DE3609924A1 - PRODUCTION OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR - Google Patents
PRODUCTION OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTORInfo
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ENGLANDENGLAND
Herstellung des epidermalen WachstumsfaktorsProduction of the epidermal growth factor
Priorität: Datum: 25. März 1985Priority: Date: March 25, 1985
Land: Großbritannien Aktenzeichen: 8507666Country: Great Britain File Number: 8507666
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Herstellung des epidermalen WachstumsfaktorsProduction of the epidermal growth factor
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung des epidermalen Wachstumsfaktors (Epidermal Growth Factor, EGF).The present invention relates to the manufacture of the epidermal Epidermal Growth Factor (EGF).
Die Synthese von Genen und deren Expression in Mikroorganismen ist eine neue, jedoch bereits etablierte Technik. Jedoch beobachtet man im allgemeinen, daß die direkte Expression von kleinen Polypeptiden, beispielsweise den Insulinketten, in E. coli sehr ineffizient ist. Dies beruht hauptsächlich darauf, daß eine sehr rasche Proteolyse durch die intrazellulären Proteasen stattfindet. Ein weiterer Grund besteht jedoch in der Notwendigkeit, eine wirksame Ribosomen-Bindungsstelle sowie benachbarte Sequenzen innerhalb des Gens zu konstruieren, die mit der erwünschten Amino-terminalen Sequenz kompatibel sind. Die Kriterien, die die Effizienz des Translationsstartes bestimmen, sind bislang nicht vollständig bekannt. Zusätzlich benötigt man ein Methionincodon als Initiator und das N-terminale Methionin kann möglicherweise nicht in effizienter Weise durch die Proteinsynthesemaschine des Wirts enfernt werden, wie es z.B. beim menschlichen Wachstumshormon der Fall ist, insbesondere bei einem hohen Expressionsgrad.The synthesis of genes and their expression in microorganisms is a new but already established technique. However, it is generally observed that direct expression of small polypeptides, for example the insulin chains, is very inefficient in E. coli. This is mainly due to the fact that a very rapid proteolysis takes place by the intracellular proteases. Another reason however, there is a need to have an effective ribosome binding site as well as constructing contiguous sequences within the gene that are compatible with the desired amino-terminal sequence are. The criteria that determine the efficiency of the translation start are not yet fully known. Additionally required using a methionine codon as the initiator and the N-terminal methionine may not be able to efficiently through the Protein synthesis machine of the host are removed, as is the case for example with human growth hormone, especially with a high level of expression.
Als Alternative zu der Expression eines fertigen Polypeptides kann man ein synthetisches Gen an einen Teil eines Gens für ein Wirtsprotein fusionieren, das selbst in einer kontrollierbaren Art und Weise in einem hohen Grad exprimiert wird (EP-A-0001930). Das erhaltene Fusionsprotein kann gegen Proteolyse gut stabilisiert werden. Ein gewünschtes Polypeptid kann anschließend durch spezifisch chemische oder enzymatische Spaltung freigesetzt werden.As an alternative to expressing a finished polypeptide, one fuses a synthetic gene to part of a gene for a host protein that is itself in a controllable manner and Manner is expressed to a high degree (EP-A-0001930). The received Fusion protein can be well stabilized against proteolysis. A desired polypeptide can then be specifically chemical or enzymatic cleavage.
EGF kann den Verlust der Wolle bei Schafen bewirken (GB-A-2082186). Jedoch sind für diesen Zweck beträchtliche Mengen des Wachstumsfaktors erforderlich, wobei die Dosis 3 bis 5 mg pro Schaf beträgt. EGF kann man aus den submaxi 11aren Lymphdrüsen von erwachsenen mann-EGF can cause the loss of wool in sheep (GB-A-2082186). However, considerable amounts of the growth factor are required for this purpose, the dose being 3 to 5 mg per sheep. EGF can be obtained from the submaxillary lymph glands of adult male
lichen Mäusen isolieren. Dieses murine EGF (mEGF) ist ein Polypeptid aus 53 Aminosäureresten mit bekannter Primärstruktur. Jedoch sind die Mengen mEGF, die man auf diese Weise isolieren kann, sehr gering.isolate mice. This murine EGF (mEGF) is a polypeptide of 53 amino acid residues with known primary structure. However, the amounts of mEGF that can be isolated in this way are large small amount.
Es wurde nun gefunden, daß ein Fusionsprotein, das eine Lysin (Lys)-Verbindung zu mEGF enthält, in E. coli-Zellen exprimiert und durch eine Lysin-spezifische Proteolyse zur Freisetzung des mEGF gespalten werden kann. mEGF besitzt kein Lysin und ist deshalb gegenüber den spezifischen Proteasen resistent. Dieser Weg besitzt generelle Anwendbarkeit und ermöglicht die Herstellung von sehr viel größeren Mengen, als es bislang möglich war, von jedem EGF oder EGF-Analogen, das keinen internen Lysinrest enthält. Verschiedene Konstruktionen von alternativen Fusionsproteinen, die diesen Weg nicht enthielten, ergaben kein mEGF.It has now been found that a fusion protein that has a lysine (Lys) compound to mEGF contains, expressed in E. coli cells and by a lysine-specific proteolysis can be cleaved to release the mEGF. mEGF has no lysine and is therefore opposite to the resistant to specific proteases. This approach has general applicability and enables the production of much larger ones Amounts than previously possible of any EGF or EGF analog, that does not contain an internal lysine residue. Different constructions of alternative fusion proteins that did not contain this pathway did not result in mEGF.
/1 Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz zur Verfügung/ 1 According to the present invention, a DNA sequence is provided
gestellt, die ein Fusionsprotein kodiert, das aus einem Trägerprotein besteht, das über einen Lysinrest an EGF oder ein EGF-Analogen' gebunden ist, wobei EGF oder das EGF-Analoge keinen internen Lysinrest enthalten und wobei das EGF oder das EGF-Analoge aus dem Fusionsprotein durch eine Lysin-spezifische Protease abspaltbar ist.which encodes a fusion protein that consists of a carrier protein which is linked to EGF or an EGF analog via a lysine residue, wherein EGF or the EGF analog does not have an internal lysine residue and wherein the EGF or the EGF analogue can be cleaved from the fusion protein by a lysine-specific protease.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Vektor zur Verfügung, der diese DNA-Sequenz enthält und der in der Lage ist, in einem transformierten Wirt das Fusionsprotein zu exprimieren. In gleicher Weise bildet ein mit einem solchen Vektor transformierter Wirt einen Teil der Erfindung. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von EGF oder eines EGF-Analogen zur Verfügung, wobei das EGF keinen internen Lysinrest enthält und wobei das Verfahren aus der Kultivierung eines auf diese Weise transformierten Wirtes besteht, so daß das Fusionsprotein exprimiert wird und in der Behandlung des Fusionsproteins mit einer Lysinspezifischen Protease um das EGF oder das EGF-Analoge freizusetzen. Das auf diese Weise erhaltene EGF oder EGF-Analoge kann zur Enthaarung eines Tieres, insbesondere zurThe invention further provides a vector that can accommodate these Contains DNA sequence and which is capable of expressing the fusion protein in a transformed host. Forms in the same way a host transformed with such a vector forms part of the invention. The invention also provides a method of manufacture from EGF or an EGF analog are available, wherein the EGF does not contain an internal lysine residue and wherein the method is derived from cultivation a host transformed in this way so that the fusion protein is expressed and used in the treatment of the Fusion protein with a lysine-specific protease around the EGF or to release the EGF analog. The EGF or EGF analog obtained in this way can be used for depilation of an animal, in particular for
Entfernung der Wolle beim Schaf durch Verabreichung an das Tier verwendet werden.Removal of wool from sheep can be used by administration to the animal.
Eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, das Fusionsprotein zu exprimieren, die eine Lysin-Verbindung zu einem EGF oder einem EGF-Analogen enthält, das kein Lysin enthält, wird in einem Vektor zur Verfugung gestellt, z. B. einem Plasmid. Die Codons für den Lysinrest und das EGF oder das EGF-Analoge werden im selben Leseraster (reading frame) wie in den Codons für das Trägerprotein zur Verfugung gestellt. Diesen Codons ist ein Promotor vorgeschaltet. Ein Wirt wird durch den Vektor transformiert. Im allgemeinen ist der Wirt ein bakterieller Wirt, wie z. B. E. coli. Anschließed wird das Fusionsprotein im Wirt exprimiert.A DNA sequence that is able to express the fusion protein that makes a lysine link to an EGF or a EGF analogs that do not contain lysine will be in a vector made available, e.g. B. a plasmid. The codons for the Lysine residue and the EGF or the EGF analog are in the same reading frame (reading frame) as provided in the codons for the carrier protein. A promoter precedes these codons. A host is transformed by the vector. Generally the host is a bacterial host such as e.g. B. E. coli. Then it will Fusion protein expressed in the host.
