DE3733986A1 - Means and process for manufacturing biosensors on the basis of an oscillating quartz crystal, and use thereof for determining antigens and affinity ligands - Google Patents

Means and process for manufacturing biosensors on the basis of an oscillating quartz crystal, and use thereof for determining antigens and affinity ligands

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Abstract

Means and process for applying a thin plastic film onto a piezoelectric oscillating quartz crystal by means of a polymer insoluble in an aqueous medium are described. Coating is effected either from an organic solution or with the aid of a vinyl monomer plasma. Owing to the polymer coating, antibodies or biomolecules can be bound either adsorptively or covalently. These immobilised biomolecules can then bind antigens or ligands; the resulting increase in mass of the oscillating quartz crystal can be measured quantitatively in the ng range on the basis of the change in oscillation frequency. Immunoassays and the determination of ligands for affinity chromatography are thus made possible.

Description

Ende der 50er Jahre wurde erstmals die Verwendung eines Radio immunoassays durch Yalow und Berson beschrieben. The late 50's the use of a radio immunoassays by Yalow and Berson was first described. Das Prinzip des Immunassays besteht in der spezifischen Erkennung eines Antigens in einem Substanzgemisch durch einen entsprechenden Antikörper (Ak). The principle of the immunoassay consists in the specific recognition of an antigen in a mixture of substances by a corresponding antibody (Ab). Bei dem zu Anfang entwickelten Radioimmuno assay (RIA) wurden Ak mit radioaktiv markierten Antigenen (Ag) und Proben-Ag zusammen inkubiert, wobei Proben-Ag und markiertes Ag um die freien Stellen am Ak konkurrieren (kompetitiver Test). In the developed initially radioimmuno assay (RIA) were Ak with radioactively labeled antigens (Ag) and incubated sample Ag together, said sample labeled Ag and Ag at the free sites on the Pc compete (competitive assay). Nach Erreichen des Gleichgewichtes wird der Ak-Ag Komplex von dem noch übriggebliebenen Ag abgetrennt; After equilibrium is reached the Ak-Ag complex is separated from the still remaining Ag; die im Ag-Ak Komplex danach gemessene Radioaktivität ist ein Maß für die Menge des vorhandenen Proben-Ag und kann sehr genau (bis zu 10 -14 Mol/l) mittels Eichkurven ermittelt werden. the measured thereafter in the Ag-Ab complex radioactivity is a measure of the amount of the existing sample and Ag can be very accurately (up to 10 -14 mol / l) are determined by means of calibration curves.

Die Abtrennung des Ak-Ag-Komplexes wird in der Praxis durch Ver wendung von Plastikröhrchen (tubes) oder Beads vorgenommen, wobei der Ak vor dem eigentlichen Test auf der Plastikoberfläche des Tubes oder Beads adsorptiv oder chemisch gebunden wird (coated-tube-Technik). The separation of Ab-Ag complex is carried out in practice by Ver application of plastic tubes (tubes) or beads, the Pc is bound adsorptively or chemically on the plastic surface of the tubes or beads before the actual test (coated-tube technique) , Anschließend werden dann markiertes Ag und Proben-Ag entweder gleichzeitig oder nacheinander in dem Tube inkubiert. labeled Ag and Ag-samples are then then either simultaneously or sequentially incubated in the tube. Nach der Inkubation werden die überschüssigen Ag-Lösungen von dem Plastikträger abgesaugt, der Ak-Ag Komplex bleibt dabei auf der Plastikoberfläche haften. After incubation, the excess Ag solutions are sucked from the plastic carrier, the Ak-Ag complex remains adhered to the plastic surface. Diese Technik des coated-Tubes oder Beads hat sich heutzutage in der Praxis durchgesetzt. This technique of coated tubes or beads has now enforced in practice. Für Routinetests werden weltweit Systeme angeboten, die die Inkubation und anschließende Messung der Radioaktivi tät vollautomatisch durchführen. For routine testing systems are available worldwide, ty incubation and subsequent measurement of Radioaktivi automatically perform. Gemessen werden beim RIA vor zugsweise Gamma-Strahlen des Jod-Isotops 125, mit dem die Ag markiert werden. are measured at the front of RIA preferably gamma-rays of iodine-125 isotope with which the Ag are marked.

Als Plastikmaterial für die Tubes oder Beads wird vornehmlich Polystyrol, Polyäthylen oder Polycarbonat verwendet. As a plastic material for the tubes or beads of polystyrene, polyethylene or polycarbonate is used primarily. Der Herstellungsprozeß der Plastikmaterialien bedarf eines großen technischen Aufwandes, da die Oberflächenbeschaffenheit der Kunststoffe von Charge zu Charge immer gleichbleibend homo gen sein muß. The production process of plastic materials requires a great technical complexity, since the surface of the plastics from batch to batch must always be gen consistently homo. Diese Voraussetzungen für einen praktikablen Immun assay sind jedoch angesichts der verschiedenen Einflüsse beim Extrudieren der Plastikmaterialien (Temperatur, Viskosität, Schmelzbedingungen, Abkühlbedingungen etc.) nur schwer zu ge währleisten. However, these conditions for a viable immune assay are given the different influences in the extrusion of plastic materials (temperature, viscosity, melt conditions, cooling conditions, etc.) are difficult to ge währleisten.

