DE3800233A1 - Methods for the production, by genetic manipulation, of a recombinant enzymatically active HIV-specific protease and the precursor molecules of the group-specific antigens (gag) and of the polymerase (pol) and use of these products in mixtures for testing HIV protease-specific inhibitors - Google Patents

Methods for the production, by genetic manipulation, of a recombinant enzymatically active HIV-specific protease and the precursor molecules of the group-specific antigens (gag) and of the polymerase (pol) and use of these products in mixtures for testing HIV protease-specific inhibitors

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Abstract

This invention comprises the simple and non-hazardous possibility of testing the activity of specific protease inhibitors, both in vitro and in vivo, with the aid of enzyme and substrate produced by genetic manipulation. This invention describes the production, by genetic manipulation, of polypeptide precursor molecules (gag precursor molecule and pol precursor molecule) as well as the expression of an enzymatically active HIV protease. The use of the said proteins in both in vitro mixtures (as protein extracts) and in vivo mixtures (expression in prokaryotic or eukaryotic cells) permits the effect of specific inhibitors on HIV protease to be determined in simple test mixtures. At the same time, the test mixtures described can be used to check the penetration of such substances into cells. The described test mixtures use exclusively HIV-authentic protein sequences. This makes it possible to avoid the elaborate and not entirely non-hazardous purification of corresponding proteins from virus-infected cell cultures or isolated virus particles.

Description

Als ein Vertreter der humanen erworbenen Immundefizienz (AIDS) sowie deren Vorstadien wurde ein Retrovirus ermittelt, dessen verschiedene Isolate zunächst "humanes T- lymphotropes Retrovirus III (HTLV III), Lymphadenopathie-Virus (LAV) oder AIDS- assoziertes Retrovirus (ARV) benannt wurden, die aber inzwischen unter dem Sammelbegriff HIV (Humanes Immundefiziens Virus) vereinigt wurden. Die komplette genetische Information einer Reihe verschiedener Isolate ist inzwischen bestimmt worden (z. B. Ratner et al, Nature, 313, (1985), 277-284; Wain-Hobson et al, Cell, 40, (1985), 9-17; Muesing et al, Nature 313, (1985), 450-458; Sanchez-Pescador et al, Science, 277, (1985), 484-492; Guyader et al, Nature, 326, (1987), 662-669).As a representative of human acquired immunodeficiency (AIDS) and its pre-stages a retrovirus was identified, the various isolates of which were initially "human T- lymphotropic retrovirus III (HTLV III), lymphadenopathy virus (LAV) or AIDS associated retrovirus (ARV) were named, but now under the collective term HIV (Human Immunodeficiency Virus) were combined. The complete genetic Information on a number of different isolates has now been determined (e.g. Ratner et al, Nature, 313, (1985), 277-284; Wain-Hobson et al., Cell, 40, (1985), 9-17; Muesing et al, Nature 313, (1985), 450-458; Sanchez-Pescador et al, Science, 277, (1985), 484-492; Guyader et al, Nature, 326, (1987), 662-669).

Die im Virus-Partikel enthaltene Erbinformation in Form von RNA wird nach Infektion von T4-Rezeptor-tragenden Zellen durch eine virale Reverse Transkriptase in DNA umgesetzt und als Provirus in zelluläre Sequenzen integriert. Dieses Provirus ist zwischen 9734bp und 9749bp lang und besitzt an beiden Enden ein LTR (long terminal repeat). In diesen "repeats" sind Sequenzen, welche die Regulation und Initiation der Synthese viraler Produkte steuern. HIV-Viren besitzen viele für Retroviren charakteristische genetische Merkmale (Abb. 1): am 5′-Ende sitzt nach der LTR-Sequenz das sogenannte gag-Gen (group specific antigen), dann folgen das pol-Gen mit der Protease, die RNA-abhängige DNA-Polymerase (Revertase), die Endonuklease und das Gen für das Hüllprotein (env).The genetic information contained in the virus particle in the form of RNA is converted into DNA by a viral reverse transcriptase after infection of T4 receptor-bearing cells and is integrated into cellular sequences as a provirus. This provirus is between 9734bp and 9749bp long and has an LTR (long terminal repeat) at both ends. In these "repeats" are sequences that control the regulation and initiation of the synthesis of viral products. HIV viruses have many genetic characteristics that are characteristic of retroviruses ( Fig. 1): the so-called gag gene (group-specific antigen) is located at the 5′-end after the LTR sequence, followed by the pol gene with the protease, the RNA -dependent DNA polymerase (revertase), the endonuclease and the gene for the coat protein (env).

