DE3787927T2 - Small peptides that inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens. - Google Patents
Small peptides that inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens.Info
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Description
Diese Erfindung bezieht sich auf synthetisch hergestellte kurze Peptid-Sequenzen, die die Bindung von HTLV-III/LAV (nachfolgend als HIV bezeichnet) an menschliche Zellen durch Blockieren von Rezeptorstellen auf der Zelloberfläche inhibieren und so virale Ansteckungsfähigkeit der menschlichen T-Zelle verhindern. Die die Ansteckungsfähigkeit verhindernden Peptide induzieren auch die Antikörper-Bildung gegen das Hüll-Protein des HIV-Virus. Somit sind diese Peptide auch von Nutzen als Vaccine zur Verhinderung der Entwicklung des erworbenen Immunerkrankungssyndroms (AIDS). Monoklonale Antikörper zu den Peptiden könnten auch als diagnostische Mittel zum Identifizieren des HIV-Virus verwendet werden. Somit hätten Peptide und Antikörper zu diesen Peptiden Verwendung bei der Herstellung von Testkits zum Identifizieren von HIV-Trägern oder an AIDS leidenden Personen.This invention relates to synthetically produced short peptide sequences that inhibit the binding of HTLV-III/LAV (hereinafter referred to as HIV) to human cells by blocking receptor sites on the cell surface, thus preventing viral infectivity of the human T cell. The infectivity-inhibiting peptides also induce antibody formation against the envelope protein of the HIV virus. Thus, these peptides are also useful as vaccines to prevent the development of acquired immune system disease syndrome (AIDS). Monoclonal antibodies to the peptides could also be used as diagnostic agents to identify the HIV virus. Thus, peptides and antibodies to these peptides would have use in the manufacture of test kits to identify HIV carriers or persons suffering from AIDS.
Die vollständige Nukleotidsequenz des AIDS (HIV)-Virus ist von mehreren Forschern berichtet worden (s. Lee Ratner et al., Nature 313, S. 277, Januar 1985, Muesing et al., Nature 313, S. 450 Februar 1985 und Wain-Habson et al., Cell 40, S. 9-17, Januar 1985). Das Hüllen-Gen ist besonders mit Antigenizität und Ansteckungsfähigkeit in Zusammenhang gebracht worden. Jedoch ist der Hüllenteil auch dafür bekannt, Bereiche aufzuweisen, die hoch divergent sind. Das HIV- Virus-Hüllen-Glycoprotein hängt, wie gezeigt wurde, kovalent an den Hirnmembranen von Menschen, Ratten und Affen und an Zellen des Immunsystems.The complete nucleotide sequence of the AIDS (HIV) virus has been reported by several investigators (see Lee Ratner et al., Nature 313, p. 277, January 1985, Muesing et al., Nature 313, p. 450, February 1985, and Wain-Habson et al., Cell 40, pp. 9-17, January 1985). The envelope gene has been particularly implicated in antigenicity and infectivity. However, the envelope portion is also known to have regions that are highly divergent. The HIV virus envelope glycoprotein has been shown to be covalently attached to the brain membranes of humans, rats, and monkeys, and to cells of the immune system.
Die Erkenntnis, daß Viren Zell- und Gewebe-Tropismus durch Anbindung an äußerst spezifischen Stellen auf den Zellmembran-Rezeptoren ausüben können, hat Forscher ermutigt, nach Mitteln zu suchen, die an die viralen Rezeptorstellen von Zellmembranen binden und so die Bindung eines spezifischen Virus an diese Zellen verhindern. Ein Nachweis dafür, daß spezifische Rezeptorvermittelte Vaccin (Kuhpocken)-Virus-Infektivität durch synthetische Peptide blockiert wird, ist zuvor erbracht worden (Epstein et al., Nature 318, 663-667).The realization that viruses can exert cell and tissue tropism by binding to highly specific sites on cell membrane receptors has encouraged researchers to search for agents that bind to the viral receptor sites on cell membranes and thus prevent the binding of a specific virus to those cells. Evidence that specific receptor-mediated vaccine (cowpox) virus infectivity is blocked by synthetic peptides has previously been provided (Epstein et al., Nature 318, 663-667).
Das HIV-Virus bindet, wie gezeigt wurde, an ein als CD4- oder T4-Bereich bekanntes Oberflächenmolekül, das auf verschiedenen, für HIV-Infektion empfänglichen Zellen, einschließlich T-Lymphozyten und Macrophagen, vorhanden ist (s. Shaw et al., Science 226, S. 1165-1171, zu einer Diskussion des Tropismus von HTLV-III).The HIV virus has been shown to bind to a surface molecule known as the CD4 or T4 region, which is present on various cells susceptible to HIV infection, including T lymphocytes and macrophages (see Shaw et al., Science 226, pp. 1165-1171, for a discussion of the tropism of HTLV-III).
Zusätzlich zu Symptomen, die durch Immunmangel entstehen, zeigen Patienten mit AIDS neuropsychologische Defekte. Das Zentralnerven- und Immunsystem teilen sich eine große Anzahl spezifischer Zelloberflächen-Erkennungsmoleküle, die als Rezeptoren für Neuropeptid-vermittelte interzelluläre Kommunikation dienen. Die Neuropeptide und ihre Rezeptoren zeigen tiefgreifende evolutionäre Stabilität, indem sie in weitgehend unveränderter Form in einzelligen Organismen sowie höheren Tieren weitgehend erhalten sind. Ferner zeigen das Zentralnerven- und Immunsystem gemeinsame DC4 (T4)-Zelloberflächen-Erkennungsmoleküle, die als Rezeptoren für die Bindung von HIV-Hüllen-Glycoprotein (gp 120) dienen. Da die gleichen weitgehend erhaltenen Neuropeptid-Informationssubstanzen Immun- und Gehirnfunktion durch Rezeptoren integrieren, die denen von HIV bemerkenswert ähneln, haben wir postuliert, eine sehr ähnliche Aminosäuresequenz zwischen dem HIV-Glycoprotein gp 120 und einem kurzen Peptid, das zuvor in anderem Zusammenhang aus dem Hüllenbereich des Epstein-Barr-Virus identifiziert worden ist, könnte auf das für virale Rezeptorbindung essentielle Kernpeptid hinweisen. Es wurde postuliert, daß solch ein Peptid von Nutzen wäre, eine Infektion von Zellen mit dem HIV durch Binden mit Rezeptorzellen und Blockieren der Bindung von HIV gp 120 zu verhindern, daß solche an Rezeptorstellen bindende Peptide zur Produktion von auf die Peptidsequenz gerichteten Antikörpern Anlaß geben würden und daß diese Peptide verwendet werden könnten, eine immunologische Grundlage für die Verhinderung von AIDS zu liefern.In addition to symptoms resulting from immune deficiency, patients with AIDS exhibit neuropsychological defects. The central nervous and immune systems share a large number of specific cell surface recognition molecules that serve as receptors for neuropeptide-mediated intercellular communication. The neuropeptides and their receptors demonstrate profound evolutionary stability, being largely conserved in largely unchanged form in unicellular organisms as well as higher animals. Furthermore, the central nervous and immune systems share DC4 (T4) cell surface recognition molecules that serve as receptors for binding HIV envelope glycoprotein (gp 120). Since the same widely conserved neuropeptide information substances integrate immune and brain function through receptors that are remarkably similar to those of HIV, we have postulated that a very similar amino acid sequence between HIV glycoprotein gp 120 and a short peptide previously identified in another context from the envelope region of Epstein-Barr virus might indicate the core peptide essential for viral receptor binding. It was postulated that such a peptide would be useful in preventing infection of cells with HIV by binding to receptor cells and blocking the binding of HIV gp 120, that such peptides binding to receptor sites would give rise to the production of antibodies directed against the peptide sequence, and that these peptides could be used to provide an immunological basis for preventing AIDS.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Peptide zur Verfügung zu stellen, die AIDS- Symptome durch Verhindern der Bindung von HIV (AIDS-Virus) an Rezeptorstellen von Zellen von Hirnmembranen und des Immunsystems lindernd wirken würden.The object of the present invention was to provide peptides that would alleviate AIDS symptoms by preventing the binding of HIV (AIDS virus) to receptor sites of cells of brain membranes and the immune system.
