DE3613575A1 - Method for immobilising microorganisms and/or enzymes - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen und/oder Enzymen unter Verwendung eines porösen Trägermaterials.The invention relates to a method for immobilization of microorganisms and / or enzymes using of a porous carrier material.
Zur Durchführung biochemischer Reaktionen, wie z.B. Reini gung von Abwasser, Herstellung von Ethanol, Antibiotika usw., werden heute vermehrt Mikro organismen oder Enzyme zu Hilfe genommen. Um einen wirt schaftlichen und effektiven Einsatz der Mikroorganismen bzw. Enzyme zu erzielen, ist es notwendig für eine hohe mikrobielle bzw. enzymatische Aktivität zu sorgen. Dies wird durch verschiedene Techniken zur Erhöhung der Konzen tration der Mikroorganismen bzw. Enzyme in einem Reaktor erreicht, in dem die biochemischen Reaktionen ablaufen sollen. Hierzu gehören z.B. Filtriertechniken zur Verhin derung von Zellverlusten aus dem Reaktor, Wiederaufarbei tung und Rückführung von Zellen in den Reaktor und Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Enzymen.For performing biochemical reactions, e.g. Reini wastewater treatment, ethanol production, antibiotics etc., are increasingly becoming micro organisms or enzymes to help. For a host efficient and effective use of microorganisms or to achieve enzymes, it is necessary for a high to ensure microbial or enzymatic activity. This is using various techniques to increase the concentration tration of the microorganisms or enzymes in a reactor achieved in which the biochemical reactions take place should. These include e.g. Filtration techniques for prevention Change of cell losses from the reactor, reprocessing treatment and recycling of cells in the reactor and Immobilization of microorganisms or enzymes.
Unter Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Enzymen versteht man die Fixierung von intakten Zellen oder Enzymen an einen bestimmten Ort, an dem die biochemischen Reaktionen durchgeführt werden sollen. An diesem Ort müssen die für hohe mikrobielle bzw. enzymatische Aktivität erforderlichen Umweltbedingungen aufrechterhalten werden. Hierzu muß vor allem eine ausreichende Versorgung mit Nahrungsstoffen, Sauerstoff, Reaktanden usw. gewährleistet werden. Durch Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Enzymen wird eine Zunahme der mikrobiellen bzw. enzymatischen Produktivität bezogen auf das Reaktorvolumen, eine Zunahme der Produkt konzentration im Reaktorabfluß und eine Abnahme der Konzen tration von Mikroorganismen bzw. Enzymen im Reaktorabfluß erreicht.Immobilizing microorganisms or enzymes one understands the fixation of intact cells or enzymes to a specific place where the biochemical reactions should be carried out. At this place, the for high microbial or enzymatic activity required Environmental conditions are maintained. To do this, must an adequate supply of nutrients, Oxygen, reactants, etc. are guaranteed. By Immobilization of microorganisms or enzymes becomes one Increase in microbial or enzymatic productivity based on the reactor volume, an increase in product concentration in the reactor effluent and a decrease in the concentration tration of microorganisms or enzymes in the reactor effluent reached.
Eine gebräuchliche Methode zur Immobilisierung von Mikro organismen oder Enzymen ist deren Einschluß in ein Netz werk. Durch Zugabe von Mikroorganismen bzw. Enzymen zu einer Lösung, die einen Gelbildner, wie z.B. Agar, Kollagen, Natrium-Alginat usw., enthält, und Eintropfen der so ent standenen Suspension in eine Vernetzungsmittel enthaltende Lösung können z.B. Gelkörper erzeugt werden, in denen die Mikroorganismen bzw. Enzyme fixiert sind.A common method of immobilizing micro organisms or enzymes is their inclusion in a network plant. By adding microorganisms or enzymes to one Solution containing a gelling agent, e.g. Agar, collagen, Contains sodium alginate, etc., and drops in the ent standing suspension in a containing crosslinking agent Solution can e.g. Gel bodies are generated in which the Microorganisms or enzymes are fixed.
Eine andere Möglichkeit zur Immobilisierung von Mikroorga nismen bzw. Enzymen stellt die Verwendung von porösem Trägermaterial, wie z.B. Stahlmaschengitter oder porösen Schaumstoffen, dar. Die Verwendung makroporöser Schaum stoffträger mit lose fixierten Mikroorganismen gehört bereits zu den gängigen Methoden der biologischen Abwasser reinigung.Another way to immobilize Mikroorga nisms or enzymes represents the use of porous Carrier material, e.g. Steel mesh or porous Foams. The use of macroporous foam belongs to a carrier with loosely fixed microorganisms already on the common methods of biological wastewater cleaning.
