DE3501865A1

DE3501865A1 - Process and apparatus for the electrofusion of cells

Info

Publication number: DE3501865A1
Application number: DE19853501865
Authority: DE
Inventors: Christian 5110 Alsdorf Matschke
Original assignee: GCA Corp
Current assignee: B Braun Melsungen AG
Priority date: 1985-01-22
Filing date: 1985-01-22
Publication date: 1986-07-24
Also published as: DE3501865C2

Abstract

In order to create a process for the electrofusion of cells in which a cell suspension is introduced into a fusion volume, the cells contained in the cell suspension are fused in the fusion volume by means of electrical fields, and subsequently the cell suspension is transferred from the fusion volume into a collecting volume, and which allows non-damaging removal of the fused cells from the fusion volume, it is proposed that the cell suspension be transferred from the fusion volume into the collecting volume by the action of centrifugal forces, to which end the fusion volume and the collecting volume are set in rotational motion around the same axis of rotation with the same angular velocity.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Method and device for

Elektrofusion von Zellen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elektrofusion von Zellen, bei welchem eine Zellsuspension einem Fusionsvolumen zugeführt wird sowie die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen in dem Fusionsvolumen mittels elektrischer Felder fusioniert werden und anschließend die Zellsuspension aus dem Fusionsvolumen in ein Sammelvolumen überführt wird. Electrofusion of cells The invention relates to a method for Electrofusion of cells, in which a cell suspension is supplied to a fusion volume as well as the cells contained in the cell suspension in the fusion volume by means of electric fields are fused and then the cell suspension from the Fusion volume is converted into a collection volume.

Des weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit einem Element zur Aufnahme einer Zellsuspension und mit mindestens zwei mit der Zellsuspension in Kontakt stehenden Elektroden, zwischen denen eine Fusion der Zellen herbeiführende elektrische Felder erzeugbar sind.The invention also relates to an implementation device of the method with an element for receiving a cell suspension and with at least two electrodes in contact with the cell suspension, between which one Fusion of the cells bringing about electric fields can be generated.

Bisher wird bei der Elektrofusion von Zellen so verfahren, daß die Zellsuspension auf einer Oberfläche eines Zellträgers aufgebracht wird, die mit mindestens zwei Elektroden versehen ist (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membran Biol. 67, 165 (1982) und U.So far, the electrofusion of cells is such that the Cell suspension is applied to a surface of a cell carrier, which with at least two electrodes are provided (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membran Biol. 67, 165 (1982) and U.

Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227-277 (1982)). Die Zellsuspension verteilt sich dabei so auf der Oberfläche des Zellträgers, daß sie mit den beiden Elektroden in Kontakt kommt. Das Fusionsvolumen entspricht dabei einem von den beiden Elektroden und der Zellträgerplatte gebildeten Kanal, der von den elektrischen Feldern durchsetzt wird. Nach Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes werden beispielsweise zu fusionierende Zellen zunächst durch Dielektrophorese aneinandergereiht und im Anschluß daran wird ein die Fusion der Zellen herbeiführender elektrischer Feldimpuls appliziert.Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227-277 (1982)). the Cell suspension is distributed on the surface of the cell carrier in such a way that it comes into contact with the two electrodes. The fusion volume corresponds to a channel formed by the two electrodes and the cell carrier plate, which is led by the electric fields is penetrated. After applying an alternating electric field For example, cells to be fused are first lined up by dielectrophoresis and in connection with this there is an electrical which brings about the fusion of the cells Field pulse applied.

Es ist auch bekannt (Patentanmeldung P 33 17 415.6), anstelle des Zellträgers mit Elektroden eine Kammer zu verwenden, bei der das Fusionsvolumen durch einen Innenkörper und einen diesen mit gleichbleibendem Abstand umschließenden Außenkörper begrenzt ist, wobei dieses Fusionsvolumen durch die zwischen dem Innen-und dem Außenkörper spiralförmig angeordneten Elektroden die Form einer mehrgängigen, den Innenkörper umgebenden Schraube besitzt.It is also known (patent application P 33 17 415.6), instead of the Cell carrier with electrodes to use a chamber in which the fusion volume by an inner body and one surrounding it at a constant distance Outer body is limited, this fusion volume by the between the inner and the outer body spirally arranged electrodes in the form of a multi-thread, has the screw surrounding the inner body.