Es war auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Peptide zur Verwendung als Vaccine zur Verfügung zu stellen, um Antikörper zu bilden, die gegen die Entwicklung von AIDS in Personen, die dem HIV (AIDS-Virus) ausgesetzt werden könnten, schützen würden.It was also an object of the present invention to provide peptides for use as a vaccine to produce antibodies that would protect against the development of AIDS in persons who could be exposed to HIV (AIDS virus).
Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diagnostische Mittel oder Maßnahmen zum Identifizieren des Vorliegens von Antikörpern auf HIV oder HIV-Hüllenprotein zur Verfügung zu stellen.It was a further object of the present invention to provide diagnostic means or measures for identifying the presence of antibodies to HIV or HIV envelope protein.
Ein Octapeptid in dem HIV-Hüllen-Glycoprotein (gp 120) wurde durch Computer-unterstützte Analyse identifiziert. Es wurde gezeigt, daß dieses Peptid, als "Peptid T" aufgrund des hohen Threonin-Gehalts bezeichnet, die Bindung von gp 120 an die Hirnmembranen inhibiert. Das Peptid hat die Sequenz Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Eine spätere Analyse offenbarte eine Klasse verwandter Pentapeptide mit ähnlichen Bindungseigenschaften.An octapeptide in the HIV envelope glycoprotein (gp 120) was identified by computer-assisted analysis. This peptide, named "peptide T" due to its high threonine content, was shown to inhibit the binding of gp 120 to brain membranes. The peptide has the sequence Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Subsequent analysis revealed a class of related pentapeptides with similar binding properties.
Einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend wird ein Peptid der Formel (I)According to a first aspect of the present invention, a peptide of formula (I)
Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb (I),Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb (I),
worin Ra einen endständigen Amino-Rest Ala oder D-Ala bedeutet und Rb einen endständigen Carboxy-Rest -Thr oder -Thr-amid bedeutet, oder ein Derivat hiervon mit einem zusätzlichen Cys- Rest an einer oder beiden der Amino- und Carboxy-Endgruppen, oder ein Peptid der Formel (II)wherein Ra represents a terminal amino residue Ala or D-Ala and Rb represents a terminal carboxy residue -Thr or -Thr-amide, or a derivative thereof with an additional Cys residue at one or both of the amino and carboxy end groups, or a peptide of formula (II)
R¹-R²-R³-R&sup4;-R&sup5; (II)R¹-R²-R³-R⁴-R⁵ (II)
worin R¹ ein endständiger Amino-Rest Thr-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile- oder Leu- ist,wherein R¹ is a terminal amino residue Thr-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile- or Leu-,
R² Thr, Ser oder Asp ist,R² is Thr, Ser or Asp,
R³ Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys oder Trp ist,R³ is Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys or Trp,
R&sup4; Tyr ist undR4 is Tyr and
R&sup5; vorzugsweise eine Carboxy-Endgruppe -Thr, -Arg oder -Gly oder ein Derivat hiervon mit einer entsprechenden D-Aminosäure als Amino-Endgruppe ist, und/oder ein entsprechendes Amid- Derivat an dem endständigen Carboxy-Rest und/oder zusätzlich ein Cys-Rest an einer oder beiden der Amino- und Carboxy-Endgruppen ist, zur Verfügung gestellt. Während die bevorzugten Aminosäuren am R&sup5; bezeichnet worden sind, kann die Aminosäure bekanntlich an dieser Position stark variieren. Tatsächlich ist es möglich, das Peptid mit R&sup4; (Tyrosin) als Carboxy-endständige Aminosäure zu beenden, wobei R&sup5; fehlt. Solche Peptide behalten die hier angegebenen Bindungseigenschaften der Gruppe. Serin und Threonin scheinen für die Zwecke der hier angegebenen biologischen Eigenschaften gegenseitig austauschbar zu sein. Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen können als physiologisch annehmbare Salze der Peptide vorliegen.R5 is preferably a carboxy-terminated group -Thr, -Arg or -Gly or a derivative thereof with a corresponding D-amino acid as the amino-terminated group, and/or a corresponding amide derivative at the terminal carboxy residue and/or additionally a Cys residue at one or both of the amino and carboxy-terminated groups. While the preferred amino acids at R5 have been indicated, it is known that the amino acid at this position can vary widely. In fact, it is possible to terminate the peptide with R4 (tyrosine) as the carboxy-terminated amino acid, with R5 absent. Such peptides retain the binding properties of the group specified herein. Serine and threonine appear to be interchangeable for the purposes of the biological properties specified herein. The active compounds of the invention may exist as physiologically acceptable salts of the peptides.
Diese Klasse von Peptiden hat sich als an die T4-Virusrezeptoren bindend erwiesen.This class of peptides has been shown to bind to the T4 virus receptors.
Die am meisten bevorzugten Peptide sowie das obige Peptid T sind die folgenden Octapeptide der Formel (I):The most preferred peptides as well as the above peptide T are the following octapeptides of the formula (I):
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr undD-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr and
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Amide undD-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Amide and
die folgenden Pentapeptide der Formel (II):the following pentapeptides of formula (II):
Thr-Asp-Asn-Tyr-ThrThr-Asp-Asn-Tyr-Thr
Thr-Thr-Ser-Tyr-ThrThr-Thr-Ser-Tyr-Thr
Thr-Thr-Asn-Tyr-ThrThr-Thr-Asn-Tyr-Thr
und deren Analoge mit D-Thr als endständigem Aminorest und/oder ein Amid-Derivat an der Carboxy-Endgruppe.and their analogues with D-Thr as the terminal amino residue and/or an amide derivative at the carboxy end group.
Die Verbindungen der Erfindung können nach bekannten Methoden vorteilhaft modifiziert werden, um die Passage von Molekülen durch die Blut-Hirn-Schranke zu verbessern. Acetylierung hat sich zum Verbessern der Bindungsaktivität des Peptids als besonders nützlich erwiesen. Die endständigen Amino- und Carboxy-Stellen sind für eine Modifizierung besonders bevorzugte Stellen.The compounds of the invention can be advantageously modified by known methods to improve the passage of molecules across the blood-brain barrier. Acetylation has been found to be particularly useful for improving the binding activity of the peptide. The terminal amino and carboxy sites are particularly preferred sites for modification.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch in einer einschränkenden Konformation modifiziert sein, um verbesserte Stabilität und orale Verfügbarkeit zu bieten.The peptides of the invention may also be modified in a restrictive conformation to provide improved stability and oral availability.
