DE3724016A1

DE3724016A1 - Methods for the genetic engineering production of antigens and their use in an approach to confirmatory tests for antibodies in the example of human immunodeficiency virus (HIV)

Info

Publication number: DE3724016A1
Application number: DE19873724016
Authority: DE
Inventors: Erwin Dr Soutschek-Bauer; Manfred Dr Motz; Hans Prof Dr Dr Wolf
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1987-07-21
Publication date: 1989-02-02

Abstract

This invention entails the detection of HIV 1 antibodies in human serum samples or CSF in a reliable and more sensitive manner than has been possible with Western blots using virus preparations as antigen. This invention also describes the generation of recombinant DNA molecules which carry HIV 1-encoding protein segments and which ensure stable expression of these protein segments in E.coli. This stable expression in E.coli takes place without heterologous fusion proteins in order to be able to rule out non-specificities against E.coli constituents in a test. Furthermore, this invention permits, by use of the recombinant antigens in a particular test approach, a more sensitive detection of HIV 1 antibodies and, at the same time, a reliable differentiation from non-specific reactions. Finally, the approach described in the invention is orders of magnitude more favourable in cost terms than the previously used HIV 1 confirmatory test (Western blots with viral purified antigens).

Description

introduction

Als ein Vertreter der humanen erworbenen Immundefizienz (AIDS) sowie deren Vorstadien wurde ein Retrovirus ermittelt, dessen verschiedene Isolate zunächst "humanes T-lymphotrophes Retrovirus III (HTLVIII), Lymphadenopatie-Virus (LAV) oder AIDS-assozierter Retrovirus (ARV) benannt wurden, die aber inzwischen unter dem Sammelbegriff HIV 1 (Humanes Immundefizienz- Virus 1) vereinigt wurden. Die komplette genetische Information einer Reihe verschiedener Isolate ist inzwischen bestimmt worden (z. B. Ratner et al, Nature, 313, (1985), 277-284; Wain-Hobson et al., Cell, 40, (1985), 9-17; Muesing et al, Nature, 31, (1985), 450-458; Sanchez-Pescador et al, Science, 277, (1985), 484-492).As a representative of human acquired immunodeficiency (AIDS) and its pre-stages a retrovirus was identified, the various isolates of which were initially "human T-lymphotrophes Retrovirus III (HTLVIII), lymphadenopathy virus (LAV) or AIDS-associated retrovirus (ARV) were named, but which are now under the collective term HIV 1 (Human Immunodeficiency Virus 1) were combined. The complete genetic information of a number of different isolates has now been determined (e.g. Ratner et al, Nature, 313, (1985), 277-284; Wain-Hobson et al., Cell, 40, (1985), 9-17; Muesing et al, Nature, 31, (1985), 450-458; Sanchez-Pescador et al, Science, 277, (1985), 484-492).

Die im Virus-Partikel enthaltene Erbinformation in Form von RNA wird nach Infektion von T4-Rezeptor-tragenden Zellen durch eine virale reverse Transkriptase in DNA umgesetzt und als Provirus in zelluläre Sequenzen integriert. Dieser Provirus ist zwischen 9734 bp und 9749 bp lang und besitzt an beiden Enden ein LTR (long terminal repeat), welche für Regulation und Initiation der Synthese viraler Produkte verantwortlich sind. HIV-1-Viren besitzen viele für Retroviren charakteristische genetische Merkmale (Abb. 1): am 5′-Ende sitzt nach den LTR-Sequenzen das sogenannte gag-Gen (group specific antigen), dann folgen das pol-Gen mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase und das Gen für das Hüllprotein (env).The genetic information contained in the virus particle in the form of RNA is converted into DNA by a viral reverse transcriptase after infection of T4 receptor-carrying cells and is integrated into cellular sequences as a provirus. This provirus is between 9734 bp and 9749 bp long and has an LTR (long terminal repeat) at both ends, which are responsible for regulation and initiation of the synthesis of viral products. HIV-1 viruses have many genetic characteristics that are characteristic of retroviruses ( Fig. 1): at the 5′-end is the so-called gag gene (group specific antigen) after the LTR sequences, followed by the pol gene with the RNA dependent DNA polymerase and the gene for the coat protein (env).

Zusätzlich besitzt das Virus noch einige Protein-kodierende Regionen, die eine Einordnung in die Retovirus-Untergruppe der Lentiviren erlauben. Es handelt sich dabei um SOR-1, zwischen pol und env gelegen, um 3′-ORF, vor dem 3′-LTR, sowie um TAT und ART, deren kodierenden Regionen getrennt auf kurzen Leseramen vor und nach dem env-Gen liegen und deren mRNA durch "splicing" entstehen.In addition, the virus also has some protein-coding regions that are classified in allow the retovirus subset of lentiviruses. It is SOR-1, between pol and env located around 3′-ORF, in front of the 3′-LTR, and around TAT and ART, their coding Regions separated on short read names before and after the env gene and their mRNA arise from "splicing".

SOR-1, 3′-ORF, TAT und ART sind Regulationsproteine, die für Latenz des Provirus in der Zelle sowie das Anschalten der Virussynthese auf transkriptioneller und translationeller Ebene verantwortlich sind.SOR-1, 3′-ORF, TAT and ART are regulatory proteins responsible for the latency of the provirus in the Cell as well as the activation of virus synthesis at the transcriptional and translational level are responsible.

Das HIV-1-gag-Gen wird als 512-Aminosäure (aa)-Protein translatiert und anschließend durch eine virale Protease in die gag-Proteine p17, p24 und p15 gespalten. Diese Strukturproteine bilden die virale Proteinhülle (core) in das die RNA und reverse Transkriptase eingelagert werden.The HIV-1 gag gene is translated as 512-amino acid (aa) protein and then by cleaved a viral protease into the gag proteins p17, p24 and p15. Form these structural proteins the viral protein envelope (core) in which the RNA and reverse transcriptase are stored.

Das pol-Gen wird ebenfalls als ein Polprotein-Vorläufer synthetisiert und dann in die Protease, die reverse Transkriptase sowie eine Endonuklease (Integrase) prozessiert.The pol gene is also synthesized as a pole protein precursor and then into the protease, the reverse transcriptase and an endonuclease (integrase) are processed.

Als weiteres Strukturprotein sitzt das env-Genprodukt in der von der infizierten Zelle stammenden Lipidmembran. Das glykosylierte Protein wird als 160 kDa großer Vorläufer (gp160) synthetisiert und in gp120 und gp41 gespalten. Die nach bisherigen Erkenntnissen gewonnene Vorstellung geht davon aus, daß gp120 keine Membranverankerung aufweist und nur durch Wechselwirkungen an das gp41 gebunden ist. Das gp41 sitzt als Transmembranprotein in der Lipidschicht wobei der N-terminale Teil außerhalb der Zelle liegt. As another structural protein, the env gene product is located in the infected cell originating lipid membrane. The glycosylated protein is a 160 kDa precursor (gp160) synthesized and split into gp120 and gp41. The one obtained according to previous knowledge The idea is that gp120 has no membrane anchoring and only through Interactions to which gp41 is bound. The gp41 sits as a transmembrane protein in the Lipid layer with the N-terminal part outside the cell.

gp120 scheint für die spezifische Anlagerung an den T4-Rezeptor der Zielzelle verantwortlich zu sein, während gp41 wahrscheinlich die Fusion der Membranen und damit das Eindringen in die Zelle mittels hydrophober Bereich am N-terminalen Ende bewerkstelligt.gp120 appears to be responsible for the specific attachment to the T4 receptor of the target cell to be during gp41 probably the fusion of the membranes and thus the penetration into the Cell accomplished by means of the hydrophobic region at the N-terminal end.

Die Übertragung von HIV 1 erfolgt in den allermeisten Fällen durch direkten Blut-Blut- Kontakt. Eine Erstinfektion kann asymptomatisch verlaufen, in vielen Fällen kommt es bedingt durch eine Virämie zu Grippe-artigen Symptomen.In the vast majority of cases, HIV 1 is transmitted by direct blood-blood Contact. An initial infection can be asymptomatic, in many cases it occurs conditionally by viremia to flu-like symptoms.

Nach einem Zeitraum von einigen Wochen bis Monaten sind Antikörper gegen virale Proteine im Serum nachweisbar. Der Erreger selbst bleibt aber über Jahre hinweg latent in T4-Rezeptor- tragenden Zellen latent vorhanden. Durch nur in Ansätzen verstandene Ereignisse werden die in das Genom integrierten Viren wieder aktiviert und kommt zu einer Elimination von T4-Zellen. Als Symptome treten Lymphknoten-Schwellungen, Fieber, Gewichtsabnahme und Durchfall auf. Bedingt durch eine Infektion von Zellen des Hirnstamms kann es teilweise zu einer Demenz kommen. Schließlich erfolgen aufgrund einer fortschreitend reduzierten zellulären Immunantwort schwere opportunistische Infektionen, die das Vollbild von AIDS ergeben und in allen bekannten Fällen mit dem Tod endeten.After a period of a few weeks to months, antibodies against viral proteins are detectable in serum. The pathogen itself remains latent in T4 receptor for years. bearing cells latently present. Events that are only partially understood mean that the in the genome re-activates integrated viruses and there is an elimination of T4 cells. Symptoms include lymph node swelling, fever, weight loss and diarrhea. Due to infection of brain stem cells, it can partially lead to dementia come. Eventually, due to a progressively reduced cellular immune response serious opportunistic infections that result in the full picture of AIDS and in all known Cases ended in death.

Diagnosis of HIV-1 antibody status

Es ist von höchster Wichtigkeit, bei Infizierten frühzeitig und präzise deren Status festzustellen, da latent Virus-tragende Personen über Jahre hinweg infektös bleiben und andere anstecken können. Als wichtigster und relevanter Marker wird hierzu die Bestimmung der Antikörper gegen HIV 1 benutzt. Es hat sich gezeigt, daß bevorzugt Antikörper gegen das p24 (ein gag-Protein) sowie gegen gp41 (Transmembranbestandteil von env) gebildet werden. Nach einer typisch verlaufenden Erstinfektion tauchen zuerst Antikörper gegen p24 auf, erst später folgen Antikörper gegen die env-Proteine. Umgekehrt ist es dann im Spätstadium der Krankheit; hier scheinen die anti-p24-Titer wieder zu sinken, während anti-gp41-Titer länger nachweisbar sind. Diese Charakteristika kann man sich für Diagnose und Verlaufsvorhersage zunutze machen.It is extremely important to determine the status of infected people early and precisely, because latent virus-carrying people remain infectious for years and infect others can. The most important and relevant marker for this is the determination of the antibodies against HIV 1 used. It has been shown that antibodies against p24 (a gag protein) are preferred. as well as against gp41 (transmembrane component of env). After a typical initial infection, antibodies against p24 appear first, followed by antibodies later against the env proteins. Conversely, it is late in the disease; here they seem anti-p24 titer to decrease again, while anti-gp41 titer can be detected longer. These Characteristics can be used for diagnosis and prognosis.