Unmittelbar nach einer derartigen Fusion sind die neu entstandenen Zellen sehr labil, da durch den Feldimpuls erzeugte Löcher der Zellmembran erst im Laufe der Zeit ausheilen und die fusionierte Zelle noch eine langgestreckte, einer Aneinanderreihung der Zellen vor der Fusion ähnelnde Form besitzt, die sich erst nach einiger Zeit abrundet und eine energetisch günstigere und mechanisch stabilere runde Form einnimmt.Immediately after such a merger, the newly created Cells very unstable, as holes in the cell membrane created by the field pulse are the result heal over time and the fused cell still has an elongated, a row of cells in front of the Fusion-like shape which only rounds off after a while and an energetically more favorable one and assumes a mechanically more stable round shape.

Trotz dieser Labilität der Zellen ist es notwendig, daß die Zellsuspension nach der Fusion möglichst schnell aus dem Fusionsvolumen entfernt wird. Dies hat zum einen den Grund, daß das Fusionsvolumen für die Fusion weiterer Zellen verwendet werden soll,und zum anderen ist dies darin begründet, daß die fusionierten Zellen möglichst schnell in ein Nachbehandlungsmedium überführt werden sollten, da ein zur Herstellung verwendetes und auch für die Durchführung der Fusion erforderliches spezielles Fusionsmedium die neu fusionierten Zellen im Laufe der Zeit schädigt und folglich deren hub er lebensrate beträchtlich reduziert.Despite this lability of the cells, it is necessary that the cell suspension is removed from the fusion volume as quickly as possible after the fusion. this has on the one hand the reason that the fusion volume is used for the fusion of further cells and on the other hand this is due to the fact that the fused cells should be transferred to an aftertreatment medium as quickly as possible, as a used for the production and also necessary for the implementation of the fusion special fusion medium damages the newly fused cells over time and consequently their stroke he reduced life rate considerably.

Bisher werden die fusionierten uwd zum Teil noch leicht an den Elektroden haftenden Zellen dadurch aus dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen überführt, daß man diese aus dem Fusionsvolumen absaugt - beispielsweise mit einer Mikropipette - oder daß man das Fusionsvolumen ausspült, wobei als Spülmedium beispielsweise das Nachbehandlungsmedium verwendet wird. Sowohl beim Ausspülen des Fusionsvolumens wie auch beim Absaugen entstehen jedoch Turbulenzen in der Suspension, die auf die Zellen wirkende Scherkräfte hervorrufen. Da die Zellmembran, wie bereits erläutert, noch nicht abgerundet und somit auch mechanisch noch sehr labil ist, haben diese Scherkräfte zur Folge, dass ein Teil der fusionierten Zellen beim Ausspülen oder Absaugen aus dem Fusionsvolumen zerstört wird.So far, the fused uwd are still lightly attached to the electrodes transferred cells from the fusion volume to the collection volume, that this is sucked out of the fusion volume - for example with a micropipette - Or that the fusion volume is rinsed out, for example as a rinsing medium the aftertreatment medium is used. Both when rinsing out the fusion volume as with suction, however, turbulence occurs in the suspension, which affects the Shear forces acting on cells. Since the cell membrane, as already explained, has not yet been rounded and is therefore still very unstable mechanically Shear forces result in some of the fused cells from being flushed out or aspirated the fusion volume is destroyed.