Zusätzlich besitzt das Virus noch einige Protein-kodierende Regionen, die eine Einordnung in die Retrovirus-Untergruppe der Lentiviren erlauben. Es handelt sich dabei um SOR-1, zwischen pol und env gelegen, um 3′-ORF, vor dem 3′-LTR, sowie um TAT und ART, deren kodierenden Regionen getrennt auf kurzen Leserahmen vor und nach dem env-Gen liegen und deren m-RNA durch "splicing" entstehen.In addition, the virus has some protein-coding regions that are classified into the retrovirus subgroup of lentiviruses. It’s SOR-1, located between pol and env, around 3′-ORF, in front of 3′-LTR, as well as TAT and ART their coding regions separated on short reading frames before and after the env gene lie and their m-RNA arise by "splicing".

SOR-1,3′-ORF, TAT und ART sind Regulationsproteine, die für Latenz des Provirus in der Zelle sowie das Anschalten der Virussynthese auf transkriptioneller und translationeller Ebene verantwortlich sind.SOR-1,3′-ORF, TAT and ART are regulatory proteins responsible for the latency of the provirus in the Cell as well as switching on the virus synthesis on transcriptional and translational Level are responsible.

Das HIV-1 gag-Gen wird als 512 Aminosäure langes Protein translatiert und anschließend durch eine virale Protease in die gag-Proteine p17, p24 und p15 gespalten. Diese Strukturproteine bilden die virale Proteinhülle (core) in das die RNA und Reverse Transkriptase eingelagert werden.The HIV-1 gag gene is translated as a 512 amino acid protein and then cleaved by a viral protease into the gag proteins p17, p24 and p15. These Structural proteins form the viral protein envelope (core) in which the RNA and reverse Transcriptase be stored.

Das pol-Gen wird ebenfalls als ein Polyprotein-Vorläufer translatiert und dann in die Protease, die reverse Transkriptase sowie eine Endonuklease (Integrase) durch eine virale Protease prozessiert.The pol gene is also translated as a polyprotein precursor and then into the Protease, the reverse transcriptase and an endonuclease (integrase) by a viral Protease processed.

Als weiteres Strukturprotein sitzt das env-Genprodukt in der von der infizierten Zelle stammenden Lipidmembran. Das glykosylierte Protein wird als 160kDa-großer Vorläufer (gp160) synthetisiert und in gp120 und gp41 gespalten. Die nach bisherigen Erkenntnissen gewonnene Vorstellung geht davon aus, daß gp120 keine Membranverankerung aufweist und nur durch Wechselwirkung an das gp41 gebunden ist. Das gp41 ist als Transmembranprotein in der Lipidschicht verankert, wobei wahrscheinlich der N-terminale Teil außerhalb der Zelle liegt.As another structural protein, the env gene product is located in the infected cell originating lipid membrane. The glycosylated protein is called a 160kDa precursor  (gp160) synthesized and split into gp120 and gp41. According to previous knowledge The idea gained assumes that gp120 has no membrane anchoring and is bound to the gp41 only by interaction. The gp41 is a transmembrane protein anchored in the lipid layer, probably with the N-terminal part outside the Cell lies.

gp120 scheint für die spezifische Anlagerung an den T4-Rezeptor der Zielzelle verantwortlich zu sein, während gp41 wahrscheinlich die Fusion der Membranen und damit das Eindringen in die Zelle hydrophober Bereiche am N-terminalen Ende bewerkstelligt.gp120 appears for the specific attachment to the T4 receptor of the target cell to be responsible during gp41 probably the fusion of the membranes and thus penetration into the cell of hydrophobic areas at the N-terminal end accomplished.

Die Übertragung von HIV erfolgt in den allermeisten Fällen durch direkten Blut-Blut-Kontakt. Eine Erstinfektion kann asymptomatisch verlaufen, in vielen Fällen kommt es, bedingt durch eine Virämie, zu Grippe-artigen Symptonen.In most cases, HIV is transmitted through direct blood-blood contact. An initial infection can be asymptomatic, in many cases it happens due to viremia, to flu-like symptoms.

