DE3784646T2

DE3784646T2 - Gamma RADIATION FROM A COLLAGEN MINERAL BLEND.

Info

Publication number: DE3784646T2
Application number: DE19873784646
Authority: DE
Inventors: George H Chu; Diana M Hendriks; Daniel Prows; Thomas L Smestad
Original assignee: Collagen Corp
Current assignee: Collagen Aesthetics Inc
Priority date: 1986-11-06
Filing date: 1987-11-05
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2007-11-06
Also published as: CA1310918C; ATE86505T1; DE3784646D1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Implantaten und Prothesen zur Reparatur von hartem Gewebe, bestehend aus Collagen und einem Mineral. Insbesondere werden Gemische aus Atelopeptid fibrillär rekonstituiertem Collagen vermischt mit einem Calciumphosphatmineral und die Gemische werden mit γ-Strahlung behandelt, um sowohl die biologischen als auch die Handhabungseigenschaften zu verbessern.The invention relates to the manufacture of implants and prostheses for repairing hard tissue, consisting of collagen and a mineral. In particular, mixtures of atelopeptide fibrillar reconstituted collagen are mixed with a calcium phosphate mineral and the mixtures are treated with γ-radiation to improve both the biological and handling properties.

Es wurde ein weiter Bereich an Materialien vorgeschlagen zur Verwendung zur Reparatur von hartem Gewebe. Fur gewichttragende Bereiche wurden Prothesen, die in der Lage sind, Belastung zu widerstehen, hergestellt aus Metallstäben bis zum rekonstituierten Tierknochen. Verschiedene Packmaterialien wurden auch angewandt zur Verstärkung der Knochenstrukturen, so wie die Verwendung von vernetztem Collagen zur Verstärkung des Alveolarkamms. Es ist erwunscht, eine Vielzahl von Materialien zur Verfügung zu haben, die geeignet sind für verschiedene Arten der Skelett- bzw. Knochenreparatur, da jede Anwendung ihre eigene Kombination von Parametern hat, um das optimale Implantat zu bestimmen. Außerdem sind die physikalischen Handhabungseigenschaften des Materials, wie es von dem medizinischen Praktiker angewandt wird, von Bedeutung, um es dem Arzt zu ermöglichen, ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen, teilweise weil die Leichtigkeit der Handhabung die Erfolgsaussichten bestimmt.A wide range of materials have been proposed for use in hard tissue repair. For weight-bearing areas, prostheses capable of withstanding loading have been made from metal rods to reconstituted animal bone. Various packing materials have also been used to reinforce bone structures, such as the use of cross-linked collagen to reinforce the alveolar ridge. It is desirable to have a variety of materials available suitable for different types of skeletal or bone repair, as each application has its own combination of parameters to determine the optimal implant. In addition, the physical handling properties of the material as it is used by the medical practitioner are important in enabling the physician to achieve a successful outcome, in part because ease of handling determines the likelihood of success.

Es wurden Versuche unternommen, geeignete Materialien aus den hauptsächlichen organischen und anorganischen Komponenten des Knochens, nämlich Collagen und Calciumphosphatmineral herzustellen. Berichte über Versuche, die Collagen/Mineral-Kombination zu verwenden sind zahlreich. Z.B berichteten Lemons, J. et al., beim Second World Congress of Biomaterials in Washington, D.C., 27. April - 1. Mai 1984 über Versuche Collagen zusammen mit handelsüblichem Hydroxyapatit mit Calciumphosphat zur Reparatur von kunstlich verursachten Verletzungen bei Kaninchen zu verwenden. Die Verwendung dieser Gemische führte nicht zu einer Verbindung der verletzten Teile. Ein Kontrollversuch unter Verwendung von frischen autogenen Knochen war jedoch erfolgreich zur Bildung einer Einheit. Ähnlich waren Levy, P. et al J. Periodontal (1981), 50: 303 - 306, nicht erfolgreich bei Ihren Versuchen Collagen/Mineral-Gel-Implantate zu verwenden, um Defekte innerhalb des Knochens in Wurzelkanälen von Hunde- oder Affenzannen zu reparieren. Gross, B.C., et al., Oral Surg (1980), 49: 21-26 berichten über einen begrenzten Erfolg bei der Verwendung von Gemischen aus rekonstituiertem lyophilisiertem Kälberhautcollagen im Gemisch mit einer Hydroxyapatitzubereitung, um das Knochenwachstum durch subperiostale Implantate bei Affen einzuleiten. Verschiedene andere haben über die Verwendung von Collagenformen die deutlich Telopeptide, eine Hauptouelle der Immunogenität von Collagen, enthalten, in Kombination mit Mineralien zur Reparatur von Knochen berichtet. Siehe z.B. Hayashi, K. et al., Arch Orthop Traumat Sura (1982) 99: 265 - 269; Battista, US-PS 4 349 490 (hydratisierte Gelatine): Cruz Jr. US- PS 3 767 437 (mit Calcium ausgefällte Form von Collagen) und Battista, et al., US-PS 3 443 261 (neben Calciumphosphat eine "neue Form" von Collagen, die Mikrokristalle aus aggregierten Tropocollageneinneiten enthält).Attempts have been made to prepare suitable materials from the main organic and inorganic components of bone, namely collagen and calcium phosphate mineral. Reports of attempts to use the collagen/mineral combination are numerous. For example, Lemons, J. et al., reported at the Second World Congress of Biomaterials in Washington, DC, April 27 - May 1, 1984 reported attempts to use collagen in combination with commercially available hydroxyapatite with calcium phosphate to repair artificially induced lesions in rabbits. The use of these mixtures did not result in union of the injured parts. However, a control experiment using fresh autogenous bone was successful in forming a unit. Similarly, Levy, P. et al J. Periodontal (1981), 50: 303 - 306, were unsuccessful in their attempts to use collagen/mineral gel implants to repair defects within the bone in root canals of dog or monkey teeth. Gross, BC, et al., Oral Surg (1980), 49: 21-26 reported limited success in using mixtures of reconstituted lyophilized calf skin collagen mixed with a hydroxyapatite preparation to induce bone growth through subperiosteal implants in monkeys. Several others have reported the use of forms of collagen containing significant amounts of telopeptides, a major source of collagen immunogenicity, in combination with minerals for bone repair. See, for example, Hayashi, K. et al., Arch Orthop Traumat Sura (1982) 99: 265 - 269; Battista, U.S. Patent No. 4,349,490 (hydrated gelatin); Cruz Jr., U.S. Patent No. 3,767,437 (calcium precipitated form of collagen); and Battista, et al., U.S. Patent No. 3,443,261 (a "new form" of collagen containing microcrystals of aggregated tropocollagen units in addition to calcium phosphate).

Miyata, et. al., US-PS 4 314 380, verwendeten eine Mineralgrundlage (backbone) die direkt hergestellt worden war durch Behandlung von Tierknochen zur Entfernung aller organischen Materialien, die dann mit einem Atelopeptid-Collagen überzogen wurde. Die japanische Anmeldung J 58/058 041, veröffentlicht am 06. April 1983, beschreibt ein schwammartiges porös es Calciumphosphat-Material mit Poren, das mit Atelopeptid-Collagen behandelt worden ist. Das Collagen stammt von Collagen in Lösung mit einer Konzentration von nicht mehr als 2 Gew.%. Die japanische Anmeldung zeigt die Vorteile von Osteoblasten (Knochenwachstum) in die Poren des Materials und neues Knochenwachstum. Die EP-A-030 583, veröffentlicht am 24. Juni 1981, beschreibt die Verwendung von Collagenfleece im Gemisch mit Hydroxyapatit zur Reparatur von Knochen. Dieses Collagennaterial ist ein Handelsprodukt, das erhalten wird aus Tierhäuten durch proteolytischen Abbau und lyophilisiert und sterilisiert wird durch γ-Strahlung. Diese Collagenzubereitung bildet ein weiches, membranartiges Material, enthält jedoch Telopeptide und ist partiell abgebaut durch die Verarbeitung.Miyata, et al., U.S. Patent No. 4,314,380, used a mineral backbone prepared directly by treating animal bone to remove all organic materials, which was then coated with an atelopeptide collagen. Japanese Application J 58/058 041, published April 6, 1983, describes a spongy porous calcium phosphate material with pores that has been treated with atelopeptide collagen. The collagen is derived from collagen in solution at a concentration of not more than 2% by weight. The Japanese application shows the benefits of osteoblasts (bone growth) in the pores of the material and new bone growth. EP-A-030 583, published June 24, 1981, describes the use of collagen fleece mixed with hydroxyapatite for bone repair. This collagen material is a commercial product that is obtained from animal hides by proteolytic degradation and lyophilized and sterilized by γ-radiation. This collagen preparation forms a soft, membranous material, but contains telopeptides and is partially degraded by processing.