Es ist ebenfalls bekannt (Patentanmeldung P 33 17 415.6 und R.Schnettler, U. Zimmermann und C.C.Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), Seiten 81-85), die fusionierten Zellen von dem Fusionsvolumen, in welchem sie in Fusionslösung suspendiert sind, in ein anderes mit Nachbehandlungslösung gefülltes Volumen durch die Einwirkung von Zentrifugalkräften zu überführen. Dabei werden jedoch weder die Fusions- noch die Nachbehandlungslösung durch die Einwirkung der Zentrifugalkräfte bewegt, sondern diese beiden Lösungen bleiben als übereinandergeschichtete Lösungen stehen und nur die fusionierten Zellen werden, wie auch bei allen bisher bekannten Zentrifugierverfahren üblich, mittels der Zentrifugalkräfte durch die Fusionslösung hindurch und von dieser in die Nachbehandlungslösung überführt.It is also known (patent application P 33 17 415.6 and R.Schnettler, U. Zimmermann and C.C. Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), pages 81-85), the fused cells from the fusion volume in which they are in fusion solution are suspended into another volume filled with aftertreatment solution to transfer the action of centrifugal forces. However, neither the Fusion nor the aftertreatment solution by the action of centrifugal forces moves, but these two solutions remain as stacked solutions stand and only the fused cells are, as with all previously known Centrifugation process common, by means of centrifugal forces through the fusion solution through and transferred from this into the aftertreatment solution.

Auch bei diesem Verfahren wirken auf die fusionierten Zellen Scherkräfte, die dadurch entstehen, dass diese Zellen durch eine stehende Flüssigkeit mit einer bestimmten Zähigkeit hindurchbewegt werden müssen, so dass aussen an der Zellmembran, vor allem bei noch nicht abgerundeten Zellen, grosse Scherkräfte angreifen.In this process, too, shear forces act on the fused cells, which arise when these cells are exposed to a standing liquid with a must be moved through a certain tenacity, so that on the outside of the cell membrane, Apply large shear forces, especially in cells that are not yet rounded.

Daher ist es hierbei ebenfalls nicht möglich, die Zellen unmittelbar nach der Fusion in die Nachbehandlungslösung ohne Schädigung zu überführen, sondern es muss, wie bei Schnettler et.al.ausführlich beschrieben, so lange abgewartet werden, bis die Membranen der fusionierten Zellen sich abgerundet und somit ihre mechanisch stabile Form erreicht haben.Therefore, it is also not possible to use the cells directly after the fusion in the aftertreatment solution without damage, but rather as described in detail by Schnettler et al., one must wait as long as up the membranes of the fused cells rounded and thus have reached their mechanically stable form.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der gattungsgemässen Art zu entwickeln, bei welchem die fusionierten Zellen schonend aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können.The invention is now based on the object of providing a method of the generic type Kind of developing in which the fused cells gently out of the fusion volume can be removed.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die Zellsuspension durch Einwirkung von Zentrifugalkräften von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen überführt wird, wozu das Fusionsvolumen und das Sammelvolumen in einetRotationsbewegung um dieselbe Drehachse mit derselben Winkelgeschwindigkeit versetzt werden.According to the invention, this object is achieved in that the cell suspension by the action of centrifugal forces from the fusion volume into the collection volume is transferred, including the fusion volume and the collection volume in a rotational movement be offset around the same axis of rotation with the same angular velocity.

Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass durch die ausschliessliche Einwirkung von Zentrifugalkräften die Suspension und mit dieser auch die darin enthaltenen fusionierten Zellen, ohne dass durch äussere Einwirkungen in der Suspension Turbulenzen und somit auf die Zellen wirkende Scherkräfte auftreten, aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können. Dieses Verfahren ist deshalb so schonend, da durch das Zentrifugieren in sämtlichen Volumenelementen der Zellsuspension und in erster Näherung auch in den Volumenelementen der fusionierten Zellen denselben Betrag und dieselbe Richtung aufweisende Kräfte auftreten, die die Zellsuspension mitsamt den darin enthaltenen fusionierten Zellen als Ganzes aus dem Fusionsvolumen hinausbewegen. Dabei kann durch Wahl der Winkelgeschwindigkeit der Betrag der Zentrifugalkräfte und somit auch eine Fließgeschwindigkeit der Suspension aus dem Fusionsvolumen heraus in einem sehr großen Bereich kontinuierlich variiert werden.The advantage of the method according to the invention is that by the exclusive action of centrifugal forces the suspension and with this also the fused cells contained therein, without being caused by external Effects in the suspension Turbulence and thus shear forces acting on the cells occur, can be removed from the fusion volume. This procedure is therefore so gentle, because centrifugation in all volume elements of the cell suspension and, to a first approximation, the same in the volume elements of the fused cells Amount and directional forces occur that affect the cell suspension including the fused cells contained therein as a whole move out of the fusion volume. You can choose the angular velocity the amount of centrifugal forces and thus also a flow rate of the suspension varies continuously from the fusion volume over a very large range will.

Schließlich ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin zu sehen, daß das Sammelvolumen gemeinsam mit dem Fusionsvolumen mitrotiert, so daß beim Übergang der Suspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen außer den Zentrifugalkräften keine Kräfte auf die Suspension wirken, wie dies z.B. der Fall wäre, wenn das Sammelvolumen gegenüber dem Fusionsvolumen mit unterschiedlicher Winkelgeschwindigkeit rotieren oder gar stillstehen würde.Finally, there is an essential advantage of the method according to the invention can be seen in the fact that the collection volume rotates together with the fusion volume, so that when the suspension passes from the fusion volume to the collection volume apart from the centrifugal forces, no forces act on the suspension, as e.g. would be the case if the collection volume compared to the fusion volume with different Would rotate angular velocity or even stand still.

Die bisherige Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt offen, ob dieses bei einzelnen Fusionsexperimenten Anwendung finden oder zur Massenproduktion von fusionierten Zellen eingesetzt werden soll. Besonders die Massenproduktion bereitete bei den bisher bekannten Verfahren große Schwierigkeiten, da ein rasches und schonendes Entfernen der Zellen aus dem Fusionsvolumen wegen der eingangs erläuterten Gründe nicht möglich war. Dies ist jedoch der große Vorteil der vorliegenden Erfindung, so dass ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens darin zu sehen ist, daß dieses quasi kontinuierlich geführt wird, wobei ein Zuführen der Zellsuspension in das Fusionsvolumen, ein Fusionieren der Zellen und das Überführen der Zellsuspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen jeweils aufeinanderfolgende und sich in dieser Reihenfolge ständig wiederholende Vorgänge sind.The previous description of the method according to the invention leaves open as to whether this will be used for individual fusion experiments or for mass production to be used by fused cells. Especially prepared for mass production with the previously known methods great difficulties, since a quick and gentle one Removal of the cells from the fusion volume for the reasons explained at the beginning was not possible. However, this is the great advantage of the present invention, so that's a particularly preferred one Embodiment of the invention Process can be seen in the fact that this is carried out quasi continuously, with feeding the cell suspension into the fusion volume, fusing the cells and transferring the cell suspension from the fusion volume to the collection volume consecutive and repetitive in this order Operations are.

Gemäß der bisherigen Verfahrensführung sammelt sich eine immer größere Menge von fusionierten Zellen in dem Sammelvolumen an, so daß das quasikontinuierliche Verfahren nach einigen Durciäufen unterbrochen werden müsste, um die fusionierten Zellen aus dem Sammelvolumen zu entnehmen. Daher ist es zweckmäßig, wenn sich an das Überführen der Zellen in das Sammelvolumen noch ein Entfernen der Zellsuspension aus dem Sammelvolumen anschließt, so daß die einzelnen Vorgänge bei dem quasikontinuierlichen Verfahren in beliebiger Zahl und beliebig lange wiederholt werden können und außerdem das Sammelvolumen nur so groß sein muß, daß es die bei einem Durchlauf des quasikontinuierlichen Verfahrens in dieses übergeführte Zellsuspension aufnehmen kann, die dann in einem letzten Schritt des quasikontinuierlichen Verfahrens aus dem Sammelvolumen entfernt wird.According to the previous procedure, an ever larger one accumulates Amount of fused cells in the collection volume so that the quasi-continuous Proceedings would have to be interrupted after a few durations in order to merge them Remove cells from the collection volume. Therefore, it is useful when on transferring the cells into the collection volume or removing the cell suspension from the collection volume, so that the individual processes in the quasi-continuous Procedures can be repeated in any number and for any length of time and also the collection volume only needs to be so large that it is the quasi-continuous Process in this transferred cell suspension can take up, which then in a last step of the quasi-continuous process removed from the collection volume will.