Für die Diagnostik sind eine Reihe von Verfahren zur Antikörperbestimmung etabliert worden.A number of methods for antibody determination have been established for diagnostics.

Zur Zeit hauptsächlich in Anwendung sind:Currently mainly used:

- Immunofluorescence determination with HIV-1 infected cells
- Western blots with purified viral antigen
- ELISA with recombinant antigen produced in prokaryotes

Zusätzlich erfolgt in manchen Fällen noch eine Diagnose durch Isolierung des Virus aus Vollblut und Bestimmung der reversen Transkriptase-Aktivität im Zellkulturüberstand.In addition, in some cases a diagnosis is made by isolating the virus from whole blood and determination of reverse transcriptase activity in the cell culture supernatant.

Als ein Screnning-Test wird meistens ein ELISA mit bakteriell produziertem p24 und/oder gp41 verwendet. Da die verwendeten Antigene nicht völlig frei von Bakterienproteinen sind oder als Fusionsproteine mit bakteriellen Anteilen produziert worden waren, kommt es häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Deshalb werden solche Seren grundsätzlich Bestätigungstests unterzogen, die in der Regel Western Blots mit gereinigtem viralen Antigen und Immunfluoreszenz-Tests mit HIV-1- infizierten Zellen sind.An ELISA with bacterially produced p24 and / or gp41 is usually used as a screening test used. Since the antigens used are not completely free of bacterial proteins or as Fusion proteins with bacterial components were produced, it often comes to wrong positive results. Therefore, such sera are always subjected to confirmation tests that usually Western blots with purified viral antigen and immunofluorescence tests with HIV-1 are infected cells.

Für den Western Blot werden große Menge an T4-Zellen herangezogen, mit HIV 1 infiziert und das Virus aus dem Überstand durch mehrere Ultrazentrifugationsschritte isoliert und pelletiert. Anschließend erfolgt eine Auftrennung der viralen Bestandteile durch eine präparative SDS- Gelelektrophorese und ein Transferrieren dieser Proteine auf Nitrozellulose. Der Nitrozellulosefilter wird dann in dünne Streifen geschnitten, mit Patientenserum inkubiert, gebundenes anti-HIV-I-IgG durch einen zweiten anti-human-IgG-Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, und eine Färbereaktion nachgewiesen.Large amounts of T4 cells are used for the Western blot, infected with HIV 1 and the virus was isolated from the supernatant by several ultracentrifugation steps and pelleted. The viral components are then separated by a preparative SDS Gel electrophoresis and transferring these proteins to nitrocellulose. The nitrocellulose filter is then cut into thin strips, incubated with patient serum, bound anti-HIV-I-IgG by a second anti-human IgG antibody conjugated to peroxidase and one Coloring reaction demonstrated.

Dieses Verfahren besitzt jedoch einige gravierende Nachteile:However, this method has some serious disadvantages:

1. It is very expensive, time-consuming and also not dangerous, the large amount required to produce viral antigen.
2. The most relevant marker for a decision, gp41, is not in the virus particles too large quantities available, this protein also appears due to its glycosylation on the blot as a diffuse band, making identification of the anti-gp41 response difficult and makes insensitive.
3. Due to cross-reactions with cellular proteins that are always present in the contaminant Virus preparation, false positive results can occur.
4. Since only narrow strips are used in this type of Western blots, one is missing Possibility of control, for example a comparison with a preparation from virus-free cells. And even then, a secure comparison would not be possible because infected and virus-producing Cells certainly express a different spectrum of cellular proteins, which are then new Bands would appear on the blot strip.

Genetic engineering basics

Die für das hier vorzustellende Verfahren verwendeten HIV-1-Antigene werden in prokaryotischen Escherichia-coli-JM109-Zellen (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, (1985), 102-119) produziert. Dabei handelt es sich um einen Stamm mit folgenden genetischen Markern: {recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ ^-, Δ(lac-proAB), [F′, traD96, proAB, lacI^qZΔM15]}. Entscheidend für eine Klonierung und nachfolgende Expression mit diesem Stamm ist einmal, daß die zelluläre β-Galaktosidase am N-Terminus eine Deletion aufweist, d. h. daß diese Bakterien keine Laktose oder das Strukturanalogon 5-Bromo-3-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) spalten können. Die Spaltung von X-Gal ergibt eine blaue Farbreaktion. Zum Zweiten ist dieser Stamm ein Überproduzent des lac-Repessor-Gens: Dieses Genprodukt ist normalerweise in der Zelle nur in wenigen Kopien vorhanden und verhindert durch spezifische Anlagerung an einen Bereich des lac-Promotors eine Transkription des lac-Operons. Falls das Substrat Lactose oder das Strukturalogon Isopropyl-thiogalaktosid (IPTG) in der Zelle auftaucht, lagern sich diese an den DNA-gebundenen Repressor an, was eine Strukturänderung und Ablösung von der DNA bewirkt. Nun kann eine Transkription und Translation erfolgen. Für eine Kontrolle von lac-Promotoren- tragenden Plasmiden ist ein lac-Repressorprotein-Überproduzent vonnöten, da die Plasmide in hoher Kopienzahl in der Zelle vorliegen, und deshalb auch eine entsprechend große Anzahl von Repressormolekülen benötigt wird.The HIV-1 antigens used for the method to be presented here are produced in prokaryotic Escherichia coli JM109 cells (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, (1985), 102-119). This is a strain with the following genetic markers: {recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ ^- , Δ (lac-proAB), [F ′, traD96, proAB, lacI ^q Z Δ M15 ]}. It is crucial for cloning and subsequent expression with this strain that the cellular β- galactosidase has a deletion at the N-terminus, ie that these bacteria have no lactose or the structural analogue 5-bromo-3-chloro-3-indolyl- β - Can split D-galactopyranoside (X-Gal). The cleavage of X-Gal gives a blue color reaction. Secondly, this strain is an overproducer of the lac repessor gene: this gene product is normally only present in the cell in a few copies and prevents transcription of the lac operon by specific attachment to a region of the lac promoter. If the substrate lactose or the structural analog isopropyl-thiogalactoside (IPTG) appears in the cell, they attach to the DNA-bound repressor, which causes a structural change and detachment from the DNA. Now a transcription and translation can take place. A lac repressor protein overproducer is required for a control of lac promoter-carrying plasmids, since the plasmids are present in the cell in high number of copies, and therefore a correspondingly large number of repressor molecules is also required.

Durch einen zweiten Regulationsmechanismus wird verhindert, daß das lac-Gen in der Gegenwart von Glukose transkribiert wird (CAP). Dies wird umgangen, indem ein Medium verwendet wird, das keine Glucose enthält.A second regulatory mechanism prevents the lac gene in the Presence of glucose is transcribed (CAP). This is circumvented by a medium is used, which contains no glucose.

Für die Expression wurden die von Messing et al. (Yanisch-Perron et al, siehe oben; Vieira und Messing, Gene, 19, (1982), 259-268) geschaffenen pUC-Vektoren verwendet. Diese kleinen ca. 2,7 kb großen Plasmide besitzen das Gen für β-Lactamase, was als Resistenzmarker bei der Klonierung benutzt wird, sowie den lac-Promotor mit dem Transkriptions- und Translationstart des β-Galaktosidase-Gens. Nach den kodierenden Sequenzen für vier Aminosäuren folgen Restriktionsenzym-Schnittstellen, die sich in Anzahl und Orientierung in den einzelnen Vektoren unterscheiden (Abb. 2).For the expression, those of Messing et al. (Yanisch-Perron et al, supra; Vieira and Messing, Gene, 19, (1982), 259-268) used pUC vectors. These small, approximately 2.7 kb plasmids have the gene for β- lactamase, which is used as a resistance marker in cloning, and the lac promoter with the start of transcription and translation of the β- galactosidase gene. The coding sequences for four amino acids are followed by restriction enzyme interfaces, which differ in number and orientation in the individual vectors ( Fig. 2).

3′ dieser Insertionsstellen für zu exprimierende DNA-Fragmente folgt die kodierende Region für das lacZα-Peptid sowie (im selben Leserahmen) noch ca. 50 durch pUC-kodierte Aminosäuren. Dieses ca. 11 kDa große Proteinsegment ist in der Lage, die zuvor beschriebene N-terminale Deletion der zellulären β-Galaktosidase zu komplementieren und die Enzymaktivität wieder herzustellen (α-Komplementation). Das bedeutet, daß JM109 mit pUC-Plasmiden auf X-Gal- Platten als blaue Kolonien erscheinen, Plasmide mit einer Insertion dagegen aufgrund fehlender α-Peptid Produktion keine Farbreaktion mehr verursachen können.3 'of these insertion sites for DNA fragments to be expressed is followed by the coding region for the lacZ α peptide and (in the same reading frame) about 50 amino acids encoded by pUC. This approximately 11 kDa protein segment is able to complement the previously described N-terminal deletion of the cellular β- galactosidase and to restore the enzyme activity ( α complementation). This means that JM109 with pUC plasmids on X-Gal plates appear as blue colonies, whereas plasmids with an insertion, on the other hand, can no longer cause a color reaction due to the lack of α- peptide production.

Ausnahmen ergeben sich, wenn die Insertion nicht allzu groß ist und der Leserahmen an den 5′- und 3′-Integrationsstellen mit dem lacZ-Leserahmen übereinstimmt. Es entsteht dann ein Fusions- lacZα-Peptid, das in einigen Fällen durchaus noch in der Lage ist, zu einer aktiven β- Galaktosidase zu komplementieren. Eine andere Möglichkeit blaue Kopien trotz eines Inserts zu erhalten, kann durch Translationssignale (Shine-Dalgarno Sequenz) und ein Methionin im lacZα- Leserahmen verursacht werden.There are exceptions if the insertion is not too large and the reading frame at the 5'- and 3'-integration points matches the lacZ reading frame. A fusion lacZ α peptide is then formed which in some cases is still able to complement an active β -galactosidase. Another possibility of obtaining blue copies despite an insert can be caused by translation signals (Shine-Dalgarno sequence) and a methionine in the lacZ α reading frame.