Ein weiterer wichtiger Punkt für die Praxis ist die Haftung des Ak auf der Kunststoffoberfläche. Another important point for practice, the liability of Ak on the plastic surface. Für kommerzielle coated-Tubes oder Beads wird heute ausschließlich die physikalische Adsorp tion herangezogen; For commercial coated tubes or beads only the physical Adsorp tion today is used; der Ak haftet dabei an der Plastikoberfläche durch reine hydrophobe Wechselwirkungskräfte. the Ak it adheres to the plastic surface by pure hydrophobic interaction forces. Diese Inkubations technik hat zunächst verfahrenstechnische Vorteile insofern, als gängige und billige Kunststoffe wie Polystyrol, Polyäthylen etc. verwendet werden können, zudem ist das Inkubationsverfahren recht simpel, da die Ak-Lösung lediglich für eine ausreichende Zeitdauer mit dem Plastik in Kontakt bleiben muß ohne irgend welche zusätzlichen chemischen oder physikalischen Manipulationen. This incubation technique initially procedural advantages in that can be used as common and cheap plastics such as polystyrene, polyethylene, etc., also the incubation process is quite simple, since Ak solution must remain for a sufficient length of time with the plastic in contact only without any which additional chemical or physical manipulation. Nach der Inkubation wird die überstehende Ak-Lösung einfach ab gesaugt. After incubation, the supernatant Ak-solution is simply sucked off.

Vom analytischen und biochemischen Standpunkt jedoch hat diese Art der physikalischen Adsorption auf hydrophoben Oberflächen den Nachteil, daß diese Oberflächen auch starke Adsorptivwirkung auf alle anderen Begleitproteine, die in der Probenlösung vor handen sind, haben. From the analytical and biochemical point of view, however, this type of physical adsorption on hydrophobic surfaces, has the disadvantage that these surfaces all other accompanying proteins in the sample solution before handen, also have strong Adsorptivwirkung. Da es sich bei den meisten Ag um Proteine handelt, kommt es somit ungewollt bei der Verwendung der hydro phoben Plastikmaterialien zu unspezifischen Adsorptionen, die die Testergebnisse erheblich stören können. As it is with most Ag proteins, there is thus unintentionally when using the hydro-phobic plastic materials to non-specific adsorption, which can severely disrupt the test results. Man verfährt daher in praxi so, daß nach der Ak-Ag Bildung desorbierend wirkende Detergenzien (Tween 20 z. B.) zugegeben werden, um unspezifisch gebundene Ag zu desorbieren oder man blockiert nach der Inkuba tion des Ak die noch vorhandenen freien Adsorptionsstellen auf dem Kunststoff mit einem inerten Protein (z. B. Serum Albumin). Therefore, one proceeds in practice so that after the Ag-Ak formation desorbing acting detergents (Tween 20 z. B.) are added to desorb non-specifically bound or Ag is blocked by the Inkuba tion of Ak the remaining free adsorption sites on the plastic with an inert protein (e.g.., serum albumin). Ein weiterer nachteiliger Aspekt der physikalischen Adsorption auf hydrophoben Oberflächen ist die relativ geringe Bindungs kapazität. A further disadvantageous aspect of the physical adsorption on hydrophobic surfaces is relatively small capacity, the binding. Man hat verschiedentlich versucht, diesem Manko durch eine chemische Kupplung entgegenzuwirken, indem man bei spielsweise Ak an Carboxylgruppen-haltige Copolymere chemisch gekoppelt hat. Various attempts have to counteract this drawback by chemical coupling, by having chemically coupled with the pitch Pc of carboxyl-containing copolymers. Diese Verfahren, die zwar sehr viel stabilere Bindungen zwischen Träger und Ak ermöglichen, sind jedoch für die Praxis zu aufwendig, da hierfür die teilweise komplizierten Kupplungstechniken, wie sie aus der Peptidchemie bekannt sind, benutzt wurden. This process, while enabling much more stable bonds between the carrier and Ak, but are too expensive for practical use, since this is the sometimes complicated coupling techniques, as they are known from peptide chemistry, were used. Auch chemische Bindungen über Glutaraldehyde haben sich nicht in der Praxis durchsetzen können. And chemical bonds via glutaraldehyde have not been successful in practice.