Bei der Erläuterung der bisherigen Führung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde nicht darauf eingegangen, wie bei Zellen unterschiedlichen Zelltyps zu verfahren ist. Beispielsweise kann bei der Fusion zweier unterschiedlicher Zelltypen jeder Zelltyp in einer getrennten Zellsuspension in das Fusionsvolumen eingebracht werden.In the explanation of the previous management of the method according to the invention How to proceed with cells of different cell types was not discussed is. For example, when two different cell types are fused, each Cell type in a separate Cell suspension into the fusion volume be introduced.

Weit zweckmäßiger ist es jedoch, wenn bei der Fusion unterschiedlicher Zelltypen diese vor dem Zuführen in das Fusionsvolumen in der Suspension miteinander vermischt werden.It is far more useful, however, when the merger is different Cell types these before being fed into the fusion volume in suspension with each other be mixed.

Sämtliche Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht auf eine bestimmte Durchführung der Elektrofusion beschränkt, sondern diese kann auf jede bisher bekannte Art und Weise erfolgen. Eine Zusammenstellung der bisher bekannten Verfahren bei der Elektrofusion findet sich in der Veröffentlichung von U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, Seite 227 bis 277 (1982). So kann beispielsweise dem Applizieren des eigentlichen Fusionsimpulses die Bildung von Perlenketten der zu fusionierenden Zellen mittels Dielektrophorese vorausgehen, es kann aber auch nur mit einer hohen Zelldichte in der Suspension gearbeitet werden, so daß sich ein Aneinanderreihen der Zellen erübrigt und die Zellen nach ihrem Durchlöchern statistisch mit einer anderen Zelle in der Umgebung fusionieren, wobei selbstverständlich die Ausbeute an fusionierten Zellen gegenüber einem Fusionsverfahren mit vorhergehender Dielektrophorese weitaus geringer ist.All of the exemplary embodiments of the method according to the invention are not limited to a specific implementation of the electrofusion, but this one can be done in any previously known manner. A compilation of the previously known processes in electrofusion can be found in the publication by U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, pages 227-277 (1982). For example, the application of the actual fusion impulse can lead to the formation precede the cells to be fused by strings of pearls by means of dielectrophoresis, However, it is also possible to work with just a high cell density in the suspension, so that there is no need to line up the cells and the cells after they have been perforated randomly fusing with another cell in the vicinity, being of course the yield of fused cells versus a fusion process with a previous one Dielectrophoresis is far less.

Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der gattungsgemäßen Art zu schaffen, die eine Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt.Another object of the invention is to provide a device to create of the generic type, an implementation of the invention Procedure allowed.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, daß die Vorrichtung ein auf einen Rotor einer Zentrifuge aufsetzbares Gehäuse mit einer zum Rotor koaxialen Drehachse umfasst, das zur Aufnahme des Elements dient, und daß das Gehäuse eine sich bezüglich seiner Drehachse in radialer Richtung an das Element anschließende Kammer besitzt, in welcher sich beim Zentrifugieren die Suspension mit den fusionierten Zellen sammelt.According to the invention, this object is achieved in the case of a device as described in the introduction described type solved in that the device is one on a rotor Includes centrifuge attachable housing with an axis of rotation coaxial to the rotor, which is used to receive the element, and that the housing is one with respect to his Axis of rotation in the radial direction to the element adjoining chamber in which The suspension with the fused cells collects during centrifugation.