Es wurde gefunden, daß eine zur Lösung der Aufgabe geeignete DNA-Sequenz aus einem Promotor, gefolgt von einem Trägerprotein-Gen, das durch ein Lysincodon an das Gen für das EGF oder EGF-Analoge gebunden ist, an das seinerseits unmittelbar ein Stop-Codon folgt, besteht. Eine derartige Sequenz kann man dadurch herstellen, indem man zunächst ein synthetisches Gen konstruiert, indem dem Gen für das EGF oder das EGF-Analoge unmittelbar ein Lys-Codon vorgeschaltet ist und dem unmittelbar ein Stop-Codon folgt. Dieses synthetische Gen wird mit einer DNA-Sequenz, die einen Promotor für das Trägerprotein und das Trägerprotein-Gen enthält, verbunden. Vorzugsweise stattet man das Trägerprotein-Gen und den Anfang des synthetischen Gens (das Lys-Codon-Ende) mit passenden, zur Komplementärbildung geeigneten Enden ("sticky ends") aus. Die Verbindung führt man so durch, daß die Codons des synthetischen Gens im korrekten Leseraster bezüglich des Promotors und des Trägerprotein-Gens sind.It has been found that a suitable DNA sequence to achieve the object from a promoter followed by a carrier protein gene linked to the gene for the EGF or EGF analog by a lysine codon is, which in turn is immediately followed by a stop codon. Such a sequence can be produced by First of all, a synthetic gene is constructed in that the gene for the EGF or the EGF analog is preceded by a Lys codon and immediately followed by a stop codon. This synthetic gene is made with a DNA sequence that is a promoter for the carrier protein and containing the carrier protein gene. It is preferable to equip the carrier protein gene and the beginning of the synthetic gene (the Lys codon end) with matching ends suitable for complementary formation ("sticky ends"). The connection is carried out in such a way that the codons of the synthetic gene are in the correct reading frame with respect to the promoter and carrier protein gene.
Andererseits kann das Fusionsprotein, das von einer DNA-Sequenz codiert wird, zwei oder mehr Wiederholungen von EGF oder eines EGF-Analogen enthalten. Dabei ist ein Abschnitt mit dem nächsten durch einen Lysinrest verbunden, so daß die Behandlung des Fusionsproteins mit einer Lysin-spezifischen Protease jedes EGF oder On the other hand, the fusion protein encoded by a DNA sequence can have two or more repeats of EGF or one EGF analogs included. One section is connected to the next by a lysine residue, so that the treatment of the fusion protein with a lysine-specific protease of each EGF or
•ν• ν
EGF-Analoge freisetzt. Für diese Ausführung konstruiert man ein synthetisches Gen, worin die DNA-Sequenzen, die jedes EGF oder EGF-Analoge codieren in tandemartiger Weise durch Lysincodons verbunden sind. Wiederholungen einer DNA-Sequenz eines EGF oder EGF-Analogen können deshalb über Lysin-Codons verbunden werden. Ein synthetisches Gen dieser Art kann anschließend mit einer DNA-Sequenz, die einem Promotor für das Trägerprotein und das Trägerprotein-Gen, wie oben, enthält, verbunden werden.EGF analog releases. For this execution a synthetic one is constructed A gene wherein the DNA sequences encoding each EGF or EGF analog are linked in tandem by lysine codons are. Repetitions of a DNA sequence of an EGF or EGF analog can therefore be linked via lysine codons. A synthetic one Gene of this type can then be linked to a DNA sequence that is a promoter for the carrier protein and the carrier protein gene, as above, contains, be connected.
Wichtig ist, daß das EGF oder EGF-Analoge, das das Fusionsprotein bildet, keinen internen Lysinrest enthält. Vorzugsweise ist das EGF mEGF.It is important that the EGF or EGF analog that forms the fusion protein does not contain an internal lysine residue. Preferably this is EGF mEGF.
EGF-Analoge sind synthetische und natürliche Derivate aus der EGF-Polypeptid-Familie, die eine Sequenz von Aminosäuren (oder Aminosäure-Substituenten) enthalten, die in der Lage ist, das Haarwachstum zu kontrollieren, insbesondere die Entfernung der Wolle bei einem Schaf. EGF-Analoge können deshalb Fragmente eines EGF sein, z. B. mEGFI-45, mEGFI-47, mEGF1-48 oder mEGF1-51. Gleichfalls kann ein Analoges einen Aminosäurerest an Stelle des natürlich vorkommenden Restes enthalten, der die Wirkung des Analogen in der Regulierung des Haarwachstums, und insbesondere in der Wirkung als Entwollungsmittel für Schafe, nicht beeinträchtigt.EGF analogs are synthetic and natural derivatives of the EGF polypeptide family that contain a sequence of amino acids (or Amino acid substituents), which is capable of hair growth control, especially the removal of wool from a sheep. EGF analogs can therefore be fragments of an EGF, e.g. B. mEGFI-45, mEGFI-47, mEGF1-48 or mEGF1-51. Likewise, a Analog contains an amino acid residue in place of the naturally occurring residue that regulates the effect of the analog of hair growth, and in particular in its effect as a decolorizing agent for sheep, is not impaired.
Das synthetische Gen kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Oligodeoxynucleotide für das Gen können durch eine bekannte manuelle Festphasenmethode, z. B. ähnlich der von Sproat und Bannwarth (1983) beschriebenen, synthetisiert werden. Diese Oligodeoxynucleotide, ausgenommen jene, die die 5'-0H-Enden des zusammengesetzten Gens ergeben, werden anschließend mit einem Überschuß vonThe synthetic gene can be produced by known methods. Oligodeoxynucleotides for the gene can be obtained by a known one manual solid phase method, e.g. B. similar to that described by Sproat and Bannwarth (1983), synthesized. These oligodeoxynucleotides, excluding those that have the 5'-OH ends of the compound Gens are then given with an excess of
32
[£ P]-ATP und Polynucleotid-Kinase vollständig umgesetzt.
Verbindungsversuche werden unter Verwendung von verschiedenen Unterklassen der Oligodeoxynucleotide durchgeführt, die auf diese Weise
erhaltenen Zwischenprodukte beispielsweise durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt und anschließend zur Bildung des synthe-32
[£ P] -ATP and polynucleotide kinase fully implemented. Connection experiments are carried out using different subclasses of oligodeoxynucleotides, the intermediates obtained in this way are purified, for example, by polyacrylamide gel electrophoresis and then used to form the synthetic
tischen Gens miteinander verbunden, worin das Gen für das EGF oder EGF-Analoge zwischen einem Lys-Codon und einem Stop-Codon Sandwichartig eingebettet ist. Die verwendeten Verfahren können ähnlich jenen, die von Smith et al. (1982) und Edge et al.(1981) bereits beschrieben worden sind, sein. Im allgemeinen stellt man das synthetische Gen mit "klebrigen" Enden (sticky ends) her, um die Verbindung in einem geeigneten Vektor zu erleichtern. Anschließend wird ein Wirt mit dem Vektor transformiert und die Kolonien, die das synthetische Gen enthalten, selektiert.tischen gene linked together, in which the gene for the EGF or EGF analog is sandwiched between a Lys codon and a stop codon. The procedures used can be similar those reported by Smith et al. (1982) and Edge et al. (1981) have already been described. Generally one makes the synthetic one Make a gene with "sticky ends" to facilitate connection in a suitable vector. Then will a host is transformed with the vector and the colonies containing the synthetic gene selected.