Bekannt ist auch folgendes Verfahren zur Immobilisierung: Ein poröses Trägermaterial wird in Gegenwart der Mikro organismen oder Enzyme synthetisiert, und die Mikroorganis men bzw. Enzyme werden bereits während der Entstehung des Trägermaterials in dieses eingeschlossen. So kann z.B. Polyurethan mit Mikroorganismen oder Enzymen vermischt und dann aufgeschäumt werden, so daß schließlich die Mikro organismen bzw. Enzyme fest im Schaumstoff eingeschlossen sind.The following immobilization method is also known: A porous support material is in the presence of the micro organisms or enzymes synthesized, and the microorganism Men or enzymes are already in development of the carrier material included in this. For example, Polyurethane mixed with microorganisms or enzymes and then be foamed, so that finally the micro organisms or enzymes firmly enclosed in the foam are.
Die bisher angewandten Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Enzymen sind jedoch jeweils mit spezifischen Nachteilen behaftet.The methods of immobilization previously used of microorganisms or enzymes, however, are included specific disadvantages.
Bei der Verwendung von Gelkörpern zur Immobilisierung ist beobachtet worden, daß nahe der Oberfläche der Gel körper die Konzentration der Mikroorganismen sehr viel größer ist als im Kern. Dies kann dadurch erklärt werden, daß nur nahe der Oberfläche der Gelkörper eine ausreichen de Versorgung der Mikroorganismen mit notwendigen Nähr stoffen, Sauerstoff, Reaktanden usw. gewährleistet ist. Bei Gelkörpern ist also offenbar das Innere für die Reaktanden schwer zugänglich, was sich zwangsläufig in einer verminderten mikrobiellen bzw. enzymatischen Akti vität, bezogen auf das Reaktorvolumen, niederschlägt. Außerdem ist die mechanische Haltbarkeit von Gelkörpern begrenzt.When using gel bodies for immobilization it has been observed that near the surface of the gel body the concentration of microorganisms very much is larger than the core. This can be explained by that only one near the surface of the gel body is sufficient de Supply of the microorganisms with the necessary nutrients substances, oxygen, reactants, etc. is guaranteed. In the case of gel bodies, the inside is obviously for them Reactants are difficult to access, which is inevitable a reduced microbial or enzymatic activity vity, based on the reactor volume. In addition, the mechanical durability of gel bodies limited.
Verwendet man hingegen poröses Trägermaterial, so können Enzyme nur begrenzt durch Adsorption aufgebracht werden. Die Mikroorganismen sind nur lose in den Poren des Träger materials fixiert und können leicht ausgewaschen werden. Außerdem eignen sich nur manche Mikroorganismenarten für diese Art der Fixierung.However, if porous support material is used, then Enzymes can only be applied to a limited extent by adsorption. The microorganisms are only loose in the pores of the wearer fixed and can be easily washed out. In addition, only some types of microorganisms are suitable for this type of fixation.
Beim Einschluß von Mikroorganismen bzw. Enzymen in porö ses Trägermaterial während des Syntheseprozesses des Trägermaterials, also z.B. beim Aufschäumen von Polyure thanschaum in Gegenwart von Mikroorganismen, können die Mikroorganismen oder Enzyme durch Ausgangsprodukte des Trägermaterials, z.B. des Polyurethanschaums, oder durch die beim Syntheseprozeß möglicherweise auftretende Wärme entstehung geschädigt werden. Außerdem sind beispielsweise die im Innern eines Polymers auf diese Weise eingeschlossenen Mikroorganismen bzw. Enzyme für Reaktanden schwer zugäng lich.When microorganisms or enzymes are enclosed in porö ses carrier material during the synthesis process of Carrier material, e.g. when foaming polyure than foam in the presence of microorganisms, can Microorganisms or enzymes from the products of the Carrier material, e.g. of the polyurethane foam, or by the heat that may occur during the synthesis process damage. In addition, for example those trapped inside a polymer in this way Microorganisms or enzymes for reactants difficult to access Lich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Ver fahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen und/oder Enzymen unter Verwendung eines porösen Trägermaterials so auszugestalten, daß eine effektive Immobilisierung erreicht wird, ohne daß die obengenannten Nachteile bisheri ger Verfahren auftreten.The object of the present invention is therefore a Ver drive to immobilize microorganisms and / or Enzymes using a porous support To be designed so that effective immobilization is achieved without the disadvantages mentioned above eng procedures.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in das poröse Trägermaterial eine Gelschicht, die die Mikroorganismen und/oder Enzyme enthält, eingebracht und ausgehärtet wird.This object is achieved in that a gel layer in the porous carrier material, which the Contains microorganisms and / or enzymes, introduced and is cured.