Die folgenden Abkürzungen werden nachfolgend verwendet: Aminosäure Drei-Buchstaben-Code Ein-Buchstaben-Code Arginin Asparagin Asparaginsäure Cystein Glycin Serin Threonin TyrosinThe following abbreviations are used below: Amino acid Three-letter code One-letter code Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glycine Serine Threonine Tyrosine
Sofern nicht anders angegeben, liegen die Aminosäuren natürlich in der natürlichen Form von L- Stereoisomeren vor.Unless otherwise stated, the amino acids are naturally present in the natural form of L-stereoisomers.
Ein Vergleich von Aminosäuresequenzen von 12 Pentapeptiden findet sich in Tabelle 1. Wenngleich historisch unsere anfängliche Computer-Recherche enthüllte, daß Peptid T (enthalten in dem ARV-Isolat) der relevante Rest war, wurde mit der Zugänglichkeit weiterer viraler Sequenzen klar, daß die relevante, bioaktive Sequenz ein kürzeres Pentapeptid, umfassend nominell Peptid T[4-8], oder die Sequenz TTNYT, sein könnte. In den Isolaten, die wir verglichen (Tabelle 1) wurden wesentliche Übereinstimmungen nur in diesem kürzeren Bereich festgestellt. Die Mehrzahl der Änderungen sind die Vertauschungen von Serin (S) und Threonin (T), zwei engverwandte Aminosäuren. Das Tyrosin der Position 7 von Peptid T ist ein unveränderliches Merkmal all dieser Bausteine, was darauf hinweist, daß es für die Bioaktivität obligatorisch sein kann. Substitutionen bei Position 5 schließen T, G, R oder S ein. Positionen 4 und 6 waren zuerst (mit einer Ausnahme) auf S, T und N beschränkt, alles Aminosäuren mit ungeladenen polaren Gruppen mit sehr ähnlichen sterischen Eigenschaften. Eine Bestimmung allgemeiner Sequenzübereinstimmung unter 5 verschiedenen AIDS-Virus-Isolaten (9, 10) zeigt, daß der Bereich um und mit der Peptid-T-Sequenz ein hochvariabler Bereich ist. Eine solche Variabilität kann Spezialisierung durch stark selektive Diversifikation der Funktion(en), die an diesem Ort definiert werden kann bzw. können, anzeigen. Wie die Opiat-Peptide scheinen diese Peptid-T-Analoga in vielfältigen Formen zu existieren, was an met- und leu-Enkephalin erinnert. Diese in diesen verschiedenen AIDS-Virus-Isolaten repräsentierten Pentapeptid-Sequenzen sind biologisch aktiv und vermögen als Agonisten des CD4-Rezeptors - zuvor weithin als Oberflächen-"marker" von T- Helferzellen bekannt - in Wechselwirkung zu treten. Tabelle 1. Vergleich der ENV-Sequenz von multiplen AIDS-Virus-Isolaten Isolat Sequenz Bezug ¹ Zahlen beziehen sich auf relative Positionen von Aminosäuren innerhalb der ARV-env-Sequenz (9).A comparison of amino acid sequences of 12 pentapeptides is provided in Table 1. Although historically our initial computer search revealed that peptide T (contained in the ARV isolate) was the relevant residue, with the availability of additional viral sequences it became clear that the relevant bioactive sequence could be a shorter pentapeptide, nominally comprising peptide T[4-8], or the sequence TTNYT. In the isolates we compared (Table 1), significant similarities were found only in this shorter region. The majority of changes are the interchanges of serine (S) and threonine (T), two closely related amino acids. The tyrosine at position 7 of peptide T is an invariant feature of all these building blocks, indicating that it may be obligatory for bioactivity. Substitutions at position 5 include T, G, R, or S. Positions 4 and 6 were initially restricted (with one exception) to S, T, and N, all amino acids with uncharged polar groups with very similar steric properties. A determination of general sequence similarity among 5 different AIDS virus isolates (9, 10) shows that the region around and including the peptide T sequence is a highly variable region. Such variability may indicate specialization by highly selective diversification of the function(s) that can be defined at this site. Like the opiate peptides, these peptide T analogues appear to exist in a variety of forms, reminiscent of met- and leu-enkephalin. These pentapeptide sequences represented in these various AIDS virus isolates are biologically active and are capable of interacting as agonists of the CD4 receptor - previously widely known as a surface "marker" of T helper cells. Table 1. Comparison of the ENV sequence of multiple AIDS virus isolates Isolate Sequence Reference ¹ Numbers refer to relative positions of amino acids within the ARV env sequence (9).
Das sieben-Aminosäure-Peptid CYS-THR-THR-ASN-TYR-TIIR-CYS ist auch aktiv. Hinzufügen von Cysteinen zu einem Kern beeinträchtigt die Aktivität nicht in nachteiliger Weise.The seven-amino acid peptide CYS-THR-THR-ASN-TYR-TIIR-CYS is also active. Adding cysteines to a core does not adversely affect activity.
Die Peptide wurden in üblicher Weise von den Peninsula Laboratories unter einer Geheimhaltungsvereinbarung zwischen den Erfindern und dem Hersteller synthetisiert. Die Merrifield-Methode der Festphasen-Peptidsynthese wurde angewandt (s. US-PS 3 531 258). Die synthetisierten Peptide sind besonders bevorzugt. Während Peptid T und das Pentapeptid, das ein Teil von ihm ist, aus dem Virus isoliert werden konnten, sind die nach Merrifield hergestellten Peptide frei von viralen und Zelltrümmern. Daher treten ungünstige Reaktionen an Verunreinigungen nicht auf, wenn die synthetisierten Peptide eingesetzt werden.The peptides were synthesized in the usual manner by Peninsula Laboratories under a confidentiality agreement between the inventors and the manufacturer. The Merrifield method of solid phase peptide synthesis was used (see US Patent 3,531,258). The synthesized peptides are particularly preferred. While peptide T and the pentapeptide that is a part of it could be isolated from the virus, the peptides prepared according to Merrifield are free of viral and cellular debris. Therefore, adverse reactions due to impurities do not occur when the synthesized peptides are used.
Die Peptide der Erfindung können nach herkömmlichen Methoden der Peptidsynthese hergestellt werden. Sowohl Festphasen- als auch Flüssigphasen-Verfahren können angewandt werden. Wir haben gefunden, daß die Festphasen-Methode von Merrifield besonders geeignet ist. Bei diesem Verfahren wird das Peptid schrittweise synthetisiert, während das Carboxy-Ende der Kette an dem unlöslichen Träger kovalent gebunden ist. Während der Synthese-Zwischenstufen bleibt das Peptid in der festen Phase und kann daher bequem gehandhabt werden. Der feste Träger ist ein chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat.The peptides of the invention can be prepared by conventional methods of peptide synthesis. Both solid phase and liquid phase methods can be used. We have found that the solid phase method of Merrifield is particularly suitable. In this method the peptide is synthesized step by step while the carboxy end of the chain is covalently bound to the insoluble support. During the intermediate stages of synthesis the peptide remains in the solid phase and can therefore be conveniently handled. The solid support is a chloromethylated styrene-divinylbenzene copolymer.
