DE3602999A1 - Immunoassayreagens und immunoassayverfahren - Google Patents

Immunoassayreagens und immunoassayverfahren

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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Description

  • Beschreibung
  • Immunoassayreagens und Immunoassayverfahren Die Erfindung bezieht sich auf ein Immunoassayreagens und auf ein Immunoassayverfahren, wobei insbesondere Mikrokapseln mit jeweils einer entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper markierten Membran eingesetzt werden.
  • Typische Immunoassayverfahren, die in der Praxis eingesetzt wurden, sind z.B. Radioimmunoassays, wobei man in einer aus vitalem Gewebe gewonnenen Probe ein Antigen über eine Antigen/Antikörper-Reaktion zwischen einem mit einem Radioisotop markierten Antikörper und diesem Antigen bestimmt. Weil dieses Verfahren jedoch mühsam ist, wurden Immunoassayverfahren auf der Basis der Absorptionsspektroskopie unter Verwendung von Mikrokapseln vorgeschlagen. Zum Beispiel beschreibt US-PS 4 342 826 ein Immunoassayverfahren, bei dem man ein Liposom, das eine Lipidmembran aufweist und dort ein Enzym trägt, mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert, eine Probe mit diesem Liposom mischt, um dabei dessen Membran mit einer immunologischen Reaktion aufzubrechen, das Enzym mit einem Substrat reagieren läßt, und schließlich die Konzentration an Antikörper oder Antigen der Reaktionsflüssigkeit mit einem Photometer bestimmt.
  • Jedoch zeigen die dabei mit einer enzymatischen Reaktion erhaltenen Daten eine gewisse probenabhängige Streuung, die zu ernsthaften Fehlern führt.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Immunoassays, mit dem eine Probe mit geringstmöglichen Fehlern analysiert werden kann, auch wenn sie ein Substrat oder ein Enzym enthält und die Bereitstellung eines Immunoassayreagenses für dieses Immunoassayverfahren.
  • In dem erfindungsgemäßen Immunoassayverfahren wird keine enzymatische Reaktion eingesetzt. Wenn nämlich eine Serumprobe ein Substrat oder Enzym enthält, würde ein Substrat oder Enzym, das durch den Fortgang der Antigen/ Antikörper-Reaktion aus der Mikrokapsel freigesetzt wird, ebenso mit dem oben erwähnten, aus der Probe herrührendem Substrat oder Enzym reagieren, und dabei einen großen Reaktionsuntergrund entstehen lassen, woraus sich häufig eine deutliche Abnahme der Analysengenauigkeit ergibt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunoassayreagens unter Verwendung von Mikrokapseln zur Verfügung, die jeweils eine entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper markierte Membran aufweisen (im folgenden als markierte Mikrokapseln bezeichnet) und die einen Chelatbildner enthalten, der bei der Koordinierung mit einem Metallion eine Färbung zeigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Immunoassayreagens zur Verfügung, das folgendes beinhaltet: markierte Mikrokapseln; einen in diesen markierten Mikrokapseln enthaltenen Chelatbildner, der bei der Koordinierung mit einem Metallion eine Färbung zeigt; und eine Flüssigkeit, in der diese Mikrokapseln dispergiert werden und in der das Metallion außerhalb der Mikrokapseln eingesetzt werden kann.
  • Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein Immunoassayverfahren bereit, in dem folgendes inbegriffen ist: Mischen von markierten, einen Chelatbildner enthaltenden Mikrokapseln, einem zur Reaktion mit diesem Chelatbildner befähigten Metallsalz, einem Komplement und einer einen Antikörper oder ein Antigen enthaltenden Probe; Freisetzen des Komplexbildners aus den Mikrokapseln durch die dadurch ausgelöste Antigen/Antikörper-Reaktion; und Bestimmung des durch die Reaktion zwischen dem Chelatbildner und dem Metallsalz erhaltenen Produktes, um dadurch das Antigen oder den Antikörper in der Probe zu analysieren.
  • Da in einer Vitalprobe kein Chelatbildner entsteht, verursacht die Probe nur einen vergleichsweise geringen Reaktionshintergrund, wodurch das Signal/Rausch-Verhältnis bedeutend angehoben wird.