Die EP-A-164 483, veröffentlicht am 18. Dezember 1985, beschreibt ein Verfahren, von dem angegeben wird, daß es einem Mineral/Collagen- Gemisch biologische Verträglichkeit verleiht. Bei diesem Gemisch wird löslich gemachtes Collagen entweder in Gegenwart von oder vor der Zugabe von einer Calciumphosphatmineral-Komponente vernetzt, bis zum dem Punkt wo es seine Resorptionsfähigkeit und Absorptionsfähigkeit, bezogen auf Körperflüssigkeiten, beibehält und die Vernetzung nicht bis zur Vollständigkeit fortschreiten kann. Die US-A-4 516 276 von Mittelmeier beschreibt die Kombination eines nichtfibrillären, nicht rekonstituierten Collagens zusammen mit Hydroxyapatit.EP-A-164 483, published December 18, 1985, describes a process which is said to impart biocompatibility to a mineral/collagen mixture. In this mixture, solubilized collagen is cross-linked either in the presence of or before the addition of a calcium phosphate mineral component to the point where it retains its resorption and absorbency of body fluids and cross-linking cannot proceed to completion. US-A-4 516 276 to Mittelmeier describes the combination of a non-fibrillar, non-reconstituted collagen together with hydroxyapatite.

Die US-Patentanmeldung Serien Nr. 848 443, eingereicht am 4. April 1986, (entsprechend der EP-A-147 693) und ihre Stammanmeldung US-Serien Nr. 717 072, eingereicht am 28. März 1985, und beide auf den gleichen Anmelder übertragen wie die vorliegende Anmeldung und auf die hier verwiesen wird, beschreiben neue Massen, enthaltend rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptid-Collagen im Gemisch mit einem Calciumphosphatmineral. Es sind auch verschiedene Verfahren angegeben, um die Masse fester zu machen, wobei diese Verfahren ein Inkubieren des Gemisches bei speziellen Temperaturen und während spezieller Zeiten, sowie die Behandlung des getrockneten Gemisches mit Wärme umfassen. Das Präparat nach diesen Anmeldungen muß, damit es für die behandelten Patienten nicht infektiös ist, unter aseptischen Bedingungen hergestellt werden, da bei den angegebenen Verfahren keine direkte Sterilisierung vorgesehen ist. Typischerweise führt die aseptische Verarbeitung zu Produkten mit Sterilitätssicherheitsniveaus (das heißt Wahrscheinlichkeit einer nicht sterilen Produkteihheit) zwischen 10&supmin;³ und 10&supmin;&sup4;.U.S. Patent Application Serial No. 848,443, filed April 4, 1986 (corresponding to EP-A-147,693) and its parent application U.S. Serial No. 717,072, filed March 28, 1985, both assigned to the same assignee as the present application and incorporated herein by reference, describe novel compositions containing reconstituted fibrillar atelopeptide collagen in admixture with a calcium phosphate mineral. Various methods are also provided for making the composition more solid, which methods include incubating the mixture at specific temperatures and for specific times, and treating the dried mixture with heat. The preparation of these applications must be prepared under aseptic conditions in order to be non-infectious to the patients being treated, since the methods provided do not involve direct sterilization. Typically, aseptic processing results in products with sterility assurance levels (i.e., probability of non-sterile product integrity) between 10-3 and 10-4.

Das Material, das nach den verschiedenen in den oben angegebenen Anmeldungen beschriebenen Härtungsbehandlungen erzielt wird, besitzt eine Kompressibilität über 6 Newton pro cm² (N/cm²). Sowohl diese Festigkeit als auch eine weitere Verbesserung der Kompressibilitätsindices können erreicht werden durch die dort angegebenen Härtungsverfahren.The material obtained after the various hardening treatments described in the above-mentioned applications has a compressibility of more than 6 Newtons per cm² (N/cm²). Both these Strength as well as a further improvement of the compressibility indices can be achieved by the hardening processes specified there.

Der Stand der Technik liefert keine geeignete Masse zur Reparatur von Knochendefekten, die leicht und wirksam sterilisiert werden kann, während sie die guten Handhabungseigenschaften beibehält, die erwunscht sind, um einen wirksamen Einsatz des Implantats zu ermöglichen. Das Material sollte gegen Druck beständig sein und noch ausreichend elastisch, um eine Formung an Ort und Stelle zu ermöglichen oder alternativ sollte es, wenn es in einem gewichttragenden Bereich angewandt wird, entsprechend starr sein. Das Verfahren und das erhaltene Produkt nach der vorliegenden Erfindung heilen diesen Mangel des Standes der Technik.The prior art does not provide a suitable mass for repairing bone defects that can be easily and effectively sterilized while retaining the good handling properties desired to enable effective use of the implant. The material should be resistant to pressure and yet sufficiently elastic to allow molding in place or, alternatively, when applied in a weight-bearing area, it should be suitably rigid. The process and resulting product of the present invention remedy this deficiency of the prior art.

Die Erfindung nutzt die Vorteile eines Bestrahlungsverfahrens, das bisher nur in Beziehung auf seine Wirkung auf die physikalischen Eigenschaften im Zusammenhang mit Massen, die nur Collagen enthalten, angegeben war. Eine Zusammenfassung der Wirkung von γ-Strahlen auf Collagenstrukturen (Sutures) findet sich z.B. in Artandi, Technical Report # 149, Intl Atomic Energy Agency, Vienna, Manual on Radiation Sterilization of Medical & Bioloaical Materials (1973) Kap. 15, und eine Übersicht über die Wirkung der Strahlung auf Collagen als Gewebekomponente ist veröffentlicht von Bailey, A.J., in Internat Rev Connect Tis (1968), S. 233 - 281. Außerdem beschreibt die PCT- Anmeldung WO8I/00963, daß die physikalische Festigkeit von Collagenmaterialien erhöht werden kann durch Wärmebehandlung und durch Behandlung mit gasförmigem Halogenwasserstoff. Die Anmelderin kennt jedoch keine Offenbarung nach dem Stand der Technik, die die Wirkung von γ-Bestrahlung auf die physikalischen Eigenschaften und Handhabungseigenschaften von Collagen/Mineral-Gemischen zeigt, obwohl γ- Bestrahlung angewandt wurde, um die lyophilisierten Zubereitungen zu sterilisieren, die in der oben erwähnten EP-A- 164 483 angegeben sind, ohne weiteren Kommentar bezüglich der Eigenschaften oder der weiteren Verwendung.The invention takes advantage of an irradiation process that has previously only been described in relation to its effect on the physical properties associated with masses containing only collagen. A summary of the effect of γ-rays on collagen structures (sutures) can be found, for example, in Artandi, Technical Report # 149, Intl Atomic Energy Agency, Vienna, Manual on Radiation Sterilization of Medical & Bioloaical Materials (1973) Chapter 15, and a review of the effect of radiation on collagen as a tissue component is published by Bailey, A.J., in Internat Rev Connect Tis (1968), pp. 233 - 281. In addition, PCT application WO8I/00963 describes that the physical strength of collagen materials can be increased by heat treatment and by treatment with gaseous hydrogen halide. However, the Applicant is not aware of any prior art disclosure showing the effect of γ-irradiation on the physical properties and handling properties of collagen/mineral mixtures, although γ-irradiation was used to sterilize the lyophilized preparations disclosed in the above-mentioned EP-A-164 483, without any further comment on the properties or further use.

Die Erfindung liefert ein Verfahren durch das Collagen/Mineral- Zubereitungen wirksam sterilisiert werden können und ihnen gleichzeitig Eigenschaften verliehen werden, die besonders gunstig sind, zur Handhabung des Materials bei der Reparatur von (Knochen) Defekten und für ihr Verhalten als Iinplantate. Der Kern des Verfahrens ist die Bestrahlung der Zubereitung mit ausreichender Gesamtenergie, um die Sterilisierung bis zu dem erforderlichen Grad zu erreichen, wobei die Collagen/Mineral-Zübereitung in einer solchen Form vorliegt, daß die Bestrahlung auch einen zufriedenstellenden Kompressionsmodul ergibt, sowie die gewünschte Kombination von Elastizität und Starrheit. Es kann ein Bereich an erwunschten Eigenschaften erzielt werden, abhängig von der Einstellung der Bedingungen oder des Status bezüglich der relevanten Parameter der Collagen/Mineralprobe während der Bestrahlungszeit.The invention provides a method by which collagen/mineral preparations can be effectively sterilized and at the same time imparted to them properties which are particularly favorable for the handling of the material in the repair of (bone) defects and for their behavior as implants. The essence of the method is the irradiation of the preparation with sufficient total energy to achieve sterilization to the required degree, the collagen/mineral preparation being in such a form that the irradiation also results in a satisfactory compression modulus, as well as the desired combination of elasticity and rigidity. A range of desired properties can be achieved, depending on the setting of the conditions or status of the relevant parameters of the collagen/mineral sample during the irradiation period.

Folglich betrifft die Erfindung nach einem Aspekt eine biologisch verträgliche Collagen/Mineralmasse, umfassend ein Gemisch aus 2 bis 40 Gew.% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptid-Collagen und 60 bis 98 Gew.% Calciumphosphatmineral, ausschließlich Feuchtigkeit, wobei die Masse einen Kompressionsmodul (Elastizitätsmodul) von mindestens 10 N/cm² und einen Sterilitätssicherheitsfaktor von 10&supmin;&sup6; oder weniger aufweist und erhältlich ist durch Bestrahlen einer Collagen/Mineralmasse, umfassend ein Gemisch aus 2 bis 40 Gew.% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptid und 60 bis 98 Gew.% Calciumphosphatmineral ausschließlich Feuchtigkeit mit 0,5 bis 4 Mrad γ-Strahlung, das während der Bestrahlung 1 bis 6 % Feuchtigkeit enthält.Accordingly, in one aspect, the invention relates to a biocompatible collagen/mineral mass comprising a mixture of 2 to 40 wt.% reconstituted fibrillar atelopeptide collagen and 60 to 98 wt.% calcium phosphate mineral, excluding moisture, wherein the mass has a compression modulus (elastic modulus) of at least 10 N/cm² and a sterility assurance factor of 10⁻⁶ or less and is obtainable by irradiating a collagen/mineral mass comprising a mixture of 2 to 40 wt.% reconstituted fibrillar atelopeptide and 60 to 98 wt.% calcium phosphate mineral, excluding moisture, with 0.5 to 4 Mrad γ-radiation, which contains 1 to 6% moisture during irradiation.

Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch verträglichen Knochenimplantatzübereitung durch Herstellung einer solchen Masse.The invention further provides a method for producing a biologically compatible bone implant preparation by preparing such a mass.

Vorzugsweise besitzt die Collagen/Mineralmasse nach der Erfindung einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,5 bis 6 % und/oder der Collagengehalt des Collagen-Calciumphosphatgemisches beträgt 2 bis 5 %. Während der Bestrahlung ist es wichtig, daß der Collagenanteil der Zubereitung ausreichend vernetzt wird oder worden ist, um die physikalischen Eigenschaften zu stabilisieren. Das kann in einer Vielzahl von Wegen erreicht werden, z.B. durch Vorerhitzen der Probe, um eine teilweise Vernetzung zu erreichen, oder durch Einstellung der Feuchtigkeit, unter der die Bestrahlung stattfindet, so daß die Bestrahlung selbst die gewunschte Vernetzung bewirkt. So findet unter diesen Bedingungen nicht nur eine Sterilisierung auf einen Sterilitätssicherheitswert von mindestens so niedrig wie 10&supmin;&sup6; statt, sondern auch eine Einstellung der physikalischen Eigenschaften, indem ein Gleichgewicht erreicht wird zwischen der Vernetzung und dem Abbau aufgrund der Bestrahlung.Preferably, the collagen/mineral mass according to the invention has a moisture content of 0.5 to 6% and/or the collagen content of the collagen-calcium phosphate mixture is 2 to 5%. During irradiation, it is important that the collagen portion of the preparation is or has been sufficiently crosslinked to stabilize the physical properties. This can be done in a variety of ways by preheating the sample to achieve partial cross-linking, or by adjusting the humidity under which irradiation takes place so that the irradiation itself causes the desired cross-linking. Thus, under these conditions, not only does sterilization to a sterility assurance level of at least as low as 10⁻⁶ take place, but also an adjustment of the physical properties by achieving a balance between cross-linking and degradation due to irradiation.

Fig. 1 zeigt ein Diagramm von alternativen Methoden zur Durchführung der Erfindung.Fig. 1 shows a diagram of alternative methods for practicing the invention.

Fig. 2a zeigt die Wirkung des Feuchtigkeitsgehalts des Collagen/Mineralgemisches auf den Kompressionsmodul bei verschiedenen Stärken der Bestrahlung;Fig. 2a shows the effect of the moisture content of the collagen/mineral mixture on the compression modulus at different intensities of irradiation;

Fig. 2b zeigt diese Wirkung auf die Trypsinempfindlichkeit.Fig. 2b shows this effect on trypsin sensitivity.

Fig. 3a und 3b zeigen die Ergebnisse von unabhängigen Bestimmungen, ähnlich denjenigen der Fig. 2a und 2b.Fig. 3a and 3b show the results of independent determinations similar to those of Fig. 2a and 2b.

Ways of implementing the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf Collagen/Mineral- Gemische mit definierter Zusammensetzung. Es folgt zunächst eine Diskussion der Art der einzelnen Bestandteile und der Art in der diese zu Gemischen verarbeitet werden.The method according to the invention is applicable to collagen/mineral mixtures with a defined composition. This is followed by a discussion of the nature of the individual components and the manner in which they are processed into mixtures.

The mineral component

Die erfindungsgemäßen Massen können eine Vielzahl von Calciumphosphat- Mineralkomponenten enthalten. Wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezieht sich "Calciumphosphat-Mineral" auf solche Materialien, die aus Ca&spplus;² Phosphationen bestehen, ungeachtet der Mikrostruktur, dem Protonisierungszustand des Phosphats oder dem Ausmaß der Hydratisierung. Calciumphosphat-Mineralien umfassen einen Vielzahl von Formen, wie die im Handel erhältlichen Formen von Tricalciumphosphat, z.B. Synthograft Tricalcium-phosphat oder von Hydroxyapatit wie Periograf , Alveograf , Interpore , OrthoMatrix HA-1000 , oder OrthoMatrix HA-500 Hydroxyapatitzubereitung. Der Hydroxyapatit oder das Tricalciumphosphat können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, wie solchen, wie sie angegeben sind von Termine, et al., in Arch Biochem Biophys (1970) 140: 307 - 325 oder Hayashi, K. et al., in Arch. Orthop Trauma Surg (1982, a.a.O.). In jedem Fall ist das Mineral allgemein und vorzugsweise nicht biologischen Ursprungs und wird als Pulver mit entsprechender Teilchengröße (mesh) zugeführt. Bevorzugte Teilchengrößen liegen im Bereich von 100 bis 2000 um. Während der Mineralgehalt von Knochen für diesen Zweck gewonnen und gereinigt werden könnte, sind wirtschaftlicher hergestellte und kontrollierte Massen bevorzugt, sowohl aus Gründen der Kosten als auch der Qualität. Wenn feste Blöcke erwunscht sind, werden diese wie unten angegeben aus den Teilchen hergestellt.The compositions of the present invention may contain a variety of calcium phosphate mineral components. As used herein, "calcium phosphate mineral" refers to those materials consisting of Ca+2 phosphate ions, regardless of the microstructure, the protonation state of the phosphate, or the extent of hydration. Calcium phosphate minerals include a variety of forms, such as the commercially available forms of tricalcium phosphate, e.g. Synthograft tricalcium phosphate, or of hydroxyapatite such as Periograf, Alveograf, Interpore, OrthoMatrix HA-1000, or OrthoMatrix HA-500 hydroxyapatite preparation. The hydroxyapatite or tricalcium phosphate can be prepared by known methods such as those given by Termine, et al., in Arch Biochem Biophys (1970) 140: 307 - 325 or Hayashi, K. et al., in Arch. Orthop Trauma Surg (1982, supra). In any case, the mineral is generally and preferably of non-biological origin and is supplied as a powder of appropriate particle size (mesh). Preferred particle sizes are in the range of 100 to 2000 µm. While the mineral content of bone could be extracted and purified for this purpose, more economically produced and controlled masses are preferred, both for reasons of cost and quality. If solid blocks are desired, these are made from the particles as indicated below.

The collage

Die Collagenkomponente der Masse ist fur Ihre Wirksamkeit kritisch. Das zur Verwendung nach der Erfindung geeignete Collagen ist ein gereinigtes fibrilläres rekonstituiertes Atelopeptid-Collagen: Es wird typischerweise aus Haut hergestellt.The collagen component of the mass is critical to its effectiveness. The collagen suitable for use according to the invention is a purified fibrillar reconstituted atelopeptide collagen: it is typically prepared from skin.

Es wurden zahlreichte Formen von Collagen hergestellt und sie unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften sowie ihrer biologischen Verträglichkeit. Wo nicht die spezielle Teilchengröße innerhalb eines Bereichs von Durchmessern angegeben werden soll, über den ein Gemisch eine Lösung, ein Colloid oder eine Suspension ist, wird der einzige allgemeine Ausdruck "Collagendispersion" verwendet. Dieser Ausdruck bezieht sich auf eine beliebige Collagenzubereitung in wäßrigem Medium, wo die Teilchengröße des Collagens nicht speziell angegeben ist - d.h. die Zubereitung kann eine Lösung, Suspension oder ein Gel sein.Numerous forms of collagen have been prepared and they differ in their physical properties as well as their biological compatibility. Where the specific particle size is not to be specified within a range of diameters over which a mixture is a solution, colloid or suspension, the single general term "collagen dispersion" is used. This term refers to any collagen preparation in an aqueous medium where the particle size of the collagen is not specifically specified - i.e. the preparation may be a solution, suspension or gel.

Natives Collagen besteht hauptsächlich aus einer Tripelhelix-Struktur, enthaltend wiederkehrende Tripletseauenzen, bestehend aus Glycin, das gebunden ist an zwei zusätzliche Aminosäuren, üblicherweise Prolin und Hydroxyprolin. Natives Collagen enthält Bereiche an jedem Ende, die nicht die Glycin-Triplett-Sequenz besitzen und somit keine Helices bilden. Es wird angenommen, daß diese Bereiche für die Immunogenität verantwortlich sind, die mit den meisten Collagenzubereitungen verbunden ist, und die Immunogenität kann abgemildert werden durch Entfernung dieser Regionen, um "Atelopeptid"-Collagen zu erhalten. Dies kann erreicht werden durch einen Abbau mit proteolytischen Enzymen wie Trypsin und Pepsin. Die Nichthelix-Telopeptid-Regionen sind auch verantwortlich für die nativ auftretende Vernetzung, und Atelopeptid-Collagen muß künstlich vernetzt werden, wenn eine Vernetzung erwünscht ist.Native collagen consists primarily of a triple helical structure, containing repeating triplet sequences consisting of glycine linked to two additional amino acids, usually proline and hydroxyproline. Native collagen contains regions at each end that do not possess the glycine triplet sequence and thus do not form helices. These regions are thought to be responsible for the immunogenicity associated with most collagen preparations, and the immunogenicity can be mitigated by removing these regions to obtain "atelopeptide" collagen. This can be achieved by digestion with proteolytic enzymes such as trypsin and pepsin. The non-helical telopeptide regions are also responsible for the natively occurring cross-linking, and atelopeptide collagen must be artificially cross-linked if cross-linking is desired.