Das synthetische Gen verbindet man mit einer DNA-Sequenz, die einen Promotor für ein Trägerprotein und das Trägerprotein-Gen enthält. Die Sequenz kann ein separates Fragment oder Teil eines Vektors sein. Die Sequenz kann gleichfalls einen Operator und/oder Attenuator in Abhängigkeit des verwendeten Expressionssystems, enthalten. In der vorliegenden Anmeldung wurde ein Teil eines Trp-Operons, das einen trp-Promotor, Attenuator und einen Teil des TrpE-Gens enthält, verwendet. Jedoch kann man das synthetische Gen unter die Kontrolle jedes geeigneten prokaryotisehen Promotors bringen. Ein Promotor/Operator, wie z. B. ein tac-Promotor-Operator-Systern, kann ebenfalls verwendet werden.The synthetic gene is linked to a DNA sequence that creates a Contains promoter for a carrier protein and the carrier protein gene. The sequence can be a separate fragment or part of a vector be. The sequence can likewise contain an operator and / or attenuator, depending on the expression system used. In the present application, part of a Trp operon, which is a trp promoter, attenuator and part of the TrpE gene contains, used. However, one can bring the synthetic gene under the control of any suitable prokaryotic promoter. A Promoter / operator, e.g. B. a tac promoter-operator system, can can also be used.
Das Trägerprotein muß ein Fusionsprotein bilden, das nicht-sensitiv für die proteolytische Spaltung durch endogene Proteasen im Wirt ist, in dem das Fusionsprotein exprimiert wird. Wünschenswerterweise liegt das meiste des Fusionsproteins im Wirt in Form von Einschlußkörperchen vor. Das Trägerprotein kann oder kann nicht selbst ein komplettes Protein sein. Wie vorhin angeführt, wurde im vorliegenden Fall ein Teil eines Trp-Operons verwendet. Folglich besteht das Fusionsprotein, das exprimiert wurde, aus einem Teil des TrpE-Proteins, das über einen Lys-Rest an mEGF gebunden ist.The carrier protein must form a fusion protein that is non-sensitive for proteolytic cleavage by endogenous proteases in the host in which the fusion protein is expressed. Desirably most of the fusion protein in the host is in the form of inclusion bodies. The carrier protein may or may not be itself be complete protein. As stated earlier, part of a Trp operon was used in the present case. Hence that exists Fusion protein that was expressed from part of the TrpE protein bound to mEGF via a Lys residue.
Der prokaryotisehe oder eukaryotische Wirt, der in der Lage ist, das Fusionsprotein zu exprimieren, kann in jeder geeigneten Weise hergestellt werden, z. B. kann man einen Expressions-Vektor für dasThe prokaryotic or eukaryotic host capable of that Expressing fusion protein can be made in any suitable manner be e.g. B. one can use an expression vector for the
Fusionsprotein durch Verbindung des synthetischen Gens im korrekten Leseraster mit dem Trägerprotein-Gen, das selbst Teil eines DNA-Fragments ist, das einen Promotor enthält, herstellen und dieses Verbindungsprodukt in den geeigneten Vektor einbringen. Der Vektor wird anschließend zur Transformation des Wirtes verwendet. Der Wirt wird unter solchen Bedingungen kultiviert, daß die Expression des Fusionsproteins stattfinden kann. Es wurde gefunden, daß man den Produktionsgrad des Fusionsproteins erhöhen kann, indem man die Kopienzahl eines Plasmids, das das Fusionsprotein exprimiert, erhöht, unter Verwendung eines Temperatur-sensitiven Plasmids, das man als "runaway-copy-number"-Plasmid bezeichnet.Fusion protein by joining the synthetic gene in the correct Reading frame with the carrier protein gene, which is itself part of a DNA fragment that contains a promoter, and this Introduce linker product into the appropriate vector. The vector is then used to transform the host. The host is cultivated under such conditions that expression of the fusion protein can take place. It was found that the Increase the level of production of the fusion protein by increasing the number of copies of a plasmid expressing the fusion protein, increased using a temperature-sensitive plasmid called a "runaway copy-number" plasmid.
Man erhält das EGF oder EGF-Analoge durch Extraktion des Fusions-Proteins aus den Wirts-Zellen und Verdauung mit einer Lys-spezifischen Protease. Das EGF oder EGF-Analoge wird anschließend freigesetzt und kann beispielsweise durch Chromatographie gereinigt werden. Eine geeignete Lys-spezifische Protease ist die Endoproteinase LysC, die Proteine an der Carboxyl-Gruppe des Lys spaltet (US-A-4,414,332).The EGF or EGF analog is obtained by extracting the fusion protein from the host cells and digestion with a Lys-specific protease. The EGF or EGF analog is then released and can be purified, for example, by chromatography. A suitable Lys-specific protease is endoproteinase LysC, which cleaves proteins on the carboxyl group of Lys (US-A-4,414,332).
Im vorliegenden Fall wurde Endoproteinase Lys C wie folgt, erhalten. Ein über-Nacht-Ansatz von Lysobacter-Enzymogenes (ATCC 27796) wurde inokuliert und in 500 ml Schüttelkolben, die 0,25 % Hefe-Extrakt, 0,1 % Glucose, 1,0 % Trypton-Soja und 1,0 mM MgCl2 in H2O enthalten unter Rühren bei 25 0C für 53 Stunden kultiviert. Der überstand wurde durch Zentrifugation aus dem Fermentations-Produkt gewonnen und die Endoproteinase LysC, wie in der US-A-4,414,332 beschrieben, isoliert. Der End-pH der Fermentation betrug 8 - 9, der pH-Wert wurde jedoch nicht spezifisch kontrolliert.In the present case, endoproteinase Lys C was obtained as follows. An overnight batch of Lysobacter-Enzymogenes (ATCC 27796) was inoculated and placed in 500 ml shake flasks containing 0.25% yeast extract, 0.1 % glucose, 1.0 % tryptone soy and 1.0 mM MgCl 2 contained in H 2 O cultured with stirring at 25 0 C for 53 hours. The supernatant was obtained from the fermentation product by centrifugation and the endoproteinase LysC, as described in US Pat. No. 4,414,332, was isolated. The final pH of the fermentation was 8-9, but the pH was not specifically controlled.
Das EGF oder das EGF-Analoge, das man erhält, kann zur Enthaarung von Tieren und insbesondere zur Entwollung von Schafen verwendet werden. Das EGF oder EGF-Analoge kann dem Schaf durch subkutane Infusion oder Injektion, durch eine langsam-Infusion aus einer implantierten Kapsel oder per os verabreicht werden. VorzugweiseThe EGF or the EGF analog that is obtained can be used for depilation of animals and in particular for dehairing of sheep. The EGF or EGF analogues can the sheep are administered by subcutaneous infusion or injection, through a slow infusion from an implanted capsule or per os. Preferably
verabreicht man eine genügende Menge des EGF oder EGF-Analogen um die mittlere Stapel-Festigkeit auf 6 N/ktex oder darunter zu reduzieren, beispielsweise 2-6 N/ktex. Verfahren zur Durchführung dieser Messung sind in A.J. Gordon, Aust. J. of Exp. Agric. Anim. Husb. 20 40 - 49 und Moore et al, Search. 12, 128 - 129 beschrieben. Typischerweise verabreicht man jedem Schaf 3 - 5 mg des EGF oder EGF-Analogen.a sufficient amount of the EGF or EGF analog is administered to reduce the average stack strength to 6 N / ktex or below, for example 2-6 N / ktex. Procedure for implementation of this measurement are in A.J. Gordon, Aust. J. of Exp. Agric. Anim. Husb. 20 40-49 and Moore et al, Search. 12, 128-129. Typically 3 - 5 mg of the EGF or are administered to each sheep EGF analogs.
In den Zeichnungen bedeuten:In the drawings:
Figur 1 zeigt die Sequenz des Lys-mEGF-Gens aus dem Beispiel 1;FIG. 1 shows the sequence of the Lys-mEGF gene from Example 1;
Figur 2 zeigt die Konstruktion des Expressions-Vektors pWRL500 gemäß Beispiel 2;Figure 2 shows the construction of the expression vector pWRL500 according to Example 2;
Figur 3 zeigt die Konstruktion des Expressions-Vektors pWRL505 gemäß Beispiel 5; undFigure 3 shows the construction of the expression vector pWRL505 according to Example 5; and
Figur 4 zeigt die Konstruktion des Expressions-Vektors pEGFtactrp2 gemäß Beispiel 6.FIG. 4 shows the construction of the expression vector pEGFtactrp2 according to example 6.
Beispiel 1: Synthese des Lys-mEGF-Gens und Herstellung eines Plasmids enthaltend dieses Gen.Example 1: Synthesis of the Lys-mEGF gene and production of a plasmid containing this gene.
Es wurde das in Figur 1 gezeigte Lys-mEGF-Gen synthetisiert.The Lys-mEGF gene shown in FIG. 1 was synthesized.