Um den schwierigen und mit gesundheitstechnischen Auflagen be hafteten Umgang mit radioaktiven Substanzen zu umgehen, wurden Anfang der 70er Jahre in Weiterentwicklung der Immunassay-Technik Testsysteme entwickelt, die sich statt des radioaktiven labels eines Enzymes oder Fluorochromes als Marker bedienen und eine dem RIA vergleichbare Empfindlichkeit aufweisen. To the difficult and be with health-related requirements adhered radioactive substances to get around the early 70s developed test systems in development of immunoassay techniques which employ instead of the radioactive labels an enzyme or fluorochrome as a marker and have the RIA comparable sensitivity ,

Die Inkubations- und Trennverfahren bei diesen Enzymimmunoassays (EIA) sind analog den Verfahren bei der RIA Technik. The incubation and separation processes in these enzyme immunoassays (EIA) are analogous to the procedures in the RIA technique. Man nutzt lediglich nach der Inkubation des Ak entweder eine Farbreaktion zwischen dem an das Ag gekoppelte Enzym und einem entsprechenden Substrat aus (z. B. Peroxidase + Leukofarbstoff + H 2 O 2 → Farbstoff + H 2 O), oder mißt die Fluoreszenz-Löschung oder Fluoreszenz-Polarisation eines mit dem Ag entsprechend gekoppel ten Fluoreszenz-Markers. One uses only after incubation of the Ak either a color reaction between the coupled to the Ag enzyme and a corresponding substrate of (z. B. peroxidase + leuco dye + H 2 O 2 → dye + H 2 O), or measures the fluorescence quenching or fluorescence polarization of a corresponding gekoppel with the Ag th fluorescent marker. Andere Nachweistechniken, die sich der Elektronen-Spin-Resonanz, Fluoreszenz-Verstärkung, Chemilumines zenz oder Puls-Polarographie bedienen, sind ebenfalls beschrie ben worden, haben jedoch keinerlei praktische Bedeutung erlangt. Other detection techniques that zenz the electron spin resonance, fluorescence enhancement, Chemilumines or operating pulse polarography, have also ben beschrie but have no practical significance is.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Ag sowie die Ermittlung von Affinitätsliganden mit Hilfe eines Kunststoff-beschichteten Biosensors auf der Basis eines piezoelektrischen Quarzkristalles. Object of the present invention are means and methods for the determination of Ag and the determination of affinity ligands by means of a plastic-coated biosensor on the basis of a piezoelectric quartz crystal.

Aufgrund der Nachteile, die sich aus den herkömmlichen RIAs und EIAs bezüglich der aufwendigen Meßtechnik, der geringen Fixierkapazität der Kunststoffträger und der Probleme bei der unspezifischen Adsorption ergeben haben, wurde ein neues Ver fahren entwickelt, das diese Nachteile umgeht und darüber hinaus Markierungen der Ag mit Radiolabeln oder Enzymen nicht mehr er forderlich macht. Because of the disadvantages that have resulted from the conventional RIAs and EIAs relating to the complex measurement technology, low fixing capacity of the plastic support and the problems of non-specific adsorption, a new Ver was developed drive which avoids these drawbacks and beyond markings of Ag no longer makes radio labels or enzymes it conducive.

Ein Schwingquarz dient hierbei als Detektionssystem. A quartz crystal serves as a detection system. Schwing quarze weisen eine Eigenschwingung auf, die abhängig von der äußeren Geometrie des Kristalls, seiner Dichte und Dicke und somit also von seiner Masse ist. Piezoelectric crystals have a natural oscillation, which is dependent on the outer geometry of the crystal, its density and thickness and so therefore on its mass. Wird nun auf diesen Schwing quarz ein Ak fixiert, der seinerseits mit einem Ag analog den Reaktionen bei den herkömmlichen Immunassays reagiert, so kommt es durch den gebildeten Ak-Ag Komplex zu einer Massenzunahme des gesamten Systems, die sich quantitativ durch eine Veränderung der Eigenschwingfrequenz zu niedrigeren Werten nachweisen und detektieren läßt. Will now be fixed to this quartz oscillator a Pc, which in turn reacts with a Ag analogous to the reactions with conventional immunoassays, as it comes through the formed Ak-Ag complex to an increase in mass of the entire system, which quantitatively by changing the natural frequency of oscillation can be detected by lower values ​​and detect. Bisherige Erfindungen dieser Art fixieren den Ak direkt auf die Kristalloberfläche mit den daraus resultieren den Nachteilen der geringen Adsorptivkapazität, der Gefahr des Ablösens des Biomoleküls sowie der unspezifischen Bindungen. Previous inventions of this type fix the Ak directly to the crystal surface with the result from the disadvantages of low Adsorptivkapazität, the risk of detachment of the biomolecule and the nonspecific binding.

Eine wesentlich bessere Haftung der Ak auf dem Quarzkristall wird nun dadurch erreicht, daß auf den Schwingquarz eine dünne (0,01-0,1 µm) Polymerschicht aufgebracht wird, die in der Lage ist, den Ak entweder adsorptiv oder kovalent zu binden. A much better adhesion of the Pc on the quartz crystal is now achieved in that a thin (0.01-0.1 microns) polymer layer is applied to the quartz resonator, which is able to bind the Ak either by adsorption or covalent.

