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Beschreibung
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Immunoassayreagens und Immunoassayverfahren Die Erfindung bezieht
sich auf ein Immunoassayreagens und auf ein Immunoassayverfahren, wobei insbesondere
Mikrokapseln mit jeweils einer entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper
markierten Membran eingesetzt werden.
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Typische Immunoassayverfahren, die in der Praxis eingesetzt wurden,
sind z.B. Radioimmunoassays, wobei man in einer aus vitalem Gewebe gewonnenen Probe
ein Antigen über eine Antigen/Antikörper-Reaktion zwischen einem mit einem Radioisotop
markierten Antikörper und diesem Antigen bestimmt. Weil dieses Verfahren jedoch
mühsam ist, wurden Immunoassayverfahren auf der Basis der Absorptionsspektroskopie
unter Verwendung von Mikrokapseln vorgeschlagen. Zum Beispiel beschreibt US-PS 4
342 826 ein Immunoassayverfahren, bei dem man ein Liposom, das eine Lipidmembran
aufweist und dort ein Enzym trägt, mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert,
eine Probe mit diesem Liposom mischt, um dabei dessen Membran mit einer immunologischen
Reaktion aufzubrechen, das Enzym mit einem Substrat reagieren läßt, und schließlich
die Konzentration an Antikörper oder Antigen der Reaktionsflüssigkeit mit einem
Photometer bestimmt.
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Jedoch zeigen die dabei mit einer enzymatischen Reaktion erhaltenen
Daten eine gewisse probenabhängige Streuung, die zu ernsthaften Fehlern führt.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Immunoassays, mit dem eine Probe mit geringstmöglichen Fehlern analysiert werden
kann, auch wenn sie ein Substrat oder ein Enzym enthält und die Bereitstellung eines
Immunoassayreagenses für dieses Immunoassayverfahren.
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In dem erfindungsgemäßen Immunoassayverfahren wird keine enzymatische
Reaktion eingesetzt. Wenn nämlich eine Serumprobe ein Substrat oder Enzym enthält,
würde ein Substrat oder Enzym, das durch den Fortgang der Antigen/ Antikörper-Reaktion
aus der Mikrokapsel freigesetzt wird, ebenso mit dem oben erwähnten, aus der Probe
herrührendem Substrat oder Enzym reagieren, und dabei einen großen Reaktionsuntergrund
entstehen lassen, woraus sich häufig eine deutliche Abnahme der Analysengenauigkeit
ergibt.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunoassayreagens unter Verwendung
von Mikrokapseln zur Verfügung, die jeweils eine entweder mit einem Antigen oder
einem Antikörper markierte Membran aufweisen (im folgenden als markierte Mikrokapseln
bezeichnet) und die einen Chelatbildner enthalten, der bei der Koordinierung mit
einem Metallion eine Färbung zeigt.
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Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Immunoassayreagens
zur Verfügung, das folgendes beinhaltet: markierte Mikrokapseln; einen in diesen
markierten Mikrokapseln enthaltenen Chelatbildner, der bei der Koordinierung mit
einem Metallion eine Färbung zeigt; und eine Flüssigkeit, in der diese Mikrokapseln
dispergiert werden und in der das Metallion außerhalb der Mikrokapseln eingesetzt
werden kann.
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Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein Immunoassayverfahren
bereit, in dem folgendes inbegriffen ist: Mischen von markierten, einen Chelatbildner
enthaltenden Mikrokapseln, einem zur Reaktion mit diesem Chelatbildner befähigten
Metallsalz, einem Komplement und einer einen Antikörper oder ein Antigen enthaltenden
Probe; Freisetzen des Komplexbildners aus den Mikrokapseln durch die dadurch ausgelöste
Antigen/Antikörper-Reaktion; und Bestimmung des durch die Reaktion zwischen dem
Chelatbildner und dem Metallsalz erhaltenen Produktes, um dadurch das Antigen oder
den Antikörper in der Probe zu analysieren.
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Da in einer Vitalprobe kein Chelatbildner entsteht, verursacht die
Probe nur einen vergleichsweise geringen Reaktionshintergrund, wodurch das Signal/Rausch-Verhältnis
bedeutend angehoben wird.
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Fig. 1 zeigt eine Kalibrierkurve zur erfindungsgemäßen Bestimmung
von AntiT4-Antikörper.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokapseln können
z.B. aus Liposomen bestehen, von denen jedes eine dünne Membran aufweist. Zur Bestimmung
des Antigens wird diese Membran mit dem kognaten Antikörper markiert.
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Umgekehrt wird zur Bestimmung eines Antikörpers die Membran mit dessen
kognatem Antigen markiert.