Nach einem Zeitraum von einigen Wochen bis Monaten sind Antikörper gegen virale Proteine im Serum nachweisbar. Der Erreger selbst bleibt aber über Jahre hinweg in T4-Rezeptor-tragenden Zellen latent vorhanden. Durch nur in Ansätzen verstandene Ereignisse werden die in das Genom integrierten Viren wieder aktiviert und es kommt zu einer Elimination von T4-Zellen. Als Symptome treten Lymphknoten- Schwellungen, Fieber, Gewichtsabnahme und Durchfall auf. Bedingt durch eine Infektion von Zellen des Hirnstamms kann es teilweise zu einer Demenz kommen. Schließlich erfolgen aufgrund einer fortschreitend reduzierten zellulären Immunantwort schwere opportunistische Infektionen, die das Vollbild von AIDS ergeben und in allen bekannten Fällen mit dem Tod endet.After a period of a few weeks to months there are antibodies detectable against viral proteins in serum. The pathogen itself remains for years latently present in T4 receptor-bearing cells. By just beginning understood events, the viruses integrated into the genome are reactivated and it T4 cells are eliminated. Symptoms are lymph nodes Swelling, fever, weight loss and diarrhea. Caused by an infection cells of the brain stem can sometimes lead to dementia. Finally done due to a progressively reduced cellular immune response, severe opportunistic Infections that result in the full picture of AIDS and in all known cases with death ends.

HIV-Protease und Möglichkeiten zur InhibitionHIV protease and inhibition options

Die Protease, die von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die sich am 5′-Ende der pol-Gen-Sequenz befindet, katalysiert ihre eigene Abspaltung sowie die Prozessierung der Revertase und Endonuklease, aber auch des gag-Vorläufermoleküls. Vergleichende Sequenzuntersuchungen (Pearl et al, Nature, 329, (1987), 351-354) legen den Schluß nahe, daß es sich bei der HIV-Protease, ähnlich wie bei den meisten retroviralen Proteasen, um eine zur Gruppe der Aspartyl-Säure Proteasen gehörendes Enzym handelt. Die Aminosäure Sequenz Asp-Thr(Ser)-Gly ist eine konservative Domäne innerhalb der bekannten Aspartyl-Proteasen aus Proteinsequenzen mit 2 konservierten Asp-Thr(Ser)-Gly-Domänen und mehr als 300 Aminosäuren bestehen, sind retrovirale Proteasen, soweit bekannt, um mehr als die Hälfte kürzer und beinhalten nur ein aktives Zentrum. The protease, which is encoded by a DNA sequence located at the 5'-end of the pol gene sequence catalyzes their own cleavage and the processing of the revertase and endonuclease, but also the gag precursor molecule. Comparative Sequence studies (Pearl et al, Nature, 329, (1987), 351-354) suggest that that the HIV protease is similar to most retroviral proteases an enzyme belonging to the group of aspartic acid proteases. The amino acid Sequence Asp-Thr (Ser) -Gly is a conservative domain within the known aspartyl proteases from protein sequences with 2 conserved Asp-Thr (Ser) -Gly domains and more than 300 amino acids consist of retroviral proteases, as far as known, by more than half shorter and contain only one active center.  

In Analogien zu bekannten Protease-Sequenzen und deren dreidimensionaler Struktur (Röntgen-Struktur-Analyse) war es möglich, ein Modell der HIV-Protease zu erstellen. Dies und die Sequenzaufklärung der Protease-spezifischen Spaltsequenzen (Pearl et al, Nature, 328, (1987), 482) können zu rational strukturierten Inhibitoren führen.In analogies to known protease sequences and their three-dimensional structure (X-ray structure analysis) it was possible to create a model of the HIV protease. This and the sequence elucidation of the protease-specific cleavage sequences (Pearl et al, Nature, 328, (1987), 482) can lead to rationally structured inhibitors.

Inhibitoren der Proteasewirkung können bis jetzt nur im Virus-Eukaryontenzell-System überprüft werden, mit allen Nachteilen und Gefahren. Deshalb sind effiziente, rasche, aussagekräftige neue Testsysteme unter Verwendung rekombinanter Proteine erforderlich. Diese erlauben in vivo bzw. in vitro, in nicht durch die Menge an Substrat und Enzym limitierten Testansätzen, Substanzen auf eine spezifische Inhibition der Protease zu prüfen.Until now, inhibitors of the protease effect can only be found in the virus-eukaryotic cell system be checked with all disadvantages and dangers. That's why efficient, quick, Meaningful new test systems using recombinant proteins are required. These allow in vivo or in vitro, not by the amount of substrate and enzyme limited test approaches to test substances for a specific inhibition of the protease.