Eine Expression von DNA-Fragmenten in diesen pUC-Vektoren wird durch folgende Schritte erreicht: Isolation und Insertion des gewünschten Fragments in den geeigneten pUC-Vektor im selben Leseraster, Charakterisierung durch Restriktionsenzym-Verdau, Anzucht des Klons in Flüssigkultur und Induktion des lac-Promotors durch IPTG, gefolgt von einer zwei- bis dreistündigen Synthesephase.Expression of DNA fragments in these pUC vectors is accomplished through the following steps achieved: isolation and insertion of the desired fragment into the appropriate pUC vector in the same reading frame, characterization by restriction enzyme digestion, cultivation of the clone in Liquid culture and induction of the lac promoter by IPTG, followed by a two to three hour period Synthesis phase.

Brief description of the invention

Das hier vorzustellende Verfahren umgeht die vorher aufgeführten Restriktionen bei der Bestimmung des HIV-1-Antikörperstatus (Bestätigungs-Western Blot), ist zudem extrem billig in der Herstellung und ungefährlich, da bakteriell exprimierte Antigen verwendet werden. Es handelt sich dabei um einen Western Blot mit verschiedenen bakteriellen Lysaten, die unterschiedliche HIV-1-Antigene enthalten. Hierzu wurden Escherichia-coli-Klone geschaffen, die gp41, p24, p17 und pol exprimieren.The procedure to be presented here bypasses the previously mentioned restrictions at Determination of HIV-1 antibody status (confirmation western blot) is also extremely cheap in the production and harmless, since bacterially expressed antigen is used. It deals is a Western blot with different bacterial lysates that have different HIV-1 antigens contain. For this purpose, Escherichia coli clones were created, the gp41, p24, p17 and express pole.

Von gp41, dem Transmembran-Protein aus der Lipidhülle des Virus, wurde ein Bereich von ca. 160 Aminosäuren verwendet, von dem bekannt ist, daß er in allen Isolaten sehr konserviert ist und daß bei einem Großteil der HIV-1-Positiven Antikörper dagegen vorhanden sind. Kloniert wurde dieser Bereich aus dem WMJ-I-Isolat aus dem Labor von B. Gallo (Hahn, B. H., Shaw, G. M., Taylor, M. E., Redfield, R. R., Markham, P. D., Salahuddin, S. Z., Wong-Staal, F., Gallo, R. C., Parks, E. S. and Parks, W. P.: Genetic Variaton in HTLV-III/LAV over time in patients with Aids or at risk of Aids. Science, 232, (1986) 1548-1554); das resultierende Expressionsplasmid pUC8RRstop besitzt am 3′-Ende ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches für einen Translations- und Transkriptions-Stop sorgt. Exprimiert wird der gp41 Bereich fusioniert am N- und C-Terminus nur mit wenigen Fremdaminosäuren.Gp41, the transmembrane protein from the lipid envelope of the virus, has a range of approx. 160 amino acids used, which is known to be very conserved in all isolates and that a large part of the HIV-1 positive antibodies are present against it. Was cloned this area from the WMJ-I isolate from B. Gallo's laboratory (Hahn, B.H., Shaw, G.M., Taylor, M.E., Redfield, R.R., Markham, P.D., Salahuddin, S.Z., Wong-Staal, F., Gallo, R.C., Parks, E. S. and Parks, W. P .: Genetic Variaton in HTLV-III / LAV over time in patients with Aids or at risk of AIDS. Science, 232, (1986) 1548-1554); the resulting expression plasmid pUC8RRstop has at the 3'-end a synthetic oligodeoxynucleotide, which for a translation and Transcription stop ensures. The gp41 region is expressed fused at the N and C terminus only with a few foreign amino acids.

Das Plasmid pUC9HPvBg10 kodiert und exprimiert den gesamten p24-kodierenden Bereich und zusätzlich noch einige Aminosäuren der flankierenden Proteine, dem p17 sowie p15. Aufgrund einer zweifachen Insertion in Tandemorientierung des kodierenden Bereichs exprimierte dieser Klon eine ungewöhnliche große Menge des rekombinanten p24.The plasmid pUC9HPvBg10 encodes and expresses the entire p24 coding region and additionally some amino acids of the flanking proteins, p17 and p15. Because of a double insertion in tandem orientation of the coding region was expressed Clone an unusually large amount of the recombinant p24.

Das Plasmid pUC18Xmnstop enthält den p17-kodierenden Bereich und weist am 3′-Ende des Inserts denselben Stop-Linker wie das gp41-Konstrukt auf.The plasmid pUC18Xmnstop contains the p17 coding region and has at the 3'-end of the Inserts the same stop linker as the gp41 construct.

Das pol-Gen schließlich ist durch zwei Plasmid-Konstruktionen vertreten: Einmal pMFPOL, welches ein Fusionsprotein mit dem C1-Repressormolekül der reversen Transkriptase kodiert; zum Zweiten pUC19EBg, welches die Protease, die reverse Transkriptase sowie einen Teil der Integrase kodiert.Finally, the pol gene is represented by two plasmid constructions: one pMFPOL, which encodes a fusion protein with the C1 repressor molecule of the reverse transcriptase; to the Second pUC19EBg, which contains the protease, the reverse transcriptase and part of the integrase encoded.

pol- und p17-Expressionsprodukte müssen nicht in jedem Fall in dem vorgestelltem Test miteingesetzt werden, da Antikörper gegen p24 in den allermeisten Fällen dieselbe Signifikanz aufweisen.pol and p17 expression products do not always have to be in the presented test are used because antibodies against p24 have the same significance in the vast majority of cases exhibit.

Dagegen ist ein Fusionskonstrukt aus p24 und gp41 von entscheidender Wichtigkeit für den Test. Dieses von pUC19RRPvBg kodierte Protein besteht aus einem gp41-kodierenden Fragment gefolgt von dem p24-Tandem-Insert und wird sowohl von anti-p24- als auch von anti-gp41- Antikörpern erkannt. Die beiden Antigene sind also jeweils doppelt im Test vorhanden, für den Fall, daß aufgrund von unspezifischen Reaktionen gegen E. coli-Proteine eines der beiden Nicht- Fusionsantigene nicht auswertbar ist.In contrast, a fusion construct from p24 and gp41 is of crucial importance for the Test. This protein, encoded by pUC19RRPvBg, consists of a fragment encoding gp41 followed by the p24 tandem insert and is used by both anti-p24 and anti-gp41 Antibodies recognized. The two antigens are therefore present twice in the test for which Case that due to non-specific reactions against E. coli proteins one of the two non- Fusion antigens cannot be evaluated.

Entscheidend dabei ist, daß diese rekombinanten Antigene nur mit einigen wenigen Aminosäuren - durch Klonierung bedingt - fusoniert sind. Dadurch kann mit einiger Sicherheit eine Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen bakterielle Proteine ausgeschlossen werden.It is crucial that these recombinant antigens only with a few Amino acids - due to cloning - are fusonized. Doing so can with some certainty a cross-reaction with antibodies against bacterial proteins can be excluded.

Für den hier vorzustellenden Test sind diese Expressionsplasmide jedoch nicht bindend; es können genauso andere Konstruktionen, die eine Expression derselben HIV-1-Proteinsegmente zulassen, verwendet werden. Ebenso können DNA-Sequenzen aus anderen HIV-1-Isolaten benutzt werden, da die exprimierten Segmente aus konservierten Regionen des viralen Genoms stammen. Die hier vorgestellten und im Folgenden genauer beschriebenen Plasmidkonstruktionen sind also nur Beispiele, andere liegen ebenfalls vor und können analog eingesetzt werden. Dasselbe gilt für einen Einsatz von HIV-2-Expressionsplasmiden, die für einen gleich gestalteten Einsatz in der Diagnostik eingesetzt werden können.However, these expression plasmids are not binding for the test to be presented here; it other constructions that express the same HIV-1 protein segments may also be used allow to be used. DNA sequences from other HIV-1 isolates can also be used because the expressed segments come from conserved regions of the viral genome. The plasmid constructions presented here and described in more detail below are therefore only examples, others are also available and can be used analogously. The same applies to use of HIV-2 expression plasmids, which are designed for the same use in the Diagnostics can be used.

Die verschiedenen bakteriellen Lysate werden nebeneinander durch SDS-Elektrophorese aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferriert, wobei entweder alle oben aufgeführten Antigene oder aber nur p24, gp41 sowie ein daraus resultierendes Fusionsprodukt, auf das später eingegangen wird, genügen.The different bacterial lysates are juxtaposed by SDS electrophoresis separated and transferred to nitrocellulose, using either all of the antigens listed above or just p24, gp41 and a resulting fusion product, to which later is sufficient.

Die direkte Verwendung bakterieller Lysate bringt wesentliche Vorteile mit sich. Zum einen sind sie extrem leicht und ohne Aufwand herzustellen, sehr billig und vor allem völlig ungefährlich. Ein weiterer Vorteil ist es, daß keinerlei Aufreinigung der Antigene vonnöten ist. Gerade in der Verwendung von Bakterienlysaten liegt ein wesentlicher Vorteil des hier vorgestellten Verfahrens, denn dadurch ist im Gegensatz zu den konventionellen Western Blots mit viralem gereinigten Antigen jederzeit eine sichere und vollständige Kontrolle von spezifischer bzw. unspezifischer Reaktion gegeben. Da die verwendeten rekombinanten Antigene alle verschiedene Molekulargewichte aufweisen, genügt ein Vergleich mit der Nachbarspur, um eine Entscheidung zu treffen; d. h. es ist völlig unwichtig, wie stark die Reaktion gegen bakterielle Proteine ist, da diese dann in allen Spuren auftritt; hingegen spezifische anti-HIV-1-Reaktionen nur an jeweils einer definierten Stelle zu finden sein werden.The direct use of bacterial lysates has significant advantages. On the one hand they are extremely easy and inexpensive to manufacture, very cheap and above all completely harmless. Another advantage is that no purification of the antigens is required. Especially in the use of bacterial lysates there is a significant advantage of this presented method, because in contrast to the conventional Western blots with viral purified antigen safe and complete control of specific or given non-specific reaction. Because the recombinant antigens used are all different Have molecular weights, a comparison with the neighboring track is sufficient to make a decision to meet; d. H. it is completely unimportant how strong the response to bacterial proteins is because of this then occurs in all tracks; however, specific anti-HIV-1 reactions only occur on one at a time defined position will be found.

Theoretisch könnte ein HIV-1-Antigen durch eine Reaktion mit einem bakteriellen Protein derselben Größe überlagert werden. Aus diesem Grund wird bei dem Test auch ein Lysat verwendet, das ein schon angesprochenes Fusionskonstrukt von p24 und gp41 enthält und das aufgrund seiner Größe auch an anderer Stelle eine Reaktion verursachen wird. Die beiden wichtigsten diagnostischen Marker sind also doppelt vorhanden, für den Fall, daß eines der beiden aufgrund einer überlagernden unspezifischen Reaktion nicht auswertbar ist.Theoretically, an HIV-1 antigen could be caused by a reaction with a bacterial protein same size are overlaid. For this reason, the test also uses a lysate used, which contains an already mentioned fusion construct of p24 and gp41 and that will cause a reaction elsewhere due to its size. The two the most important diagnostic markers are therefore duplicated, in the event that one of the two cannot be evaluated due to an overlapping non-specific reaction.