Natürlich vorkommende Collagene wurden in etwa 10 Typen unterklassifiziert, abhängig von der Aminosäuresequenz in den einzelnen Ketten, dem Kohlenhydratgehalt und dem Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Disulfidquerverbindungen. Die üblichsten Untergruppen sind Typ I, der in Haut, Sehnen und Knochen vorhanden ist und von Fibroblasten gebildet wird, sowie Typ III, der sich hauptsächlich in der Haut findet. Andere Typen liegen in spezialisierten Membranen oder Knorpel oder an Zelloberflächen vor. Die Typen I und III enthalten ähnliche Anzahlen an Aminosäuren in ihren Helices und haben eine hohe Homologie; jedoch enthält Typ III, aber nicht Typ I, zwei angrenzende Cysteingruppen an den C-terminalen Enden der Tripelhelix, die in der Lage sind, Querverbindungen bzw. Vernetzungen zwischen den Ketten zu bilden. Daher können Collagenzubereitungen sich aufgrund Ihrer Anfangszusammensetzung, die mit ihrem Ursprung zusammenhängt oder aufgrund ihrer Herstellungsverfahren voneinander unterscheiden. Collagen von Knochen enthält z.B. ausschließlich Collagen vom Typ I, während Collagen aus Haut auch Typ III enthält. Auch können durch das Herstellungsverfahren Telopeptide entfernt oder nicht entfernt werden. So sind sowohl unverändertes als auch "Atelopeptid"-collagen möglich. So können Vernetzungen vorsätzlich erzeugt werden oder zufällig auftreten. Sterilisierung durch γ-Bestrahlung oder durch starke Wärme kann zu einer Vernetzung führen, ohne daß das Ausmaß oder die Art kontrolliert werden, und führen zu einem teilweisen Abbau der Tripelhelix. Eine beabsichtigte Vernetzung kann durch eine Vielzabl von Mitteln durchgeführt werden, einschließlich Behandlung mit Glutaraldehyd. Unterschiede, die von möglicherweise feineren Ursachen herrühren, sind möglicherweise das Ergebnis von Veränderungen in Details des Herstellungsverfahrens. Z.B. kann das Collagen löslich gemacht und wieder ausgefällt werden oder es kann einfach fein zerteilt und in Suspensionen gehalten werden. Wenn das löslich gemachte Material reaggregiert wird, kann die Aggregierung so durchgeführt werden, daß nicht spezifisch gebundene Feststoffe entstehen, oder das Collagen kann wieder zu Fasern rekonstituiert werden, die die native Form simulieren. Außerdem kann natürlich auch der Grad der Reinheit variieren.Naturally occurring collagens have been subclassified into about 10 types, depending on the amino acid sequence in each chain, carbohydrate content, and the presence or absence of disulfide cross-links. The most common subgroups are type I, which is present in skin, tendons, and bone and is formed by fibroblasts, and type III, which is found primarily in skin. Other types are present in specialized membranes or cartilage, or on cell surfaces. Types I and III contain similar numbers of amino acids in their helices and have a high degree of homology; however, type III, but not type I, contains two adjacent cysteine groups at the C-terminal ends of the triple helix that are capable of forming cross-links between the chains. Therefore, collagen preparations may differ from one another due to their initial composition, which is related to their origin, or due to their manufacturing processes. For example, collagen from bone contains only type I collagen, while collagen from skin also contains type III. Telopeptides can also be removed or not removed by the manufacturing process. Both unmodified and "atelopeptide" collagen are possible. Cross-links can be created intentionally or occur accidentally. Sterilization by gamma irradiation or by strong heat can lead to cross-links without the extent or type being controlled. and result in partial degradation of the triple helix. Intentional cross-linking can be accomplished by a variety of means, including treatment with glutaraldehyde. Differences arising from perhaps more subtle causes may be the result of changes in details of the manufacturing process. For example, the collagen may be solubilized and reprecipitated, or it may simply be finely divided and held in suspension. When the solubilized material is reaggregated, the aggregation may be carried out to form non-specifically bound solids, or the collagen may be reconstituted into fibers simulating the native form. In addition, of course, the degree of purity may vary.

Wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "frei von Verunreinigungen" oder "gereinigt" in Beziehung auf Collagenzubereitungen, auf solche Verunreinigungen, die üblicherweise mit Collagen in nativer Form verbunden sind. So ist Collagen, das aus Kälberhaut hergestellt worden ist, frei von Verunreinigungen wenn andere Bestandteile der Kälberhaut entfernt worden sind, solches aus Knochen, wenn andere Bestandteile des Knochens eliminiert worden sind.As used herein, the term "free from impurities" or "purified" in relation to collagen preparations refers to those impurities normally associated with collagen in its native form. Thus, collagen prepared from calf skin is free from impurities if other components of the calf skin have been removed, and that prepared from bone is free from impurities if other components of the bone have been eliminated.

"Rekonstituiertes" Collagen bezieht sich auf Collagen, das in einzelne Tripelhelix-Moleküle, mit oder ohne Telopeptidausdehnung, zerlegt worden, in Lösung gebracht, und dann erneut zu "fibrillären" Formen zusammengefügt worden ist. In dieser Form bestehen die Fibrillen aus langen dünnen Collagenmolekülen, die mehrfach gegeneinander versetzt sind, um etwa ein Viertel ihrer Länge. Das führt zu einem Fasergefuge, das weiter zu Fasern aggregiert werden kann."Reconstituted" collagen refers to collagen that has been broken down into individual triple helix molecules, with or without telopeptide extension, placed in solution, and then reassembled into "fibrillar" forms. In this form, the fibrils consist of long, thin collagen molecules that are offset multiple times by about a quarter of their length. This results in a fibrous structure that can be further aggregated into fibers.

Collagen, das "im wesentlichen frei von Vernetzungen" ist, bezeichnet Collagen, von dem die Atelopeptide entfernt sind, und das so keine native Fähigkeit zur Bildung von Vernetzungen bzw. Querverbindungen besitzt. Diese Zubereitungen bleiben im wesentlichen vernetzungsfrei, wenn sie nicht absichtlich vernetzt werden, z.B. indem sie mit Glutaraldehyd behandelt oder einer Behandlung unterworfen worden sind, die selbst zu einer Vernetzung führt, z.B. Behandlungen, die häufig für Sterilisierungszwecke angewandt werden, wie hohe Temperaturen und γ- Bestrahlung, wie hier beschrieben, wenn sie unter entsprechenden Bedingungen durchgeführt werden.Collagen which is "substantially free of cross-links" means collagen from which the atelopeptides have been removed and which thus has no native ability to form cross-links. These preparations remain substantially free of cross-links unless they are intentionally cross-linked, e.g. by being treated with glutaraldehyde or by being subjected to a treatment which itself results in cross-linking, e.g. treatments which are often used for sterilization purposes such as high temperatures and γ- Irradiation as described here, when carried out under appropriate conditions.

Eine Collagenzubereitung, die für die erfindungsgemäßen Gemische geeignet ist, ist ein Atelopeptid, das zu fibrillärer Form rekonstituiert ist und als Dispersion von 5 bis 100 mg/ml, vorzugsweise etwa 50 bis 70 mg/ml, geliefert wird. Derartige Dispersionen wie Zyderm Collagen Implantat (ZCI), das in Zubereitungen, enthaltend 35 mg/ml Collagen oder 65 mg/ml Collagen in Salzlösung, die von Collagen Corporation, Palo Alto, Californien hergestellt worden sind, sind geeignet. Für die erfindungsgemäßen Mittel werden die ZCI und andere Collagendispersionen ohne Lidocain oder andere sedative Arzneimittel verwendet. "ZCI" bedeutet hier die wäßrige Collagendispersion und nicht die Collagenkomponente per se.A collagen preparation suitable for the compositions of the invention is an atelopeptide reconstituted into fibrillar form and supplied as a dispersion of 5 to 100 mg/ml, preferably about 50 to 70 mg/ml. Such dispersions as Zyderm Collagen Implant (ZCI) which is available in preparations containing 35 mg/ml collagen or 65 mg/ml collagen in saline, manufactured by Collagen Corporation, Palo Alto, California, are suitable. For the compositions of the invention, the ZCI and other collagen dispersions are used without lidocaine or other sedative drugs. "ZCI" as used herein means the aqueous collagen dispersion and not the collagen component per se.