Das Gen codiert für die Aminosäure-Sequenzen des mEGF und für ein Verbindungs-Peptid, Leu-Lys. Das Verbindungs-Protein erlaubt die Insertion des Gens in die Bglll-Stelle, die das Codon für 11e-323 in einem TrpE-Gen enthält. Dadurch wurde die Expression eines Fusions-Proteins aus 378 Aminosäureresten möglich, woraus mEGF, das keine Lysin-Reste aufweist, durch eine Lysin-spezifische Protease, Endoproteinase LysC, freigesetzt werden konnte. Am Ende des Gens wurde ein Stop-Codon, gefolgt von einer EcoRI-Restriktions-Stelle, eingebaut, um das Klonieren in die BamHI - EcoRI-Stelle von pAT153 zu ermöglichen.The gene codes for the amino acid sequences of the mEGF and for a Linking peptide, Leu-Lys. The junction protein allows the gene to be inserted into the BglII site containing the codon for 11e-323 in contains a TrpE gene. This made the expression of a fusion protein of 378 amino acid residues possible, from which mEGF, the none Has lysine residues, could be released by a lysine-specific protease, endoproteinase LysC. At the end of the gene it was a stop codon followed by an EcoRI restriction site incorporated, to allow cloning into the BamHI - EcoRI site of pAT153 enable.
■/I. -'-■ : ' -3509924 ■ / I. -'- ■ : ' -3509924
-X--X-
Die Codons wurden auf Basis der bevorzugten Verwendung durch E. coli in hochgradig exprimierten Proteinen ausgewählt (Grantham et al, 1981; Gouy & Gautier 1982). Eine Anzahl von Modifikationen wurde durchgeführt, um Bereiche von unerwünschter Komplementarität und Wiederholungen zu entfernen, die möglicherweise die korrekte Verbindung der Oligodeoxynucleotid-Segmente beeinflussen wür.den. Eine durchschnittliche Länge von 21 Resten wurde für die Oligonucleotid-Synthese gewählt, da diese ausreichend gut synthetisiert und gereinigt werden konnten und weiterhin eine gute Überlappung für eine ausreichende Hybridisierung vor Verbindung ergeben.The codons were chosen based on the preferred use by E. coli selected in highly expressed proteins (Grantham et al, 1981; Gouy & Gautier 1982). A number of modifications were made performed to remove areas of unwanted complementarity and repetition that may create the correct connection of the oligodeoxynucleotide segments would affect. One average length of 21 residues was used for oligonucleotide synthesis chosen because these could be synthesized and purified sufficiently well and still have a good overlap for result in sufficient hybridization prior to connection.
Die sechzehn Oligodeoxynucleotide EGF-3 bis EGF-18, gezeigt in Figur 1, wurden durch eine manuelle Festphasen-Methode synthetisiert, die auf jener von Duckworth et al. (1981) und Gait et al. (1982) beschriebenen Methode beruht, jedoch mit den folgenden Modifikationen, die vergleichbar sind, wie sie von Sproat. & Bannwarth (1983) beschrieben wurden. Das 3'-terminale Deoxynucleosid wurde durch einen 3'-0-Succinamido-Teil an mit 3-Aminopropyl versehenen Glaskügelchen mit kontrollierten Poren (240 A Poren-Größe) gebunden. Geschützte Dinucleosid-Triethylammonium-Salze wurden nach Chattopadhyaya & Reese (1979) hergestellt, Mesitylen - Sulphonyl-3-nitro-1,2,4-triazol mit N-Methylimidazol-Katalysator (Efimov et al, 1982) wurde zur Aktivierung der geschützten Mono- und Di-Deoxynucleotid-Phosphat-Diester für jeden Kondensierungsschritt verwendet. Trichloressigsäure (10 %) in 1,1,1-Trichlorethan wurde zur Entfernung der Dimethoxytrityl-Schutzgruppe für jeden Zyklus für die kürzeste erforderliche Zeit, überprüft durch die Entfernung von gefärbtem Material (40 - 80 Sekunden), verwendet. Das letzte geschützte Oligodeoxynucleotid wurde mit 4-Nitrobenzaldoxim und 1,1,3,3-Tetramethylguanidin in 50 % Dioxan zur Abspaltung der 2-Chlorophenyl-Schutzgruppen und zur Abspaltung des Oligodeoxynucleotids vom Glas-Träger, verwendet. Es folgten Ammoniak und Essigsäure-Schutzentfernungsschritte, wie von Duckworth et al, 1981 beschrieben.The sixteen oligodeoxynucleotides EGF-3 through EGF-18 shown in Figure 1 were synthesized by a manual solid phase method based on that of Duckworth et al. (1981) and Gait et al. (1982), but with the following modifications, which are comparable to those of Sproat. & Bannwarth (1983). The 3'-terminal was deoxynucleoside-3'-0-succinamido part bound by a shipping to 3-aminopropyl controlled pore glass beads Henen (240 A pore size). Protected dinucleoside triethylammonium salts were prepared according to Chattopadhyaya & Reese (1979), mesitylene - sulphonyl-3-nitro-1,2,4-triazole with N-methylimidazole catalyst (Efimov et al, 1982) was used to activate the protected Mono - and di-deoxynucleotide phosphate diesters used for each condensation step. Trichloroacetic acid (10 %) in 1,1,1-trichloroethane was used to remove the dimethoxytrityl protecting group for each cycle for the shortest time required as verified by the removal of colored material (40-80 seconds). The last protected oligodeoxynucleotide was used with 4-nitrobenzaldoxime and 1,1,3,3-tetramethylguanidine in 50 % dioxane to cleave the 2-chlorophenyl protecting groups and to cleave the oligodeoxynucleotide from the glass support. Ammonia and acetic acid deprotection steps as described by Duckworth et al, 1981 followed.
Die Oligodeoxynucleotide wurden durch Ionen-Austausch HPLC-Chromato-The oligodeoxynucleotides were ion-exchanged by HPLC chromatography
graphie über eine Partisil-SAX-Säule bei 55 0C in 30 % Formamid mit einem Gradienten von 10 - 700 mM KH2PO4 gereinigt und über eine Sephadex G25-Säule entsalzt. Jedes Oligonucleotid war rein, wiegraphie on a Partisil-SAX column at 55 0 C in 30 % formamide with a gradient of 10-700 mM KH 2 PO 4 and desalted on a Sephadex G25 column. Each oligonucleotide was pure, like
durch Autoradiographie des C P]-Phosphat-markierten Materials, das durch Elektrophorese in 15 % Polyacrylamid-Gelen in 8 M Harnstoff abgetrennt wurde, gezeigt werden konnte.could be demonstrated by autoradiography of the CP] phosphate-labeled material which was separated by electrophoresis in 15 % polyacrylamide gels in 8 M urea.
Die Oligodeoxynucleotide EGF-3 bis EGF-15 und EGF-18 wurde präparativ an ihren 5'-Hydroxy1-Guppen unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase und einem Überschuß von ty- P3ATP phosphoryliert. Die Verbindungen wurden mit drei Klassen von Oligodeoxynucleotiden durchgeführt: Klasse E, enthält 40 pMol EGF-17, jeweils 17,5 pMol von Kinase-behandeltem EGF-3, EGF-4, EGF-5 und EGF-18 und 20,4 pMol von Kinase-behandeltem EGF-6;The oligodeoxynucleotides EGF-3 through EGF-15 and EGF-18 became preparative at their 5'-hydroxy1 groups using polynucleotide kinase and an excess of ty-P3ATP phosphorylated. The compounds were made with three classes of oligodeoxynucleotides performed: class E, contains 40 pmoles EGF-17, each 17.5 pmoles of kinase-treated EGF-3, EGF-4, EGF-5 and EGF-18 and 20.4 pmoles from kinase-treated EGF-6;
Klasse F5 enthält 20,4 pMol Kinase-behandeltes EGF-7 und EGF-11 und jeweils 17,5 pMol Kinase-behandeltes EGF-8, EGF-9 und EGF-10; Klasse G, enthält 20,4 pMol Kinase-behandeltes EGF-12, jeweils 17,5 pMol EGF-13, EGF-14 und EGF-15 und 40 pMol EGF-16.Class F 5 contains 20.4 pmoles of kinase-treated EGF-7 and EGF-11 and 17.5 pmoles each of kinase-treated EGF-8, EGF-9 and EGF-10; Class G, contains 20.4 pmoles of kinase-treated EGF-12, 17.5 pmoles each of EGF-13, EGF-14 and EGF-15, and 40 pmoles of EGF-16.