Für die adsorptive Bindung des Ak auf dem Schwingquarz können folgende Verfahren benutzt werden: For the adsorptive binding of the Ab on the quartz oscillator following procedure can be used:

  • a) Ein in wäßrigen Lösungen unlösliches Polymer, z. a) An insoluble in aqueous solutions of polymer, eg. B. Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyamid, Polyester, etc., wird in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Benzol für Polystyrol, Dekalin für Polyäthylen, Trifluoressig säure für Polyester, Trifluoräthanol für Polyamid, THF für Poly methylmethacrylat) aufgelöst und die Lösung auf den Kristall aufgebracht. As polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polyamide, polyester, etc., is dissolved in an organic solvent (e.g., benzene polystyrene, decalin for polyethylene, trifluoroacetic acid for polyesters, trifluoroethanol for polyamide, THF for poly methyl methacrylate) and the solution is applied to the crystal. Anschließend wird das organische Lösungsmittel an der Luft und/oder im Vakuum abgedampft, so daß ein fester Polymerfilm auf der Quarzoberfläche entsteht. The organic solvent in the air and / or is evaporated in vacuo to obtain a solid polymer film on the quartz surface. Durch Variation der Polymerkonzentration in der Lösung kann in einfacher Weise die Dicke der Polymerschicht den elektronischen Erfordernissen des Schwingquarzes angepaßt werden. By varying the polymer concentration in the solution in a simple manner the thickness of the polymer layer can be adapted to the electronic requirements of the quartz crystal.
    Diese Polymerschicht eignet sich nun für die physikalische Adsorption des Ak analog der coated-tube-Technik bei den her kömmlichen Immunoassays. This polymer layer is now suitable for the physical adsorption of the Ak analogous to the coated-tube technique in her conventional immunoassays. Um die Bindungskapazität der Quarz oberfläche zu erhöhen, kann vorzugsweise folgender Verfahrens schritt herangezogen werden: Nach dem Aufbringen der Kunststoff schicht auf den Kristall, wird dieser in eine vorteilhafterweise abgekühlte Lösung gebracht, die - in der Regel ein Nichtlöse mittel für das coating-Polymer - als Fällmitel für das Poly mere fungiert. In order to increase the binding capacity of the silica surface, can be used preferably step following procedure: After application of the plastic layer on the crystal, this is placed in an advantageously cooled solution - usually a non-solvent for the coating polymer - acts as Fällmitel for the poly mers. Mit Hilfe dieser Manipulation ist es möglich, die Kristallisation des Polymeren auf der Quarzoberfläche zu verhindern - in jedem Fall bei den Polymeren, deren Glastempera tur oberhalb der Raumtemperatur liegt - und so zu einer amorphen Polymerschicht zu kommen, deren Bindungskapazität wesentlich höher liegt als bei einem teilkristallinen Material. With this manipulation, it is possible to prevent the crystallization of the polymer on the quartz surface - in each case with the polymers whose glass Tempera ture is above room temperature - and thus to achieve an amorphous polymer layer, the binding capacity is substantially higher than in a semi-crystalline material. So läßt sich z. Thus, for leaves. B. eine in Trifluoräthanol aufgebrachte Polyamid-Schicht in einfacher Weise in einer Eiswasserlösung ausfällen. B. precipitating an applied in trifluoroethanol polyamide layer in a simple manner in an ice-water solution. In ähnlicher Weise kann auch mit Polystyrol, das in z. Similarly, also with polystyrene in z. B. Methanol ausgefällt werden kann, oder Polymethylmethacrylat, das in Äthanol ausgefällt werden kann, verfahren werden. For example, methanol can be precipitated, or be moved polymethyl methacrylate, which can be precipitated in ethanol.
  • b) Neben dem Coating-Verfahren, das ausschließlich für die Ad sorption geeignet ist, lassen sich auch solche Polymeren heran ziehen, die über eine funktionelle kupplungsfähige Seitengruppe verfügen, über die der Ak kovalent gebunden werden kann. b) In addition to the coating method that is suitable only for the ad sorption, also those polymers can be drawn zoom that have a functional group capable of coupling side through which the Pc can be covalently bound. Polymere solcher Art sind z. Polymers of this kind are for. B. Polyglycidylmethacrylat, Poly glycidylacrylat, Polyacrolein sowie Copolymere aus diesen funktionellen Kunststoffen und solchen Polymeren, die für die reine Adsorption benutzt werden. B. polyglycidyl methacrylate, poly glycidyl acrylate, polyacrolein and copolymers of these functional polymers and such polymers that are used for the pure adsorption. Mit Hilfe der kupplungsfähi gen Seitengruppen - vorzugsweise werden Polymere mit Oxiran struktur, wie z. With the help of kupplungsfähi gen side groups - preferably polymers with oxirane structure such. B. Polyglycidylmethacrylat, eingesetzt - kann die Bindung zu dem Ak durch einfache Inkubation bewerkstelligt werden. B. polyglycidyl used, - the bond to the Ak can be accomplished by simple incubation. Zusätzliche Kupplungsreagenzien sind dabei nicht erforderlich. Additional coupling reagents are not required. Der verfahrenstechnische Ablauf der Präpa ration des Immunoassays reduziert sich damit auf den Aufwand einer coated-tube Präparation. The process-engineering sequence of Präpa ration of the immunoassay is thus reduced to the cost of a coated-tube preparation. Die Beschichtung der Piezo kristalle geschieht in analoger Weise wie es unter Punkt a) be schrieben ist: Polymer oder Copolymer werden in einem geeig neten organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend auf den Quarz aufgebracht. The coating of the piezoelectric crystals is done in a similar manner as in point a) be written: polymer or copolymer are dissolved in a geeig Neten organic solvent and then applied to the quartz. Glycidylacrylate lassen sich vorzugs weise aus einer Dioxanlösung aufbringen; Glycidyl can be applied from a dioxane preference; das gleiche Lösungs mittel kann auch z. can slow the same solution also z. B. für ein Glycidylmethacrylat/Styrol-Co polymer verwendet werden. B. be used for a polymer of glycidyl methacrylate / styrene Co. Die Kupplungsmechanismen des Ak an die beschichtete Kristalloberfläche laufen analog ab wie bei den bekannten Aktivierungsverfahren für die Affinitätschromatogra phie. The coupling mechanisms of Ak to the coated crystal surface running from analog as in the known activation procedures for the Affinitätschromatogra chromatography. Vorzugsweise wird demnach die Kupplung in einem neutralen bis schwach basischen Milieu bei mittlerer Ionenstärke des Kupplungspuffers vorgenommen. Accordingly, the coupling is preferably carried out in a neutral to slightly basic medium of the coupling buffer at moderate ionic strength.