  • Fig. 1 zeigt eine Kalibrierkurve zur erfindungsgemäßen Bestimmung von AntiT4-Antikörper.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokapseln können z.B. aus Liposomen bestehen, von denen jedes eine dünne Membran aufweist. Zur Bestimmung des Antigens wird diese Membran mit dem kognaten Antikörper markiert.
  • Umgekehrt wird zur Bestimmung eines Antikörpers die Membran mit dessen kognatem Antigen markiert.
  • Diese Mikrokapseln werden nach einem Verfahren hergestellt, das in "Methods in Enzymology", 74, 152-161 (1981) beschrieben ist. Dabei werden Sphingomyelin, Cholesterin, Dicetylphosphat und Thyroxin (T4) in Methanol gelöst. Das Lösemittel der erhaltenen Lösung wird im Vakuum auf einer Glasplatte verdampft, wobei auf dieser eine trockene Lipid-Membran entsteht. Dann wird die mit Thyroxin-einem Antigen -markierte Membran durch Rühren in einem Mixer mit einer Lösung des Chelatbildners von bestimmter Konzentration gemischt, um das Lipid zu'ernulgieren. Auf diese Weise wird der Chelatbildner in jederMikrokapsel eingeschlossen.
  • Die Lipidmembran bildet ein Liposom mit einer hydrophilen äußeren Oberfläche. Die so erhaltenen Liposomen werden durch das Auswaschen von Verunreinigungen gereinigt. Jedes Liposom hat bevorzugt eine Teilchengröße von 1 m(gm) bis 1 mm, obwohl einzelne Teilchen auch Größen außerhalb dieses Bereiches aufweisen können.
  • Zusätzlich zu Liposomen können auch Erythrocyten vom Schaf und Nylonkapseln als Mikrokapseln eingesetzt werden. Diese Mikrokapseln können getrocknet werden und in Form eines aranulierten oder tablettierten Immunoassayreagenses aufbewahrt werden. Alternativ kann man zur Zubereitung eines Immunoassayreagenses die Liposomen auch in einer Pufferlösung von geeignet eingestelltem pH-Wert suspendieren. Zusätzlich zu den Liposomen muß dieses flüssige Reagens weiterhin ein Komplement und ein Metallsalz enthalten. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Zusammensetzung eines solchen flüssigen Immunoassayreagenses.
  • Tabelle 1 Liposom T4-bindende Liposome mit einem Gehalt von 10 m M 5-Br-PAPS Komplement gepooltes eerschweinchen-Serum Metallsalz 100 mM FeCl2 Pufferlösung 10 mM Veronalpufferlösung (pH 7,4) Bei der Verwendung von 2-5-Br-2-pyridylazo-5-N-propyl-N-sulfopropylaminoanilin (nachfolgend als 5-Br-PAPS bezeichnet) als Chelatbildner eignen sich FeCl2 und ZnC1 als Metallsalze, und die Extinktion kann bei 552 nm 2 gemessen werden; verwendet man Dimethylsulfonazo-III als Chelatbildner, eignet sich als Metallsalz BaCl2 (Bestimmungder Extinktion bei 655 nm); verwendet man Chromazurol B als Chelatbildner, eignet sich FeCl3 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 630 nm); verwendet man 2- (2-Thiazolylazo) -4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure (nachfolgend als TAMSMB bezeichnet) als Chelatbildner, eignet sich CuCl2 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 585 nm); verwendet man Nitroso-PSAP als Chelatbildner, eignet sich FeCl2 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 756 nm); verwendet man Bathophenanthrolin (nachfolgend als BFT bezeichnet) als Chelatbildner, eignet sich FeCl2 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 535 nm).
  • Jeder Chelatbildner zeigt eine Färbung bei der Koordinierung mit einem Metallion, insbesondere einem Schwermetallion, wodurch die optische Bestimmung mit einem Photometer ermöglicht wird.