Die Oligodeoxynucleotide wurden in Polypropylenröhrchen in einem gesamt-Volumen von 15 - 18 ul HpO für jede Mischung eingebracht. Die Röhrchen wurden dann auf 100 0C für 2 Minuten erhitzt, anschließend langsam in einem 2-Liter-Wasserbad, das ursprünglich auf 100 0C in einem isolierendem Mantel erhitzt worden war, über Nacht abgekühlt. Die Röhrchen wurden auf 0 0C abgekühlt, Ligase-Puffer (jeweils 15 ul) und Rinderserumalbumin (0,1 %) zugegeben, gefolgt von 1 μΐ T4 DNA-Ligase (BioLabs). Die Verbindung wurde für eine Stunde bei 37 0C durchgeführt. Die DNA-Produkte wurden mit Ethylalkohol ausgefällt und die DNA-Fragmente mit richtiger Größe in einer denaturierenden Gel-Elektrophorese in 12 % Acrylamid-Gel gereinigt. Die Produkte von 3 verschiedenen Verbindungen wurden gemischt und miteinander durch Erhitzen auf 100 0C und langsames Abkühlen miteinander verbunden. Ligase-Puffer mit 0,1 % Rinderserum-The oligodeoxynucleotides were placed in polypropylene tubes in a total volume of 15-18 ul of HpO for each mixture. The tubes were then heated to 100 ° C. for 2 minutes, then slowly cooled overnight in a 2 liter water bath, which had originally been heated to 100 ° C. in an insulating jacket. The tubes were cooled to 0 ° C., ligase buffer (15 μl each) and bovine serum albumin (0.1 %) were added, followed by 1 μl T4 DNA ligase (BioLabs). The connection was carried out at 37 ° C. for one hour. The DNA products were precipitated with ethyl alcohol and the DNA fragments of the correct size were purified in denaturing gel electrophoresis in 12% acrylamide gel. The products of 3 different compounds were mixed and connected to one another by heating to 100 ° C. and slowly cooling. Ligase buffer with 0.1 % bovine serum
-3BU9:S-24-3BU9 : S-24
albumin wurde zugegeben, ebenso wie 1 ul T4 DNA. Nach 1 Stunde bei 37 0C wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt. Dieses Produkt wurde in das große pAT153 EcoRI-BanM Fragment bei 7 0C über Nacht eingeführt und die letzte Verbindungs-Mischung wurde zur Transformierung von E. coli K12 HB101 verwendet. Die Ampicillin-resistenten Kolonien wurden selektiert auf Tetracyclin-Sensivität selektiert und die selektierten Kolonien mittels Kartierung durch Restriktions-Enzyme unter Verwendung von PstI + BstEII und EcoRI + BamHI untersucht. Die erwarteten Fragmente mit 2700 und 790 bp im ersten und 3300 und 167 bp in den letzteren Verdauungsansätzen wurden in 11 von 15 untersuchten Kolonien identifiziert. Daher enthielten diese Kolonien das erwünschte Plasmid, bezeichnet als pEGF6. Dies wurde unter Verwendung von Hpall, Taql und EcoRI-Kartierung bestätigt. Die EGF-Gene aus 2 Kolonien wurden vollständig unter Verwendung der Maxam-Gilbert-Technik (Maxam und Gilbert, 1980), sequenziert. Ein Isolat besaß die korrekte Sequenz, während das andere einen einzelnen Basen-Austausch enthielt, der jedoch die Aminosäure-Sequenz nicht beeinträchtigte.albumin was added, as was 1 µl of T4 DNA. After 1 hour at 37 ° C., the DNA was precipitated with ethanol. This product was inserted into the large EcoRI-BNote pAT153 fragment at 7 0 C overnight and the final compound mixture was used to transform E. coli K12 HB101. The ampicillin-resistant colonies were selected for tetracycline sensitivity and the selected colonies examined by mapping by restriction enzymes using PstI + BstEII and EcoRI + BamHI. The expected fragments of 2700 and 790 bp in the first and 3300 and 167 bp in the latter digests were identified in 11 of 15 colonies examined. Therefore, these colonies contained the desired plasmid, designated pEGF6. This was confirmed using Hpall, Taql and EcoRI mapping. The EGF genes from 2 colonies were completely sequenced using the Maxam-Gilbert technique (Maxam and Gilbert, 1980). One isolate had the correct sequence while the other contained a single base change which, however, did not affect the amino acid sequence.
Beispiel 2: Konstruktion des Expressions-Vektors für (Teil TrpE)-Lys-mEGF-FusionsproteinExample 2: Construction of the expression vector for (part of TrpE) -Lys-mEGF fusion protein
Das komplette mEGF-Gen und die abwärts-1legenden Sequenzen wurden unter Verwendung einer BamHI-Pstl Verdauung aus dem pEGF6 ausgeschnitten. Das Plasmid pBRtrp, das die Gene für den Teil des Trp-Operons enthält, wurde mit EcoRI und BgIII verdaut und das Fragment, das den trp-Promotor, den Attenuator und den Teil des TrpE-Gens enthält, wurde isoliert. Diese beiden Fragmente wurden in das große EcoRI-Pst 1-Fragment von pAT153 eingebunden, und ergaben das Plasmid pWRL500, das ein Gen für ein (Teil TrpE)-Lys-mEGF-Fusionsprotein unter der Kontrolle des Trp-Promotor-Operator-Systems enthielt. Die Längen der Fragmente, die zur Konstruktion des Plasmids pWRL500 verwendet wurden, waren wie folgt:The complete mEGF gene and the down-1-laying sequences were excised from the pEGF6 using a BamHI-Pstl digestion. The plasmid pBRtrp, which contains the genes for the part of the Trp operon, was digested with EcoRI and BglII and the Fragment containing the trp promoter, attenuator and part of the TrpE gene was isolated. These two fragments were in incorporated the large EcoRI-Pst 1 fragment from pAT153, and yielded the plasmid pWRL500, which contains a gene for a (part of TrpE) -Lys-mEGF fusion protein under the control of the Trp promoter-operator system contained. The lengths of the fragments used to construct plasmid pWRL500 were as follows:
2907 bp Pst-EcoRI von pAT153
1210 bp EcoRI-Bglll von pBRtrp 930 bp Pst-BamHI von pEGF62907 bp Pst-EcoRI from pAT153
1210 bp EcoRI-BglII from pBRtrp 930 bp Pst-BamHI from pEGF6
-3609324-3609324
Die Fragmente wurden in einer einzigen Mischung miteinander verbunden. Die Konstruktion des Plasmids pWRL500 wird in Figur 2 gezeigt. Das Plamid pBRtrp ist ein Verwandter von pBR322 mit dem 2,08 kb Hpal-Hind III-Fragment des Tryptophan-Operons von E. coli, codierend den Promotor, das Führungspeptid und das Struktur-Gen von TrpE, das zwischen der EcoRI und der Hind Ill-Stelle von pBR322 lokalisiert ist.The fragments were joined together in a single mixture. The construction of plasmid pWRL500 is shown in FIG shown. The plamid pBRtrp is a relative of pBR322 with the 2.08 kb Hpal-Hind III fragment of the tryptophan operon from E. coli, encoding the promoter, leader peptide and structural gene of TrpE which is located between the EcoRI and Hind III site of pBR322 is localized.
Das Plasmid pWRL500 wurde zur Transformation von E. coli HB1O1 verwendet. Die Kolonien wurden auf Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz selektiert. Die Plasmide aus 20 Kolonien wurden mittels EcoRI-Restriktions-Kartierung untersucht und die Plasmide, die die erwarteten 3660, 1220 und 167 bp langen Fragmente enthalten, wurden zusätzlich durch Verwendung von Pstl + Bst EII-Verdauung charakterisiert. Das Plasmid pWRL500 ergab die erwarteten Fragmente mit einer Länge von 790 und 4257 bp.The plasmid pWRL500 was used to transform E. coli HB101 used. The colonies were selected for ampicillin and tetracycline resistance. The plasmids from 20 colonies were using EcoRI restriction mapping examined and the plasmids containing the expected fragments containing 3660, 1220 and 167 bp in length were additionally characterized by using Pstl + Bst EII digestion. The plasmid pWRL500 gave the expected fragments with a length of 790 and 4257 bp.