Die Vorteile dieser Vorrichtung entsprechen denen des bereits eingangs beschriebenen Verfahrens.The advantages of this device correspond to those already at the beginning described procedure.

Es ist ausdrücklich zu erwähnen, daß sich die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht darauf beschränkt, daß nur ein Element und eine diesem zugeordnete Kammer in dem Gehäuse vorgesehen sind, sondern daß in dem Gehäuse auch mehrere Elemente vorgesehen sein können und/oder daß jedem der Elemente jeweils eine Kammer zur Aufnahme der fusionierten Zellen des jeweiligen Elements zugeordnet werden kann.It should be expressly mentioned that the device according to the invention not limited to only one element and one chamber associated therewith are provided in the housing, but that in the housing also several elements can be provided and / or that each of the elements has a respective chamber for receiving can be assigned to the fused cells of the respective element.

Bezüglich einer Ausbildung der Kammer wurden bislang noch keine Angaben gemacht, so daß beliebige Formen denkbar sind. Besonders bevorzugt wird jedoch ein Ausführungsbeispiel der Kammer, bei dem diese einen Volumenbereich besitzt, der so ausgebildet ist, daß sich darin nach dem Zentrifugieren die in die Kammer überführte Suspension mit fusionierten Zellen sammelt und nicht zu dem Element zurückfließt. Dies ist auf vielerlei Art möglich. Im einfachsten Fall ist der Volumenbereich bezüglich des Elements in Richtung der Schwerkraft tiefergelegt, so daß die Suspension nach dem Zentrifugieren nicht zu dem Element zurückfließen kann.No information has yet been provided with regard to the training of the chamber made so that any shapes are conceivable. However, one is particularly preferred Embodiment of the chamber in which it has a volume area that is designed so that after centrifugation, the transferred into the chamber Fused cell suspension collects and does not flow back to the element. This is due to a number of things Kind possible. In the simplest case it is Volume area lowered in relation to the element in the direction of gravity, so that the suspension does not flow back to the element after centrifugation can.

Das Element zur Aufnahme der Zellsuspension kann unterschiedlich ausgebildet sein. Es ist ausschließlich erforderlich, daß dieses ein Entweichen der Suspension in Richtung der Zentrifugalkraft ermöglicht. Beispielsweise kann das Element als Rinne, Kanal, Trog oder auch als allseitig geschlossenes Behältnis mit einer öffnung ausgebildet sein, aus welchem die Suspension durch Wirkung der Zentrifugalkraft in die sich in radialer Richtung anschließende Kammer entweichen kann.The element for receiving the cell suspension can be designed in different ways be. It is only necessary that this allow the suspension to escape in the direction of centrifugal force. For example, the element can be saved as Channel, channel, trough or as a container closed on all sides with an opening be formed from which the suspension by the action of centrifugal force can escape into the adjoining chamber in the radial direction.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Element eine Zellträgerplatte darstellt, die auf einer Oberfläche mit mindestens zwei Elektroden versehen ist.It is particularly advantageous if the element is a cell carrier plate represents, which is provided on a surface with at least two electrodes.

Der Vorteil einer derartigen Zellträgerplatte besteht darin, daß einerseits die Suspension auf diese sehr einfach aufzubringen ist und andererseits die Suspension durch Einwirkung der Zentrifugalkräfte sehr leicht über die Oberfläche dieser Zellträgerplatte in Richtung der Kammer abfließen kann.The advantage of such a cell carrier plate is that on the one hand the suspension is very easy to apply to this and, on the other hand, the suspension by the action of centrifugal forces very easily over the surface of this cell carrier plate can flow in the direction of the chamber.