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Diese Mikrokapseln werden nach einem Verfahren hergestellt, das in
"Methods in Enzymology", 74, 152-161 (1981) beschrieben ist. Dabei werden Sphingomyelin,
Cholesterin, Dicetylphosphat und Thyroxin (T4) in Methanol gelöst. Das Lösemittel
der erhaltenen Lösung wird im Vakuum auf einer Glasplatte verdampft, wobei auf dieser
eine trockene Lipid-Membran entsteht. Dann wird die mit Thyroxin-einem Antigen -markierte
Membran durch Rühren in einem Mixer mit einer Lösung des Chelatbildners von bestimmter
Konzentration
gemischt, um das Lipid zu'ernulgieren. Auf diese
Weise wird der Chelatbildner in jederMikrokapsel eingeschlossen.
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Die Lipidmembran bildet ein Liposom mit einer hydrophilen äußeren
Oberfläche. Die so erhaltenen Liposomen werden durch das Auswaschen von Verunreinigungen
gereinigt. Jedes Liposom hat bevorzugt eine Teilchengröße von 1 m(gm) bis 1 mm,
obwohl einzelne Teilchen auch Größen außerhalb dieses Bereiches aufweisen können.
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Zusätzlich zu Liposomen können auch Erythrocyten vom Schaf und Nylonkapseln
als Mikrokapseln eingesetzt werden. Diese Mikrokapseln können getrocknet werden
und in Form eines aranulierten oder tablettierten Immunoassayreagenses aufbewahrt
werden. Alternativ kann man zur Zubereitung eines Immunoassayreagenses die Liposomen
auch in einer Pufferlösung von geeignet eingestelltem pH-Wert suspendieren. Zusätzlich
zu den Liposomen muß dieses flüssige Reagens weiterhin ein Komplement und ein Metallsalz
enthalten. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Zusammensetzung eines solchen flüssigen
Immunoassayreagenses.
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Tabelle 1 Liposom T4-bindende Liposome mit einem Gehalt von 10 m
M 5-Br-PAPS Komplement gepooltes eerschweinchen-Serum Metallsalz 100 mM FeCl2 Pufferlösung
10 mM Veronalpufferlösung (pH 7,4) Bei der Verwendung von 2-5-Br-2-pyridylazo-5-N-propyl-N-sulfopropylaminoanilin
(nachfolgend als 5-Br-PAPS bezeichnet) als Chelatbildner eignen sich FeCl2 und
ZnC1
als Metallsalze, und die Extinktion kann bei 552 nm 2 gemessen werden; verwendet
man Dimethylsulfonazo-III als Chelatbildner, eignet sich als Metallsalz BaCl2 (Bestimmungder
Extinktion bei 655 nm); verwendet man Chromazurol B als Chelatbildner, eignet sich
FeCl3 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 630 nm); verwendet man 2- (2-Thiazolylazo)
-4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure (nachfolgend als TAMSMB bezeichnet) als
Chelatbildner, eignet sich CuCl2 als Metallsalz (Bestimmung der Extinktion bei 585
nm); verwendet man Nitroso-PSAP als Chelatbildner, eignet sich FeCl2 als Metallsalz
(Bestimmung der Extinktion bei 756 nm); verwendet man Bathophenanthrolin (nachfolgend
als BFT bezeichnet) als Chelatbildner, eignet sich FeCl2 als Metallsalz (Bestimmung
der Extinktion bei 535 nm).
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Jeder Chelatbildner zeigt eine Färbung bei der Koordinierung mit einem
Metallion, insbesondere einem Schwermetallion, wodurch die optische Bestimmung mit
einem Photometer ermöglicht wird.
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Eisen-, Aluminium-, Magnesium-, Calcium-, Nickel- und Kobalt-Salze
sind Beispiele für Metallsalze, die in der Lösung enthalten sein können, welche
mit der Probe zu mischen ist, um dadurch eine Antigen/Antikörper-Reaktion auszulösen.
Bei der Vermischung einer Mikrokapsel mit einer Probe, die das zu bestimmende Antigen
oder den zu bestimmenden Antikörper enthält, erfolgt eine Antigen/Antikörper-Reaktion
zwischen zu bestimmendem Antigen oder zu bestimmendem Antikörper und dem Antigen
oder Antikörper, mit dem die Membran der Mikrokapsel markiert ist. Danach greift
ein auf diese Weise aktiviertes Komplement die Membran der Mikrokapsel an, um sie
aufzulösen. Auf diese Weise wird der in der Mikrokapsel enthaltene Chelatbildner
daraus freigesetzt und reagiert mit dem Metallion außerhalb der Mikrokapsel. Daraufhin
weist der Chelatbildner eine Färbung auf, die von dem Ausmaß dieser Freisetzung
abhängig ist. Da die Anzahl der aufgebrochenen Mikrokapseln der Menge von Antigen
oder Antikörper in der Probe direkt propor-
tional ist, kann man
die Konzentration an Antigen oder Antikörper entsprechend der Färbung bestimmen,
was über eine vorher aufgenommene Kalibrierkurve geschieht.