Eine N-geschützte Form der Carboxy-Endgruppen-Aminosäure, z. B. eine t-butoxycarbonylgeschützte (Boc-) Aminosäure, wird mit dem Chlormethylrest des chlormethylierten Styrol- Divinylbenzol-Copolymerisatharzes zu einem geschützten Aminoacyl-Derivat des Harzes umgesetzt, wobei die Aminosäure an das Harz als Benzylester gekoppelt ist. Die Schutzgruppe wird hiervon abgespalten, und es wird mit einer geschützten Form der nächsten erforderlichen Aminosäure umgesetzt, wodurch so ein an das Harz geknüpftes geschütztes Dipeptid entsteht. Die Aminosäure wird im allgemeinen in aktivierter Form eingesetzt, z. B. durch Verwendung eines Carbodiimids oder aktiven Esters. Diese Folge wird wiederholt, und die Peptidkette wächst zugleich um einen Rest durch Kondensation am Aminoende mit den nötigen N-geschützten Aminosäuren, bis das benötigte Peptid am Harz zusammengesetzt ist. Das Peptid-Harz wird dann mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure behandelt, um den das zusammengesetzte Peptid an das Harz bindenden Ester zu spalten, um das gewünschte Peptid freizusetzen. Funktionelle Seitenkettengruppen von Aminosäuren, die während des Synthesevorgangs unter Anwendung herkömmlicher Methoden blockiert werden müssen, können gleichzeitig auch entfernt werden. Die Synthese eines Peptids mit einer Amidgruppe an seiner Carboxyendgruppe kann in herkömmlicher Weise unter Verwendung eines 4-Methylbenzhydrylamin-Harzes erfolgen.An N-protected form of the carboxy-terminated amino acid, e.g. a t-butoxycarbonyl-protected (Boc) amino acid, is reacted with the chloromethyl moiety of the chloromethylated styrene-divinylbenzene copolymer resin to form a protected aminoacyl derivative of the resin, with the amino acid coupled to the resin as a benzyl ester. The protecting group is then cleaved from this and it is reacted with a protected form of the next required amino acid, thus forming a protected dipeptide linked to the resin. The amino acid is generally used in an activated form, e.g. by using a carbodiimide or active ester. This sequence is repeated, and the peptide chain simultaneously grows one residue by condensation at the amino end with the necessary N-protected amino acids until the required peptide is assembled on the resin. The peptide resin is then treated with anhydrous hydrofluoric acid to cleave the ester binding the assembled peptide to the resin to release the desired peptide. Amino acid side chain functional groups that must be blocked during the synthesis process using conventional methods can also be removed at the same time. The synthesis of a peptide with an amide group at its carboxy end group can be carried out in a conventional manner using a 4-methylbenzhydrylamine resin.
Die Verbindungen der Erfindung haben sich als Rezeptorstellen von Zellen wirksam blockierend und Zell-Infektivität mit HIV (AIDS-Virus) in Affen, Ratte und menschlichen Hirnmembranen und Zellen des Immunsystems verhindernd erwiesen.The compounds of the invention have been shown to be effective in blocking cell receptor sites and preventing cell infectivity with HIV (AIDS virus) in monkey, rat and human brain membranes and cells of the immune system.
Als einen Aspekt der Erfindung stellen wir daher eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Peptidverbindung der Erfindung assoziiert mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder -Exzipiens, angepaßt zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, umfaßt. Solche Zusammensetzungen können zur Verwendung in herkömmlicher Weise in einer Mischung mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern oder Exzipientien dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können gegebenenfalls weiterhin ein oder mehrere weitere therapeutische Mittel enthalten, die, wenn gewünscht, ein anderes antivirales Mittel sein kann bzw. können.As one aspect of the invention we therefore provide a pharmaceutical composition comprising a peptide compound of the invention associated with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient adapted for use in human or veterinary medicine. Such compositions may be prepared for use in a conventional manner in admixture with one or more physiologically acceptable carriers or Excipients. The compositions may optionally further contain one or more other therapeutic agents which may be another antiviral agent if desired.
So können die erfindungsgemäßen Peptide für orale, bukkale, parenterale, topische oder rektale Verabreichung formuliert werden.Thus, the peptides of the invention can be formulated for oral, buccal, parenteral, topical or rectal administration.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Peptide für Injektion oder Infusion formuliert und inIn particular, the peptides according to the invention can be formulated for injection or infusion and in
Einheitsdosisform in Ampullen oder in Vielfachdosis-Behältern mit einem zugesetzten Konservierungsmittel dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel, wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil zum Ansetzen mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor Gebrauch in Pulverform sein.Unit dosage form in ampoules or in multidose containers with an added preservative. The compositions may take such forms as suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles and may contain formulants such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents. Alternatively, the active ingredient may be in powder form for reconstitution with a suitable vehicle, e.g. sterile, pyrogen-free water, before use.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch weitere aktive Bestandteile, wie antimikrobielle Mittel oder Konservierungsstoffe, enthalten.The pharmaceutical compositions according to the invention may also contain other active ingredients, such as antimicrobial agents or preservatives.
Die Zusammensetzungen können von 0,001-99% des aktiven Materials enthalten.The compositions can contain from 0.001-99% of the active material.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung, das das Zusammenbringen eines Peptids der Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens oder Träger umfaßt.The invention further provides a process for preparing a pharmaceutical composition comprising bringing into association a peptide of the invention with a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.
Zur Verabreichung durch Injektion oder Infusion wird die Tagesdosis, angewandt zur Behandlung eines erwachsenen Menschen von etwa 70 kg Körpergewicht, im Bereich von 0,2 mg bis 10 mg, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg liegen, die z. B. in 1 bis 4 Dosen verabreicht werden kann, in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten.For administration by injection or infusion, the daily dose used to treat an adult human weighing approximately 70 kg will be in the range of 0.2 mg to 10 mg, preferably 0.5 to 5 mg, which may be administered in 1 to 4 doses, depending on the route of administration and the condition of the patient.
Es wurde postuliert, daß die Affinitätskonstanten ähnlich denen von Morphin sind. Auf der Grundlage dieser Affinität wurde eine Dosierung von 0,33-0,0003 mg/kg pro Tag vorgeschlagen. Dies hat sich als wirksam erwiesen. Eine Blutkonzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹¹-molarer Blutkonzentration wird empfohlen. In Affen liefern 3 mg/kg pro Tag eine Serumkonzentration von 150·10&supmin;&sup9; M. Diese Konzentration ist 15 mal größer als für die Erzielung einer Konzentration von 10&supmin;&sup8; M nötig. Primaten benötigen im allgemeinen 10 mal die Dosis, die in Menschen angewandt wird.It has been postulated that the affinity constants are similar to those of morphine. On the basis of this affinity, a dosage of 0.33-0.0003 mg/kg per day has been suggested. This has been shown to be effective. A blood concentration of 10-6 to 10-11 molar blood concentration is recommended. In monkeys, 3 mg/kg per day provides a serum concentration of 150·10-9 M. This concentration is 15 times greater than that required to achieve a concentration of 10-8 M. Primates generally require 10 times the dose used in humans.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Vaccin-Präparate, die ein erfindungsgemäßes Peptid enthalten, um Schutz gegen AIDS-Virusinfektionen zu erzielen. Das Vaccin enthält eine wirksame immunogene Menge an Peptid, z. B. 1 ug bis 20 mg/kg Wirt, gegebenenfalls konjugiert an ein Protein, wie Human-Serumalbumin, in einem geeigneten Träger, z. B. sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder gepufferter Kochsalzlösung. Hilfsstoffe, wie Aluminiumhydroxidgel, können verwendet werden. Die Verabreichung kann durch Injektion, z. B. intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder intravenös, erfolgen. Die Verabreichung kann einmal oder mehrmals, z. B. in Intervallen von 1 bis 4 Wochen, erfolgen.Another aspect of the invention relates to vaccine preparations containing a peptide according to the invention to provide protection against AIDS virus infections. The vaccine contains a effective immunogenic amount of peptide, e.g. 1 µg to 20 mg/kg host, optionally conjugated to a protein such as human serum albumin, in a suitable carrier, e.g. sterile water, physiological saline or buffered saline. Excipients such as aluminium hydroxide gel may be used. Administration may be by injection, e.g. intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously or intravenously. Administration may be given once or several times, e.g. at intervals of 1 to 4 weeks.