Bei der erfindungsgemäßen Immobilisierungsmethode wird ein poröses Trägermaterial, wegen der besseren Zugäng lichkeit für Reaktanden möglichst ein makroporöses Träger material, verwendet. Durch die Poren wird die innere Ober fläche des Trägermaterials vergrößert. In die Poren des Trägermaterials wird eine Gelschicht, die die Mikroorga nismen bzw. Enzyme enthält, eingebracht, so daß die gesamte innere Oberfläche des Trägermaterials bedeckt wird. Als Trägermaterial kommen insbesondere Polyurethanschaum oder Polyethylenschaum in Betracht, doch sind auch andere or ganische Polymerschäume möglich, ferner Gestrickkörper aus Kunststoff- oder Stahlfäden, Blähton, Bims und andere.In the immobilization method according to the invention a porous carrier material, because of the better access possible for reactants to be a macroporous carrier material, used. Through the pores, the inner upper area of the carrier material enlarged. In the pores of Carrier material becomes a gel layer, which the Mikroorga Contains nisms or enzymes, so that the entire inner surface of the carrier material is covered. As Backing material comes in particular polyurethane foam or Polyethylene foam is considered, but other or ganic polymer foams possible, also knitted fabric made of plastic or steel threads, expanded clay, pumice and others.
Die Präparation erfolgt z.B. in folgenden Schritten: Zunächst wird ein geeigneter Gelbildner, z.B. Natrium- Alginat, Agar, Carrageenan, Pectin, Chitosan, Kollagen u.a., in Wasser gelöst. Diese Lösung wird dann bei maximal 120°C für etwa 20 Minuten in einen Autoklaven gebracht. Anschließend werden die Mikroorganismen oder Enzyme zugegeben, bis etwa eine Konzentration von 0,2 bis 0,5 g Mikroorganismen- bzw. Enzymgewicht pro ml Lösung erreicht ist. Mit der so ent standenen Suspension wird das Trägermaterial getränkt und möglicherweise anschließend bis auf einen vorgegebenen Wert ausgepreßt, um einen gewünschten Grad der Imprägnierung einstellen zu können. Dann wird das getränkte Trägermaterial gemäß einer bevorzugten Ausbildung des Erfindungsgedankens in eine geeignete Elektrolytlösung, die z. B. Ca2+-, Co2+-, Zn2+-, Mn2+-, Ba2+-, Fe2+-, Al3+-Ionen enthält, vorzugsweise CaCl₂-Lösung, zu ionotroper Gelierung eingebracht. Durch den Austausch z. B. der Na⁺-Ionen gegen die Ca2+-Ionen erfolgt eine Quervernetzung der Alginsäuren und es bildet sich ein Netzwerk, ein Gel aus, das die Mikroorganismen bzw. Enzyme enthält.The preparation is carried out, for example, in the following steps: First, a suitable gel former, for example sodium alginate, agar, carrageenan, pectin, chitosan, collagen and others, is dissolved in water. This solution is then placed in an autoclave at a maximum of 120 ° C. for about 20 minutes. The microorganisms or enzymes are then added until a concentration of 0.2 to 0.5 g of microorganism or enzyme weight per ml of solution is reached. With the resulting suspension, the carrier material is soaked and possibly subsequently pressed out to a predetermined value in order to be able to set a desired degree of impregnation. Then the impregnated carrier material according to a preferred embodiment of the inventive concept in a suitable electrolyte solution, which, for. B. Ca 2+ , Co 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Ba 2+ , Fe 2+ , Al 3+ ions, preferably CaCl₂ solution, introduced to ionotropic gelation. By exchanging z. B. the Na⁺ ions against the Ca 2+ ions there is a crosslinking of the alginic acids and it forms a network, a gel that contains the microorganisms or enzymes.