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Das Komplement, das mehrere Bestandteile enthält, erkennt eine immunologische
Reaktion und löst die Liposom-Membran auf.
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üblicherweise verwendet man als Komplement ivleerschweinchen-Serum.
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Die vorliegende Erfindung eignet sich zur Detektion vieler Antigen/Antikörper-Reaktionen.
Typische Beispiele für Antigene sind T4, T3, Globulin und IGG.
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Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter beschrieben.
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Man bereitet eine Lösung von 5-Br-PAPS-einemChelatbildner -mit einer
Konzentration von 10 Mol/l, die in die Mikrokapseln eingebracht werden muß. Hierzu
dispergiert man ein zur Markierung mit einem Antigen oder einem Antikörper befähigtes
Lipid in dieser Lösung, wodurch eine Anzahl von Liposomen erhalten wird, indenender
Chelatbildner nunmehr ingeschlossenist.Die äußere Oberfläche der erhaltenen Liposomen
wird durch wiederholtes Auswaschen von Verunreinigungen gesäubert. Dann markiert
man die Oberfläche jeder Mikrokapsel mit Thyroxin (T4).
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Man dispergiert 0,001 ml der so erhaltenen Mikrokapseln in einer isotonischen
Lösung, die 0,154 Mol/l Natriumchlorid enthält, gibt 100 mM Eisenchlorid (FeCl2)
und 20 ßl eines öinplenaents dazu und stellt das Gesamtvolumen auf 1 1 ein.
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Die Reaktionslösung kann in einem Behälter aufbewahrt und bei Bedarf
als Immunoassayreagens verwendet werden.
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Man bestückt den Probenaufnehmer (sampler) eines klinischen Analysenautomaten
mit Probengefäßen, die eine Serumprobe enthalten, hält die Reaktionsstrecke bei
37 "C und bringt
Reaktionsgefäße beweglich intermittierend in die
Reaktionsstrecke, in der ein Probenpipettiersystem, ein Reagensversorgungssystem
und ein Vielfachwellenlängen-Photometer vorhanden sind. Durch das Probenpipettiersystem
werden jeweils 10 Wl der Serumprobe aus den Probengefäßen pipettiert und in die
Reaktionsgefäße der Reaktionsstrecke überführt. Durch das Reagensversorgungssystem
werden jeweils 2 ml des nach obiger Vorschrift hergestellten Reagens in die Reaktionsgefäße
eingebracht. Anschließend werden die Reaktionsgefäße bei gleichzeitiger Weiterbeförderung
inkubiert. Nach 30 min erreicht jedes Reaktionsgefäß zusammen mit der Reaktionsflüssigkeit
die Stelle der photometrischen Messung, wo die Reaktionsflüssigkeit, zur Bestimmung
ihrer Extinktion bei 522 nm, bestrahlt wird. Das Ergebnis der Messung wird in einem
Rechner ermittelt und die Konzentration an AntiT4-Antikörper in der Probe ausgedruckt.
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Fig. 1 zeigt eine Kalibrierkurve, die man erhält, wenn das Reaktionsgefäß
mit der oben erwähnten Reagenslösung, mit Antikörper-freiem Serum und mit AntiT4-Antikörper
bekannter Konzentration beschickt wird. Diese Blindprobe zeigt einen Mittelwert
von 0,04 ßM/l und eine Varianz von 0,02 ßM/l.
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Die Reproduzierbarkeit bei einer mittleren Antikörper-Konzentration
von 15 ßM/l zeigt eine Standardabweichung von 0,02 ßM/l. Die Empfindlichkeit im
Hinblick auf den Serumspiegel ist in diesem Reaktionssystem 2 x io8 M/l.
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Tabelle 2 zeigt einen Vergleich zwischen dem Ergebnis einer Antikörperbestimmung
unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Kalibrierkurve und jenem eines herkömmlichen
Verfahrens, wobei durchEinschlußeines Enzyms in Liposome derselbe AntiT4-Antikörper
bestimmt wird.
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Tabelle 2
| Antikörper- Standardabweichung |
| Konzentration |
| erfindungsgemäßes herkömmliches |
| Verfahren Verfahren |
| 1 µM 0,11 µM 0,65 µM |
| 15 µM 0,02 µM 0,42 µM |
Wie bereits beschrieben, verringert die vorliegende Erfindung entscheidend die aus
der Probe resultierenden Fehler, wobei die Genauigkeit des Immunoassays verbessert
wird. Dadurch werden Ultramikroanalysen ermöglicht.
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