  • Eisen-, Aluminium-, Magnesium-, Calcium-, Nickel- und Kobalt-Salze sind Beispiele für Metallsalze, die in der Lösung enthalten sein können, welche mit der Probe zu mischen ist, um dadurch eine Antigen/Antikörper-Reaktion auszulösen. Bei der Vermischung einer Mikrokapsel mit einer Probe, die das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthält, erfolgt eine Antigen/Antikörper-Reaktion zwischen zu bestimmendem Antigen oder zu bestimmendem Antikörper und dem Antigen oder Antikörper, mit dem die Membran der Mikrokapsel markiert ist. Danach greift ein auf diese Weise aktiviertes Komplement die Membran der Mikrokapsel an, um sie aufzulösen. Auf diese Weise wird der in der Mikrokapsel enthaltene Chelatbildner daraus freigesetzt und reagiert mit dem Metallion außerhalb der Mikrokapsel. Daraufhin weist der Chelatbildner eine Färbung auf, die von dem Ausmaß dieser Freisetzung abhängig ist. Da die Anzahl der aufgebrochenen Mikrokapseln der Menge von Antigen oder Antikörper in der Probe direkt propor- tional ist, kann man die Konzentration an Antigen oder Antikörper entsprechend der Färbung bestimmen, was über eine vorher aufgenommene Kalibrierkurve geschieht.
  • Das Komplement, das mehrere Bestandteile enthält, erkennt eine immunologische Reaktion und löst die Liposom-Membran auf.
  • üblicherweise verwendet man als Komplement ivleerschweinchen-Serum.
  • Die vorliegende Erfindung eignet sich zur Detektion vieler Antigen/Antikörper-Reaktionen. Typische Beispiele für Antigene sind T4, T3, Globulin und IGG.
  • Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter beschrieben.
  • Man bereitet eine Lösung von 5-Br-PAPS-einemChelatbildner -mit einer Konzentration von 10 Mol/l, die in die Mikrokapseln eingebracht werden muß. Hierzu dispergiert man ein zur Markierung mit einem Antigen oder einem Antikörper befähigtes Lipid in dieser Lösung, wodurch eine Anzahl von Liposomen erhalten wird, indenender Chelatbildner nunmehr ingeschlossenist.Die äußere Oberfläche der erhaltenen Liposomen wird durch wiederholtes Auswaschen von Verunreinigungen gesäubert. Dann markiert man die Oberfläche jeder Mikrokapsel mit Thyroxin (T4).
  • Man dispergiert 0,001 ml der so erhaltenen Mikrokapseln in einer isotonischen Lösung, die 0,154 Mol/l Natriumchlorid enthält, gibt 100 mM Eisenchlorid (FeCl2) und 20 ßl eines öinplenaents dazu und stellt das Gesamtvolumen auf 1 1 ein.
  • Die Reaktionslösung kann in einem Behälter aufbewahrt und bei Bedarf als Immunoassayreagens verwendet werden.
  • Man bestückt den Probenaufnehmer (sampler) eines klinischen Analysenautomaten mit Probengefäßen, die eine Serumprobe enthalten, hält die Reaktionsstrecke bei 37 "C und bringt Reaktionsgefäße beweglich intermittierend in die Reaktionsstrecke, in der ein Probenpipettiersystem, ein Reagensversorgungssystem und ein Vielfachwellenlängen-Photometer vorhanden sind. Durch das Probenpipettiersystem werden jeweils 10 Wl der Serumprobe aus den Probengefäßen pipettiert und in die Reaktionsgefäße der Reaktionsstrecke überführt. Durch das Reagensversorgungssystem werden jeweils 2 ml des nach obiger Vorschrift hergestellten Reagens in die Reaktionsgefäße eingebracht. Anschließend werden die Reaktionsgefäße bei gleichzeitiger Weiterbeförderung inkubiert. Nach 30 min erreicht jedes Reaktionsgefäß zusammen mit der Reaktionsflüssigkeit die Stelle der photometrischen Messung, wo die Reaktionsflüssigkeit, zur Bestimmung ihrer Extinktion bei 522 nm, bestrahlt wird. Das Ergebnis der Messung wird in einem Rechner ermittelt und die Konzentration an AntiT4-Antikörper in der Probe ausgedruckt.
  • Fig. 1 zeigt eine Kalibrierkurve, die man erhält, wenn das Reaktionsgefäß mit der oben erwähnten Reagenslösung, mit Antikörper-freiem Serum und mit AntiT4-Antikörper bekannter Konzentration beschickt wird. Diese Blindprobe zeigt einen Mittelwert von 0,04 ßM/l und eine Varianz von 0,02 ßM/l.
  • Die Reproduzierbarkeit bei einer mittleren Antikörper-Konzentration von 15 ßM/l zeigt eine Standardabweichung von 0,02 ßM/l. Die Empfindlichkeit im Hinblick auf den Serumspiegel ist in diesem Reaktionssystem 2 x io8 M/l.