The collagen/mineral mixtures

Die erfindungsgemäßen Massen, die am Ende der Strahlung ausgesetzt werden, werden ursprünglich hergestellt durch Vermischen von 50 bis 85 Gew.% Calciumphosphat-Mineralkomponente vorzugsweise 65 bis 75 % Mineralkomponente, wobei der Rest eine Collagendispersion in wäßrigem Medium wie ZCI ist. Angegeben als Verhältnis Mineral zu Collagen (ausschließlich des Wassergehalts der Collagendispersion) enthalten die Gemische 60 bis 98 % Mineral, vorzugsweise 75 bis 98 % Mineral und als Rest Collagen. Die Mittel können einfach hergestellt werden durch sorgfältiges Vermischen der beiden Komponenten zu einer zusammenhängenden Masse. Das Gemisch kann auch in eine gewünschte Form (z.B. Blöcke, Qader, Folien) gegossen werden. Es kann (überlagert) eine Vernetzung durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Glutaraldehyd in einer Menge von 0,001 bis 0,1 %, entweder für ein trockenes oder ein naßes Produkt, wie unten näher beschrieben.The compositions according to the invention, which are finally exposed to radiation, are initially prepared by mixing 50 to 85% by weight of calcium phosphate mineral component, preferably 65 to 75% mineral component, the remainder being a collagen dispersion in an aqueous medium such as ZCI. Expressed as a ratio of mineral to collagen (excluding the water content of the collagen dispersion), the mixtures contain 60 to 98% mineral, preferably 75 to 98% mineral, and the remainder being collagen. The compositions can be prepared simply by carefully mixing the two components to form a coherent composition. The mixture can also be cast into a desired shape (e.g. blocks, squares, sheets). Cross-linking (superimposed) can be carried out, e.g. using glutaraldehyde in an amount of 0.001 to 0.1%, either for a dry or a wet product, as further described below.

Die Gemische werden dann auf weniger als 1 % Feuchtigkeitsgehalt getrocknet und entweder rehydratisiert oder wärmebehandelt, bevor sie dem Sterilisierungsbestrahlungsverfahren nach der Erfindung, wie unten beschrieben, unterworfen werden. Die prozentuale Zusammensetzung von Collagen/Mineral und Feuchtigkeitsgehalt werden wie folgt berechnet: Prozentgehalte an Collagen und Mineral sind angegeben als Trockengewichte, bezogen auf das Gesamtgewicht dieser beiden Komponenten allein ohne Wasser. Der prozentuale Feuchtigkeitsgehalt ist das Gewicht an Wasser dividiert durch das Gesamtgewicht (Wasser + Collagen + Mineral) x 100.The mixtures are then dried to less than 1% moisture content and either rehydrated or heat treated before being subjected to the sterilization irradiation process of the invention as described below. The percent collagen/mineral composition and moisture content are calculated as follows: Collagen and mineral percentages are given as dry weights based on the total weight of these two components alone, excluding water. Percent moisture is the weight of water divided by the total weight (water + collagen + mineral) x 100.

Das bei dem Bestrahlungsprozeß entstehende sterilisierte Material kann per se als Mineral/Collagen verwendet werden oder es kann mit weiteren Komponenten vermischt werden, die ebenfalls, wie erforderlich sterilisiert sind, zur Verabreichung (Implantation) an den Patienten. Die Zubereitungen werden, obwohl sie als Collagen und Mineral beschrieben werden, dem Patienten immer in feuchter Form verabreicht und enthalten entweder den inherenten Feuchtigkeitsgehalt des ursprünglichen Gemisches oder sind wieder mit sterilem Wasser oder Salzlösung vor der Verabreichung befeuchtet worden. Außerdem können Komponenten, die geeignet sind, um die Wirksamkeit des Mittels zu verbessern, zugesetzt werden, wie Blut oder Knochenmark. Wie oben angegeben, geben die Prozentsätze an Collagen und Mineral ihre relativen Mengen an und das Collagen/Mineral-Gemisch kann so wenig wie 10 % der gesamten Zubereitung ausmachen, die in einigen Fällen verabreicht wird. Etwaige Zusätze müssen selbst ebenfalls sterilisiert sein oder aus solchen Quellen stammen, bei denen eine Sterilisierung irrelevant ist, wie z.B. im Falle von Blut.The sterilized material resulting from the irradiation process may be used as mineral/collagen per se or it may be mixed with other components, also sterilized as required, for administration (implantation) to the patient. The preparations, although described as collagen and mineral, are always administered to the patient in wet form and contain either the inherent moisture content of the original mixture or have been re-moistened with sterile water or saline prior to administration. In addition, components suitable to enhance the effectiveness of the agent may be added, such as blood or bone marrow. As stated above, the percentages of collagen and mineral indicate their relative amounts and the collagen/mineral mixture may constitute as little as 10% of the total preparation administered in some cases. Any additives must themselves be sterilized or come from sources where sterilization is irrelevant, such as blood.

Desired properties of the mixture

Das Collagen/Mineral-Gemisch selbst muß in Abhängigkeit von seiner Anwendung bestimmte physikalische Eigenschaften besitzen. Speziell muß es elastisch genug sein, um eine gewisse Formung zu ermöglichen, aber muß gleichzeitig ausreichend starr sein, um unter Belastung einer vollständigen Deorganisation bzw. einem Zerfall zu widerstehen. Die Beständigkeit gegen Druck kann gemessen werden als Kompressions- bzw. Druckmodul unter Anwendung einer handelsüblichen Vorrichtung, wie eines Instron Universal Testing Instruments Modell 4202 und nach Richtlinien für die Messung von Druckmodulen, wie sie veröffentlicht sind von der American Society for Testing Materials (ASTM).The collagen/mineral mixture itself must possess certain physical properties depending on its application. Specifically, it must be elastic enough to allow some degree of molding, but at the same time must be sufficiently rigid to resist complete disorganization or disintegration under load. Resistance to compression can be measured as compression modulus using a commercially available device such as an Instron Universal Testing Instruments Model 4202 and following guidelines for measuring compression moduli as published by the American Society for Testing Materials (ASTM).

Um diese Messung durchzuführen, werden die Gemische zunächst 5 bis 24 h in physiologische Salzlösung gelegt. Das führt zu relevanteren Daten, da das Material, wenn es implantiert ist, naß ist. Das Gemisch bleibt ausreichend lange in der Salzlösung, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen, und es wird dann in die Testvorrichtung gebracht. Wenn das Material elastisch ist, wird es leicht zusammengepreßt bis ein Punkt erreicht ist, an dem es, um das Material weiter zusammenzupressen, notwendig ist, die Eigenstruktur im mikroskopischen Maßstab zu zerstören. Wenn das Material starr ist, wird dieser Punkt bei einer geringeren Verformung erreicht als bei elastischen Materialien. Bei Collagen/Mineral-Gemischen wird die mikroskopische Organisation zunächst durch die Tripelhelix per se aufrecht erhalten, aber auch durch eine Wechselwirkung zwischen den Collagen-Tripelhelixteilen der einzelnen Komponenten der Fibrillen sowie die Bindung der Fibrillen aneinander. Ein Zusammenpressen unter Zerstörung einer dieser Organiations-Komponenten ist schwieriger als ein allgemeines Zusammenpressen mit einer Abnahme des Volumens des Leerraums. Natürlich ist, je stärker organisiert und vernetzter die Collagenketten in dem Mittel sind, ihre mikroskopische Kompression umso schwieriger.To perform this measurement, the mixtures are first placed in physiological saline for 5 to 24 hours. This leads to more relevant data because the material is wet when implanted. The mixture is left in the saline for a sufficient time to ensure complete wetting and is then placed in the test device. If the material is elastic, it is gently compressed until a point is reached where, in order to compress the material further, it is necessary to destroy the intrinsic structure on a microscopic scale. If the material is rigid, this point is reached with less deformation than in elastic materials. In collagen/mineral mixtures, the microscopic organization is maintained first by the triple helix per se, but also by an interaction between the collagen triple helix parts of the individual components of the fibrils as well as the binding of the fibrils to each other. Compression with destruction of one of these organizational components is more difficult than general compression with a decrease in the volume of the empty space. Of course, the more organized and interconnected the collagen chains in the agent are, the more difficult their microscopic compression is.

So zeigt ein hoher Kompressionsmodul (gemessen in N/cm²) einen hohen Grad an Organisation im mikroskopischen Bereich an, speziell eine hohe Vernetzung. Ein niedriger Kompressionsmodul zeigt an, daß die Vernetzung gering ist. Für angemessene physikalische Handhabungseigenschaften und zur Aufrechterhaltung der Integrität als Implantat, ist es wichtig, daß der Kompressionsmodul vernüftig hoch ist, mindestens etwa 10 N/cm² oder darüber und so hoch sein kann wie 35 bis 45 N/cm². Die oberen Grenzen des Kompressionsmoduls werden bestimmt durch die Art der Materialien und es wird angenommen, daß Gemische dieser Art tatsächlich keine Modulwerte von wesentlich mehr als 100 N/cm² unter einer beliebigen Vernetzung erreichen können. In jedem Falle ist es von Bedeutung, um geeignete physikalische Eigenschaften für die erfindungsgemäßen Mittel zu erzielen, daß der Kompressionsmodul über 10 N/cm² liegt und vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 60 N/cm² insbesondere 25 bis 45 N/cm². Das erhaltene Mittel wird nach der Behandlung entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durch diese Messung untersucht, um klarzustellen, daß die geeignete Druckbeständigkeit erreicht ist.Thus, a high compression modulus (measured in N/cm²) indicates a high degree of organization at the microscopic level, specifically high cross-linking. A low compression modulus indicates that cross-linking is low. For adequate physical handling properties and to maintain integrity as an implant, it is important that the compression modulus is reasonably high, at least about 10 N/cm² or more, and may be as high as 35 to 45 N/cm². The upper limits of the compression modulus are determined by the nature of the materials, and it is believed that blends of this type cannot actually achieve modulus values substantially greater than 100 N/cm² under any cross-linking. In any event, in order to achieve suitable physical properties for the compositions of the invention, it is important that the compression modulus be above 10 N/cm², and preferably in the range of 10 to 60 N/cm², especially 25 to 45 N/cm². The resulting agent is treated according to the method of the invention by this Measurement is examined to clarify that the appropriate pressure resistance is achieved.