Diese Erfindung beinhaltet die Produktion HIV-spezifischer Proteine durch gentechnologische Methoden und deren Verwendung in Ansätzen zur Testung von Substanzen, die die enzymatische Wirkung der HIV-Protease inhibieren. Ein Bestandteil dieser Erfindung ist die Produktion aktiver, rekombinanter HIV-Protease, die für die genannten Ansätze eingesetzt werden kann, sei es als Proteinextrakt oder als enzymatisch aktives Fusionsprotein mit gag- bzw. pol-spezifischen Vorläufermolekülen.This invention involves the production of HIV-specific proteins Genetic engineering methods and their use in approaches for testing Substances that inhibit the enzymatic action of the HIV protease. A component This invention is the production of active, recombinant HIV protease that is useful for mentioned approaches can be used, be it as a protein extract or as enzymatic active fusion protein with gag- or pol-specific precursor molecules.

Zu diesem Zweck wurden verschiedene E. coli Klone erzeugt, die HIV-entsprechende Aminosäuresequenzen kodierende Genomabschnitte beinhalten.For this purpose, various E. coli clones were generated that correspond to HIV Include genomic segments encoding amino acid sequences.

  • a) Ein Expressionsplasmid pUCHBgEc2, welches entsprechende Gensequenzen beinhaltet, die für die HIV-spezifischen Protease, Revertase und komplette Endonuklease kodieren. Ein Segment mit 1010 Aminosäuren wurde verwendet (Abb. 2), nur minimale heterologe Fusionsanteile sind verwendet worden.a) An expression plasmid pUCHBgEc2, which contains corresponding gene sequences which code for the HIV-specific protease, revertase and complete endonuclease. A 1010 amino acid segment was used ( Fig. 2), only minimal heterologous fusion fractions were used.
  • b) Ein Expressionsplasmid pUC19HBgB1, welches entsprechende Gensequenzen beinhaltet, die für eine vollständige Protease einschließlich der carboxyl-terminalen, Protease-spezifischen Spaltsequenzen kodiert. Ein Segment mit 187 Aminosäuren wurde verwendet (Abb. 2).b) An expression plasmid pUC19HBgB1 which contains corresponding gene sequences which code for a complete protease including the carboxyl-terminal, protease-specific cleavage sequences. A segment with 187 amino acids was used ( Fig. 2).
  • c) 2 Expressionsplasmide pUC19GAGst und pUCGAGth, die entsprechende Gensequenzen beinhalten, welche für gag Vorläufermoleküle kodieren. Die Aminosäuresegmente mit 511 Aminosäuren bzw. 435 Aminosäuren (Abb. 3 bzw. Abb. 4) wurden verwendet.c) 2 expression plasmids pUC19GAGst and pUCGAGth, which contain corresponding gene sequences which code for gag precursor molecules. The amino acid segments with 511 amino acids and 435 amino acids ( Fig. 3 and Fig. 4) were used.
  • d) 2 Expressionsplasmide entsprechend unter c). Zusätzlich zu den angegebenen Aminosäuresequenzen wurden im selben Leserahmen die Protease kodierenden Aminosäuren, einschließlich der am 3′-Ende der Protease befindlichen Spaltsequenz, fusioniert. Entsprechend wurden folgende Aminosäuresequenzen wie in Abb. 4 und 5 dargestellt verwendet.d) 2 expression plasmids according to c). In addition to the specified amino acid sequences, the protease-encoding amino acids, including the cleavage sequence located at the 3'-end of the protease, were fused in the same reading frame. The following amino acid sequences were used accordingly, as shown in FIGS. 4 and 5.

Die enzymatische Wirkung der Protease-Spaltung kann in einem definierten Testsystem gezeigt werden. Dazu werden entweder ungereinigte Proteinextrakte miteinander inkubiert, die sich nur in dem Vorhandensein des jeweiligen rekombinanten Proteins unterscheiden. Im gegebenen Fall etwa den Rohextrakt von gag-Vorläufermolekül produzierenden E.-coli-Klonen gemischt mit dem Rohextrakt des Protease produzierenden E.-coli-Klons. Nach Inkubation werden die Gesamt-Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Folie geblottet und danach entweder mit einem HIV-spezifischen Serum oder einem, in diesem Beispiel monoklonalen Antikörper gegen p24 (gag) inkubiert (Western-Blot oder Immunoblot). Durch Zugabe eines entsprechenden Antiserums, welches enzymmarkierte Antikörper enthält, die diese HIV-Antigen spezifischen Antikörper erkennen, und einer folgenden Farbreaktion, werden die durch Protease-Einwirkung entstandenen Proteinbanden im Vergleich zu unbehandelten Proteinextrakten deutlich erkennbar. Natürlich kommt es zu Background-Reaktion, da ungereinigte Zusätze verwendet werden, aber durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern kann diese mögliche Störung leicht umgangen werden. Ein Testsystem ist nun leicht realisierbar, in dem zu dem oben beschriebenen Ansatz bei Zugabe der Protease gleichzeitig ein spezifischer Inhibitor oder eine zu testende Substanz zugegeben wird, mit der Möglichkeit direkt die Inhibitionswirkung im Proteinextrakt zu bestimmen.The enzymatic effect of protease cleavage can be determined in a defined test system to be shown. For this purpose, either unpurified protein extracts are incubated with one another, which differ only in the presence of the respective recombinant protein. in the in this case, for example, the crude extract of gag precursor molecule-producing E. coli clones mixed with the crude extract of the protease producing E. coli clone. To Incubation, the total proteins are separated by SDS-PAGE, on nitrocellulose film blotted and then either with an HIV-specific serum or with, in In this example, monoclonal antibodies against p24 (gag) were incubated (Western blot or Immunoblot). By adding an appropriate antiserum which labeled enzyme Contains antibodies that recognize these HIV antigen-specific antibodies,  and a subsequent color reaction, those resulting from protease exposure Protein bands are clearly recognizable compared to untreated protein extracts. Naturally there is a background reaction because unpurified additives are used, but through The use of monoclonal antibodies can easily alleviate this possible disorder be circumvented. A test system is now easy to implement by going to the one above described approach when adding the protease simultaneously a specific inhibitor or a substance to be tested is added, with the possibility of directly the inhibitory effect to be determined in the protein extract.