  • Tabelle 2 zeigt einen Vergleich zwischen dem Ergebnis einer Antikörperbestimmung unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Kalibrierkurve und jenem eines herkömmlichen Verfahrens, wobei durchEinschlußeines Enzyms in Liposome derselbe AntiT4-Antikörper bestimmt wird.
  • Tabelle 2
    Antikörper- Standardabweichung
    Konzentration
    erfindungsgemäßes herkömmliches
    Verfahren Verfahren
    1 µM 0,11 µM 0,65 µM
    15 µM 0,02 µM 0,42 µM
    Wie bereits beschrieben, verringert die vorliegende Erfindung entscheidend die aus der Probe resultierenden Fehler, wobei die Genauigkeit des Immunoassays verbessert wird. Dadurch werden Ultramikroanalysen ermöglicht.
  • - Leerseite -

Claims (12)

  1. Patentansprüche 1. Immunoasseyreagens g e k e n n z e i c h n e t durch: a) Mikrokapseln, die jeweils eine entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper markierte Membran aufweisen, b) einen in den Mikrokapseln enthaltenen Chelatbildner, der zur Farbreaktion mit einem Metallion befähigt ist, und c) einem Metallsalz, das eine Farbreaktion mit dem Chelatbildner eingeht.
  2. 2. Immunoasseyreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner 2-5-Br-2-pyridylazo-5-N-propyl-N-sulfopropylaminoanilin, Dimethylsulfonazo-III, Chromazurol B, 2-(2-thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure, Nitroso-PSAP oder Bathophenanthrolin enthalten ist.
  3. 3. Immunoasseyreagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallsalz ein Eisen (II)-, Eisen (III)-, Zink-, Kupfer-, Barium-, Nickel-, Kobalt-, Calcium-, Magnesium oder Aluminiumsalz enthalten ist.
  4. 4. Immunoassayreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln in einer Lösung suspendiert sind und das Metallsalz in dieser Lösung gelöst ist.
  5. 5. Immunoasseyreagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösung eine auf einen bestimmten pH-Wert eingestellte Pufferlösung vorliegt.
  6. 6. Immunoasseyreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikrokapseln Liposomen mit einer Teilchengröße von 1 mß bis 1 mm vorliegen.
  7. 7. Immunoasseyreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich anwesend ist d) ein Komplement, das durch eine Reaktion zwischen dem Antigen und dessen kognatem Antikörper aktiviert wird.
  8. 8. Immunoasseyreagens zur Bestimmung eines Antikörpers oder eines Antigens, g e k e n n z e i c h n e t durch.
    a) Mikrokapseln, die jeweils eine entweder mit dem korrespondierenden Antigen oder Antikörper markierte Membran aufweisen, und b) einen in den Mikrokapseln enthaltenen Chelatbildner, der zur Farbreaktion mit einem Metallion befähigt ist.
  9. 9. Immunoasseyreagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln in trockener Form vorliegen.
  10. 10. Immunoassayreagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln in einer Flüssigkeit suspendiert sind.
  11. 11. Immunoasseyverfahren g e k e n n z e i c h n e t d u r c h folgende Verfahrensschritte: a) Mischen von Mikrokapseln, die jeweils eine mit einem Antigen markierte Membran aufweisen und einen Chelatbildner enthalten, einem Metallsalz, das zur Reaktion mit dem Chelatbildner befähigt ist, einem Komplement und einer den Antikörper enthaltenden Probe, b) Freisetzen des Chelatbildners aus den Mikrokapseln durch eine Antigen/Antikörper-Reaktion, und c) optische Antikörper-Bestimmung mittels der Färbung, die durch die Reaktion zwischen dem Chelatbildner und dem Metallion verursacht wird.
  12. 12. Immunoassayverfahren, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h folgende Verfahrensschritte: a) Mischen von Mikrokapseln, die jeweils eine mit einem Antigen markierte Membran aufweisen und einen Chelatbildner enthalten, einem Metallion, das zur Reaktion mit dem Chelatbildner befähigt ist, einem Komplement und einer das Antigen enthaltenden Probe, b) Freisetzen des Chelatbildners aus den Mikrokapseln durch eine Antigen/Antikörper-Reaktion, und c) optische Antigen-Bestimmung inder dadurch gefärbten Reaktionsflüssigkeit.
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