Während das Gemisch die Integrität im mikroskopischen Bereich beibehalten muß, muß es auch ausreichend porös und verletzlich sein, um biologische Eigenschaften aufzuweisen, die ein Einwachsen des umgebenden harten Gewebes ermöglichen, und in einigen Fällen sollte es Resorbierbarkeit aufweisen, wenn es einem Patienten implantiert ist. Dies ist jedoch eine Eigenschaft, die optimiert und nicht maximiert werden muß. Es wird angenommen, daß ein mäßiger Grad eines Abbaus der Collagenfibrillen sie geeignet macht, für biologische Prozesse, wenn sie einem Patienten eingesetzt werden.While the mixture must maintain integrity at the microscopic level, it must also be sufficiently porous and vulnerable to exhibit biological properties that allow for ingrowth of the surrounding hard tissue, and in some cases should exhibit resorbability when implanted in a patient. However, this is a property that must be optimized and not maximized. It is believed that a moderate degree of degradation of the collagen fibrils makes them suitable for biological processes when implanted in a patient.

Eine in vitro Messung dieser Eigenschaft ist die Zugänglicbkeit der Hydrolyse durch Trypsin oder "Trypsinempfindlichkeit". Um diese Messung durchzuführen, werden die Proben mit der Protease Trypsin behandelt, die nur fragmentierte Teile des Collagenproteins angreifen kann. Das Ausmaß der Hydrolyse wird gemessen durch Fluorescaminbestimmung für lösliche Peptide und die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz Nichthelix-Collagen. Z.B. und zum Vergleich sind Gelatinezubereitungen von Collagen 100 % nicht helixförmig, Collagen in Lösung ist zu etwa 10 % nicht helixförmig und ZCL ist 10 % nicht helixförmig. Gewünschte Bereiche hängen von der vorgesehenen Verwendung ab.An in vitro measurement of this property is the accessibility of hydrolysis by trypsin or "trypsin sensitivity". To perform this measurement, samples are treated with the protease trypsin, which can only attack fragmented parts of the collagen protein. The extent of hydrolysis is measured by fluorescamine determination for soluble peptides and the results are reported as a percentage of non-helical collagen. For example, and for comparison, gelatin preparations of collagen are 100% non-helical, collagen in solution is approximately 10% non-helical and ZCL is 10% non-helical. Desired ranges depend on the intended use.

Eine alternative Maßnahme zur Fragmentierung im mikroskopischen Bereich ist die Übergangstemperatur, gemessen durch Differential-Scanning-Calorimetry (DSC). Eine Verringerung der Übergangstemperatur zeigt eine Zunahme der Fragmentierung im mikroskopischen Bereich an, in einer Weise ähnlich derjenigen, wie sie durch die Trypsinempfindlichkeit gemessen wird.An alternative measure of fragmentation at the microscopic level is the transition temperature, measured by differential scanning calorimetry (DSC). A decrease in the transition temperature indicates an increase in fragmentation at the microscopic level, in a manner similar to that measured by trypsin sensitivity.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Einstellung der obigen Parameter, um optimale physikalische und biologische Verträglichkeitseigenschaften zu erzielen. Das Verfahren führt auch zu einer wirksamen Sterilisierung des Materials, was einen Sterilisierungsgrad von mindestens so wenig wie 10&supmin;&sup6; sicherstellt.The method according to the invention allows the adjustment of the above parameters in order to achieve optimal physical and biological compatibility properties. The method also leads to an effective sterilization of the material, ensuring a degree of sterilization of at least as little as 10⁻⁶.

Method of the invention

Die Sterilisierung und Optimierung von physikalischen Eigenschaften werden erreicht, indem die Massen einer Bestrahlung unter Anwendung einer γ-Strahlenquelle im Bereich von 0,5 bis 4 Mrad, vorzugsweise 1 bis 3 Mrad und insbesondere 2,5 bis 3 Mrad, ausgesetzt werden. Es ist bekannt, daß diese Dosen eine Sterilisierung von Zubereitungen, enthaltend nur Collagen, bewirken (siehe Artandi, (a.a.O)). Das Bestrahlungsverfahren selbst wird durchgeführt unter Anwendung von Standardverfahren, die an sich bekannt sind zur Sterilisierung von Nahrungsmitteln, Kosmetika und ähnlichem. Die Bestrahlung wird durchgeführt unter Anwendung einer γ-Strahlenquelle, wie ¹³¹I, ¹³&sup7;Cs oder am üblichsten &sup6;&sup0;Co. Diese Materialien werden in Standardformen geliefert und auf die Proben angewandt unter Anwendung üblicher Standardvorrichtungen von AEC-Lizenznehmern nach den anerkannten Leitlinien. Es wird Bezug genommen auf Process Control Guidelines for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices veröffentlicht von der Assoc. for Advancement of Medical Instrumentation (1984) als AAMI Recommended Practice. Außerdem wird Bezug genommen auf Technical Reports Series 149; "Manual on Radiation Sterilization of Medical & Biological Materials", Intl Atomic Energy Commission, Wien 1973.Sterilization and optimization of physical properties are achieved by subjecting the masses to irradiation using a γ-ray source in the range of 0.5 to 4 Mrad, preferably 1 to 3 Mrad, and especially 2.5 to 3 Mrad. These doses are known to effect sterilization of preparations containing only collagen (see Artandi, (supra)). The irradiation process itself is carried out using standard procedures known per se for sterilizing foods, cosmetics and the like. The irradiation is carried out using a γ-ray source such as 131I, 137Cs or most commonly 60Co. These materials are supplied in standard forms and applied to the samples using standard equipment from AEC licensees in accordance with recognized guidelines. Reference is made to Process Control Guidelines for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices published by the Assoc. for Advancement of Medical Instrumentation (1984) as AAMI Recommended Practice. Reference is also made to Technical Reports Series 149; "Manual on Radiation Sterilization of Medical & Biological Materials", Intl Atomic Energy Commission, Vienna 1973.

Die wesentlichen Faktoren für die Wirkung der Bestrahlung auf die Probe sind die Gesamtdosis (Mrad) und der Zustand der Probe während der Bestrahlung. Andere Faktoren, wie die Rate, mit der die Energie zugeführt wird, die gesamte Bestrahlungszeit, der Abstand der Probe von der Bestrahlungsquelle usw. sind im allgemeinen irrelevant mit Ausnahme ihrer kombinierten Wirkung auf die Gesamtdosis.The main factors affecting the effect of irradiation on the sample are the total dose (Mrad) and the condition of the sample during irradiation. Other factors such as the rate at which energy is delivered, the total irradiation time, the distance of the sample from the irradiation source, etc. are generally irrelevant except for their combined effect on the total dose.

Der Zustand der Probe, die der Bestrahlung unterworfen wird, ist von höchster Bedeutung und bildet die Grundlage für die vorliegende Erfindung. Die Probe muß entweder den gewünschten Vernetzungsgrad aufweisen bevor sie der Bestrahlung unterworfen wird oder sie muß während der Bestrahlung in einen Zustand gebracht werden, um es zu ermöglichen, daß die Bestrahlung selbst diese Vernetzung bewirkt oder es muß eine Kombination dieser Faktoren angewandt werden.The condition of the sample subjected to irradiation is of paramount importance and forms the basis for the present invention. The sample must either have the desired degree of cross-linking before it is subjected to irradiation, or it must be brought into a condition during irradiation to enable the irradiation itself to effect this cross-linking, or a combination of these factors must be used.

Bei dem Verfahren zur Durchführung der Erfindung wird sichergestellt, daß das Gemisch einen Feuchtigkeitsgehalt von 1 bis 6 %, vorzugsweise 1 bis 2 %, während der γ-Bestrahlung aufweist. Das kann besonders bequem erreicht werden, indem das Gemisch zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1 % mit Hilfe von trockener Wärme bei 35 bis 45ºC, vorzugsweise 35 bis 37ºC, getrocknet wird und das Gemisch anschließend durch 6 bis 24 h langes Behandeln bei 35 bis 45ºC und 50 bis 95 %iger relativer Feuchtigkeit (RH), vorzugsweise 35 bis 37ºC bei 50 bis 80 % RH, rehydratisiert wird, um den gewünschten Gleichgewichtsfeuchtigkeitsgehalt zu erzielen. Der Feuchtigkeitsgehalt kann nach Standardverfahren gemessen werden, wie sie beschrieben sind von Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394, um sicherzustellen, daß der gewünschte Bereich erreicht ist. Andere Möglichkeiten, den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt zu erreichen, können ebenfalls angewandt und der Wassergehalt wie oben verifiziert werden. Wenn das Gemisch den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt aufweist, wird es der angegebenen Strahlendosis ausgesetzt. Die Vernetzung bis zu dem gewünschten Grad tritt dann während der Bestrahlung ein.The process for carrying out the invention involves ensuring that the mixture has a moisture content of 1 to 6%, preferably 1 to 2%, during γ-irradiation. This can be particularly conveniently achieved by first drying the mixture to a moisture content of less than 1% by dry heat at 35 to 45°C, preferably 35 to 37°C, and then rehydrating the mixture by treating it at 35 to 45°C and 50 to 95% relative humidity (RH), preferably 35 to 37°C at 50 to 80% RH, for 6 to 24 hours to achieve the desired equilibrium moisture content. The moisture content can be measured by standard methods as described by Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394 to ensure that the desired range is achieved. Other means of achieving the desired moisture content can also be used and the water content verified as above. When the mixture has the desired moisture content, it is exposed to the specified dose of radiation. Crosslinking to the desired degree then occurs during irradiation.