Antigene Sequenzen aus der Krabbe sowie Proteine aus anderen Wirbellosen können den erfindungsgemäßen Peptiden auch zugesetzt werden, um Antigenizität zu fördern.Antigenic sequences from the crab as well as proteins from other invertebrates can also be added to the peptides of the invention to promote antigenicity.
Ein noch weiterer Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf Testkits zum Nachweis des AIDS-Virus und von Antikörpern zum AIDS-Virus, enthaltend ein erfindungsgemäßes Peptid als Antigen- Quelle oder einen durch ein erfindungsgemäßes Peptid hervorgerufenen monoklonalen Antikörper. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Peptid in einem Testkit zum Nachweis von AIDS- Infektion und zur Diagnose von AIDS und Vor-AIDS-Zuständen durch seine Verwendung als Testreagens in einem Enzym-verknüpften Immunosorbensassay (ELISA) oder einem Enzym- Immunodot-Assay verwendet werden. Solche Testkits können eine unlösliche poröse Oberfläche oder ein festes Substrat umfassen, an die bzw. das das antigene Peptid oder der monoklonale Antikörper zuvor absorbiert oder kovalent gebunden worden ist, eine solche Oberfläche oder ein solches Substrat vorzugsweise in Form von Mikrotiterplatten oder Mulden; Testseren; Heteroantisera, die an das Antigen oder den Antikörper, an die Oberfläche oder den Träger absorbiert, spezifisch binden und es bzw. ihn sättigen; verschiedenen Verdünnungsmitteln und Puffern; markierten Konjugaten zum Nachweis spezifisch gebundener Antikörper oder anderer Signal-erzeugender Reagentien, wie Enzymsubstrat, Cofaktoren und Chromogene.Yet another aspect of this invention relates to test kits for detecting the AIDS virus and antibodies to the AIDS virus, containing a peptide of the invention as an antigen source or a monoclonal antibody elicited by a peptide of the invention. For example, a peptide of the invention can be used in a test kit for detecting AIDS infection and for diagnosing AIDS and pre-AIDS conditions by its use as a test reagent in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or an enzyme immunodot assay. Such test kits can comprise an insoluble porous surface or a solid substrate to which the antigenic peptide or monoclonal antibody has been previously absorbed or covalently bound, such surface or substrate preferably in the form of microtiter plates or wells; test sera; Heteroantisera that specifically bind to and saturate the antigen or antibody, surface or carrier; various diluents and buffers; labeled conjugates for detecting specifically bound antibodies or other signal-producing reagents such as enzyme substrates, cofactors and chromogens.
Das erfindungsgemäße Peptid kann als Immunogen zur Bildung monoklonaler Antikörper verwendet werden, die spezifisch an den relevanten Teil der Hüllensequenz des AIDS-Virus unter Anwendung herkömmlicher Techniken binden; solche monoklonalen Antikörper bilden ein weiteres Merkmal der Erfindung.The peptide of the invention can be used as an immunogen to produce monoclonal antibodies which specifically bind to the relevant part of the envelope sequence of the AIDS virus using conventional techniques; such monoclonal antibodies form a further feature of the invention.
HTLV-IIIb-Isolat von HIV wurde in H9-Zellen vermehrt, und das gp 120 wurde durch Immunoaffinitätschromatographie und präparative NaDodSO&sub4;/PAGE isoliert. Gereinigtes gp 120 wurde mit ¹²&sup5;I nach der Chloramin-T-Methode markiert.HTLV-IIIb isolate of HIV was propagated in H9 cells and gp 120 was isolated by immunoaffinity chromatography and preparative NaDodSO₄/PAGE. Purified gp 120 was labeled with 125I by the chloramine-T method.
Frischer Hippocampus von Mensch, Affe und Ratte wurde in 100 Volumina eiskaltem 50 mM Hepes (pH 7,4) rasch homogenisiert (Polytron, Brinkmann Instruments). Die durch Zentrifugieren (15.000 · g) gesammelten Membranen wurden im ursprünglichen Puffervolumen gewaschen und frisch eingesetzt oder bei -70ºC gelagert. Vor der Verwendung wurden Hirnmembranen und hochgereinigte T-Zellen (Referenz 16; Gabe von Larry Wahl) 15-30 min in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) vorinkubiert. Aus 2 mg (anfängliches Naßgewicht) Hirn (ungefähr 100 ug Protein) stammenden Membranen wurden mit 28.000 cpm ¹²&sup5;I-gp 120 1 h bei 37ºC in 200 ul (Endvolumen) 50 mM Hepes enthaltend, 0,1% Rinderserumalbumin und die Peptidaseinhibitoren Bacitracin (0,005%), Aprotinin (0,005%), Leupeptin (0,001%) und Chymostatin (0,001%), inkubiert. Die Inkubationen wurden rasch vakuumfiltriert und gezählt, um das Rezeptor-gebundene Material zu bestimmen.Fresh hippocampus from human, monkey and rat was rapidly homogenized in 100 volumes of ice-cold 50 mM Hepes (pH 7.4) (Polytron, Brinkmann Instruments). Membranes collected by centrifugation (15,000 x g) were washed in the original buffer volume and used fresh or stored at -70ºC. Before use, brain membranes and highly purified T cells (reference 16; gift from Larry Wahl) were preincubated for 15-30 min in phosphate-buffered saline (PBS). Membranes derived from 2 mg (initial wet weight) of brain (approximately 100 µg protein) were incubated with 28,000 cpm of 125I-gp 120 for 1 h at 37°C in 200 µl (final volume) of 50 mM Hepes, 0.1% bovine serum albumin, and the peptidase inhibitors bacitracin (0.005%), aprotinin (0.005%), leupeptin (0.001%), and chymostatin (0.001%). Incubations were rapidly vacuum filtered and counted to determine receptor-bound material.
Immunopräzipitate wurden durch Inkubieren (über Nacht bei 4ºC) von 0,5% Triton X-100/PBS-solubilisierten, Lactoperoxidase/Glucoseoxidase/¹²&sup5;I-jodierten Hirnmembranen oder intakten T-Zellen mit angegebenen mAbs bei 10 ug pro Reaktion hergestellt. Ein Festphasen-Immunoabsorbens (immunobeads, Bio-Rad) wurde zur Fällung von Immunkomplexen vor ihrer Auflösung durch NaDodSO&sub4;/PAGE verwendet. Kontrollinkubationen enthielten kein primäres mAb oder ein Unterklassen-Kontroll-mAb (OKT8).Immunoprecipitates were prepared by incubating (overnight at 4°C) 0.5% Triton X-100/PBS-solubilized, lactoperoxidase/glucose oxidase/125I-iodinated brain membranes or intact T cells with indicated mAbs at 10 µg per reaction. A solid phase immunoabsorbent (immunobeads, Bio-Rad) was used to precipitate immune complexes prior to their resolution by NaDodSO4/PAGE. Control incubations contained no primary mAb or a subclass control mAb (OKT8).