Ein weiterer entscheidender Vorteil des Systems ist die erheblich bessere Sensitivität der anti-gp41-Reaktion. Wie schon ausgeführt, erscheint das aus Viruspartikeln gewonne gp41 als schwache, diffuse Bande im Blot und ist zudem oft von Reaktionen gegen zelluläre Proteine überlagert. Das im Bakterienlysat benutzte rekombinante Fragment von gp41 ist dagegen in ausreichender Menge vorhanden und erscheint zudem als scharfe Bande. Eine anti-gp41-Reaktion kann wohl als spezifisch für eine HIV-1-Infektion gewertet werden, da hier keine Kreuzreaktionen mit verwandten Retroviren auftreten werden. Die erheblich höhere Sensitivität des rekombinanten gp41 kann als die entscheidende Verbesserung dieses Testes angesehen werden.Another decisive advantage of the system is the significantly better sensitivity of the anti-gp41 reaction. As already stated, the gp41 obtained from virus particles appears as weak, diffuse band in the blot and is also often of reactions against cellular proteins overlaid. The recombinant fragment of gp41 used in the bacterial lysate, however, is in sufficient quantity available and also appears as a sharp band. An anti-gp41 reaction can probably be rated as specific for HIV-1 infection since there are no cross-reactions with related retroviruses. The significantly higher sensitivity of the recombinant gp41 can be seen as the decisive improvement of this test.

Das vorgestellte Verfahren verbindet die Vorteile des bisher benutzten Western Blots, die in der Darstellung einer Reaktion als spezifische Bande liegt, mit der von rekombinant produzierten Antigenen, die sehr kostengünstig sind, ohne Aufreinigung hier eingesetzt werden können, sensitiver sind und von unspezifischen Reaktionen unterschieden werden können.The method presented combines the advantages of the Western blot used previously, which in the Representation of a reaction as a specific band, with that of recombinantly produced Antigens, which are very inexpensive and can be used here without purification, are more sensitive are and can be distinguished from non-specific reactions.

Die eben geschilderten Vorteile dieses Systems können jedoch auch auf andere Bereiche von serologischer Diagnostik angewendet werden. Voraussetzung ist dabei lediglich, daß rekombinante Bakterienklone vorliegen, die relevante Antigene in ausreichend großer Menge als unfusionierte Proteine produzieren. However, the advantages of this system just described can also be applied to other areas of serological diagnostics can be used. The only requirement is that recombinant Bacterial clones are present, the relevant antigens in sufficient quantities as unfused Produce proteins.

Brief description of the pictures Fig. 1 Genome and coding regions of HIV 1

Der obere Teil stellt das über 9000 bp lange Genom von HIV 1 mit den beiden LTR's dar. Im unteren Teil die Lage der Protein-kodierenden Bereiche, sowie die nach Spaltung entstehenden Produkte.The upper part represents the over 9000 bp long genome of HIV 1 with the two LTRs. Im lower part, the position of the protein-coding areas, as well as those arising after cleavage Products.

Fig. 2 pUC plasmids, polycloning site and reading frame

Im unteren Teil ist der für alle ca. 2,7 kb großen pUC-Plasmide gleiche Aufbau gezeichnet mit dem "Origin of replication" (ori), dem β-Laktamase-Gen (Ap^R), dem lac-Promotor und Operator (lacPO) sowie dem lacZα-kodierenden Bereich (Balken). Am 5′-Ende dieser Sequenz befinden sich die Insertionsstellen mit den für die einzelnen Vektoren unterschiedlichen Restriktionsenzyme. Diese sowie die sich daraus ergebenden Leserahmen mit den Aminosäuresequenzen sind im oberen Teil aufgeführt. Die Translation des von lacP gestarteten Transkrips beginnt mit dem ATG am linken Ende der Sequenzen.In the lower part, the structure identical for all approx. 2.7 kb pUC plasmids is drawn with the "Origin of replication" (ori), the β- lactamase gene (Ap ^R ), the lac promoter and operator (lacPO ) and the lacZ α coding area (bar). At the 5'-end of this sequence are the insertion sites with the different restriction enzymes for the individual vectors. These and the resulting reading frames with the amino acid sequences are listed in the upper part. The translation of the transcript started by lacP begins with the ATG at the left end of the sequences.

Fig. 3 gp41 coding region and expressed segment

Im oberen Teil ist das 160 kDa große env-Produkt als Balken eingezeichnet mit den Transmembranregionen (TM), von denen die rechte wahrscheinlich für die Verankerung in der Zellmembran sorgen, während die beiden linken mehr hypothetisch sind und eventuell bei der Fusion beteiligt sind. Darunter ist die Lage einiger Restriktionsenzyme angegeben (B, BglII; R, RsaI; P, PstI). Der ganz unten eingezeichnete Balken gibt die Lage des für die Expression verwendeten RsaI-RsaI Fragments an.The 160 kDa env product is shown in the upper part as a bar with the Transmembrane regions (TM), the right one of which is likely to be anchored in the Cell membrane worry, while the left two are more hypothetical and possibly in the Merger are involved. The location of some restriction enzymes is shown below (B, BglII; R, RsaI; P, PstI). The bar at the bottom shows the position of the for expression used RsaI-RsaI fragments.

Fig. 4 DNA and amino acid sequence of pUC18RRstop

Der Computerdruck listet die für die Expression von rekombinanten gp41 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt. Das synthetische Desoxyoligonuleotid ist als PstI/HindIII-Fragment zwischen bp 540 und 590 inseriert worden und beinhaltet Translationsstops in allen drei Rastern bis zu der Bgl-II-Stelle und danach einen Transkriptionsstop.Computer printing lists the sequences of the plasmid relevant for the expression of recombinant gp41. The start is at the start of translation of the pUC vector (see FIG. 2), the start and end of the HIV-1 sequences and the translation stop are shown; In addition, some restriction enzyme sites important for characterization are listed. The synthetic deoxyoligonuleotide was inserted as a PstI / HindIII fragment between bp 540 and 590 and contains translation stops in all three frames up to the Bgl-II site and then a transcription stop.

Fig. 5 gag coding region with p17 and p24 expressed regions

Im oberen Teil ist als Balken der 55 kDa große gag-Vorläufer mit den einzelnen Teilen, p17, p24 und p15 eingezeichnet; darunter die Lage einiger Restriktionsenzym-Stellen (X, XmnI; P, PvuII; HindIII, B, BglII). Die für die Expression klonierten Bereiche sind als dünne Balken ganz unten eingezeichnet.In the upper part, the 55 kDa gag precursor with the individual parts, p17, plotted p24 and p15; including the location of some restriction enzyme sites (X, XmnI; P, PvuII; HindIII, B, BglII). The areas cloned for expression are whole as thin bars shown below.

Fig. 6 DNA and amino acid sequence of pUC9HPvBg10

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten p24 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen mit den kodierenden Bereichen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym-Stellen aufgeführt. Die Fusion des Tandem-Inserts bei Basenpaar 983 erfolgte wahrscheinlich durch eine Ligierung bei der das Bgl-II-"sticky end" als "blunt end" wirkte, indem zuerst das 3′-zurückstehende Ende mit dem PvuII-Ende verknüpft wurde. Die Verbindung des zweiten Strangs mit dem zuvor nötigen Abbau des 5′-überstehenden Bgl-II-Endes wurde dann von der E. coli-DNA-Polymerase nach der Transformation besorgt.The computer printout lists the sequences of the plasmid relevant for the expression of recombinant p24. The start is at the translation start of the pUC vector (see FIG. 2), the beginning and the end of the HIV-1 sequences with the coding regions and the translation stop are shown; In addition, some restriction enzyme sites important for characterization are listed. The fusion of the tandem insert at base pair 983 was probably carried out by a ligation in which the Bgl-II "sticky end" acted as a "blunt end" by first connecting the 3′-back end to the PvuII end. The connection of the second strand with the previously required degradation of the 5'-protruding Bgl-II end was then carried out by the E. coli DNA polymerase after the transformation.

Fig. 7 DNA and amino acid sequence of pUC18Xmnstop

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten p17 relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt. Das synthetische Desoxyoligonuleotid ist als PstI/HindIII-Fragment zwischen bp 480 und 540 inseriert worden und beinhaltet Translationsstops in allen drei Rastern bis zu der Bgl-II-Stelle und danach einen Transkriptionsstop. The computer printout lists the sequences of the plasmid relevant for the expression of recombinant p17. The start is at the start of translation of the pUC vector (see FIG. 2), the start and end of the HIV-1 sequences and the translation stop are shown; In addition, some restriction enzyme sites important for characterization are listed. The synthetic deoxyoligonuleotide was inserted as a PstI / HindIII fragment between bp 480 and 540 and contains translation stops in all three frames up to the Bgl-II site and then a transcription stop.

Fig. 8 Pol-coding region with expressed segment

Oben ist der pol-kodierende Bereich (pol-ORF) mit seinen nach Prozessierung entstehenden Bestandteilen, Protease (PRT), reverse Transkriptase (RT, 66 und 51 kDa) und Integrase (INT) gezeichnet; sowie darunter einige Restriktionsschnitt-Stellen (B, BglII; H, HincII; K, KpnI; E, EcoRI). Der untere dünne Balken gibt die Lage und Ausdehnung des in pUC19BgE exprimierten Segments an.At the top is the pole-coding area (pole-ORF) with its created after processing Ingredients, protease (PRT), reverse transcriptase (RT, 66 and 51 kDa) and integrase (INT) drawn; as well as some restriction sites (B, BglII; H, HincII; K, KpnI; E, EcoRI). The lower, thin bar shows the position and extent of what is expressed in pUC19BgE Segments.

Fig. 9 DNA and amino acid sequence of pUC19EBg

Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten pol relevanten Sequenzen des Plasmids auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtigen Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt.The computer printout lists the sequences of the plasmid relevant for the expression of recombinant pol. The start is at the start of translation of the pUC vector (see FIG. 2), the start and end of the HIV-1 sequences and the translation stop are shown; In addition, some restriction enzyme sites important for characterization are listed.