Der Frage der Zellgängigkeit von solchen inhibierenden Substanzen kann mit der Verwendung von rekombinanten Zellsystemen (prokaryontische wie eukaryontische Zellen) einfach nachgegangen werden. Durch die Fusionierung der Protease-kodierenden Aminosäuren an überexprimierte gag-Vorläufermoleküle in prokaryontischen und eukaryontischen Expressionsplasmiden und deren Kombination mit den jeweiligen Replikations-, Transkriptions- und Selektionssequenzen, ist es möglich, die Proteasewirkung im Zellsystem zu verfolgen.The question of the cell mobility of such inhibiting substances can be answered with the Use of recombinant cell systems (prokaryotic as well as eukaryotic cells) just be followed up. By fusing the protease encoding Amino acids to overexpressed gag precursors in prokaryotic and eukaryotic expression plasmids and their combination with the respective Replication, transcription and selection sequences, it is possible the protease effect to track in the cell system.

So kann z. B. nach Induktion des Promotors in E. coli durch IPTG eine effiziente Transkription angeschaltet werden.So z. B. after induction of the promoter in E. coli by IPTG an efficient Transcription can be switched on.

Durch die im Vorläufermolekül mit beinhaltete Protease kommt es zu einer Prozessierung des Polypeptids. Nach Extraktion, Auftrennung in der SDS-PAGE, Transfer auf Nitrocellulose und anschließender Inkubation mit Antiserum, kann nach Immunfärbung die Protease-katalysierte Spaltung sichtbar gemacht werden. Inhibierende Substanzen können wie oben auf ihre Wirksamkeit untersucht werden, wobei auch deren Zellgängigkeit verfolgt werden kann. Mit den beschriebenen Ansätzen ist man also in der Lage, beliebige Mengen von authentischem Substrat und Enzym herzustellen, ohne die limitierenden Einschränkungen, wie sie durch die Verwendung von infektiösen Viren und suszeptiblen Zellen, der damit verbundenen zeitaufwendigen Zellkulturarbeit und der schlecht quantifizierbaren Wirkung von Protease-Inhibitoren auf die Wachstumseigenschaften der Viren im Zellkultursystem gegeben sind.The protease contained in the precursor molecule leads to a processing of the Polypeptide. After extraction, separation in the SDS-PAGE, transfer to nitrocellulose and subsequent incubation with antiserum, the protease-catalyzed after immunostaining Split can be made visible. Inhibitory substances can be as above their effectiveness will be examined, whereby their cell mobility can also be followed. With the approaches described, one is able to get any amount of to produce authentic substrate and enzyme without the limiting restrictions, as they do through the use of infectious viruses and susceptible cells associated time-consuming cell culture work and the poorly quantifiable effect of protease inhibitors on the growth properties of viruses in the cell culture system given are.

Abbildungen (Beispiele)Illustrations (examples)

Abb. 1: Genom und kodierende Regionen von HIV 1.
Die Abbildung zeigt das über 9000 bp lange Genom von HIV 1 mit den beiden LTR-Regionen. Im unteren Teil ist die Lage der Protein-kodierenden Bereiche, sowie die nach Spaltung entstehenden Produkte eingezeichnet. Im oberen Teil sind Schnittstellen für Restriktionsenzyme markiert, die für die Konstruktion der beschriebenen Expressionsplasmide verwendet wurden. Fig. 1: Genome and coding regions of HIV 1.
The figure shows the over 9000 bp genome of HIV 1 with the two LTR regions. The position of the protein-coding regions and the products formed after cleavage are shown in the lower part. In the upper part, interfaces for restriction enzymes are marked, which were used for the construction of the expression plasmids described.