Kryostat-geschnittene 25 um-Schnitte frisch gefrorenen Hirns von Mensch, Affe und Ratte wurden auf Gelatine-beschichteten Platten auftau-angebracht und getrocknet, und Rezeptoren wurden sichtbar gemacht, wie beschrieben (18 Inkubationen, mit oder ohne Antikörper (10 ug/ml) gegen T4, T4A, T8 und T11, wurden über Nacht bei 0ºC in RPMI-Medium durchgeführt, auf ihre Antigene vernetzt und mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-Antimaus-Antikörper sichtbar gemacht. Inkubationen von auf Platten montierten Gewebeschnitten zum Markieren des Antigen-Rezeptors mit ¹²&sup5;I-gp 120 wurden in 5 ml-Plattenträgern mit (1 uM) oder ohne unmarkiertes gp 120 oder mAb OKT4A (10 ug/ml) durchgeführt (Ortho-Diagnostika).Cryostat-cut 25 µm sections of fresh frozen human, monkey and rat brain were thawed-mounted on gelatin-coated plates and dried, and receptors were visualized as described (18 incubations, with or without antibodies (10 µg/ml) against T4, T4A, T8 and T11, were performed overnight at 0°C in RPMI medium, cross-linked for their antigens and visualized with 125I-labeled goat anti-mouse antibody. Incubations of plate-mounted tissue sections for labeling of the antigen receptor with 125I-gp 120 were performed in 5 ml plate slides with (1 µM) or without unlabeled gp 120 or mAb OKT4A (10 µg/ml) (Ortho-Diagnostics).
Subsets von T-Zellen wurden durch Behandeln von Percoll-Dichte-gereinigten peripheren Blut-T-Zellen mit spezifischen monoklonalen Antikörpern (T4 oder T8) bei 10 kg/ml erhalten. Die behandelten Zellen wurden dann auf einer Kunststoff- Petrischale, die mit Ziegen-[F(ab')&sub2;] Antimaus-Immunoglobulin (Sero Lab, Eastbury, MA) 30 min bei 4ºC ausgewaschen (21). Die nicht anhaftenden Zellen wurden dann entfernt, gewaschen und durch Durchflußzytometrie auf Reaktivität analysiert. Die getrennten T4- und T8-Zellpopulationen haben < 5% Verunreinigung anderer T-Zell-Subsets. Zellen wurden dann mit Phytohämagglutinin (1 ug/ml) 72 h kultiviert und HIV ausgesetzt, wie unten beschrieben. Infizierte Zellen wurden phänotypisch charakterisiert, wenn Zytotoxizitättests durchgeführt wurden.Subsets of T cells were obtained by treating Percoll density-purified peripheral blood T cells with specific monoclonal antibodies (T4 or T8) at 10 kg/ml. Treated cells were then washed on a plastic Petri dish coated with goat [F(ab')2] antimouse immunoglobulin (Sero Lab, Eastbury, MA) for 30 min at 4°C (21). Nonadherent cells were then removed, washed, and analyzed for reactivity by flow cytometry. The separated T4 and T8 cell populations have < 5% contamination of other T cell subsets. Cells were then cultured with phytohemagglutinin (1 ug/ml) for 72 h and exposed to HIV as described below. Infected cells were phenotypically characterized when cytotoxicity assays were performed.
Das zum Infizieren verwendete HTLV-III-Virus wurde aus einer Interleukin 2 (IL-2)-abhängig kultivierten T-Zellinie isoliert, die von frischem AIDS-Patientenmaterial stammte, und in HuT 78, einer zulässigen IL-2-unabhängigen Zellinie, übergeführt.The HTLV-III virus used for infection was isolated from an interleukin 2 (IL-2)-dependent cultured T cell line derived from fresh AIDS patient material and transferred into HuT 78, a permissive IL-2-independent cell line.
Fig. 1A zeigt eine Vernetzung von ¹²&sup5;I-gp 120 an Hirnmembranen und T-Zellen (a) ¹²&sup5;I-gp 120 ausschließlich; (b) Affe; (c) Ratte; (d) menschliches Hirn; und (e) Human-T-Zellen.Figure 1A shows cross-linking of 125I-gp 120 to brain membranes and T cells (a) 125I-gp 120 exclusively; (b) monkey; (c) rat; (d) human brain; and (e) human T cells.
Fig. 1B und 1C zeigen Immunopräzipitation von ¹²&sup5;I-markierten Affenhirn-Membranen bzw. Human-T-Zellen; (f, i) keine primäre Antikörper-Kontrolle; (g, j) OKT4 Mab; (h, k) OKT8 Mab.Figures 1B and 1C show immunoprecipitation from 125I-labeled monkey brain membranes and human T cells, respectively; (f, i) no primary antibody control; (g, j) OKT4 Mab; (h, k) OKT8 Mab.
Fig. 2A zeigt eine Verschiebung spezifischer ¹²&sup5;I-gp 120-Bindung an frische Ratten- Hippocampus-Membranen. Jede Bestimmung erfolgte dreifach; die Ergebnisse eines Versuchs, der dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt wurde, sind dargestellt. Spezifische Bindung, verschiebbar durch 10 kg/ml OKT4 und 4A, lag im Bereich zwischen 27 und 85% Gesamtbindung, was 2,201 ± 74 cpm im dargestellten Versuch war.Figure 2A shows a shift in specific 125I-gp 120 binding to fresh rat hippocampal membranes. Each determination was done in triplicate; the results of an experiment performed three times with similar results are shown. Specific binding shifted by 10 kg/ml OKT4 and 4A ranged between 27 and 85% total binding, which was 2.201 ± 74 cpm in the experiment shown.
Fig. 2B zeigt, daß virale Infektivität durch Peptid T und seine synthetischen Analoga blockiert wird. Jede Bestimmung erfolgte doppelt. Ergebnisse repräsentieren einen einzelnen Versuch, der dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt wurde.Fig. 2B shows that viral infectivity is blocked by peptide T and its synthetic analogues. Each determination was performed in duplicate. Results represent a single experiment that was repeated three times with similar results.
Ein einzelnes radiomarkiertes Vernetzungsprodukt von etwa 180 Kd wird nach spezifischem Binden von ¹²&sup5;I-gp120 an Membranen von entweder Totenkopfäffchen, Ratte oder Menschenhirnmembranen, die von dem von Human-T-Zellen (Fig. 1A) nicht unterscheidbar sind, erhalten. Dieses Ergebnis zeigt an, daß gp120 an ein ungefähr 60 Kd-Protein gekoppelt werden kann; nicht-umgesetztes ¹²&sup5;I-gp120 liegt nahe der membranfreien Kontrolle (Spur a).A single radiolabeled cross-link product of approximately 180 Kd is obtained after specific binding of 125I-gp120 to membranes of either squirrel monkey, rat or human brain membranes, which is indistinguishable from that of human T cells (Fig. 1A). This result indicates that gp120 can be coupled to an approximately 60 Kd protein; unreacted 125I-gp120 is close to the membrane-free control (lane a).