Fig. 10 DNA and amino acid sequence of pUC19RRPvBg

Der Computerausdruck listet die für die relevanten Sequenzen des Plasmids für die Expression des gp41/p24-Fusionsprodukts auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (siehe Abb. 2), der Anfang und das Ende der HIV-1-Sequenzen sowie der Translationsstop sind eingezeichnet; daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtige Restriktionsenzym- Stellen aufgeführt.The computer printout lists the relevant sequences of the plasmid for the expression of the gp41 / p24 fusion product. The start is at the start of translation of the pUC vector (see FIG. 2), the start and end of the HIV-1 sequences and the translation stop are shown; In addition, some restriction enzyme sites important for characterization are listed.

Fig. 11 Reactivity of the HIV-1 expression products

Die in Beispiel 1 bis 5 beschriebenen Bakterienklone mit den jeweiligen Plasmiden wurden, wie in Beispiel 6 aufgeführt, induziert, durch 17,5%ige (Spuren 1-4) oder 15%ige (5 + 6) PAGE aufgetrennt, elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferriert und mit einem hochtitrigen anti-HIV 1 Serum inkubiert und immun-gefärbt.The bacterial clones described in Examples 1 to 5 with the respective plasmids were as listed in Example 6, induced by 17.5% (lanes 1-4) or 15% (5 + 6) PAGE separated, electrophoretically transferred to nitrocellulose and with a high-titer anti-HIV 1 Serum incubated and immunostained.

Fig. 12 Reactivity of different sera with the E. coli expression products

SDS-17%ige PAGE mit 6 × 6 cm Gelgröße wurden mit je 5 µl der in Beispiel 6 beschriebenen Lysate beladen, elektrophoretisiert und nach Western Blot mit verschiedenen Seren immun-gefärbt. SDS-17% PAGE with 6 × 6 cm gel size were each with 5 μl of that described in Example 6 Load lysates, electrophoresed and immunostained with various sera after Western blot.

Der Auftrag erfolgte von links nach rechts in folgender Reihenfolge: p24 (pUC9HPvBg10), p24/gp41 (pUC19RRPvBg), gp41 (pUC18RRstop), p17 (pUC18Xmnstop) und pol (cl- Fusionskonstrukt pMFpol).The order was placed from left to right in the following order: p24 (pUC9HPvBg10), p24 / gp41 (pUC19RRPvBg), gp41 (pUC18RRstop), p17 (pUC18Xmnstop) and pol (cl- Fusion construct pMFpol).

Fig. 13 Reactivity of questionable positive sera

Versuchsanordnung und Durchführung wie Abb. 13, jedoch mit Seren aus der HIV-Diagnostik, bei denen aus verschiedensten Gründen aufgrund der Western Blot-Ergebnisse keine eindeutige Aussage möglich war. Aufgrund der hier gezeigten Ergebnisse lassen sich alle Seren eindeutig bestimmen (bis auf G10 239 alle positiv).Experimental set-up and implementation as in Fig. 13, but with sera from HIV diagnostics, in which, for a variety of reasons, no clear statement was possible due to the Western blot results. Based on the results shown here, all sera can be clearly determined (all positive except G10 239).

Fig. 14 Reactivity of questionable positive sera

Wie Abb. 13, jedoch wurden hier nur p24, p24/gp41 und gp41 als Antigen aufgetragen, außerdem erfolgte die Auftrennung in Gelen mit 12 cm Laufstrecke. Es soll hier demonstriert werden, daß die Verwendung von nur drei Antigenen völlig ausreichend ist.As in Fig. 13, but only p24, p24 / gp41 and gp41 were applied as antigen, in addition the separation was carried out in gels with a 12 cm running distance. It should be demonstrated here that the use of only three antigens is completely sufficient.

Fig. 15 Application of the test principle for EBV serology

Testdurchführung wie Abb. 13 und 14, jedoch wurden hier ungereinigte Bakterienlysate mit rekombinant produzierten EBV-Antigenen verwendet und die Reaktion gegen diese von vier Seren bestimmt, wobei jeweils zusätzlich die IgG, die IgA und IgM spezifische Reaktion bestimmt wurde. M. Molekulargewichtsmarker, 1, negatives E. coli-Lysat; 2, p138 (pUCARG1140); 3, EBNA 1 (pUC8KSH1,2); 4, p54 (pUC9MBcE3,2); 5, p150 (pUR288CXH580); 6, gp350 (pURLP1,9); 7, gp350 (pUCLP1,9). Die Immunglobulin-Klassen spezifische Bestimmung wurde mittels Peroxidase- konjugierter zweiter Antikörper bestimmt, die gegen humanes IgG, IgA oder IgM gerichtet waren.The test was carried out as in FIGS. 13 and 14, but here unpurified bacterial lysates with recombinantly produced EBV antigens were used and the reaction against them was determined from four sera, the IgG, the IgA and IgM-specific reaction being additionally determined. M. molecular weight marker, 1, negative E. coli lysate; 2, p138 (pUCARG1140); 3, EBNA 1 (pUC8KSH1.2); 4, p54 (pUC9MBcE3.2); 5, p150 (pUR288CXH580); 6, gp350 (pURLP1.9); 7, gp350 (pUCLP1.9). The immunoglobulin class-specific determination was determined using peroxidase-conjugated second antibodies which were directed against human IgG, IgA or IgM.

Example 1 Construction of expression plasmids for gp41

Von env-Gen wurde das in Abb. 3 dargestellte Segment für eine Expression in JM109 verwendet. Es handelt sich dabei nach der gängigen Vorstellung um den extrazellulären Bereich dieses Transmembranproteins ohne den N-terminalen Bereich, der wie schon erwähnt hydrophobe Segmente aufweist. Im Vergleich zu anderen gentechnologisch produzierten gp41-Segmenten reicht die hier benutzte Sequenz bis in die Transmembranregion und sollte damit mehrere Epitope abdecken.The segment shown in FIG. 3 of env gene was used for expression in JM109. According to the common notion, this is the extracellular region of this transmembrane protein without the N-terminal region, which, as already mentioned, has hydrophobic segments. Compared to other genetically engineered gp41 segments, the sequence used here extends into the transmembrane region and should cover several epitopes.

Hierzu wurde das Plasmid pWMJI/env, welches einem Genomteil des schon oben angesprochenen HIV-1-Isolats WMJI mit dem env-Gen trägt, mit PstI und BglII verdaut, eine 1,0 kb-Bande isoliert und in die entsprechenden Stellen des Vektors pUC18 (Abb. 2) inseriert. (Bei diesen und allen folgenden Prozeduren wurde nach den üblichen und oft beschriebenen Methoden vorgegangen, z. B. Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J.: Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1982), Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurde wie von den Herstellern beschrieben eingesetzt.) Von dem so entstandenen Plasmid pUC18BgP1,0 wurde das HIV-1-Insert als EcoRI-PstI Fragment wiederum isoliert und mit RsaI verdaut. Ein daraus resultierendes 486 bp-Fragment wurde nach Isolation in die HincII-Stelle von pUC18 kloniert. Dieses Segment kodiert nun von Aminosäure (aa) 530 bis 692 von gp160 oder von aa28 bis 190 von gp41. Bei dieser Klonierung wurde das Insert in beiden Orientierungen erhalten, die Charakterisierung erfolgte durch Spaltung mit EcoRI und AvrII. pUC18RR enthält das RsaI-RsaI Segment in derselben 5′-3′-Orientierung wie das vom lac-Promotor gestartete Transkript. Der Leserahmen am 5′-Ende stimmt mit dem des lacZα-kodierenden Transkripts überein. Bei pUC18RR sitzt das Insert in der anderen Orientierung.For this purpose, the plasmid pWMJI / env, which carries a genome part of the HIV-1 isolate WMJI mentioned above with the env gene, was digested with PstI and BglII, a 1.0 kb band was isolated and into the corresponding sites of the vector pUC18 ( Fig. 2). (These and all of the following procedures were carried out according to the usual and often described methods, e.g. Maniatis, T., Fritsch, EF and Sambrook, J .: Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1982), restriction enzymes and T4 DNA ligase were used as described by the manufacturers.) The HIV-1 insert was again isolated as an EcoRI-PstI fragment from the resulting plasmid pUC18BgP1.0 and digested with RsaI. A resulting 486 bp fragment was cloned into the HincII site of pUC18 after isolation. This segment now codes from amino acid (aa) 530 to 692 from gp160 or from aa28 to 190 from gp41. In this cloning, the insert was obtained in both orientations, and the characterization was carried out by cleavage with EcoRI and AvrII. pUC18RR contains the RsaI-RsaI segment in the same 5′-3′-orientation as the transcript started by the lac promoter. The reading frame at the 5'-end agrees with that of the lacZ α -coding transcript. With pUC18RR, the insert is in the other orientation.

Von pUC18RR wurde das gp41-Segment wiederum nach EcoRI und PstI Verdau isoliert und in die entsprechenden Stellen von pUC18stop inseriert. Dieser Vektor weist 3′ der PstI-Stelle ein sythetisches Oligodesoxynukleotid mit Translations- und Transkriptions-Stopsignalen auf.The gp41 segment was isolated from pUC18RR again after EcoRI and PstI digestion and in the corresponding positions are advertised by pUC18stop. This vector indicates 3 'of the PstI site synthetic oligodeoxynucleotide with translation and transcription stop signals.

Die DNA-Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge des Expressionsprodukts mit den wenigen pUC-kodierten fusionierten Aminosäuren sind in Abb. 4 gezeigt. The DNA sequence and the resulting amino acid sequence of the expression product with the few pUC-coded fused amino acids are shown in Fig. 4.

Example 2 Construction of expression plasmids for p24

In Abb. 5 ist der gag-kodierende Bereich von HIV 1 gezeigt. p24 wird von p17 und p15 flankiert. Für eine Subklonierung wurde das Plasmid pBH10-R3, welches das Genom des HIV-1-Isolats BH10 (Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, K. J., Starcich, B., Josephs, S. F., Doran, E. R., Rafalski, J. A., Whitehorn, E. A., Baumeister, K., Ivanoff, L., Petteway, S. R., Pearson, M. L., Lautenberger, J. A., Papas, T. S., Ghrayeb, J., Chang, N. T., Gallo, R. C. and Wong-Staal, F.: Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III, Nature, 313, (1985), 277-284) enthält, mit BglII und PvuII verdaut, ein 949 bp großes Fragment isoliert und in den mit HincII und BamHI linearisierten Vektor pUC9 inseriert. Nach Ligierung der HincII- mit der PvuII- "blunt ends", sowie der BglII mit der BamHI überstehenden Enden stimmt der Leserahmen mit dem vom lac- Promotor gestarteten Transkripts am 5′- und 3′-Ende des Inserts überein. Fig. 5 shows the gag coding region of HIV 1. p24 is flanked by p17 and p15. For subcloning, the plasmid pBH10-R3, which is the genome of the HIV-1 isolate BH10 (Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, KJ, Starcich, B., Josephs, SF, Doran , ER, Rafalski, JA, Whitehorn, EA, Baumeister, K., Ivanoff, L., Petteway, SR, Pearson, ML, Lautenberger, JA, Papas, TS, Ghrayeb, J., Chang, NT, Gallo, RC and Wong-Staal, F .: Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III, Nature, 313, (1985), 277-284) contains, digested with BglII and PvuII, isolated a 949 bp fragment and in the with HincII and BamHI linearized vector pUC9. After ligating the HincII- with the PvuII- "blunt ends" and the BglII with the BamHI protruding ends, the reading frame matches the transcript started by the lac promoter at the 5'- and 3'-end of the insert.