  • c) Durch Elektronenstöße im kalten Plasma von Glimm- und Corona- Enladungen können organische Substanzen umgewandelt werden. c) electron collisions in the cold plasma of glow and corona Enladungen organic substances can be transformed. Diese Methode wird seit geraumer Zeit in der präparativen Chemie, z. This method has been used for some time in preparative chemistry, eg. B. für Isomerisierungs-, Eliminierungs-, Dimerisierungs, Fragmentierungsreaktionen etc. eingesetzt. As for isomerization, elimination, dimerization, fragmentation reactions, etc. used. Unter einem Plasma versteht man ein teilweise ionisiertes Gas. Under A plasma is a partially ionized gas.
    Für den vorliegenden Zweck wird ein Plasma aus Vinylmonomeren erzeugt, das sich auf dem Schwingquarz als dünne Polymerschicht niederschlägt. For the present purpose, a plasma of vinyl monomers is produced, which deposits on the quartz crystal as a thin polymer layer. Dazu kann beispielsweise ein mit zwei Elektroden bestücktes Vakuumgefäß mit Gaseinleitungsvorrichtung benutzt werden, das von einer Gleichspannungsquelle oder einem nieder frequenten Wechselstrom gespeist wird. For this purpose, a mounted two-electrode vacuum vessel may be used with gas introducing means, for example, which is fed by a DC voltage source or a low-frequency alternating current. Je nach Stromstärke kommt es zu einer selbstständigen Elektronenerzeugung, oder man ver wendet zusätzliche Anregungsquellen in Form von UV oder anderen Strahlen. Depending on the current, there is a separate electron generation, or you ver applies additional excitation sources in the form of UV or other radiation. Andere Formen der Plasmaerzeugung lassen sich durch eine außen am Reaktorgefäß angebrachte Induktionsspule, die von einem Hochfrequenzgenerator gespeist wird, realisieren. Other forms of plasma generation can be, realized by an externally mounted on the reactor vessel induction coil which is fed by a high frequency generator.
    Für die Beschichtung der Kristalle kommen grundsätzlich sämtliche verdampfbaren Vinylmonomeren wie z. principle for coating the crystals come all vaporizable vinyl monomers such. B. N-Vinylpyrrolidon, Hydroxy äthylmethacrylat, Vinylacetat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Styrol, Glycidylmethacrylat in Frage. B. N-vinyl pyrrolidone, hydroxy ethyl methacrylate, vinyl acetate, methyl methacrylate, acrylic acid, styrene, glycidyl methacrylate in question. Vorteilhaft können auch Vinylmonomermischungen verwendet werden, so daß eine Copolymer beschichtung bestehend aus einer hydrophilen Inertkomponente (z. B. Vinylpyrrolidon) und einem kupplungsfähigen Monomeren (z. B. Glycidylacrylat) gebildet wird. Advantageously, also vinyl monomer mixtures can be used, so that a copolymer coating comprising a hydrophilic inert component (z. B. vinylpyrrolidone) and a couplable monomers (eg. As glycidyl acrylate) is formed. Durch diese Auswahl von funktionellen und hydrophilen Monomeren lassen sich über raschenderweise hohe Kapazitäten - bedingt durch die chemische Bindung - und geringe unspezifische Adsorptiveigenschaften kombinieren. This selection of functional and hydrophilic monomers can be surprisingly high capacity - and combine low nonspecific Adsorptiveigenschaften - due to the chemical bond.
    Die Beschichtungsbedingungen lassen sich in breitem Rahmen durch Variation des Druckes, der Elektronenenergie, der Mono merkonzentration und der Verweilzeit beeinflussen und so für die Anwendung im Bereich des Immunassays optimieren. The coating conditions can be merkonzentration and affect the residence time and thus optimize for application in the field of immunoassays within a wide range by varying the pressure, the electron energy, the Mono.
  • c) Analog Verfahren a) läßt sich die coating-Prozedur ebenfalls mit Isocyanat-haltigen Präpolymeren durchführen. c) Analogously to method a) can be the coating procedure is also carried out with the isocyanate-containing prepolymer.
    Vorteilhaft werden dabei Diole oder Diamine mit Di- oder Tri isocyanaten umgesetzt. it diols or diamines with di- or tri isocyanates are converted. Als Polyhydroxyverbindungen eignen sich gesättigte und ungesättigte Glykole wie beispielsweise Buten diol; As polyhydroxy compounds to saturated and unsaturated glycols such as butene suitable diol; als Diisocyanate kommen z. diisocyanates for coming. B. Toluylen-2,4-diisocyanat, Hexamethylendiisocyanat, Phenylen-1,4-diisocyanat in Frage. As tolylene-2,4-diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, phenylene-1,4-diisocyanate in question. Die Polyaddition wird dabei so gesteuert, daß ein ausreichender Restanteil von Isocyanatgruppen verbleibt. The polyaddition is controlled so that a sufficient residual amount of isocyanate groups remaining. Dies wird dadurch erreicht, daß pro Hydroxy- oder Amingruppe ein Mol Diisocyanat eingesetzt wird. This is achieved in that one mole of diisocyanate is used per hydroxyl or amine group. Über diese verbleibende Isocyanatgruppe wird nach dem Beschichten des Quarzes die kovalente Bindung zu dem Ak herbeigeführt. This residual isocyanate group, the covalent bond to the Pc is brought about after the coating of quartz.
    Zur Beschleunigung der Polyaddition können die bekannten basi schen Katalysatoren (z. B. Triethylendiamin) oder Metall katalysatoren (z. B. Zinn-octoat), wie sie allgemein für die Urethanbildung benutzt werden, herangezogen werden. To accelerate the polyaddition known basi's catalysts (eg. B. triethylenediamine) or metal, catalysts (eg. As tin octoate) as they are generally used for urethane formation, are used.