Bei einer alternativen Ausführungsform wird die Vernetzung eingeleitet durch Erhitzen vor der Bestrahlung. Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird die Probe zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1 %, oder vorzugsweise 0,5 bis 1 %, wie oben getrocknet und dann 4 bis 24 h auf etwa 60 bis 90ºC, vorzugsweise 70 bis 80ºC, bei 20 bis 80 % relativer Feuchtigkeit, vorzugsweise 50 bis 60 % relativer Feuchtigkeit, erwärmt, um die gewunschte Vernetzung zu erreichen, wie sie gemessen wird durch den Kompressionsmodul. Geeignete Werte für den Kompressionsmodul sind 10 bis 45 N/cm². Alternative Maßnahmen, um diese Vernetzung zu erreichen, sind ebenfalls möglich, einschließlich der Behandlung mit Vernetzungsmitteln wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd. In jedem Falle wird die Probe diesen Vernetzungsbehandlungen unterworfen, bis ein geeignetes Maß an Vernetzung, angegeben durch den Kompressionsmodul, erzielt ist. Die Probe wird dann der Strahlung ausgesetzt.In an alternative embodiment, cross-linking is initiated by heating prior to irradiation. In a preferred procedure, the sample is first dried to a moisture content of less than 1%, or preferably 0.5 to 1%, as above, and then heated to about 60 to 90°C, preferably 70 to 80°C, at 20 to 80% relative humidity, preferably 50 to 60% relative humidity, for 4 to 24 hours to achieve the desired cross-linking, as measured by the compression modulus. Suitable values for the compression modulus are 10 to 45 N/cm2. Alternative means of achieving this cross-linking are also possible, including treatment with cross-linking agents such as glutaraldehyde or formaldehyde. In any event, the sample is subjected to these cross-linking treatments until a suitable level of cross-linking, as indicated by the compression modulus, is achieved. The sample is then exposed to radiation.

So wird bei der ersten oben angegebenen Ausführungsform angenommen, daß die Vernetzung während des Bestrahlungsverfahrens auftritt, aufgrund des Vorhandenseins von Feuchtigkeit in der Probe; bei der zweiten Arbeitsweise wird die Vernetzung vor der Bestrahlungsbehandlung durchgeführt und während der Sterilisierung nicht stark erhöht. Es ist jedoch klar, daß eine Kombination der beiden oben erwähnten Behandlungen angewandt werden kann, indem der Grad der Vernetzung bei der Behandlung vor der Bestrahlung verringert wird und der Feuchtigkeitsgehalt der Probe während der Bestrahlung so eingestellt wird, daß das gewünschte Verfahren vervollständigt wird. Die allgemeinen Aspekte der oben angegebenen bevorzugten Verfahren sind in Fig. 1 angegeben.Thus, in the first embodiment given above, cross-linking is assumed to occur during the irradiation process due to the presence of moisture in the sample; in the second mode of operation, cross-linking is carried out before the irradiation treatment and is not greatly increased during sterilization. However, it is clear that a combination of the two treatments mentioned above can be used by reducing the degree of cross-linking in the treatment before irradiation and adjusting the moisture content of the sample during irradiation to complete the desired process. The general aspects of the preferred methods given above are given in Figure 1.

Für die Bestrahlungsstufe werden die Massen, die wie oben angegeben für die Bestrahlungsbehandlung entsprechend vorbereitet sind, in Materialien verpackt, die mit γ-Strahlung verträglich sind, um sicherzustellen, daß die Sterilisierung der Proben erhalten bleibt und werden dann einer 0,5 bis 4 Mrad-Bestrahlung nach Standrardverfahren unterworfen. Die Proben sind dann verpackt in einer Form, die geeignet ist zur Rekonstitution unter sterilen Bedingungen und Anwendung bei einem Patienten. Für eine derartige Verwendung wird die Probe aus der Verpackung unter sterilen Bedingungen entnommen und in steriler Salzlösung oder vermischt mit Blut oder Knochenmark nach Wunsch vollgesaugt und für den gewünschten Zweck verwendet.For the irradiation step, the masses, appropriately prepared for irradiation treatment as above, are packaged in materials compatible with gamma radiation to ensure that the sterilization of the samples is maintained and are then subjected to 0.5 to 4 Mrad irradiation according to standard procedures. The samples are then packaged in a form suitable for reconstitution under sterile conditions and administration to a patient. For such use, the sample is removed from the package under sterile conditions and soaked in sterile saline or mixed with blood or bone marrow as desired and used for the desired purpose.

Use of the mass

Die erhaltene Masse wird verwendet, um die Knochenmasse zu vermehren und Knochendefekte auszufüllen, z.B. peridontale Knochentaschen, Aushöhlungen nach Zahnextraktion und Kiefernzysten. Ein wichtiges Beispiel für ein Auflageverfahren umfaßt die Verstärkung der Alveolarkante. Die Verfahren für chirurgische Implantationen sind bekannt. Zur Vermerhung der Alveolarkante wird die Masse unter dem Periosteum an Stellen eingesetzt, wo eine Vermehrung der Knochenmasse erwünscht ist. Bei orthopädischen und rekonstruktiven Anwendungen können auch Mineralien in Form von porösen Blöcken angezeigt sein, besonders wenn der Pfropf bzw. Block Spannung aushalten muß. Die Implantation von mit Collagen imprägnierten Blöcken wird ebenfalls nach chirurgischen Standrardverfahren durchgeführt.The resulting mass is used to increase bone mass and fill bone defects, eg periodontal bone pockets, cavities after tooth extraction and jaw cysts. An important example of a top-up procedure involves the reinforcement of the alveolar ridge. The procedures for surgical implantation are well known. To increase the alveolar ridge, the mass is inserted under the periosteum in places where an increase in bone mass is desired. In orthopedic and reconstructive applications, minerals in the form of porous blocks may also be indicated, especially when the plug or block must withstand tension. The implantation of Collagen impregnated blocks are also performed according to standard surgical procedures.

Examples

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sind jedoch nicht zur Begrenzung ihres Umfangs gedacht.The following examples illustrate the invention but are not intended to limit its scope.

example 1 Preparation of a base mass

Eine Mineral/Collagen-Zubereitung wurde erhalten durch Vermischen von 65 Gewichtsteilen OrthoMatrix HA-1000 Hydroxyapatit mit 35 Gewichtsteilen Zyderm Collagenimplantat (65 mg/ml) ohne Lidocain. (Da ZCI eine 6,5 %ige Zubereitung von Collagen in Salzlösung ist, enthält die Endmasse 65 Teile HA, 2,3 Teile Collagen (0,065 x 35) und 32,7 Teile (35-2,3) Salzlösung, jeweils auf das Gewicht bezogen).A mineral/collagen preparation was obtained by mixing 65 parts by weight of OrthoMatrix HA-1000 hydroxyapatite with 35 parts by weight of Zyderm collagen implant (65 mg/ml) without lidocaine. (Since ZCI is a 6.5% preparation of collagen in saline, the final composition contains 65 parts HA, 2.3 parts collagen (0.065 x 35) and 32.7 parts (35-2.3) saline, all by weight).

Das Gemisch wurde gründlich vermischt und Anteile von 0,55 ml zu Blöcken extrudiert und unter einer laminaren Strömungshaube etwa 48 h bei 36 bis 37ºC getrocknet. Die erhaltene Zubereitung besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,87 %, gemessen nach dem Verfahren von Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394. Die Masse enthält so 0,87 % Wasser, 3,37 % Collagen und 95,76 % Mineralstoff, jeweils auf das Gewicht bezogen, wie oben definiert.The mixture was thoroughly mixed and 0.55 ml portions were extruded into blocks and dried under a laminar flow hood for about 48 hours at 36 to 37°C. The resulting preparation had a moisture content of 0.87%, measured by the method of Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394. The mass thus contains 0.87% water, 3.37% collagen and 95.76% mineral, all by weight, as defined above.

Example 2 Effect of moisture content

Die nach Beispiel 1 hergestellten Blöcke wurden in Glasgefäße zur Wiederbefeuchtung gegeben. 20 Gefäße wurden bei 75 % relativer Feuchtigkeit und 35ºC etwa 24 h inkubiert, um Blöcke mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 1,86 % zu erhalten. Zehn dieser Blöcke wurden weiter 95 %iger relativer Feuchtigkeit bei 36 bis 43ºC wahrend 15 1/2 h unterworfen, um einen Feuchtigkeitsgehalt von 5,9 % zu erzielen.The blocks prepared according to Example 1 were placed in glass jars for rehumidification. 20 jars were incubated at 75% relative humidity and 35ºC for about 24 hours to obtain blocks with a moisture content of 1.86%. Ten of these blocks were further incubated at 95% relative humidity at 36 to 43ºC for 15 1/2 hours to achieve a moisture content of 5.9%.