Einander zugewandte Seiten der Elektroden, die mit der Zellträgerplatte zusammen das Fusionsvolumen eingrenzen, können in beliebigen Richtungen auf der Zellträgerplatte verlaufen. Zum Beispiel kann das Fusionsvolumen ein Kanal sein, der zick-zack- oder mäanderförmig über die Zellträgerplatte verläuft. Ein besonders schonendes Entfernen der fusionierten Zellen aus dem Fusionsvolumen ist jedoch dann möglich, wenn einander zugewandte Seiten der Elektroden auf der Zellträgerplatte, zumindest zu einem wesentlichen Teil ihres Verlaufs, sich ungefähr in radialer Richtung zu der Drehachse des Gehäuses erstrecken, so dass zwischen diesen in radialer Richtung verlaufende Kanäle gebildet werden, längs denen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen durch die Zentrifugalkräfte von dem Fusionsvolumen in die Kammer überführt werden kann, ohne dass in der Zellsuspension Turbulenzen und somit Scherkräfte auftreten.Facing sides of the electrodes with the cell support plate together delimit the fusion volume, can be in any direction on the Cell carrier plate run. For example, the fusion volume can be a channel which runs zigzag or meander over the cell support plate. A particularly gentle removal of the fused cells from the fusion volume is however, possible if facing sides of the electrodes on the cell carrier plate, at least for a substantial part of its course, extends approximately in the radial direction to the axis of rotation of the housing extend so that between these in the radial direction running channels are formed, along which the cell suspension together with the fused Cells transferred from the fusion volume into the chamber by centrifugal forces without turbulence and thus shear forces occurring in the cell suspension.

Die Elektroden können in unterschiedlichster Weise auf die Zellträgerplatte aufgebracht sein. Die einfachste Möglichkeit sind auf der Zellträgerplatte gehaltene Drähte, die jede beliebige Form besitzen können.The electrodes can be placed on the cell carrier plate in a wide variety of ways be upset. The simplest option are those held on the cell carrier plate Wires that can be of any shape.

Besonders günstig ist es jedoch, wenn die Elektroden auf die Zellträgerplatte aufgebrachte dünne Schichten sind, da diese beispielsweise durch Aufdampfen auf die Zellträgerplatte sehr einfach herstellbar sind und außerdem eine glatte Oberfläche besitzen. Dies hat den Vorteil, daß die aufgrund der Zentrifugalkräfte über die Oberfläche der Elektroden hinwegbewegten fusionierten Zellen durch die Oberflächenrauhigkeit dieser Elektroden nicht beschädigt werden.However, it is particularly favorable if the electrodes are placed on the cell carrier plate are applied thin layers, as these are applied, for example, by vapor deposition the cell carrier plate are very easy to manufacture and also have a smooth surface own. This has the advantage that the centrifugal forces on the Fused cells moved away from the surface of the electrodes due to the surface roughness these electrodes are not damaged.

Die Abstände der Elektroden können in Abhängigkeit von der Größe der Zellen ohne Einschränkung beliebig gewählt werden. Damit jedoch zur Erzeugung einer für die Fusion ausreichenden Feldstärke an die Elektroden keine allzu großen Felder angelegt werden müssen, ist es von Vorteil, wenn die Elektroden in Abständen voneinander angeordnet sind, die entsprechend einer Größe der Zellen in einem Bereich von ungefähr 0,5 u bis zu mehreren mm liegen.The distances between the electrodes can depend on the size of the Cells can be freely selected without restriction. However, in order to generate a Fields that are sufficient for the fusion to the electrodes are not too large need to be applied, it is advantageous if the electrodes are spaced apart are arranged corresponding to a size of the cells in a range of approximately 0.5 u to several mm.

Für die Ausbildung des das Element zur Aufnahme der Zellsuspension umgebenden Gehäuses ist eine Vielzahl von Ausführungsformen denkbar. So ist es günstig, wenn das Element an dem Gehäuse auswechselbar gehalten ist.For the formation of the element for taking up the cell suspension surrounding housing, a variety of embodiments are conceivable. So it is favorable when the element is held replaceably on the housing.