Über den Immunassay hinaus läßt sich die Messung der Frequenz änderung des Schwingquarzes auch vorteilhaft für die Bestimmung von Liganden für die Affinitätschromatographie nutzen. measuring the frequency change of the quartz crystal over the immunoassay addition, can also be used advantageously for the determination of ligands for affinity chromatography. Die Probenpräparation ist dabei identisch mit der für den Immun assay. The sample preparation is identical to the assay for immune.
Anstelle des Ak wird jetzt ein Biomolekül (z. B. Enzym, Hormon, Blutfaktor etc.) auf den Quarz aufgebracht, der sodann mit verschiedenen Liganden (z. B. Aminosäuren, Peptiden, Cofaktoren, Hormonen, Inhibitoren, Oligonucleotiden etc.) in Kontakt ge bracht wird. a biomolecule (eg., enzyme, hormone, blood factor, etc.) is now applied to the quartz instead of the Pc, which then with various ligands (eg. as amino acids, peptides, cofactors, hormones, inhibitors, oligonucleotides, etc.) in Contact is placed ge. Der Ligand, der eine besonders deutliche Frequenz erniedrigung hervorruft, hat entsprechend ein hohe Affinität zu dem fixierten Biomolekül und kann daher vorteilhaft als Ligand für die affinitätschromatographische Trennung dieses be treffenden Biomoleküls herangezogen werden. The ligand which causes a particularly significant lowering of the frequency has to be, therefore, advantageously be used as a ligand for the affinity chromatographic separation of this be taken biomolecule according to a high affinity to the fixed biomolecule and can. Man ist dadurch in die Lage versetzt, in einfacher und schneller Weise und da rüber hinaus sehr präzise Aussagen über die Spezifität eines Affinitätsliganden zu machen. It is therefore in a position to make very precise statements about the specificity of an affinity ligand in a simple and rapid manner and over there also. Die Anwendung der Affinitätschro matographie wird damit sehr erleichtert. The application of Affinitätschro chromatography simplify the way.