Abb. 2: DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUCBgEc2.
Der Computerausdruck listet die für die Expression von rekombinanten, pol-Leserahmen abgeleiteten Proteinen (Protease, Revertase, Endonuklease) relevanten Sequenzen auf. Der Beginn ist bei dem Translationsstart des pUC-Vektors (Yanisch-Perron et al, Gene, 33, 1985, 102-119), der Anfang und das Ende sowie der translationsstop der HIV-Sequenzen sind eingezeichnet. Daneben sind noch einige für die Charakterisierung wichtige Restriktionsenzym-Schnittstellen eingezeichnet. Anfang und Ende von Protease, Revertase und Endonuklease sind eingezeichnet. Zur Konstruktion des Protease experimierenden Plasmids wurde eine Deletion mit den Restriktionsenzymen Bal I und EcoR I durchgeführt. Fig. 2: DNA and amino acid sequence of pUCBgEc2.
The computer printout lists the sequences relevant for the expression of recombinant, pol reading frames derived proteins (protease, revertase, endonuclease). The beginning is at the translation start of the pUC vector (Yanisch-Perron et al, Gene, 33, 1985, 102-119), the beginning and the end as well as the translation stop of the HIV sequences are shown. In addition, some restriction enzyme interfaces that are important for characterization are shown. The beginning and end of protease, revertase and endonuclease are shown. To construct the plasmid experimenting with protease, a deletion was carried out with the restriction enzymes Bal I and EcoR I.

Abb. 3: DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUCC18GAGstop.
Der Computer-Ausdruck listet entsprechend der Abb. 2 die kodierenden Sequenzen des das gesamte gag-Gen umfassenden Vorläufermoleküls auf. Fig. 3: DNA and amino acid sequence of pUCC18GAGstop.
According to Fig. 2, the computer expression lists the coding sequences of the precursor molecule comprising the entire gag gene.

Abb. 4: DNA-und Aminosäure-Sequenz von PUC18GAGth.
Der Computer-Ausdruck listet entsprechend der Abb. 2 die kodierenden Sequenzen des das verkürzte gag-Gen umfassenden Vorläufermoleküls auf. Fig. 4: DNA and amino acid sequence of PUC18GAGth.
According to Fig. 2, the computer expression lists the coding sequences of the precursor molecule comprising the truncated gag gene.

Abb. 5: DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC18GstPrt.
Der Computer-Ausdruck listet entsprechend der Abb. 2 die kodierenden Sequenzen des das gesamte gag-Gen umfassenden Vorläufermoleküls auf einschließlich der fusionierten Protease mit Ihrer spezifischen Spalt-Sequenz. Fig. 5: DNA and amino acid sequence of pUC18GstPrt.
According to FIG. 2, the computer expression lists the coding sequences of the precursor molecule comprising the entire gag gene, including the fused protease with your specific cleavage sequence.

Abb. 6: DNA- und Aminosäure-Sequenz von pUC18GthPrt.
Der Computer-Ausdruck listet entsprechend der Abb. 2 die kodierenden Sequenzen des das verkürzte gag-Gen umfassenden Vorläufermoleküls auf einschließlich der fusionierten Protease mit ihrer spezifischen Spalt-Sequenz. Fig. 6: DNA and amino acid sequence of pUC18GthPrt.
According to FIG. 2, the computer expression lists the coding sequences of the precursor molecule comprising the shortened gag gene, including the fused protease with its specific cleavage sequence.

Abb. 7: Western-Blot in der SDS-Page aufgetrennter Testansätze von Zellextrakten.
Die Abbildung zeigt aufgetrennte Zellextrakte jeweils unbehandelt, 5 min nach Protease-Extrakt Zugabe und 35 min nach Protease-Extrakt Zugabe. Verwendet wurden entsprechende Vorläufermoleküle, wie sie zum Teil in dieser Erfindung beschrieben sind. Deutlich ist bei Zugabe des Protease-Extrakts eine Spaltung des Vorläufermoleküls zu erkennen. Lediglich der Extrakt der das rekombinante Vorläufermolekül, welches von pUC18GAGth exprimiert wird, enthält, wird zu den angegebenen Zeiten nur wenig gespalten. Fig. 7: Western blot in the SDS page of separated test batches of cell extracts.
The figure shows separated cell extracts each untreated, 5 minutes after adding the protease extract and 35 minutes after adding the protease extract. Corresponding precursor molecules, as are partly described in this invention, were used. When the protease extract is added, a cleavage of the precursor molecule can be clearly seen. Only the extract that contains the recombinant precursor molecule, which is expressed by pUC18GAGth, is only slightly cleaved at the times indicated.