Darüber hinaus wurde ein Klon erhalten, bei dem das Insert zweifach in Tandem-Orientierung vorhanden ist (pUC9HPvBg10). Durch ein fehlerhaftes Verbinden des 3′-BglII-Endes mit einem 5′- PvuII-Ende ist diese Konstellation möglich geworden. Die Sequenz des Übergangs der beiden Insertionen wurde nach Subklonierung in m13-Phagen, Anlagerung eines "sequencing primers" und der Dideoyx-"chain-termination" Methode bestimmt. Aus den Sequenzierungsdaten geht hervor, daß die Translation einen Aminosäure-Codon nach den Übergang in das zweite Insert gestoppt wird. Die DNA-Sequenz mit diesem Übergang sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 6 gezeigt. Das rekombinante p24 besitzt 13 N-terminal fusionierte Aminosäuren von p17, sowie 59 Aminosäuren von p15 an seinem C-Terminus.In addition, a clone was obtained in which the insert is present twice in tandem orientation (pUC9HPvBg10). An incorrect connection of the 3'-BglII end with a 5'-PvuII end made this constellation possible. The sequence of the transition of the two insertions was determined after subcloning in m13 phages, addition of a "sequencing primer" and the Dideoyx "chain termination" method. The sequencing data indicate that the translation of one amino acid codon is stopped after the transition to the second insert. The DNA sequence with this transition and the resulting amino acid sequence is shown in Fig. 6. The recombinant p24 has 13 N-terminally fused amino acids from p17 and 59 amino acids from p15 at its C-terminus.

Example 3 Construction of an expression plasmid for p17

Wie in Abb. 5 gezeigt, wurde für die Subklonierung des p17-kodierenden Bereiches ein 424 bp langes Fragment durch XmnI-Verdau aus dem Plasmid pBH10-R3 isoliert und in die HincII-Stelle des Vektors pUC19 inseriert. Aufgrund der "blunt end"-Ligierung sind beide Orientierungen möglich. pUC19Xmn19 das Fragment in richtiger Orientierung und Leserahmen zum lac-Promotor, pUC19Xmn21 in der entgegengesetzten Orientierung. Von pUC19Xmn21 wurde erneut das HIV-1- Segment nach BamHI und PstI Verdau isoliert und in die entsprechenden Stellen von pUC18stop inseriert (pUC18Xmnstop). Die DNA-Sequenz des relevanten Bereichs sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 7 gezeigt.As shown in Fig. 5, for the subcloning of the p17 coding region, a 424 bp long fragment was isolated from the plasmid pBH10-R3 by XmnI digestion and inserted into the HincII site of the vector pUC19. Both orientations are possible due to the "blunt end" ligation. pUC19Xmn19 the fragment in the correct orientation and reading frame to the lac promoter, pUC19Xmn21 in the opposite orientation. The HIV-1 segment was again isolated from pUC19Xmn21 after BamHI and PstI digestion and inserted into the corresponding sites of pUC18stop (pUC18Xmnstop). The DNA sequence of the relevant region and the resulting amino acid sequence are shown in Fig. 7.

Example 4 Construction of an expression plasmid for pol

Von dem Plasmid pBH10-R3 wurde ein 2787 bp langes Fragment nach BglII und EcoRI Verdau (Abb. 8) isoliert und in pUC19 inseriert. Der entstandene Klon, pUC19BgE, enthält nun die kodierende Region der Protease, der gesamten reversen Transkriptase, sowie 121aa der Integrase. Die DNA Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge mit den Übergängen von und in den lacZa-Bereich ist in Abb. 9 gezeigt.A 2787 bp fragment from the plasmid pBH10-R3 was isolated after BglII and EcoRI digestion ( FIG. 8) and inserted into pUC19. The resulting clone, pUC19BgE, now contains the coding region of the protease, the entire reverse transcriptase, and 121aa of the integrase. The DNA sequence and the resulting amino acid sequence with the transitions from and into the lacZ a region are shown in Fig. 9.

Example 5 Construction of an expression plasmid for a protein fused from gp41 and p24

Das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pUC18RR-, welches das RsaI-RsaI-Fragment von gp41 in minus-Orientierung relativ zum lac-Promotor enthält, wurde mit HindIII geschnitten und das dabei entstehende 318 bp lange Fragment in die HindIII-Stelle von pUC19 inseriert. Durch Verdau mit PstI wurde die Orientierung der entstandenen Klone getestet und davon einer weiter verwendet, bei dem der gp41-Leserahmen dieselbe Orientierung hatte, wie das lacZ-Transkript des Vektors (pUC19RR). Dieses Plasmid wurde mit HindIII partiell geschnitten und die lineare Form nach Gelelektrophorese isoliert. Durch erneuten Verdau mit EcoRI und Isolierung des DNA- Fragments in der Größe der linearen Form ist nun ein Vektor entstanden, der das gp41-kodierende Fragment mit einer 3′-terminalen HindIII-Stelle noch enthält, während das andere Ende ein EcoRI-Ende besitzt.The plasmid pUC18RR- described in Example 1, which contains the RsaI-RsaI fragment of gp41 containing in minus orientation relative to the lac promoter was cut with HindIII and that resulting 318 bp fragment inserted into the HindIII site of pUC19. Through digestion the orientation of the resulting clones was tested with PstI and one more of them in which the gp41 reading frame had the same orientation as the lacZ transcript of the Vector (pUC19RR). This plasmid was partially cut with HindIII and the linear form isolated after gel electrophoresis. By digesting again with EcoRI and isolating the DNA Fragments the size of the linear form has now been created as a vector which encodes the gp41 Fragment with a 3'-terminal HindIII site still contains one while the other end Has EcoRI end.

Das in Beispiel 2 beschriebene Plasmid pUCHPvBg10, welches das p24-kodierende PvuII-BglII Fragment in Tandem-Orientierung enthält, wurde mit EcoRI linearisiert und anschließend mit HindIII partiell verdaut. Ein dabei entstehendes ca. 1,8 kb großes Fragment, welches dem gesamten Tandem-Insert entspricht, wurde isoliert und in den oben beschriebenen EcoRI und HindIII geschnittenen Vektor pUC19RR inseriert. Das entstehende Plasmid, pUCRRPvBg, enthält nun 3′ des lac-Promotors das RsaI-HindIII Fragment von gp41 gefolgt von dem p24-Tandem-Insert im richtigen Leserahmen. Die DNA-Sequenz sowie die daraus resultierende Aminosäureabfolge ist in Abb. 10 aufgeführt. The plasmid pUCHPvBg10 described in Example 2, which contains the p24-encoding PvuII-BglII fragment in tandem orientation, was linearized with EcoRI and then partially digested with HindIII. A resulting approximately 1.8 kb fragment, which corresponds to the entire tandem insert, was isolated and inserted into the vector pUC19RR cut EcoRI and HindIII described above. The resulting plasmid, pUCRRPvBg, now contains 3 'of the lac promoter, the RsaI-HindIII fragment of gp41 followed by the p24 tandem insert in the correct reading frame. The DNA sequence and the resulting amino acid sequence are shown in Fig. 10.

Example 6 Determination of the reactivity of human sera against the recombinant HIV-1 antigens

Von den in Beispiel 1 bis 5 beschriebenen Bakterienklonen mit den Plasmiden für p24-, gp41-, p17-, pol- und gp41/p24-Expression wurde jeweils eine 5-ml-Flüssigkeit mit L-Broth/Ampicillin (50 µg/ml) über Nacht bei 37°C gewachsen und dann in einen 250-ml-Schüttelkolben mit 100 ml L-Broth/ Ampicillin-Medium überführt. Die Kultur bei 37°C im Schüttelinkubator gehalten bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht hatte. Bei diesem Zeitpunkt wurde mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM induziert und anschließend die Kultur für weitere 2,5 h intensiv geschüttelt.Of the bacterial clones described in Examples 1 to 5 with the plasmids for p24-, gp41-, p17, pol and gp41 / p24 expression were each a 5 ml liquid with L-broth / ampicillin (50 µg / ml) grown overnight at 37 ° C and then in a 250 ml shake flask with 100 ml L-Broth / Ampicillin medium transferred. The culture is kept at 37 ° C in the shaking incubator until the Bacteria suspension had reached an optical density at 600 nm of 0.7. At this time was induced with IPTG at a final concentration of 1 mM and then the culture for shaken vigorously for a further 2.5 h.

Anschließend erfolgte eine Pelletierung der Bakterien in einem SS34-Rotor bei 6000 rpm in 10 min bei 4°C und ein Resuspendieren in 10 ml "boiling mix" (20% Saccharose, 2% SDS, 5% Mercaptoethanol, 2% Bromphenolblau, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Die Suspension wurde in 500 µl Fraktionen in Eppendorf-Hütchen aliquotiert, für 10 min bei 100°C erhitzt und die Lysate schließlich bei -20°C gelagert.The bacteria were then pelleted in an SS34 rotor at 6000 rpm in 10 min at 4 ° C and resuspending in 10 ml "boiling mix" (20% sucrose, 2% SDS, 5% Mercaptoethanol, 2% bromophenol blue, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5). The suspension was in 500 ul Fractions in Eppendorf cones aliquoted, heated for 10 min at 100 ° C and the lysates finally stored at -20 ° C.