Nachdem die Gelschicht 30 bis 60 Minuten ausgehärtet wor den ist, wird das behandelte Trägermaterial aus der Lösung herausgenommen, gewaschen und getrocknet.After the gel layer has been cured for 30 to 60 minutes is, the treated carrier material from the solution taken out, washed and dried.
Durch die Verwendung porösen, insbesondere makroporösen Trägermaterials, ist eine gute Zugänglichkeit für Reaktan den zu den Mikroorganismen bzw. Enzymen bis in den Kern des Trägermaterials gegeben. Außerdem steht dadurch eine große Oberfläche im Trägermaterial zur Verfügung, die von den Mikroorganismen bzw. Enzymen besetzt werden kann. Andererseits weist die erfindungsgemäße Methode nicht die typischen Nachteile bekannter trägergebundener Immo bilisierungsverfahren auf, da die Mikroorganismen oder Enzyme durch die Gelschicht fest an die Oberfläche des Trägermaterials gebunden sind und nicht ausgewaschen werden können. Durch die freie Wahl des Imprägnierungs grades kann die Dicke der Gelschicht variiert werden, so daß auch nicht die Nachteile der Gelkörper verwendenden Immobilisierungsmethoden, bei denen das Innere der Gelkör per kaum von Reaktanden erreicht werden kann, auftreten. Ferner ist infolge der Verwendung eines Trägergerüstes in Verbindung mit einer bindenden Gelschicht eine hervor ragende mechanische Haltbarkeit gewährleistet. Durch die ionotrope Gelierung ist eine besonders schonende Behandlung der Mikroorganismen bzw. Enzyme sichergestellt, da die Mikroorganismen bzw. Enzyme z.B. weder toxischen Ausgangs produkten des Trägermaterials noch zu hohen Temperaturen, die z.B. bei der Synthese des Trägermaterials entstehen können, ausgesetzt werden.By using porous, especially macroporous Carrier material, is a good access for reactants to the microorganisms or enzymes right down to the core given the carrier material. It also stands for one large surface area available in the backing material can be occupied by the microorganisms or enzymes. On the other hand, the method according to the invention does not the typical disadvantages of known carrier-bound real estate bilization procedure because the microorganisms or Enzymes through the gel layer firmly to the surface of the Carrier material are bound and not washed out can be. Through the free choice of impregnation the thickness of the gel layer can be varied, so that does not use the disadvantages of the gel body Immobilization methods in which the inside of the gel body can hardly be reached by reactants. Furthermore, due to the use of a support structure in combination with a binding gel layer outstanding mechanical durability guaranteed. Through the Ionotropic gelation is a particularly gentle treatment of the microorganisms or enzymes ensured because the Microorganisms or enzymes e.g. neither toxic output products of the carrier material still at high temperatures, e.g. arise in the synthesis of the carrier material can be exposed.
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungs gemäßen Verfahrens besteht darin, das nach den obengenannten Verfahrensschritten imprägnierte und ionotrop behandelte Trägermaterial nach dessen Trocknung erneut in die Elektro lytlösung einzubringen und anschließend zu trocknen. Dadurch werden die Netzwerkeigenschaften verbessert, da durch den nochmaligen Kontakt der Gelschicht mit der ver netzenden Elektrolytlösung nach der Trocknung der Gelschicht das Netzwerk dichter wird, und so die Konzentration der Mikroorganismen bzw. Enzyme bis auf etwa 0,7 bis 1,0 g Mikroorganismen- bzw. Enzymgewicht pro ml Gel gesteigert werden kann. Dies erhöht die mikrobielle bzw. enzymatische Aktivität pro Volumen und die mechanische Stabilität. Ferner ist es vorteilhaft, dem Gel Nährstoffe für die Mikroorganismen zuzugeben, um eine hohe biologische Akti vität zu gewährleisten. Die Trägerteilchen besitzen zweckmäßigerweise einen Durchmesser von etwa 1 cm, doch sind grundsätzlich Durchmesser von 2 mm bis einige cm möglich. Auch große Blöcke sind bei großen Porenradien anwendbar.A particularly advantageous embodiment of the invention According to the method is that according to the above Process steps impregnated and ionotropically treated Backing the substrate into the electrical system after it has dried Introduce lyt solution and then dry. This improves the network properties because through the renewed contact of the gel layer with the ver wetting electrolyte solution after drying the gel layer the network becomes denser, and so the concentration of Microorganisms or enzymes up to about 0.7 to 1.0 g Microorganism or enzyme weight increased per ml of gel can be. This increases the microbial or enzymatic Activity per volume and mechanical stability. It is also advantageous to provide the gel with nutrients for the Add microorganisms to a high biological acti ensure vity. Have the carrier particles expediently a diameter of about 1 cm, but are basically from 2 mm to a few cm in diameter possible. Large blocks are also with large pore radii applicable.
Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren kann er gänzt und abgewandelt werden. So kann beispielsweise vor Einbringen des Gels in das Trägermaterial ein bindendes Grundierungsmittel eingebracht werden, um die Haftwirkung der Gelschicht noch zu erhöhen. Ferner kann alternativ zur ionotropen Gelierung unter Verwendung einer Elektrolytlö sung eine andere Methode der Gelierung angewendet werden, die statt dessen eine Vernetzungschemikalien enthaltende Lösung benutzt. Dabei wird das mit der Mikroorganismen bzw. Enzyme enthaltenden Suspension getränkte Trägermaterial in eine Lösung mit Vernetzungschemikalien zur Gelierung eingebracht, ausgehärtet, gewaschen und getrocknet.He can use the immobilization method according to the invention be added and modified. For example a binding before introducing the gel into the carrier material Primers are added to the adhesive effect to increase the gel layer even more. Furthermore, alternatively to ionotropic gelation using an electrolyte solution another method of gelation can be used which instead contains a crosslinking chemical Solution used. This is what happens with the microorganisms or enzyme-containing suspension impregnated carrier material in a solution with crosslinking chemicals for gelation introduced, cured, washed and dried.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Enzymen bietet eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten.The inventive method for immobilizing Microorganisms and enzymes offer a wide range of applications.
Die Lösung spezieller Probleme bei der Abwasserreinigung, wie die Behandlung schwer abbaubarer Stoffe (z.B. Lignine) scheitert bisher oft daran, daß sich dafür speziell ge züchtete Mikroorganismenarten für die üblichen trägerge bundenen Immobilisierungsmethoden nicht eignen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können auch diese speziellen Bakterien und Pilze immobilisiert und zur Abwasserbehandlung herangezogen werden.The solution to special problems in wastewater treatment, like the treatment of poorly degradable substances (e.g. lignins) Hitherto often fails because of the fact that ge cultured microorganism species for the usual carriers bound immobilization methods are not suitable. By the Methods according to the invention can also use these special ones Bacteria and fungi immobilized and for wastewater treatment be used.
Durch die hohe erreichbare mikrobielle bzw. enzymatische Aktivität eignet sich die Erfindung besonders für die Durchführung von Biosynthesen, wie z.B. Medikamenten, hochwertigen Chemika lien, Enzymen usw.Due to the high achievable microbial or enzymatic The invention is particularly suitable for activity Performing biosynthesis, e.g. Medicines, high quality chemicals lien, enzymes etc.
Da beim erfindungsgemäßen Verfahren eine größtmögliche Aktivität der Mikroorganismen bei geringem Reaktorvolumen möglich ist, bietet die Erfindung auch Aussicht auf wirtschaftliche Alternativen zur Energiegewinnung, wie z.B. Erzeugung von Methangas aus organischem Abfall oder Abwasser, Methanol- oder Ethanolgewinnung aus pflanz lichen Produkten mittels spezieller Mikroorganismen usw.Since the largest possible in the method according to the invention Activity of the microorganisms in a small reactor volume is possible, the invention also offers prospects economic alternatives to energy production, such as e.g. Generation of methane gas from organic waste or wastewater, methanol or ethanol from plants products using special microorganisms etc.
Weiter besteht die Möglichkeit, mit erfindungsgemäß immobilisierten Mikroorganismen aus einer verdünnten Lösung von Stoffen bestimmte Stoffe, wie z.B. Metallionen, aufzunehmen und anzureichern.There is also the possibility of using the invention immobilized microorganisms from a diluted Solution of substances certain substances, e.g. Metal ions, record and enrich.
Schließlich bietet die Erfindung auch die Möglichkeit, spezielle Mikroorganismen zu immobilisieren und durch die Schaffung günstiger Umweltbedingungen anzureichern.Finally, the invention also offers the possibility of to immobilize and by special microorganisms enrich the creation of favorable environmental conditions.
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