Abb. 8: Western-Blot in der SDS-PAGE aufgetrennter Zellextrakte.
Die Abbildung zeigt aufgetrennte Zellextrakte von induzierten E.-coli-Zellen, die entsprechende Plasmide, wie in dieser Erfindung angegeben, enthalten im Western-Blot. Deutlich ist bei den Zellextrakten, die das jeweilige Vorläufermolekül enthalten einschließlich der fusionierten Protease, ein charakteristisches Spaltprodukt bei etwa 25 000 Dalton zu erkennen. Fig. 8: Western blot in the SDS-PAGE of separated cell extracts.
The figure shows separated cell extracts from induced E. coli cells, which contain corresponding plasmids, as indicated in this invention, in the Western blot. A characteristic cleavage product at around 25,000 daltons can be clearly seen in the cell extracts which contain the respective precursor molecule, including the fused protease.

Abb. 9: Western-Blot in der SDS-PAGE aufgetrennter Zellextrakte.
Die Abbildung zeigt entsprechend der Abb. 8 einen Western-Blot mit den gleichen Testansätzen. Hier wurde ein Monoklonaler Antikörper (anti p24) verwendet, um das Spaltprodukt nachzuweisen. Fig. 9: Western blot in the SDS-PAGE of separated cell extracts.
The illustration shows a Western blot with the same test approaches in accordance with FIG. 8. Here a monoclonal antibody (anti p24) was used to detect the cleavage product.

Claims (15)