Eine Auftrennung der Proteine der Lysate erfolgte durch SDS-Gelelektrophorese mit 17% Acrylamid, vernetzt mit DADT, entweder mit 6 × 6-m-Gelen oder großen Gelen mit 14 cm Länge. Dabei wurden jeweils 5 µl der Lysate nebeneinander aufgetragen und für 2-3 h elektrophoretisiert bis die Bromphenolblau-Bande ca. 1 cm vor den unteren Rand gewandert war. Anschließend wurden die Proteine durch Western Blotting auf Nitrocellulose transferiert und durch Poissant-Färbung sichtbar gemacht. Die Lage und Ausdehnung der zusammengehörenden Lysate wurde mit einem Stift markiert, durch Waschen mit TTBS (0,5 M NaCl, 0,05% Tween-20, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) die Proteine wieder entfärbt und der Filter für 2 h durch Inkubation mit Cohen-Puffer (1 mg/ml Ficoll-400, 1 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 16 mg/ml Rinder-Serumalbumin, 0,1% Nonidet-P40, 0,05% Gelatine, 170 mM Borat, 150 mM NaCl, pH 7,5) abgesättigt. HIV-1-positive oder -negative Seren wurden mit TTBS 1 : 100 oder 1 : 500 verdünnt und zusammen und mit den Filtern über Nacht bei leichtem Schütteln inkubiert. Aufgrund der zuvor erfolgten Markierung auf dem Filter, was ein genaues Ausschneiden der relevanten Bereiche zuläßt, reichen 5 ml eines verdünnten Serums völlig aus. Durch Waschen mit TTBS für 4 h und mehrmaligem Pufferwechsel wurden nicht gebundene Antikörper vom Filter entfernt und dann mit einem zweiten Antikörper für 2 h inkubiert. Es wurde dabei ein anti-human-IgG-Antikörper aus Kaninchen verwendet, der mit Peroxidase konjugiert ist. Durch intensives Waschen mit TTBS für 1 h mit sechsmaligem Pufferwechsel wurden dann nicht gebundene Antikörper entfernt und anschließend die Färbereaktion ausgeführt. Dazu wurde der Filter in eine Lösung aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mg/ml Diaminobenzidin und 0,5 µl/ml 30% H₂O₂ gegeben, nach dem Erreichen der gewünschten Färbereaktion mit Wasser gut gespült und auf einem Filter getrocknet. Abb. 11 zeigt die Expressionsprodukte der verschiedenen Klone, angefärbt mit einem hoch-titrigen HIV-1-Serum. Das rekombinante p24 besitzt, wie aufgrund der Sequenz zu erwarten war, ein Molekulargewicht von ca. 34 kDa und wird in ungewöhnlich großen Mengen gemacht (ca. 15-20% des Gesamtproteins, geschätzt nach Coomassie-blau Anfärbung des SDS- Gels). Das Fusionskonstrukt aus p24 und gp41 ist ca. 47 kDa groß, stellt ca. 2-5% des Gesamtproteins dar und wird teilweise wieder proteolytisch abgebaut und/oder nicht vollständig translatiert, was sicherlich an der für E. coli-Expression kritischen Größe von über 40 kDa für ein eukaryotisches Nicht-Fusionsprotein liegt. gp41 mit einem Molekulargewicht von ca. 17 kDa wird in etwas geringerer Menge produziert, reagiert aber sehr stark als eine scharf begrenzte Bande. Das rekombinante p17 wird relativ stark exprimiert (ca. 2-5% des Gesamtproteins) und besitzt eine Größe von ca. 20 kDa. Das rekombinante pol-Produkt von pUC19BgE tritt in zwei Formen mit ca. 66 und 51 kDa auf; offensichtlich ist der Protease-Anteil am N-Terminus nach E. coli-Expression noch aktiv. pMFpol exprimiert ein Produkt von über 80 kDA, daß jedoch nicht sehr stabil ist und in kleinere Fragmente gespalten wird, die jedoch noch durchaus sehr reaktiv sind.The proteins of the lysates were separated by SDS gel electrophoresis with 17% acrylamide, crosslinked with DADT, either with 6 × 6 m gels or large gels with a length of 14 cm. 5 µl of the lysates were applied side by side and electrophoresed for 2-3 h until the bromophenol blue band had migrated about 1 cm in front of the lower edge. The proteins were then transferred to nitrocellulose by western blotting and visualized by poissant staining. The position and extent of the lysates belonging together were marked with a pen, the proteins were decolorized by washing with TTBS (0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5) and the filter for 2 h by incubation with Cohen buffer (1 mg / ml Ficoll-400, 1 mg / ml polyvinylpyrrolidone, 16 mg / ml bovine serum albumin, 0.1% Nonidet-P40, 0.05% gelatin, 170 mM borate, 150 mM NaCl, pH 7.5). HIV-1 positive or negative sera were diluted 1: 100 or 1: 500 with TTBS and incubated together and with the filters overnight with gentle shaking. Due to the previous marking on the filter, which allows an exact cutting out of the relevant areas, 5 ml of a diluted serum is completely sufficient. Unbound antibodies were removed from the filter by washing with TTBS for 4 h and repeated buffer changes and then incubated with a second antibody for 2 h. An rabbit anti-human IgG antibody conjugated to peroxidase was used. By washing intensively with TTBS for 1 h with six changes of buffer, unbound antibodies were then removed and the staining reaction was then carried out. For this purpose, the filter was placed in a solution of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mg / ml diaminobenzidine and 0.5 µl / ml 30% H₂O₂, rinsed well with water after reaching the desired coloring reaction and on dried in a filter. Fig. 11 shows the expression products of the different clones, stained with a high-titer HIV-1 serum. As expected from the sequence, the recombinant p24 has a molecular weight of approximately 34 kDa and is made in unusually large amounts (approximately 15-20% of the total protein, estimated after Coomassie blue staining of the SDS gel). The fusion construct from p24 and gp41 is approx. 47 kDa, represents approx. 2-5% of the total protein and is partially proteolytically broken down and / or not fully translated, which is certainly due to the size critical for E. coli expression 40 kDa for a non-fusion eukaryotic protein. gp41 with a molecular weight of approx. 17 kDa is produced in a somewhat smaller amount, but reacts very strongly as a sharply defined band. The recombinant p17 is expressed relatively strongly (approx. 2-5% of the total protein) and has a size of approx. 20 kDa. The recombinant pol product of pUC19BgE occurs in two forms with approx. 66 and 51 kDa; obviously the protease portion at the N-terminus is still active after E. coli expression. pMFpol expresses a product of over 80 kDA, which is however not very stable and is split into smaller fragments, which are, however, still very reactive.

Die ungewöhnlich hohe Expressionsausbeute von p24 bei pUC9HPvBg10 im Gegensatz zu Klonen, die das kodierende Fragment nur einmal inseriert haben (nicht gezeigt), dürfte höchstwahrscheinlich auf eine stabilere mRNA mit "loop"-Strukturen zurück zu führen sein. Diese "loop"-Strukturen nach dem Ende des ersten Inserts ergeben sich mit den Anfangssequenzen des zweiten Tandem-Teils; auf diese Erklärungsmöglichkeit soll jedoch nicht näher eingegangen werden.The unusually high expression yield of p24 in pUC9HPvBg10 in contrast to Cloning that inserted the coding fragment only once (not shown) is likely most likely due to a more stable mRNA with "loop" structures. These "Loop" structures after the end of the first insert result with the initial sequences of the second tandem part; however, this possibility of explanation should not be discussed in more detail will.

Abb. 12 zeigt einige, mit verschiedenen Seren inkubierte Nitrozellulose Blot-Streifen. Für die Austestung der Reaktivität wurden Seren aus der diagnostischen Abteilung des Max von Pettenkofer-Instituts, München, verwendet, die relativ gut charakterisiert waren. Als Ergebnis läßt sich festhalten, daß bei normal-titrigen Seren die Reaktivität und damit Sensitivität des hier vorgestellten Tests ohne Probleme HIV-1-positive Seren entdeckt. Fig. 12 shows some nitrocellulose blot strips incubated with different sera. Sera from the diagnostic department of the Max von Pettenkofer Institute, Munich, were used for testing the reactivity and were characterized relatively well. As a result, it can be stated that the reactivity and thus sensitivity of the test presented here easily detects HIV-1-positive sera in normal-titered sera.

Example 7 Sensitivity of the "lysate blot" in comparison with the conventional confirmation western blots

Als einer der Hauptvorteile des neuen Tests soll die erheblich bessere Sensitivität für anti-gp41- Antikörper heraus gestellt werden. Dabei wurde der in Beispiel 6 geschilderte Ablauf für Seren angewandt, die nach herkömmlicher Testung fraglich positiv blieben; sei es, weil keine anti- gp41-Reaktion im Western Blot zu finden war, oder aufgrund von unspezifischen Reaktionen unklar blieb.One of the main advantages of the new test is the significantly better sensitivity to anti-gp41 Antibodies are put out. The procedure described in Example 6 for sera applied that remained questionably positive after conventional testing; be it because no anti gp41 reaction was found in the Western blot, or due to non-specific reactions remained unclear.

Als Antigene wurden dabei die in Beispiel 6 verwendeten eingesetzt, teilweise aber auch nur p24, gp41 und die Fusion aus beiden. Falls nur drei Antigene verwendet wurden, erfolgte die Auftrennung in Gelen mit 12 cm Laufstrecke.The antigens used in Example 6 were used, but sometimes only p24, gp41 and the fusion of both. If only three antigens were used, the Separation into gels with a 12 cm running distance.

Abb. 13 und Abb. 14 zeigen jeweils als Beispiel die Reaktivität einiger dieser fraglichen Seren. In Tab. 1 und Tab. 2 sind die Ergebnisse der getesteten Seren zusammengefaßt und mit den Befunden der herkömmlichen Testung verglichen. Dabei ergibt sich eindeutig eine erhebliche Verbesserung der anti-gp41-Sensitivität, was in sehr vielen Fällen eine sichere Zuordnung als HIV-1-positiv zuläßt. Es war kein Serum zu finden, bei dem im herkömmlichen Western Blot eine (auch nur fragliche) anti-gp41-Reaktivität auftrat, die in dem neuen Test nicht zu reproduzieren war. Das Gegenteil war häufiger der Fall: In vielen Fällen konnte durch den neuen Ansatz eine anti-gp41- Reaktion nachgewiesen werden, die im herkömmlichen Test nicht gefunden worden war. Fig. 13 and Fig. 14 each show the reactivity of some of these sera in question as an example. The results of the sera tested are summarized in Table 1 and Table 2 and compared with the results of conventional testing. This clearly results in a significant improvement in the anti-gp41 sensitivity, which in many cases allows a reliable assignment as HIV-1 positive. There was no serum to be found which showed (even questionable) anti-gp41 reactivity in the conventional Western blot, which could not be reproduced in the new test. The opposite was more often the case: in many cases the new approach demonstrated an anti-gp41 reaction that was not found in the conventional test.