Beispiel 3: Expression des (Teil TrpE)-Lys-mEGF-FusionsproteinsExample 3: Expression of the (part of TrpE) -Lys-mEGF fusion protein
Die E. coli-Zellen, die das Plasmid pWRL500 tragen, wurden zur Produktion von hohen Konzentrationen, schätzungsweise etwa 10 % des gesamten Zellproteins, untersucht durch Coomassie-Blau-Färbung von Polyacrylamid-Gel-Elektrophoretogrammen, des Fusionsproteins, Mr 42085; nach Tryptophanentzug und Zugabe von Indol-Acrylsäure, induziert. Die Struktur der Verbindungsregion des Fusionsproteins und der DNA-Sequenz wurde wie folgt bestimmt:E. coli cells carrying plasmid pWRL500 were tested for production of high concentrations, estimated to be about 10 % of total cell protein, by Coomassie blue staining of polyacrylamide gel electrophoretograms, the fusion protein, Mr 42085; after withdrawal of tryptophan and addition of indole acrylic acid. The structure of the junction region of the fusion protein and the DNA sequence was determined as follows:
Endoproteinase-Lys-C-Spaltung j—>EGF TrpE(1-320)-Ile-Glu-Ile-Leu-Lys-Asn-Ser-Tyr Endoproteinase -Lys-C cleavage j-> EGF TrpE (1-320) -Ile-Glu-Ile-Leu-Lys-Asn-Ser-Tyr
ATT GAG ATC CTT AAG AAT TCT TAT TAA CTC TAG,GAA TTC TTA A'GA ATA Bglll/BamHI EcoRI Fusionierung ATT GAG ATC CTT AAG AAT TCT TAT TAA CTC TAG, GAA TTC TTA A'GA ATA BglII / BamHI EcoRI fusion
j,j,
36Ö9924 /b ·36Ö9924 / b
Beispiel 4: Reinigung von mEGFExample 4: Purification of mEGF
(i) Unter Verwendung eines 2-Liter-Fermentations-Gefäßes(i) Using a 2 liter fermentation jar
Die gesammelten E. coli-Zellen (aus 24000 Ac00 Units der Kultur) wurden unter Verwendung von Lysozym/EDTA und Einfrieren-Auftauen, gefolgt von einer DNAse-Behandlung, aufgeschlossen. Die Hauptmenge des Fusionsproteins lag in Form von Einschlußkörperchen vor, wie durch immunocytochemische Analyse unter Verwendung von Protein-A-colloidalem Gold zur Darstellung von Kaninchen anti-mEGF Immunglobulin G-Molekülen, gebunden an das Fusionsprotein in fixierten E. coli-Zellen gezeigt wurde, und fand sich in der Pellet-Fraktion nach Zentrifugation bei 40000 χ g für 1 Stunde bei 20 0C. Das Pellet wurde in 8 M Harnstoff,1 mMol EDTA, 1mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM NH4HCO3, pH 8,3 homogenisiert und die Mischung 5-fach mit 50 mM NH4HCO3 verdünnt. Die opaleszierende Mischung wurde wie oben zentrifugiert und der überstand, der die Hauptmenge des Fusionsproteins enthält, wurde mit Endoproteinase LysC verdaut (0,75 U, Boehringer Mannheim GmbH) 24 Stunden bei 37 0C. Weitere 0,75 U Protease wurde zugegeben und die Verdauung für 3 Tage weitergeführt. Das verdaute Material wurde für 2 Stunden gegen 1mM NH4HCO3, 0,2 mM EDTA, pH 8 bei 4 0C dialysiert und anschließend gegen 50 mM HCl, 0,1 M NaCl für 2 Stunden dialysiert. Die Mischung wurde bei 40000 χ. g für 10 Minuten bei 4 0C zentrifugiert und der überstand wurde auf 15 ml in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle mit einer UM2-Membran konzentriert. Die Lösung wurde über eine Biogel P-10-Säule (2,5 cm χ 80 cm) in 50 mM HCl, 0,1 M NaCl chromatographiert und der mEGF-Peak, der nach den Gesamtsäulenvolumen eluiert wird, wurde gesammelt (Savage & Cohen, 1972). Die Lösung wurde auf pH 5,6 mit NH3 gebracht und bis zur kompletten Trockenheit konzentriert. Das Material wurde in 20 mM NH4OAc, eingestellt auf pH 5,6 mit Essigsäure.gelöst und über eine DEAE-Cellulose-Säule mit einem Gradienten von pH 5,6 Ammonium-Acetat-Puffer chromatographiert. Der erste Peak, der nach Anlegung des Gradienten eluiert, war mEGF; ein zweiter Peak enthielt eine Mischung von mEGF-ähnlichen Proteinen und wahrscheinlichen Abbauprodukten. Ein Test auf Endotoxin (Limulus Test) zeigte nur sehr geringe Mengen (3,1 ng/mg mEGF).The collected E. coli cells (from 24000 Ac 00 Units of culture) were made using lysozyme / EDTA, and freeze-thawing, followed by DNAse treatment open. The majority of the fusion protein was in the form of inclusion bodies as shown by immunocytochemical analysis using Protein A colloidal gold to display rabbit anti-mEGF immunoglobulin G molecules bound to the fusion protein in fixed E. coli cells. and was found in the pellet fraction after centrifugation at 40000 χ g for 1 hour at 20 0 C. the pellet was resuspended in 8 M urea, 1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NH 4 HCO 3, pH 8.3 homogenized and the mixture diluted 5 times with 50 mM NH 4 HCO 3. The opalescent mixture was centrifuged as above and the supernatant containing the major amount of the fusion protein was digested with endoproteinase LysC (0.75 U, Boehringer Mannheim GmbH) for 24 hours at 37 0 C. Additional 0.75 U protease was added and the Digestion continued for 3 days. The digested material was dialyzed for 2 hours against 1 mM NH 4 HCO 3, 0.2 mM EDTA, pH 8 at 4 0 C and then dialyzed against 50 mM HCl, 0.1 M NaCl for 2 hours. The mixture was at 40,000 χ. centrifuged for 10 min at 4 0 C and the supernatant was concentrated to 15 ml in an Amicon ultrafiltration cell with a UM2 membrane. The solution was chromatographed on a Biogel P-10 column (2.5 cm × 80 cm) in 50 mM HCl, 0.1 M NaCl and the mEGF peak, which is eluted after the total column volume, was collected (Savage & Cohen , 1972). The solution was brought to pH 5.6 with NH 3 and concentrated to dryness. The material was dissolved in 20 mM NH 4 OAc, adjusted to pH 5.6 with acetic acid, and chromatographed on a DEAE cellulose column with a gradient of pH 5.6 ammonium acetate buffer. The first peak to elute after the gradient was applied was mEGF; a second peak contained a mixture of mEGF-like proteins and likely degradation products. A test for endotoxin (Limulus test) showed only very small amounts (3.1 ng / mg mEGF).
'J7' -'- : -3609S24 'J 7 '-'- : -3609S24
(ii) Unter Verwendung eines 200-Liter-Fermentations-Ansatzes(ii) Using a 200 liter fermentation approach
Die gesammelten E. coli-Zellen wurden in 1 kg-Anteilen von gepackten Zellpellets behandelt, bei -20 0C bis zur Verwendung gelagert. Die aufgetauten Zellen wurden mit 1,5 1 HpO resuspendiert und durch Zugabe von 50 mg Phenylmethansulphonylfluorid in 10 ml Ethanol, 50 ml 1M Tris-Base, 5 ml 0,5 M EDTA, pH 8, 1 ml 2-Mercaptoethanol, 5 ml NP40 Detergens, 2 - 3 ml 3 M NaOH, zur Einstellung des PH's auf 8,5 und 1 g Lysozym aufgeschlossen, gefolgt von einer Inkubation für 2 Stunden bei 30 0C. MgCl2 (5ml, 1 M) und DNAse (50 mg) wurde zugegeben und die Inkubation für 2 Stunden weitergeführt. EDTA (10 ml, 0,5 M, pH 8) wurde zugegeben. Die Mischung wurde bei 27000 χ g für 45 Minuten bei 20 0C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1,25 1 50 mM NH.HCOo, 1 mM EDTA, 1 mM 2-Mercaptoethanol (pH 8,3) homogenisiert und durch nochmalige Zentrifugation die Festanteile gesammelt. Harnstoff (0,9 g/g Pellet) wurde zugegeben und die Mischung auf 37 0C erwärmt und homogenisiert. Die klare, viskose Lösung wurde zweifach verdünnt, durch Zentrifugation geklärt und weiter auf 5 1 mit 50 mM NH4HCO3 verdünnt. 2-Hydroxyethyldisulphid (2,75 ml) und Endoproteinase LysC (12 U) wurde zugegeben und die Mischung drei Tage bei 37 0C inkubiert. Unter diesen Bedingungen erhielt man eine komplette Aufspaltung.The collected E. coli cells were treated at 1 kg-portions of packed cell pellets stored at -20 0 C until use. The thawed cells were resuspended with 1.5 1 HpO and by adding 50 mg phenylmethanesulphonyl fluoride in 10 ml ethanol, 50 ml 1M Tris base, 5 ml 0.5 M EDTA, pH 8, 1 ml 2-mercaptoethanol, 5 ml NP40 detergent, 2 - 3 ml of 3 M NaOH, open for adjusting the pH to 8.5 and 1 g of lysozyme, followed by incubation for 2 hours at 30 0 C. MgCl 2 (5ml, 1 M) and DNAse (50 mg) was added and incubation continued for 2 hours. EDTA (10 ml, 0.5 M, pH 8) was added. The mixture was centrifuged at 27000 χ g for 45 minutes at 20 ° C. The pellet was homogenized with 1.25 liters of 50 mM NH.HCOo, 1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoethanol (pH 8.3) and the solids were collected by centrifugation again. Urea (0.9 g / g pellet) was added and the mixture was heated to 37 ° C. and homogenized. The clear, viscous solution was diluted two-fold, clarified by centrifugation and further diluted to 5 liters with 50 mM NH 4 HCO 3 . 2-Hydroxyethyldisulphid (2.75 ml) and endoproteinase LysC (12 U) was added and the mixture incubated for three days at 37 0 C. A complete split was obtained under these conditions.