1) DNA- und Amino-Sequenzen, charakterisiert dadurch, daß sie entsprechende kodierende Bereiche von HIV 1 oder HIV 2 enthalten, die nach Expression Proteaseaktivität zeigen.1) DNA and amino sequences, characterized in that they contain corresponding coding regions of HIV 1 or HIV 2 which show protease activity after expression. 2) Expressionsplasmide mit HIV 1- und HIV 2-Sequenzen entsprechend Anspruch 1, die eine Produktion von HIV-Polyeptid-Vorläufermolekülen in prokaryonten oder eukaryonten Zellen erlauben.2) Expression plasmids with HIV 1 and HIV 2 sequences according to claim 1, the a production of HIV polyeptide precursors in prokaryotes or eukaryotes Allow cells. 3) Expressionsplasmide mit HIV 1- und HIV 2-Sequenzen entsprechend Anspruch 1, die eine Produktion von HIV-spezifischen Enzymen in prokaryonten oder eukaryonten Zellen erlauben.3) Expression plasmids with HIV 1 and HIV 2 sequences according to claim 1, the a production of HIV-specific enzymes in prokaryotic or eukaryotic cells allow. 4) Testansätze, die die Vorteile rekombinanter DNA-Technologie verwenden, um spezifische Inhibitoren für HIV-spezifische Enzyme zu erproben.4) Test approaches that take advantage of recombinant DNA technology to specific To test inhibitors for HIV-specific enzymes. 5) Testansätze, die die Vorteile rekombinanter DNA-Technologie verwenden, um spezifische Inhibitoren für HIV-Protease in vitro zu erproben.5) Test approaches that take advantage of recombinant DNA technology to specific To test inhibitors for HIV protease in vitro. 6) Testansätze, die die Vorteile rekombinanter DNA-Technologie verwenden, um spezifische Inhibitoren in vitro zu erproben.6) Test approaches that take advantage of recombinant DNA technology use to test specific inhibitors in vitro. 7) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinierten Plasmid pUC19HBgEc2 in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines den gesamten pol-Leserahmen umfassenden Polypeptids bewirkt.7) A DNA sequence according to claim 2, which is in the recombined plasmid pUC19HBgEc2 in the manner described and shown is included and their Transcription and translation the production of an entire pol reading frame comprehensive polypeptide. 8) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinierten Plasmid pUC18GAGst in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines den gesamten gag-Leserahmen umfassenden Polypeptids bewirkt.8) A DNA sequence according to claim 2, which is in the recombined plasmid pUC18GAGst is included in the described and shown manner and their transcription and Translation the production of an entire gag reading frame Polypeptide causes. 9) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinierten Plasmid pUC18GAGth in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Überproduktion eines, den größten Teil des gesamten gag-Leserahmen umfassenden, Polypeptids bewirkt. 9) A DNA sequence according to claim 2, which is in the recombined plasmid pUC18GAGth as described and shown is included and its transcription and translation the overproduction of one, most of the entire gag reading frame comprehensive, polypeptide effects.   10) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2, die in dem rekombinierten Plasmid pUC19HBgB in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines proteolytisch aktiven Enzyms bewirkt, einschließlich der HIV-Protease spezifischen Spaltstelle am 3′-Ende.10) A DNA sequence according to claim 2, which is in the recombined plasmid pUC19HBgB in the manner described and shown is included and their transcription and translation causes the production of a proteolytically active enzyme, including the HIV protease-specific cleavage site at the 3'-end. 11) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2 und 3, die in dem rekombinierten Plasmid pUC18GstPrt in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Produktion eines gag-Polypeptids an welches NH₂-terminal die Protease mit ihrer spezifischen Spaltsequenz anfusioniert wurde.11) A DNA sequence according to claims 2 and 3, which is in the recombined plasmid pUC18GstPrt in the manner described and shown is included and its transcription and translation the production of a gag polypeptide to which NH₂-terminal the protease was fused with their specific cleavage sequence. 12) Eine DNA-Sequenz entsprechend Anspruch 2 und 3, die in dem rekombinanten Plasmid pUC18GthPrt in der beschriebenen und gezeigten Art beinhaltet ist und deren Transkription und Translation die Überproduktion eines verkürzten gag-Peptids, an welches NH₂-terminal die Protease mit ihrer spezifischen Spaltsequenz anfusioniert wurde, erlaubt.12) A DNA sequence according to claims 2 and 3, which is in the recombinant plasmid pUC18GthPrt in the manner described and shown is included and its transcription and translation the overproduction of a truncated gag peptide to which NH₂-terminal the protease was fused with its specific cleavage sequence. 13) Ein Testansatz, bei dem rekombinant produzierte HIV-1 oder HIV-2 Proteine entsprechend Anspruch 2 und 3 oder Ansprüche 6-12, durch spezifische Proteasewirkung in charakteristische Spaltprodukte gespalten werden. Diese Spaltprodukte werden nach Auftrennung in der SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose geblottet und durch Immunfärbung nachgewiesen. Dabei können HIV-Serum-Pools oder aber monoklonale Antikörper verwendet werden.13) A test approach in which recombinantly produced HIV-1 or HIV-2 proteins according to claims 2 and 3 or claims 6-12, by specific Protease effect can be split into characteristic cleavage products. These fission products are separated after separation in the SDS-PAGE, blotted onto nitrocellulose and demonstrated by immunostaining. HIV serum pools or monoclonal Antibodies are used. 14) Ein Testansatz, wie unter Anspruch 13, bei dem Zellextrakte verwendet werden, die entsprechende rekombinante Polypeptid-Vorläufermoleküle verwenden, zusammen mit HIV Protease-spezifischen Zellextrakten. Die durch die Protease-Wirkung entstandenen Spaltprodukte werden wie unter 13 nachgewiesen. Inhibitoren können direkt zugegeben werden und deren Wirkung auf die Spaltung wie unter 13 nachgewiesen werden.14) A test approach as in claim 13, in which cell extracts are used which use corresponding recombinant polypeptide precursor molecules, together with HIV Protease-specific cell extracts. Those caused by the protease effect Fission products are detected as under 13. Inhibitors can be added directly and their effect on the cleavage can be demonstrated as under 13. 15) Ein Testansatz, wie unter Anspruch 13, bei dem rekombinante eukaryontische oder prokaryontische Zellen verwendet werden, die entsprechend induzierbare Plasmide wie unter Anspruch 3 beinhalten. Nach Induktion der jeweiligen Promotoren werden Polypeptid-Vorläufermoleküle exprimiert, zugleich mit der HIV-Protease. Spaltprodukte werden wie unter Anspruch 13 nachgewiesen.
Mit diesem Testansatz können hemmende Wirkung und Zellgängigkeit der zu testenden Inhibitoren geprüft und untersucht werden.15) A test approach as in claim 13, in which recombinant eukaryotic or prokaryotic cells are used which contain correspondingly inducible plasmids as in claim 3. After induction of the respective promoters, polypeptide precursor molecules are expressed, at the same time as the HIV protease. Fission products are detected as under claim 13.
With this test approach, the inhibitory effect and cell mobility of the inhibitors to be tested can be tested and examined.
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