Immunfällung von radiojodierten Human-Hirnmembranen mit OKT4 und OKT8 (10 ug/ml) (Fig. 1B) zeigt, daß Hirnmembranen ein T4-Antigen von etwa 60 Kd enthalten, nicht unterscheidbar von dem an Human-T-Lymphozyten (Fig. 1C) identifizierten; dagegen immunopräzipitiert OKT8 ein niedermolekulargewichtiges (etwa 30 Kd) Protein aus T-Lymphozyten (Fig. 1C), das in Hirnmembranen fehlt (Fig. 1B), was anzeigt, daß Hirn-T4 nicht von vorhandenen Lymphozyten stammt. Ähnliche Ergebnisse werden mit Affen- und Ratten- (nicht gezeigt) Hippocampusmembranen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, daß das T4-Antigen als viraler Rezeptor dient und ein weitgehend erhaltenes 60 Kd-Molekül ist, das sich das Immunsystem und das zentrale Nervensystem teilen.Immunoprecipitation of radioiodinated human brain membranes with OKT4 and OKT8 (10 ug/ml) (Fig. 1B) shows that brain membranes contain a T4 antigen of about 60 Kd, indistinguishable from that identified on human T lymphocytes (Fig. 1C); in contrast, OKT8 immunoprecipitates a low molecular weight (about 30 Kd) protein from T lymphocytes (Fig. 1C) that is absent from brain membranes (Fig. 1B), indicating that brain T4 is not derived from existing lymphocytes. Similar results are observed with monkey and rat (not shown) hippocampal membranes. These results demonstrate that the T4 antigen serves as a viral receptor and is a largely conserved 60 Kd molecule shared by the immune and central nervous systems.
Die Erkenntnis, daß Epstein-Barr und HTLV-III/LAV eine nahezu identische Octapeptid-Sequenz gemeinsam ist, löste die Synthese und Untersuchung von "Peptid T" aus. Fig. 2 zeigt die hohe (0,1 nM-Bereich) Affinität und Sättigungsfähigkeit (Fig. 2A) der ¹²&sup5;I-gp120-Bindung an frisch hergestellte Rattenhirnmembranen. Spezifizität (Fig. 2B) wird demonstriert durch Blockade mit OKT4 und OKT4A, aber nicht OKT3 (0,1 ug/m l). Peptid T und zwei seiner synthetischen Analoga (aber nicht die irrelevante Octapeptid-Substanz P [1-8]) hemmten erheblich die ¹²&sup5;I-gp120- Bindung im 0,1 nM-Bereich (Fig. 2C). Substitution eines D-Threoninamids in Position 8 führte zu einem wenigstens 100-fachen Verlust an Rezeptorbindungsaktivität. Die klassische [D-Ala]- Substitution für [L-Ala] führt zu einem zuverlässig stärkeren, vermutlich Peptidase-resistenteren Analogon als Peptid T; Amidierung des C-endständigen Threonins ruft auch zuverlässig etwas größere Wirkungskraft hervor (Fig. 3).The finding that Epstein-Barr and HTLV-III/LAV have an almost identical octapeptide sequence triggered the synthesis and study of "Peptide T". Figure 2 shows the high (0.1 nM range) affinity and saturability (Fig. 2A) of 125I-gp120 binding to freshly prepared rat brain membranes. Specificity (Fig. 2B) is demonstrated by blockade with OKT4 and OKT4A, but not OKT3 (0.1 ug/ml). Peptide T and two of its synthetic analogues (but not the irrelevant octapeptide substance P [1-8]) significantly inhibited 125I-gp120 binding in the 0.1 nM range (Fig. 2C). Substitution of a D-threonine amide at position 8 resulted in at least a 100-fold loss of receptor binding activity. The classical [D-Ala] substitution for [L-Ala] leads to a reliably more potent, presumably more peptidase-resistant analogue than peptide T; amidation of the C-terminal threonine also reliably produces somewhat greater potency (Fig. 3).
Als die synthetischen Peptide auf ihre Fähigkeit zum Blockieren viraler Infektion von Human-T- Zellen getestet wurden, waren Experimentatoren blind gegenüber den Bindungstestversuchen. Bei 10&supmin;&sup7;M sind die drei beim Bindungstest aktiven Peptide in der Lage, nachweisbare Werte an reverser Transcriptase-Aktivität um fast das 9-fache zu senken. Der weniger aktive Bindungsverdränger [D-Thre]-Peptid T zeigte ähnlich stark reduzierte Blockade der viralen Infektion, indem er 100-fach höhere Konzentrationen erforderte, um eine bedeutsame Hemmung zu erzielen. So stehen nicht nur die Rangordnung der Wirkungsstärken der vier Peptide (D-[Ala]&sub1;peptid-T-amid > D-[Ala]&sub1;-peptid T > Peptid T > D-[Thre]&sub8;-peptid-T-amid), sondern auch ihre absoluten Konzentrationen bei der Hemmung der Rezeptorbindung und viralen Infektivität in engem Zusammenhang (Fig. 3).When the synthetic peptides were tested for their ability to block viral infection of human T cells, experimenters were blinded to the binding assay experiments. At 10-7 M, the three peptides active in the binding assay are able to reduce detectable levels of reverse transcriptase activity by almost 9-fold. The less active binding displacer [D-Thre]-peptide T showed similarly greatly reduced blockade of viral infection, requiring 100-fold higher concentrations to achieve meaningful inhibition. Thus, not only the order of potency of the four peptides (D-[Ala]1 peptide-T-amide > D-[Ala]1 peptide T > peptide T > D-[Thre]8 peptide-T-amide) but also their absolute concentrations in inhibiting receptor binding and viral infectivity are closely related (Fig. 3).
Ein etwa 60-Kd-Protein, das ähnlich, wenn nicht identisch mit Human-T-Zell-T4- Antigen ist, lag in anscheinend beibehaltener molekularer Form auf aus Menschenhirn hergestellten Membranen vor; ferner kann das radiomarkierte HIV-Hüllen-Glycoprotein (¹²&sup5;I-gp120) an ein in drei Säugetierhirnen vorhandenes Molekül kovalent vernetzt werden, dessen Größe und Immunfällungseigenschaften von dem T4-Antigen nicht unterscheidbar waren. Unter Anwendung einer Methode zur Sichtbarmachung Antikörper-gebundener Rezeptoren auf Hirnscheiben wurde das neuroanatomische Verteilungsmuster von Hirn-T4, das über kortikalem Neuropil am dichtesten ist und in allen drei Säugetierhirnen analog organisiert ist, dargelegt. Auch radiomarkiertes HIV- virales-Hüllenglycoprotein, in identischem Muster an benachbarte Hirnschnitte gebunden, was wieder nahelegt, daß T4 der HIV-Rezeptor war.An approximately 60-Kd protein similar, if not identical, to human T-cell T4 antigen was present in apparently retained molecular form on membranes prepared from human brain; further, radiolabeled HIV envelope glycoprotein (125I-gp120) can be covalently cross-linked to a molecule present in three mammalian brains whose size and immunoprecipitation properties were indistinguishable from the T4 antigen. Using a method for visualizing antibody-bound receptors on brain slices, the neuroanatomical distribution pattern of brain T4, which is densest over cortical neuropil and is organized analogously in all three mammalian brains, was revealed. Radiolabeled HIV viral envelope glycoprotein also bound in an identical pattern to adjacent brain sections, again suggesting that T4 was the HIV receptor.