Die Verdauungsmischung wurde auf 15 % Acetonitril gebracht und auf pH 3,75 eingestellt. Die Hauptmenge des präcipitierten denaturierten Polypeptidmaterials wurde durch Absetzen und Filtration entfernt und mEGF aus dem überstand durch Umkehrchromatographie über Prep RP18 Silicagel mit einem Gradienten von 15 - 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure isoliert. Das ungereinigte mEGF wurde verdünnt, neutralisiert und, wie vorhin beschrieben, über DEAE-CeIlulose chromatographiert, der mEGF-Peak angesäuert und über Bio-Gel P-10 chromatographiert. Das Endprodukt wurde neutralisiert, dialysiert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug etwa 15 % des theoretischen Wertes, basierend auf Abschätzungen des Fusionsproteingehaltes im Bakterienpellet; etwa 200 mg mEGF wurden erhalten.The digestion mixture was brought to 15% acetonitrile and adjusted to pH 3.75. Most of the precipitated denatured polypeptide material was removed by settling and filtration, and mEGF was isolated from the supernatant by reverse chromatography over Prep RP18 silica gel with a gradient of 15-50 % acetonitrile in 0.1 % trifluoroacetic acid. The unpurified mEGF was diluted, neutralized and, as described above, chromatographed on DEAE cellulose, the mEGF peak acidified and chromatographed on Bio-Gel P-10. The final product was neutralized, dialyzed and freeze-dried. The yield was about 15 % of the theoretical value, based on estimates of the fusion protein content in the bacterial pellet; about 200 mg of mEGF was obtained.
■ft-■ ft-
(iii) Reinheitsanalyse(iii) Purity Analysis
Phasenumkehr-und Ionen-Austausch HPLC-Chromatographie des gereinigten mEGF ergaben eine Reinheit größer als $5 %. Aminosäureanalyse und die Peptidkartierungsergebnisse stimmten mit der Struktur des mEGF überein.Phase inversion and ion exchange HPLC chromatography of the purified mEGF were found to be greater than $ 5% purity. Amino acid analysis and the peptide mapping results were consistent with the structure of the mEGF.
Beispiel 5: Konstruktion eines alternativen Expressionsvektors für ein (Teil TrpE)-Lys-mEGF-FusionsproteinExample 5: Construction of an alternative expression vector for a (part of TrpE) -Lys-mEGF fusion protein
Um den Expressionsgrad des Fusionsproteins zu erhöhen, wurde das (Teil TrpE)-Lys-mEGF-Gen von pWRL500 in einen Temperatur-sensitiven runaway-copy-number-Vektor, pMM1 (Wong et al., 1982) übertragen. Dies ist in Figur 3 gezeigt. Das aus der BamHI und PstIVerdauung des Plasmids pMM1 abgeleitete 3,2 kb-Fragment, enthaltend den Replikationsursprung wurde mit BamHI-Pstl verdautem pWRL500 Plasmid verbunden. E. coli HB101 wurde mit dem Verbindungsprodukt transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf Wachstum bei 30 0C jedoch nicht bei 42 0C selektiert. Die Kolonien, die das korrekt gebildete pWRL505-Plasmid enthielten wurden durch Restriktionskartierung unter Verwendung von BamHI und Pstl identifiziert.In order to increase the level of expression of the fusion protein, the (part of TrpE) -Lys-mEGF gene was transferred from pWRL500 to a temperature-sensitive runaway copy number vector, pMM1 (Wong et al., 1982). This is shown in FIG. The 3.2 kb fragment derived from the BamHI and PstI digestion of plasmid pMM1, containing the origin of replication, was linked to BamHI-PstI-digested pWRL500 plasmid. E. coli HB101 was transformed with the product compound and ampicillin resistant colonies were not selected for growth at 30 0 C at 42 0 C. The colonies containing the properly formed pWRL505 plasmid were identified by restriction mapping using BamHI and PstI.
Mit pWRL505 transformierte E. coli-Zellen wurden bei 30 0C in Glucose-Minimalmedium mit Casaminosäuren auf eine AgQQ = 1 kultiviert, die Temperatur wurde auf 37 0C für 2 Stunden erhöht, wodurch die Kopienanzahl des Plasmids um ein vielfaches erhöht wurde, anschließend wurde in Indolacrylsäure zur Induktion der Expression vom Trp-Promotor zugegeben. Nach weiteren 6 Stunden bei 30 0C erreichte die Expression des (Teil TrpE)-Lys-mEGF Werte von etwa 20 % des gesamten Zellproteins. Das mEGF wurde wie in Beispiel 4(ii) beschrieben gereinigt und besaß eine ähnliche Reinheit, wie in Beispiel 4(iii), beschrieben.With pWRL505 transformed E. coli cells minimal medium glucose were incubated at 30 0 C in cultured with casamino acids to a AgQQ = 1, the temperature was raised to 37 0 C for 2 hours, whereby the copy number of the plasmid has been increased by a multiple, then was added in indole acrylic acid to induce expression from the Trp promoter. After a further 6 hours at 30 0 C, the expression of the (partial TrpE) -Lys-mEGF reached values of total cell protein of approximately 20%. The mEGF was purified as described in Example 4 (ii) and had a similar purity as described in Example 4 (iii).
Beispiel 6: Expression eines Teil (TrpE)-Lys-mEGF-Fusionsproteins unter Kontrolle des tac-Promotor-Operator-Systems.Example 6: Expression of a partial (TrpE) -Lys-mEGF fusion protein under the control of the tac promoter-operator system.
36Ό99-24"36Ό99-24 "
Eine Proteinexpression mit hohem Wirkungsgrad über das trp-Promotor-System erfordert Mangelbedingungen für Tryptophan. Die Expression von Proteinen, die Tryptophan enthalten, wie z. B. mEGF, wird unter diesen Bedingungen für nicht optimal angesehen. Der tac-Promotor (de Boer et al. (1983)) kann durch Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG) in einem Aminosäure-reichen Medium induziert werden und reproduzierbar hohe Expressionsausbeuten können erwartet werden. Der tac-Promotor des Plasmids ptac 12 (Amann et al (1983)) wurde deshalb zur Konstruktion eines Plasmids, pEGFtactrp2, verwendet, das in der Lage ist, ein Fusionsprotein, das mEGF verbunden durch einen Lysinrest an den Teil des TrpE-Protein, enthält, zu exprimieren. Die Konstruktion des Plasmids pEGFtactrp2 ist in Figur 4 gezeigt.Protein expression with high efficiency via the trp promoter system requires tryptophan deficiency conditions. The expression of proteins that contain tryptophan, such as. B. mEGF, is not considered optimal under these conditions. The tac promoter (de Boer et al. (1983)) can be replaced by isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) can be induced in an amino acid-rich medium and reproducibly high expression yields can be expected will. The tac promoter of the plasmid ptac 12 (Amann et al (1983)) was therefore used to construct a plasmid, pEGFtactrp2, which is capable of a fusion protein that linked mEGF by expressing a lysine residue to the part of the TrpE protein that contains. The construction of the plasmid pEGFtactrp2 is shown in FIG.