Daß trotzdem einige der Seren weiter unklar bleiben, liegt wohl an der anti-p24-Reaktion, die für sich alleine, wenn sie nicht sehr stark auftritt, entweder das Indiz für eine beginnende Serokonversion und frische Infektion spricht, oder aber bei nur schwacher Reaktion für Unspezifität gehalten werden muß. Dies ist umso wahrscheinlicher, wenn man miteinbezieht, daß dieses rekombinante p24 in sehr großer Menge exprimiert wird und damit auch bei nur sehr schwacher unspezifischer Bindung ein Signal hervorruft.That some of the sera still remain unclear is probably due to the anti-p24 reaction by itself, if it does not appear very strongly, either the indication of a beginning Seroconversion and fresh infection speaks for, or if there is only a weak reaction for Unspecificity must be kept. This is all the more likely if you include that this recombinant p24 is expressed in a very large amount and thus only in very weak unspecific binding produces a signal.

Bei sehr starker Reaktion und fehlenden anti-gp41-Titer ist ein solches Serum auf jeden Fall stark verdächtig; es handelt sich dann entweder um einen Serokonvertierer oder um eine andere retrovirale Infektion, eventuell HIV 2, da die gag-Proteine sehr stark konserviert sind. In the case of a very strong reaction and no anti-gp41 titer, such a serum is definitely strong suspicious; it is then either a seroconverter or another retroviral infection, possibly HIV 2, because the gag proteins are very well preserved.

Tabelle 1 Table 1

Zusammenfassung der getesteten, zum Teil fraglichen Seren und Vergleich mit den Ergebnissen der herkömmlichen Bestätigungstests Summary of the tested, partly questionable sera and comparison with the results of the conventional confirmation tests

Die erste Spalte gibt die Nummer, die Zweite die Benennung des Serums an. Spalten 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der herkömmlichen Western Blots (Vir. Blot), Spalte 3 die Reaktion mit gag und pol, Spalte 4 die mit gp41 oder gp120/160. In Spalte 5 ist die Reaktivität des Serums mit dem rekombinanten p24, in Spalte 6 die mit dem rekombinanten gp41 aufgelistet (Rek. Blot). Spalte 7 gibt die Diagnose aufgrund der Ergebnisse des rekombinanten Blots, und in Spalte 8 gegenübergestellt der Befund aufgrund des herkömmlichen Bestätigungs-Western Blots. The first column gives the number, the second the name of the serum. Columns 3 and 4 show the results of the conventional Western blots (Vir. Blot), column 3, the reaction with gag and pol, column 4 those with gp41 or gp120 / 160. Column 5 shows the reactivity of the serum with the recombinant p24, listed in column 6 with the recombinant gp41 (rec. blot). Column 7 gives the diagnosis based on the results of the recombinant blot, and in column 8 the results are compared with the conventional confirmation Western blot.

Tabelle 2 Table 2

Diagnose-Ergebnis im Vergleich mit Viralem Western Blot Diagnostic result compared to viral western blot

Bei den Tab. 1 zusammengefaßten Seren handelt es sich zum Teil um ausgesuchte seltene Seren, die in einem Western Blot zum Teil fraglich oder negativ blieben, obwohl andere Daten für eine Infektion sprachen (Finalstadium von AIDS).The serums summarized in Tab. 1 are selected rare sera, which in some cases remained questionable or negative in a Western blot, although other data for one Infection (final stage of AIDS).

Von den 16 nach dem vir. Blot sicher positiven konnten alle mit dem rek. Blot erkannt werden (1. Spalte). Von den 16 getesteten negativen Seren wurden dagegen 3 als positiv erkannt, da noch eine gp41-Reaktion stattgefunden hatte. Es handelt sich dabei um die Seren MB1519, G8099 und G1220. Von den nach der herkömmlichen Testung fraglichen Seren (18) blieben schließlich drei weiterhin fraglich, wobei ein Serum HIV-2-positiv war. Von den restlichen wurden 8 als negativ eingeordnet, obwohl, wie schon angesprochen zum Teil eine schwache p24-Reaktion auftrat, und immerhin 7 Seren waren durch die höhere Sensitivität als positiv einzuordnen (MB1503, MB1510, G9222, G10 431, G11 287, G7078 und G7187). Of the 16 after the vir. Blot sure positive could all with the rec. Blot can be detected (1st column). On the other hand, of the 16 negative sera tested, 3 were recognized as positive, as of yet a gp41 reaction had taken place. These are the sera MB1519, G8099 and G1220. Finally, three of the sera (18) in question after conventional testing remained still questionable, although one serum was HIV-2 positive. Of the rest, 8 were considered negative classified, although, as already mentioned, a weak p24 reaction sometimes occurred, and after all, 7 sera were classified as positive due to the higher sensitivity (MB1503, MB1510, G9222, G10 431, G11 287, G7078 and G7187).

Example 8 Use of the test principle for other recombinantly produced antigens

Generell läßt sich das hier vorgestellte Prinzip auch für andere Diagnostik-Verfahren, bei denen Antikörper bestimmt werden, einsetzen. Voraussetzung dabei ist, daß die jeweiligen Antigene in Bakterien als unfusionierte Proteine gentechnologisch produziert werden können. Analog zu dem vorgestellten HIV-1-Bestätigungstest werden auch hier mehrere rekombinant produzierte Antigene nebeneinander durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und können dann im Test eingesetzt werden. Der Vorteil hier ist wiederum, daß keinerlei Aufreinigung nötig ist, was den Test extrem billig hält und gleichzeitig eine Kontrolle von bakteriellen, unspezifischen Reaktionen erlaubt. Als ein Beispiel soll hier die Verwendung von Lysaten mit rekombinant produzierten Epstien-Barr-Virus(EBV)-Proteinen gezeigt werden. Bei Abb. 15 handelt es sich um eine Anzahl von Western Blots, mit denen vier verschiedene Seren auf den anti-EBV-Titer getestet wurden (EBV-negativ, frische Infektion-infektöse Mononukleose, EBV-positiv und NPC Nr. 359-Serum eines Patienten mit Nasopharynx-Carcinom). Zusätzlich ist in diesem Beispiel noch die Möglichkeit gezeigt, zwiscchen IgG, IgA und IgM zu unterscheiden, was bei der EBV-Serologie von Wichtigkeit ist, speziell bei der Frühdiagnose von NPC, wo charakteristischerweise der IgA-Titer gegen spezielle EBV-Antigene ansteigt. Die Bedeutung der einzelnen Antigene für die Diagnose, die Klonierung der entsprechenden DNA-Sequenzen sowie die gentechnologische Produktion ist ausführlich in den beiden Patentanträgen, Chin. Pat.: 8 61 00 441 (Method for the differential in vitro diagnosis of EBV-related diseases) und EP 8 51 10 565.0 (DNA sequences of the EBV genome, recombinant DNA molecules, process for producing EBV-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions of said antigens), dargestellt.In general, the principle presented here can also be used for other diagnostic methods in which antibodies are determined. The prerequisite for this is that the respective antigens can be genetically engineered in bacteria as unfused proteins. Analogous to the HIV-1 confirmation test presented here, several recombinantly produced antigens are separated next to one another by gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose and can then be used in the test. The advantage here is again that no purification is necessary, which makes the test extremely cheap and at the same time allows control of bacterial, non-specific reactions. As an example, the use of lysates with recombinantly produced Epstien-Barr virus (EBV) proteins is to be shown here. Fig. 15 is a number of Western blots used to test four different sera for anti-EBV titer (EBV-negative, fresh infection-infectious mononucleosis, EBV-positive and NPC No. 359 serum one) Patients with nasopharyngeal carcinoma). In addition, this example also shows the possibility of distinguishing between IgG, IgA and IgM, which is important in EBV serology, especially in the early diagnosis of NPC, where the IgA titer against specific EBV antigens typically increases. The importance of the individual antigens for diagnosis, the cloning of the corresponding DNA sequences and the genetic engineering production is detailed in the two patent applications, Chin. Pat .: 8 61 00 441 (Method for the differential in vitro diagnosis of EBV-related diseases) and EP 8 51 10 565.0 (DNA sequences of the EBV genome, recombinant DNA molecules, process for producing EBV-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions of said antigens).

Wie bei den Blotstreifen mit den HIV-1-Antigenen lassen sich auch hier problemlos spezifische Reaktionen identifizieren.As with the blot strips with the HIV-1 antigens, specific ones can also be easily produced here Identify reactions.

Claims

1. DNA sequences, characterized in that they coding regions of HIV 1 or HIV 2 include.

2. Expression plasmids with HIV-1 and HIV-2 sequences according to claim 1, the one Production of diagnostically relevant HIV-1 antigens in E. coli cells as non- Allow fusion proteins.

3. Test approaches that take advantage of recombinant DNA technology with those of, for example Connect the western blots previously used in HIV-1 diagnostics for confirmation and quickly Introduction of safe serological tests for viral and microbiological pathogens.

4. A DNA sequence according to claim 2 which is in the recombinant plasmid pUC9HPvBg10 in the manner described and shown is included and their transcription and Translation causes the production of a p24-analogous antigen.

5. A DNA sequence according to claim 2 which is in the recombinant plasmid pUC18RRstop in the manner described and shown is included and its transcription and Translation causes the production of a gp41-analogous antigen.

6. A DNA sequence according to claim 2 which is in the recombinant pUC18Xmnstop in the manner described and shown is included and its transcription and Translation causes the production of a p17 analog antigen.

7. A DNA sequence according to claim 2, which in the recombinant plasmid pUC19EBg and is contained in the plasmid pMFpol in the manner described and shown and their Transcription and translation causes the production of a pol-analog antigen.

8. A DNA sequence according to claim 2 which is in the recombinant plasmid pUC19RRPvBg in the manner described and shown is included and their transcription and Translation causes the production of an antigen which simultaneously epitopes gp41 and p24 carries.

9. A test approach in which recombinantly produced HIV-1 or HIV-2 antigens are used accordingly Claim 2 or the antigens mentioned in claims 3 to 8 or those for their expression responsible plasmids can be used by bacterial lysates of these clones Gel electrophoresis can be separated and onto nitrocellulose or other protein-binding supports be transferred. After incubation of the nitrocellulose strip with patient serum bound antibodies by a second, peroxidase-conjugated, anti-human antibody and Peroxidase reaction or an analog system (e.g. phosphatase staining) detected.

10. A test approach analogous to claim 9, but in contrast to this only with three Antigens or their expression plasmids (pUC9PvBg10, pUC18RRstop, pUC19RRPvBg).

11. The method of interpreting the results, where it is completely irrelevant that unpurified bacterial lysates are used and that nonspecific reactions with bacterial proteins occur; as well as that in comparison with the conventional confirmation test significantly improved control options by using multiple tracks Antigen in which the neighboring track is used as a negative control.

12. The significantly improved sensitivity for the particularly important in a diagnosis Antibodies against gp41, which only allow the use of an additional antigen (p24); such as which is orders of magnitude cheaper than conventional confirmation tests Manufacturing.