Beispiel 1 example 1

50 mg Polyamid-6, M w : ca. 25 000, werden in 25 ml Trifluoräthanol bei Raumtemperatur gelöst. 50 mg of polyamide-6, M w: 25 000 are dissolved in 25 ml of trifluoroethanol at room temperature. Der Schwingquarz wird in diese Lösung für einige Sekunden eingetaucht und anschließend an der Luft getrocknet; The quartz crystal is immersed in this solution for a few seconds and then air-dried; die weitere Endtrocknung erfolgt im Exsikkator unter Wasserstrahlpumpenvakuum über KOH für eine Stunde. further final drying in a desiccator under water pump vacuum over KOH for one hour. Zum getrockneten Quarz wird nach den bekannten Verfahren der coated-tube-Technik 250 µm einer anti-Thyroxin-IgG Aus gangslösung (4 µg/100 ml 0,05 M PBS-Puffer, pH 7,5) gege ben. To the dried silica by the known method of coated-tube technique 250 microns of an anti-thyroxine-IgG is from interim solution (4 g / 100 ml of 0.05 M PBS buffer, pH 7.5) gege ben. Es wird 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. It is incubated for 15 hours at room temperature. Danach wird der Kristall 4mal mit PBS-Puffer gewaschen und im Vakuum getrocknet. Thereafter, the crystal is washed 4 times with PBS buffer, and dried in vacuo.
Die Frequenz des beschichteten und mit Ak inkubierten Quarzes beträgt 9,99 323 MHz. The frequency of the coated and incubated with Ak quartz is 9.99 323 MHz.
Sodann wird der Kristall mit einer Thyroxinlösung (30 µg/100 ml PBS-Puffer) zwei Stunden inkubiert, gewaschen und im Vakuum ge trocknet. Is then incubated with a crystal of the thyroxine solution (30 g / 100 ml PBS buffer) for two hours and washed dried in vacuo.

Die gemessene Frequenzänderung beträgt danach 455 Hz; The measured frequency change is then 455 Hz; dies ent spricht einer Massenzunahme von 5,17 · 10 -12 g Thyroxin. This corresponds to a weight gain of 5.17 × 10 -12 g thyroxine.

Beispiel 2 example 2

50 mg eines Copolymerisates bestehend aus 40 Teilen Glycidyl methacrylat und 20 Teilen Styrol werden in 30 ml Dioxan gelöst und anschließend auf den Quarzkristall analog Beispiel 1 auf gebracht. 50 mg of a copolymer consisting of 40 parts of glycidyl methacrylate and 20 parts of styrene are dissolved in 30 ml of dioxane and then placed on the quartz crystal analogously to Example 1 on. Nach dem Trocknen im Vakuum erfolgt das coaten mit dem Ak emäß Beispiel 1; After drying in vacuo, the effected coating with the Ak emäß Example 1; die Prozedur des Immunassays erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. the procedure of the immunoassay carried out as described in Example. 1
Die gemessene Frequenzänderung beträgt bei diesem Versuch 490 Hz, was einem Massenzuwachs von 5,58 · 10 -12 g Thyroxin entspricht. The measured frequency change is in this experiment 490 Hz, which corresponds to a weight gain of 5.58 x 10 -12 g thyroxine.

Beispiel 3 example 3

In 34,8 g Toluylen-2,4-diisocyanat werden bei 85°C unter gutem Rühren 8,8 g Buten-(2)-diol-(1,4) tropfenweise eingetragen; In 34.8 g of tolylene-2,4-diisocyanate (1,4) are at 85 ° C with good stirring 8.8 g of butene (2) -diol- dropwise added; die Temperatur steigt dabei auf ca. 100°C an. the temperature rises to about 100 ° C. Die Reaktion wird durch weiteres 1-2stündiges Erhitzen auf 100-110°C zu Ende geführt. The reaction is conducted by further heating at 100-110 ° C 1-2stündiges to an end. Das so entstehende Harz mit einem Restgehalt Isocyanat gruppen wird nun im Vakuum getrocknet. The thus resulting resin having a residual isocyanate groups is then dried in vacuo.
40 mg dieses Polymeren werden anschließend in 30 ml Äthylacetat gelöst und gemäß Beispiel 1 auf den Piezokristall aufgetragen. 40 mg of this polymer are then dissolved in 30 ml of ethyl acetate and applied to the piezoelectric crystal in accordance with Example. 1 Die weiteren Prozeduren schließen sich an die Vorschriften aus Beispiel 1 an: Frequenzänderung: 523 Hz = 5,78 · 10 -12 g Thyroxin. The other procedures align themselves with the provisions of Example 1 to: change of frequency: 523 Hz = 5.78 × 10 -12 g thyroxine.

Für alle Versuche werden Piezokristalle der Firma Kristallver arbeitung Neckarbischofsheim GmbH, Durchmesser 12 mm, Dicke 0,5 mm, mit einer Grundfrequenz von 10 MHz ± 10 -6 verwendet. For all experiments, the piezo crystals of the company Kristallver processing Neckarbischofsheim GmbH, diameter 12 mm, thickness 0.5 mm was used with a fundamental frequency of 10 MHz ± 10 -6. Die Quarze sind mit Gold-beschichteten Metallelektroden ver sehen. The crystals are seen with gold-coated metal electrodes ver. Andere Schwingquarze mit ähnlichen elektronischen Eigen schaften sind grundsätzlich auch für die in der Erfindung be schriebenen Zwecke geeignet. Other quartz oscillators with similar electronic own companies are basically suitable for the invention be in the prescribed purposes.