Chemische Neuroanatomie, Computer-unterstützte Densitometrie. Cryostatgeschnittene 25 um-Schnitte frisch gefrorenen Hirns von Mensch, Affe und Ratte wurden auf Gelbeschichteten Platten auftaumontiert und getrocknet und Rezeptoren sichtbar gemacht, wie von Herkenham und Pert, J. Neurosci, 2 : 1129-1149 (1982) beschrieben. Inkubationen, mit oder ohne Antikörper (10 ug/ml) gegen T4, T4A, T8 und T11 erfolgten über Nacht bei 0ºC in RPMI, an ihre Antigene gebunden und mit ¹²&sup5;I-Ziegen-Antimaus-Antikörper sichtbar gemacht. Inkubationen von auf Platten angebrachten Gewebeschnitten, um Antigen/Rezeptor mit ¹²&sup5;I-gp120 zu markieren, erfolgten in 5 ml Plattenträgern mit (10&supmin;&sup6;M) oder ohne unmarkiertes gp120 oder Mab OKT4A (10 ug/mD (Ortho Diagnostics), wie oben für Membranen beschrieben.Chemical neuroanatomy, computer-assisted densitometry. Cryostat-cut 25 µm sections of fresh frozen human, monkey and rat brain were thaw-mounted on gel-coated plates and dried and receptors visualized as described by Herkenham and Pert, J. Neurosci, 2 : 1129-1149 (1982). Incubations with or without antibodies (10 µg/ml) to T4, T4A, T8 and T11 were carried out overnight at 0ºC in RPMI, bound to their antigens and visualized with ¹²⁵I goat antimouse antibody. Incubations of Plated tissue sections to label antigen/receptor with 125I-gp120 were performed in 5 ml plate slides with (10-6M) or without unlabeled gp120 or Mab OKT4A (10 ug/mD (Ortho Diagnostics) as described above for membranes.
Computer-unterstützte Transformation autoradiographischer Filmtrübung in quantitative Farbbilder wurde durchgeführt. Gleichzeitige Belichtung von Standards bekannter Radioaktivitätszunahme mit Affenhirnschnitten lieferte ein lineares Diagramm (4 = > 0,99) von log O.D. gegen cpm, woraus die relative Konzentration der Radioaktivität aussagekräftig extrapoliert werden kann. Zellfärbungen von Hirnschnitten mit Thionin erfolgten nach klassischen Methoden und Sichtbarmachung von über gefärbtem Gewebe liegenden Rezeptoren.Computer-assisted transformation of autoradiographic film turbidity into quantitative color images was performed. Simultaneous exposure of standards of known radioactivity increase with monkey brain sections yielded a linear plot (4 = > 0.99) of log O.D. versus cpm, from which the relative concentration of radioactivity can be meaningfully extrapolated. Cell staining of brain sections with thionin was performed using classical methods and visualization of receptors overlying stained tissue.
Versuche wurden durchgeführt, um die Verteilung von T4-Antigen an einer rostralen bis caudalen Reihe oder Kranzschnitten von Totenkopfäffchen-Hirn zu bestimmen. Diese Versuche zeigen, daß es nachweisbare Gehalte an T4-monoklonaler Antikörper-Bindung an cytoarchitektonisch bedeutsame Bereiche des Hirnstamms (z. B. die substantia nigra) gibt, aber das auffallende Muster kortikaler Anreicherung ist bei jedem Wert der Neuroachse augenscheinlich. OKT8, ein T-Lymphozyt-gerichteter monoklonaler Antikörper von der gleichen Unterklasse wie OKT4, zeigt kein beobachtbares Muster. Allgemein gilt, je mehr Oberflächenschichten innerhalb des zerebralen Cortex die dichtesten Konzentrationen des T4-Antigens enthalten, sind der frontale und perilimbische Cortex über der amydala liegend besonders rezeptorreich durch die tieferen Schichten. Die Hippocampus-Formation hat die dichteste Konzentration an Rezeptoren im Affen-, Ratten- und menschlichen Hirn. Dunkelfeldmikroskopie von Totenkopfäffchen-Schnitten, in photographische Emulsion getaucht, zeigte, daß das Band dichtester Rezeptormarkierung innerhalb der molekularen Schichten des Gyrus dentatus und Hippocampus proper liegt (die sehr wenig Neuronen enthalten). So scheinen Rezeptoren recht verteilt zu sein über den Neuropil (die neuronalen Vorsprünge von Dendriten und Axonen) oder können lokalisiert sein auf einen spezifischen Subset ungefärbter astroglialer Zellen.Experiments were performed to determine the distribution of T4 antigen on a rostral to caudal series or coronal sections of squirrel monkey brain. These experiments show that there are detectable levels of T4 monoclonal antibody binding to cytoarchitecturally important areas of the brainstem (e.g., the substantia nigra), but the striking pattern of cortical enrichment is evident at any value of the neuroaxis. OKT8, a T lymphocyte-directed monoclonal antibody of the same subclass as OKT4, shows no observable pattern. In general, the more surface layers within the cerebral cortex contain the densest concentrations of T4 antigen, the frontal and perilimbic cortex overlying the amydala being particularly receptor-rich throughout the deeper layers. The hippocampal formation has the densest concentration of receptors in the monkey, rat, and human brain. Darkfield microscopy of squirrel monkey sections immersed in photographic emulsion showed that the band of densest receptor labeling lies within the molecular layers of the dentate gyrus and hippocampus proper (which contain very few neurons). Thus, receptors appear to be fairly distributed throughout the neuropil (the neuronal projections of dendrites and axons) or may be localized to a specific subset of unstained astroglial cells.
Anzeichen für die Spezifizität der chemischen Neuroanatomie und Ergebnisse, die zeigen, daß T4 und das virale Hüllenerkennungsmolekül nicht unterscheidbar sind, sind festgestellt worden. Kranzschnitte von Rattenhirn zeigten ein sehr ähnliches Cortex/Hippocampus-reiches Muster der Rezeptorverteilung, ob OKT4 oder ¹²&sup5;I-gp120 zur Sichtbarmachung verwendet wurden. Ferner trat dieses Muster nicht in Erscheinung, wenn Inkubation in Gegenwart von unmarkiertem gp120 (1 uM), OKT4A (10 ug/ml) oder OKT4 (10 ug/ml) erfolgte. Andere Maus-Mabs, gegen andere Human-T-Zell-Oberflächenantigene einschließlich OKT8 und OKT11 ergaben kein nachweisbares Muster an Rattenhirn, wenn durch ¹²&sup5;I-Ziegen-Antimaus-IgG-sec.-Antikörper sichtbar gemacht, so wie auch kein reproduzierbarer, nachweisbarer Antigen/Rezeptor mit sekundärem Antikörper alleine vorlag.Evidence for the specificity of the chemical neuroanatomy and results showing that T4 and the viral envelope recognition molecule are indistinguishable have been established. Rat brain coronal sections showed a very similar cortex/hippocampus-rich pattern of receptor distribution whether OKT4 or 125I-gp120 was used for visualization. Furthermore, this pattern was not apparent when incubated in the presence of unlabeled gp120 (1 µM), OKT4A (10 µg/ml) or OKT4 (10 µg/ml). Other mouse Mabs against other human T cell surface antigens including OKT8 and OKT11 failed to produce a detectable pattern on rat brain when visualized by 125I goat anti-mouse IgG sec. antibody, nor was there any reproducible detectable antigen/receptor with secondary antibody alone.
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