag 0 in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Werte beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen (--, -○-, -⊲-) und sind im Vergleich zu Kontrollkulturen (-∎-, -⚫-, dargestellt (Mittelwert ± SE).Influence of Na-butyrate on t-PA synthesis in CHO cells, which were cultured in medium with 7.5% FCS. Na-butyrate was added on day 0 at a concentration of 1 mM. The values refer to 1 × 10⁶ cells (-, - ○ -, -⊲-) and are compared to control cultures (-∎-, -⚫-, represented (mean ± SE).

A. Extracellular t-PA concentration (DCA, n = 5-14).
B. Extracellular t-PA concentration (Elisa, n = 5-8).
C. Intracellular t-PA concentration (Elisa, n = 5-8).

Fig. 10

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden. 1 mM Na-Butyrat wurde einmal oder zweimal zu verschiedenen Zeitpunkten zugegeben. Die Werte sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand (Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Increased t-PA production in CHO cells cultured in medium with 7.5% FCS. 1 mM Na-butyrate was added once or twice at different times. The values are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 ml of cell supernatant (mean ± SE, n = 4). The t-PA determination was performed by DCA.

Fig. 11

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch Na-Butyrat. Na-Butyrat wurde nach 24 h-Kultur der Zellen in serumfreiem Medium in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Werte sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand. Die t-PA-Bestimmung wurde mittels Elisa durchgeführt (Mittelwert ± SE, n = 4).Increase of t-PA production in CHO cells by Na-butyrate. Na-butyrate was added after 24 h culture of the cells in serum-free medium at a concentration of 1 mM. The values are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 ml of cell supernatant. The t-PA determination was performed by Elisa (mean ± SE, n = 4).

Fig. 12

Einfluß von Na-Butyrat auf die t-PA-Produktion in CHO-Zellen. Na-Butyrat wurde nach 24 h-Kultur der Zellen in serumfreiem Medium in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und wurden mittels DCA (-∎-) und Elisa (--) bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 4-6).Influence of Na-butyrate on t-PA production in CHO cells. Na-butyrate was added after 24 h culture of the cells in serum-free medium at a concentration of 1 mM. The values refer to 1 ml of cell supernatant and were determined by means of DCA (-∎-) and Elisa (-) (mean ± SE, n = 4-6).

Fig. 13

Einfluß von Na-Butyrat auf die t-PA-Synthese in CHO-Zellen. Na-Butyrat wurde nach 24 h-Kultur der Zellen in serumfreiem Medium in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Werte beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen und wurden mittels DCA (-∎-) und Elisa (--) bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 4-6).Influence of Na-butyrate on t-PA synthesis in CHO cells. Na-butyrate was added after 24 h culture of the cells in serum-free medium at a concentration of 1 mM. The values refer to 1 × 10⁶ cells and were determined by means of DCA (-∎-) and Elisa (-) (mean ± SE, n = 4-6).

Fig. 14

Einfluß von Ascorbinsäure (10 mM) auf die t-PA-Synthese (A) und Proteinsynthese (B) in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden. Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Die Werte () sind im Vergleich zu Kontrollkulturen () dargestellt und beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen (Mittelwert ± SE, n = 4). Influence of ascorbic acid (10 mM) on t-PA synthesis (A) and protein synthesis (B) in CHO cells cultured in 7.5% FCS medium. The t-PA determination was performed by DCA. The values () are shown in comparison to control cultures () and refer to 1 × 10⁶ cells (mean ± SE, n = 4).

Fig. 15

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch verschiedene schwefelhaltige Verbindungen, Thioglykolsäure (-⚫-), Thiodiglykolsäure (--), L-Cystein (-∎-), und Glutathion (-○-) in Abhängigkeit von der Zeit. Die Zellen wurden in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-6). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.Increasing t-PA production in CHO cells through various sulfur compounds, thioglycolic acid (-⚫-), thiodiglycolic acid (-), L-cysteine (-∎-), and glutathione (- ○ -) over time , The cells were cultured in medium with 7.5% FCS. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4-6). The t-PA determination was performed by DCA.