Nach den bekannten Verfahren zur Messung der Massenbelegung auf einen Schwingquarz aus der resultierenden Frequenzänderung, wird die Frequenzmessung mit einer elektronischen Quarzwaage, die aus einem Schwingquarz und einer stabilisierten und hochgenauen Os zillatorschaltung besteht, durchgeführt. According to the known method of measuring the mass per unit area on a quartz oscillator from the resulting frequency change, the frequency measurement with an electronic quartz crystal balance that consists of a quartz oscillator and a stabilized and highly accurate Os zillatorschaltung is performed.

Nach Aufbringen der jeweiligen Polymerschicht und Fixieren des betreffenden Ak bzw. Biomolekül auf dem beschichteten Quarz wird die gegenüber dem Grundzustand (Quarz ohne Beschichtung) veränderte Frequenz gemessen (Ausgangsfrequenz). After application of the respective polymer layer, and fixing the relevant Pc or biomolecule on the coated quartz opposite to the ground state (quartz without coating) is measured change in frequency (output frequency). Nach der Bindung der entsprechenden Ag bzw. Liganden wird die Änderung (Abnahme) der Quarzfrequenz registriert und als Maß für die Zahl der gebundenen Moleküle ausgewertet. After binding of the corresponding Ag or ligands the change (decrease) is registered to the crystal frequency and evaluated as a measure of the number of bound molecules.

Bei einer qualitativen Messung wird nur registriert, ob eine Abnahme der Frequenz die Bindung der nachzuweisenden Moleküle (z. B. der Affinitäts-Liganden) auf der Oberfläche anzeigt. In a qualitative measurement is only registered if a decrease in the frequency indicates the binding of the molecules to be detected (eg. As the affinity-ligand) on the surface. Der Ligand, der die stärkste Abnahme verursacht, ist der mit der spezifischsten Affinität zum Biomolekül. The ligand that causes the greatest reduction, is the most specific to the affinity for the biomolecule.

Claims (10)

1. Mittel und Verfahren zur Beschichtung eines Schwingquarzes mit Hilfe eines synthetischen Polymeren, welches Antikörper oder andere biologisch aktive Moleküle auf dem Schwingquarz adsorptiv oder chemisch binden kann. 1. A composition and method for coating a quartz crystal with the help of a synthetic polymer which can bind antibody or other biologically active molecules on the quartz resonator by adsorption or chemical.
2. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung aus einem synthetischen Polymeren besteht, das in wäßriger Lösung unlöslich, in organisch-chemischer Phase jedoch löslich ist. 2. Means and process according to claim 1, characterized in that the coating consists of a synthetic polymer which, in organic chemical phase, however, is insoluble in aqueous solution soluble.
3. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Beschichtung mittels eines Copolymeren aus organisch-chemischer Phase bewerkstelligt wird. 3. The composition and process according to claim 1 and 2, characterized in that the coating is accomplished by means of a copolymer of organic chemical phase.
4. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß eine Komponente des Copolymeren funktionelle kupplungsfähige Seitengruppen enthält. 4. The composition and process according to claim 1 to 3, characterized in that a component of the copolymer contains functional groups capable of coupling side.
5. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Polymerschicht nach dem Aufbringen auf den Quarz in einem Nicht-Lösungsmittel ausgefällt wird. 5. The composition and process according to claim 1 to 4, characterized in that the polymer layer is precipitated after being applied to the quartz in a non-solvent.
6. Mittel und Verfahren zur Aufbringung einer Polymerschicht auf einen Schwingquarz mit Hilfe eines Vinylmonomer-Plasmas. 6. A composition and method for applying a polymer layer on a quartz oscillator using a vinyl monomer plasma.
7. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma aus mehreren Vinylmonomeren besteht, wobei eine Komponente eine funktionelle kupplungsfähige Seitengruppe ent hält. 7. The composition and process according to claim 6, characterized in that the plasma consists of a plurality of vinyl monomers, wherein one component holds a functional group capable of coupling side ent.
8. Mittel und Verfahren zur Aufbringung von Polymerschichten auf einen Quarzkristall mit Hilfe von Urethanpräpolymeren. 8. Means and methods for applying polymer layers on a quartz crystal using urethane prepolymers.
9. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Urethanpolymer aus einer Diol- oder Diaminkomponente und einem Di- oder Triisocyanat besteht, wobei die Isocyanat komponente im Überschuß zugesetzt wird. 9. The composition and process according to claim 8, characterized in that the urethane polymer from a diol or diamine and a di- or triisocyanate, wherein the isocyanate component is added in excess.
10. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 8 und 9, dadurch gekenn zeichnet, daß das Urethanpräpolymer aus organisch-chemischer Lösung auf den Kristall aufgetragen wird. 10. A composition and method according to claim 8 and 9, characterized in that the urethane prepolymer is applied from organic-chemical solution to the crystal.
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