Das Plasmid pWRL500 aus dem Beispiel 2 wurde einer partiellen EcoRI-Verdauung zur Umorientierung des trp-Promotors und des Fusionsprotein-Gens unterworfen. Daraus resultiert das Plasmid pEGFtrpl. Dieses Plasmid enthält eine Erkennungsstelle für BstX1 bei der Base 80 der TrpE-Codierungssequenz. Der trp-Promotor des pEGFtrpl durchgehend bis zur BstX1-Erkennungsstelle des TrpE-Gens wurde durch eine Sequenz, die den tac-Promotor aus ptac 12 bis zur Base 80 der TrpE-Codierungssequenz, wie unten gezeigt, enthält, ersetzt. Die Shine-Dalgarno-Sequenzen, ribosomale Bindungssequenzen, sind als SD bezeichnet. Das erhaltene Plasmid pEGFtactrpl, wurde einer partiellen EcoRI-Verdauung unterworfen, um den tac-Promotor und das Fusionsprotein-Gen umzuorientieren um das Plasmid pEGFtactrp2 zu erhalten.The plasmid pWRL500 from Example 2 was subjected to a partial EcoRI digest to reorient the trp promoter and the fusion protein gene subject. This results in the plasmid pEGFtrpl. This plasmid contains a recognition site for BstX1 at the base 80 of the TrpE coding sequence. The trp promoter of the pEGFtrpl throughout up to the BstX1 recognition site of the TrpE gene was replaced by a sequence that encodes the tac promoter from ptac 12 to base 80 of the TrpE coding sequence, as shown below. The Shine-Dalgarno sequences, ribosomal binding sequences, are designated as SD. The resulting plasmid, pEGFtactrpl, was subjected to partial EcoRI digestion to obtain the tac promoter and the fusion protein gene reorient to obtain the plasmid pEGFtactrp2.
Sequenz der tac-Promotor-Konstruktion, die zur Expression des Fusionsproteins in pEGFtactrpl und 2 verwendet wurdeSequence of the tac promoter construction required for expression of the Fusion protein in pEGFtactrpl and 2 was used
TTCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCTTCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATC
20 4020 40
-35-35
Me tA GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTTATGAMe tA GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTTATGA
80 10080 100
-10 SD-10 SD
snLeuGlyProAsnLysIleArgGluxxx MetGln ..mTrpE ATTTGGGCCCGAACAAAATTAGAGAATAACAATGCAAsnLeuGlyProAsnLysIleArgGluxxx MetGln ..mTrpE ATTTGGGCCCGAACAAAATTAGAGAATAACAATGCAA
140 140
SDSD
E. coli K12 JM105-Zellen (Yanisch-Perron, et al. (1985)) wurden mit pEGFtactrp2 transformiert. Der Stamm wurde in einem nährstoffreichen Medium in einem 2-Liter-Fermenter bei 30 0C kultiviert und mit IPTG bei einer O.D.ggO 130 induziert. Densitometrische Untersuchungen von mit Coomassie-Blau gefärbten SDA-Polyacrylamid-Gel-Elektrophoretrogrammen zeigten, daß 38 % des gesamten Zellproteins aus (Teil TGrpE)-Lys-mEGF-Fusionsprotein bestand. Das mEGF wurde isoliert und gemäß Beispiel 4(i) gereinigt und besaß eine ähnliche Reinheit wie in Beispiel 4(iii) beschrieben.E. coli K12 JM105 cells (Yanisch-Perron, et al. (1985)) were transformed with pEGFtactrp2. The strain was cultured in a nutrient-rich medium in a 2-liter fermentor at 30 0 C and induced with IPTG at a ODgg O 1 3 0th Densitometric examinations of SDA-polyacrylamide gel electrophoretrograms stained with Coomassie blue showed that 38% of the total cell protein consisted of (part of TGrpE) -Lys-mEGF fusion protein. The mEGF was isolated and purified according to Example 4 (i) and had a similar purity as described in Example 4 (iii).
LiteraturhinweiseBibliography
Amann et al. (1983) Gene 25, 167 - 178 de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 21 Chattopadhyaya & Reese (1979) Tetrahedron Lett. 5059 - 5062.Amann et al. (1983) Gene 25, 167-178 de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. May be. USA 80, 21 Chattopadhyaya & Reese (1979) Tetrahedron Lett. 5059-5062.
Duckworth et al. (1981) Nucl. Acids, Res. 9, 1691 - 1706.Duckworth et al. (1981) Nucl. Acids, Res. 9, 1691-1706.
Edge et al. (1981) Nature 292, 756 - 762.Edge et al. (1981) Nature 292, 756-762.
Efimov et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23, 961 - 964.Efimov et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23, 961-964.
Gait et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6243 - 6254.Gait et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6243-6254.
Gouy & Gautier (1982) Nucl. Acids Res. 10, 7055 - 7074.Gouy & Gautier (1982) Nucl. Acids Res. 10, 7055-7074.
Grantham et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, r43 - r74.Grantham et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, r43- r74.
Maxam & Gilbert (1980) Methods Enzymol. 65, 499 - 560.Maxam & Gilbert (1980) Methods Enzymol. 65, 499-560.
Savage & Cohen (1972) J. Biol. Chem. 247, 7609 - 7611.Savage & Cohen (1972) J. Biol. Chem. 247, 7609-7611.
Smith et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4467 - 4482.Smith et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4467-4482.
Sproat & Bannwarth (1983) Tetrahedron Lett. 24,.5771 - 5774.Sproat & Bannwarth (1983) Tetrahedron Lett. 24, .5771 - 5774.
Wong et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 3570 - 3574.Wong et al. (1982) Proc. Natl. Acad. May be. USA 79, 3570-3574.
Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103 - 119.Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119.
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| US5366081A (en) * | 1987-08-26 | 1994-11-22 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| IL89673A0 (en) * | 1988-03-24 | 1989-09-28 | Oncogen | Novel polypeptides having growth factor activity and nucleic acid sequences encoding the polypeptides |
| JPH01247099A (en) * | 1988-03-30 | 1989-10-02 | Hitachi Ltd | Biotechnological production of human epitheliocyte growth factor |
| JPH01247098A (en) * | 1988-03-30 | 1989-10-02 | Hitachi Ltd | Biotechnological production of human epitheliocyte growth factor |
| EP0335400B1 (en) * | 1988-03-30 | 1994-06-08 | Hitachi, Ltd. | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering |
| US5218093A (en) * | 1989-03-01 | 1993-06-08 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | EGF variants and pharmaceutical use thereof |
| US5359831A (en) | 1989-08-01 | 1994-11-01 | United States Surgical Corporation | Molded suture retainer |
| AU648272B2 (en) * | 1989-10-11 | 1994-04-21 | Pitman-Moore Australia Limited | Recombinant growth factors |
| CA2059245C (en) * | 1991-02-08 | 2004-07-06 | Michael P. Chesterfield | Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures |
| US5904716A (en) * | 1995-04-26 | 1999-05-18 | Gendler; El | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof |
| US20090192554A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-07-30 | Confluent Surgical, Inc. | Bioabsorbable block copolymer |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE53166B1 (en) * | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
| US4532207A (en) * | 1982-03-19 | 1985-07-30 | G. D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
| SE8300693L (en) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | SET TO MAKE AND ISOLATE PROTEINS AND POLYPEPTIDES, AND A HYBRID VECTOR FOR THIS |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of mature human IGF and EGF via prokaryotic recombinant DNA technology |
| JPS6028994A (en) * | 1983-07-08 | 1985-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | (21-leucine) human urogastrone, corresponding gene, corresponding recombinant plasmid, transformed cell and their preparation |
| JP2554459B2 (en) * | 1984-07-02 | 1996-11-13 | アース製薬 株式会社 | β-urogastron gene, corresponding plasmid recombinant and corresponding transformant |
| ATE73345T1 (en) * | 1984-10-19 | 1992-03-15 | Chiron Corp | STIMULATION TO HEAL A WOUND USING HUMAN SKIN GROWTH FACTOR PRODUCED BY RECOMBINANT DNA. |
-
1985
- 1985-03-25 GB GB858507666A patent/GB8507666D0/en active Pending
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1986
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