Die trockenen und wiederbefeuchteten Proben wurden verschiedenen Gesamtstrahlungsmengen im Bereich von 0,5 bis 3 Mrad ausgesetzt. Die Ergebnisse der Bestrahlung auf den Kompressionsmodul sind in Fig. 2a angegeben und die Wirkung auf die Trypsinempfindlichkeit ist in Fig. 2b gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß Proben enthaltend 1,86 % Feuchtigkeit durch das Bestrahlungsverfahren fester wurden in Beziehung auf den Kompressionsmodul während ihre Trypsinempfindlichkeit nicht merklich zunahm. Im Gegensatz dazu zeigten nicht wiederbefeuchtete Proben eine beachtliche Fragmentierung während der Bestrahlung und die Kompressionsfestigkeit wurde nicht meßbar verbessert. (Alle Proben zeigten eine mäßige Abnahme der Übergangstemperatur, gemessen durch DSC).The dry and rehydrated samples were exposed to various total irradiation amounts ranging from 0.5 to 3 Mrad. The results of irradiation on bulk modulus are given in Fig. 2a and the effect on trypsin sensitivity is shown in Fig. 2b. These results show that samples containing 1.86% moisture became stronger in terms of bulk modulus by the irradiation process while their trypsin sensitivity did not increase significantly. In contrast, non-rehydrated samples showed considerable fragmentation during irradiation and compressive strength was not measurably improved. (All samples showed a modest decrease in transition temperature as measured by DSC).

Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei diesmal die Proben auf 1,28 % und 1,62 % Feuchtigkeitsgehalt befeuchtet wurden und man erhielt vergleichbare Ergebnisse, wie in den Fig. 3a bzw. 3b gezeigt. Wieder zeigten die Proben mit einem höheren Feuchtigkeitsgehalt eine geringere Fragmentierung während der Bestrahlung, entsprechend der Bestimmung der Trypsinempfindlichkeit, aber eine deutliche Erhöhung des Kompressionsmoduls während der Bestrahlung, wie in Fig. 3a gezeigt.The above procedure was repeated, this time humidifying the samples to 1.28% and 1.62% moisture content and comparable results were obtained as shown in Fig. 3a and 3b, respectively. Again, the samples with higher moisture content showed less fragmentation during irradiation, as determined by trypsin sensitivity, but a significant increase in the compressive modulus during irradiation as shown in Fig. 3a.

Example 3 Effect of pretreatment with heat

Die in Beispiel 1 hergestellten Proben wurden in Glasgefäße gegeben und 16 Gefäße mit einem Stopfen verschlossen und 48 h bei 80ºC und 50 bis 70 % RH behandelt. Die Wirkung der Bestrahlung auf diese wärmebehandelten Proben wurde verglichen mit nicht wärmebehandelten Proben, die jedoch den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt von 0,87 % enthielten. Die Trypsinenpfindlichkeit der wärmebehandelten Proben nahm von einem Wert der 10 % nicht helixförmiges Collagen für nichtbestrahlte Proben zeigt auf ein Gehalt von 60 % nicht helixförmigen Bestandteilen für mit 3 Mrad bestrahlten Proben zu, im Gegensatz zu einer verhältnismäßig geringen Zunahme der Fragmentierung von 3 % Nichthelix-Charakter auf etwa 25 % bei 3 Mrad für die nicht wärmebehandelte Probe. Die Kompressionsfestigkeit der Probe wurde meßbar erhöht durch Wärmebehandlung und betrug etwa 35 N/cm² vor der Bestrahlung und behielt diesen Wert während der Bestrahlung bei.The samples prepared in Example 1 were placed in glass vials and 16 vials were stoppered and treated for 48 hours at 80ºC and 50 to 70% RH. The effect of irradiation on these heat-treated samples was compared to non-heat-treated samples, but containing the original moisture content of 0.87%. The tryptic sensitivity of the heat-treated samples increased from a value indicating 10% non-helical collagen for non-irradiated samples to a content of 60% non-helical components for samples irradiated with 3 Mrad, in contrast to a relatively small increase in fragmentation from 3% non-helical character to about 25% at 3 Mrad for the non-heat treated sample. The compressive strength of the sample was measurably increased by heat treatment and was about 35 N/cm² before irradiation and maintained this value during irradiation.

In einem getrennten Versuch wurden Proben, enthaltend 0,87 % Feuchtigkeit, nur 6 1/2 h auf 80ºC bei 50 bis 70 % RH erwärmt und zeigten ebenfalls einen Kompressionsmodul von 35 N/cm².In a separate experiment, samples containing 0.87% moisture were heated to 80ºC at 50 to 70% RH for only 6 1/2 hours and also showed a compression modulus of 35 N/cm2.

So scheint es, daß die wärmebehandelten Materialien ihre Fähigkeit, Druck zu widerstehen, nach der Bestrahlung beibehalten, während sie eine erhöhte Trypsinempfindlichkeit zeigen.Thus, it appears that the heat-treated materials retain their ability to resist pressure after irradiation while showing increased sensitivity to trypsin.

Example 4 Effect of heat curing alone

Es wurden Proben wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das extrudierte Gemisch 72 h bei 26 bis 34ºC und 90 bis 95 % relativer Feuchtigkeit vor dem Trocknen, wie oben beschrieben, behandelt wurde, um einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,48 bis 0,49 % zu erreichen. Wenn dieses präinkubierte Gemisch während unterschiedlicher Zeitdauern auf 80ºC bei 50 bis 70 % RH erhitzt wurde, zeigte es eine konsistente Zunahme in dem Kompressionsmodul von 15 N/cm² ohne Wärmebehandlung auf 25 N/cm² nach 4 h bei 80ºC, 30 N/cm² nach 8 h und 14 N/cm² nach 12 h. Daher ist die Wärmebehandlung wirksam zur Erhöhung der Kompressibilität von getrockneten Proben, ebenso wie die Anwendung von Strahlung, es tritt jedoch nicht notwendigerweise eine Sterilisierung auf.Samples were prepared as in Example 1, except that the extruded mixture was treated for 72 hours at 26-34°C and 90-95% RH prior to drying as described above to achieve a moisture content of 0.48-0.49%. When this preincubated mixture was heated to 80°C at 50-70% RH for varying periods of time, it showed a consistent increase in the compression modulus from 15 N/cm2 without heat treatment to 25 N/cm2 after 4 hours at 80°C, 30 N/cm2 after 8 hours, and 14 N/cm2 after 12 hours. Therefore, heat treatment is effective in increasing the compressibility of dried samples, as is the application of radiation, but sterilization does not necessarily occur.

Claims

1. A biocompatible collagen/mineral mass comprising a mixture containing 2-40% reconstituted fibrillar atelopeptide collagen and 60-98% calcium phosphate mineral by weight, excluding moisture, said mass having a compressive modulus of at least 10 N/cm2 and a sterility safety factor of 10-6 or less, and which is obtainable by irradiating a collagen/mineral mass comprising a mixture of 2-40% reconstituted fibrillar atelopeptide and 60-98% calcium phosphate mineral by weight, excluding moisture, and which contains 1-6% moisture during irradiation, with 0.5-4 Mrad γ-radiation.

2. A composition according to claim 1, which has a moisture content of 0.5-6%.

3. A composition according to claim 1 or claim 2, wherein the collagen content of the mixture is 2-5%.

4. A composition according to any one of claims 1 to 3, which has a compressive modulus of 25-45 N/cm².

5. A method of making a biocompatible bone implant having a compressive modulus of at least 10 N/cm2 and a sterility safety factor of 10-6 or less, which method comprises irradiating a collagen/mineral mass comprising a mixture of 2-40% reconstituted fibrillar atelopeptide collagen and 60-98% calcium phosphate mineral by weight, excluding moisture, and containing 1-6% moisture during irradiation, with 0.5-4 Mrad γ-radiation.

6. The method of claim 5, wherein the mass contains 1-2% moisture during irradiation.

7. A method according to claim 5 or claim 6, comprising drying a collagen/mineral mass to a moisture content of less than 1% and rehydrating the mass to a moisture content of 1-6% prior to irradiation.

8. A process according to claim 7, comprising rehydrating the mass at 35-45ºC and 50-95% RH for 6-24 hours.

9. A method according to claim 5 or claim 6, comprising heat treating a mass containing 0.5-1% moisture to achieve crosslinking corresponding to a compressive modulus of 10-45 N/cm2 prior to irradiation.

10. A process according to claim 9, comprising heat treating the mass for 4-24 hours at 60-90ºC and 20-80% RH.

11. Method according to one of claims 5 to 10, wherein the radiation dose is 1-3 Mrad.

12. A process for obtaining a collagen/mineral mass having a moisture content of 1-6%, the process comprising drying a mixture of 2-40% reconstituted fibrillar atelopeptide collagen and 60-98% calcium phosphate mineral, by weight, excluding moisture, to a moisture content of less than 1%, and rehydrating by incubating at 35-45ºC and a relative humidity of 50-80%.

13. Collagen/mineral mass according to one of claims 1 to 4 or prepared by a process according to one of claims 5 to 12 for use in a method of treatment of the human or animal body by surgery or therapy.

14. Use of a collagen/mineral mass according to any one of claims 1 to 4 or prepared by a process according to any one of claims 5 to 12 for the manufacture of a medicine for use in a method of treatment of the human or animal body by surgery or therapy.