Fig. 16

Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, nach einfacher oder zweifacher Applikation von Thioglykolsäure (1 mM) zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Werte sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand (Mittelwert ± SE, n = 4-6). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.Increase of t-PA production in CHO cells cultured in medium with 7.5% FCS after single or double application of thioglycolic acid (1 mM) at different time points. The values are given in% compared to the control (0%) and refer to 1 ml of cell supernatant (mean ± SE, n = 4-6). The t-PA determination was performed by DCA.

Fig. 17

Einfluß von 1 mM Thioglykolsäure auf die t-PA-Synthese in CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden. Die Werte beziehen sich auf 1 × 10⁶ Zellen (--, -○-, -∆-) und sind im Vergleich zu Kontrollkulturen (-∎-, -⚫-, -▲-) dargestellt (Mittelwert ± SE, n = 4-5).Influence of 1 mM thioglycolic acid on t-PA synthesis in CHO cells cultured in 7.5% FCS medium. The values refer to 1 × 10⁶ cells (-, - ○ -, -Δ-) and are shown in comparison to control cultures (-∎-, -⚫-, - ▲ -) (mean ± SE, n = 4- 5).

A. Extracellular t-PA concentration (DCA)
B. Extracellular t-PA concentration (Elisa)
C. Intracellular t-PA concentration (Elisa)

Fig. 18

Steigerung der t-PA-Produktion in 1 µM Aphidicolin-synchronisierten CHO-Zellen, die nach Mediumwechsel (MW) in serumfreiem Medium kultiviert wurden. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-9). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.Increased t-PA production in 1 μM aphidicolin-synchronized CHO cells cultured after medium change (MW) in serum-free medium. The values refer to 1 ml of cell supernatant and are given in% compared to the control (0%) (mean ± SE, n = 4-9). The t-PA determination was performed by DCA.

Claims

1. A method for increasing the production of a protein in cultures of these protein-producing cells, wherein the cell culture is added to a substance that induces the production of the protein, characterized in that as a protein-inducing substance thioglycolic acid, thiodiglycolic acid, L- Cysteine, glutathione, butyrylcholine bromide, butyrylcholine chloride, nonactic acid, furan fatty acid, ascorbic acid, aphidicolin, 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-one, fusaric acid, mevalonic acid, trans-anhydromevalonic acid, anhydromevalonic acid lactone, cis-anhydromevalonic acid lactone, D- α- hydroxy-substituted (C₃ or C₄) aliphatic mono- or di-carboxylic acid or salts thereof.

2. Method of increasing the production of a protein from cultures of transformed CHO cells, thereby in that a C₃-C₄ aliphatic Monocarboxylic acid or its salt added to the culture.

3. Method according to claim 2, characterized in that the protein is t-PA or a mutant thereof.

4. Method according to claim 1, characterized in that one transformed cultured CHO cells.

5. Method according to claim 4, characterized in that the protein is t-PA or a mutant thereof.

6. Method according to claim 5, characterized in that one as a protein-inducing substance thioglycolic acid or their salt used.

7. Method according to claim 5, characterized in that one as protein-inducing substances nonactic acid or furan fatty acid or its salts.

8. Method according to claim 2 or 3, characterized that as protein-inducing substance butyric acid or their salt used.

9. Method according to one of claims 1 to 8, characterized that the cultivation in serum-free Medium performs.

10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized characterized in that the cultivation in serum-containing Medium performs.

11. Method according to one of claims 1 to 10, characterized that one the protein-inducing substance in culture at a concentration of 0.005 μM until 500 mM added.

12. The method according to claim 11, characterized in that a C₃-C₄ aliphatic monocarboxylic acid or their salt in a concentration of 1 mM to 10 mM added.

13. Method according to claim 11, characterized in that Thioglycolic acid, thiodiglycolic acid, L-cysteine or glutathione or its salts in one concentration from 1 mM to 10 mM.

14. Method according to one of claims 1 to 13, characterized that the cells in the presence of a of the substances cultivated, the cells of the culture and then place in new culture medium and cultured in the presence of one of the substances.

15. Method according to claim 14, characterized in that Aphidicolin is the first mentioned substance and the second substance butyric acid, propionic acid, butyrylcholine chloride or butyrylcholine bromide or its salts.

16. Method according to one of claims 1 to 13, characterized that you have two or more of the substances used simultaneously.

17. Method according to claim 16, characterized in that butyric acid and thioglycolic acid or their salts used, the butyric acid as the 2nd substance of the Cell culture is added.