Dies hat den Vorteil, daß die aufgrund der geringen Elektrodenabstände aufwendig zu reinigende Zellträgerplatte gegebenenfalls durch eine andere, gereinigte Zellträgerplatte ersetzt werden kann, so daß die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne großen Zeitverlust wieder verwendbar ist. In der Regel sind diese Zellträgerplatten, wenn sie beispielsweise auf fotografischem Wege hergestellt sind, auch sehr billig herzustellen, so daß es vor allem bei einer kommerziellen Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung rationeller ist, die benutzten Zellträgerplatten gar nicht mehr zu reinigen, sondern, wenn sie verschmutzt sind, durch neue Zellträgerplatten zu ersetzen.This has the advantage that due to the small spacing between the electrodes Cell carrier plate, which is expensive to clean, optionally with another, cleaned one Cell support plate can be replaced so that the according to the invention Device can be reused without losing a great deal of time. Usually these are Cell carrier plates, for example if they are produced by photographic means, also very cheap to manufacture, so it is especially useful in a commercial application the device according to the invention is more efficient, the cell support plates used Can no longer be cleaned at all, but when they are dirty, use new cell carrier plates to replace.

In der erfindungsgemäßen Vorrichtung muß unter sterilen Bedingungen gearbeitet werden, da ansonsten die Suspension der zu fusionierenden oder auch der fusionierten Zellen durch andere Organismen infiziert werden kann, die ein Kultivieren der fusionierten Zellen unmöglich machen. Aus diesem Grund ist es wünschenswert, wenn das Gehäuse steril verschließbar ist, so daß das darin befindliche Element zur Aufnahme der Zellsuspension während der Fusion und auch während dem sich anschliessenden Zentrifugiren unter sterilen Bedingungen gehalten werden kann.In the device according to the invention must be under sterile conditions be worked, otherwise the suspension of the to be merged or the fused cells can be infected by other organisms that cultivate one of the fused cells impossible. For this reason it is desirable when the housing can be closed in a sterile manner, so that the element located therein for uptake of the cell suspension during the fusion and also during the subsequent one Centrifugation can be kept under sterile conditions.

Da der Deckel des Gehäuses nach Aufbringen der Zellsuspension auf das Element aus den bereits genannten Gründen geschlossen werden sollte, ist es günstig, wenn dieser mindestens zwei elektrische Durchführungen aufweist, die einerseits mit den verschiedenen Elektroden des Elements Kontakt haben und andererseits von außerhalb des Gehäuses mit einer Spannungsquelle verbindbar sind.Since the cover of the housing after application of the cell suspension on Should the item be closed for the reasons already stated, it is favorable if this has at least two electrical bushings, on the one hand have contact with the various electrodes of the element and, on the other hand, of can be connected to a voltage source outside the housing.

Damit die Zellen während der Fusion beobachtet werden können, ist es weiterhin günstig, wenn das Element übergreifende Teile des Gehäuses, wie z.B. der Deckel des Gehäuses, durchsichtig sind.So that the cells can be observed during the fusion is it is furthermore favorable if the element overlaps parts of the housing, such as e.g. the cover of the case, are transparent.

Außerdem kann es weiterhin von Vorteil sein, wenn das Element selbst aus durchsichtigem Material hergestellt ist, so daß dieses zum Beobachten der Zellfusion beleichtbar und einsehbar ist.In addition, it can still be an advantage if the element itself made of clear material so that it can be used to observe cell fusion can be exposed and viewed.

Damit die Vorrichtung auch zur Durchführung des vorstehend beschriebenen quasikontinuierlichen Verfahrens geeignet ist, ist eine Zuführeinrichtung zur Beschickung des Elements mit Zellsuspension und eine Abführeinrichtung zum Entfernen der Zellsuspension aus der Kammer vorgesehen. Außerdem ist es noch zweckmäßig, wenn sowohl die Zuführeinrichtung wie auch die Abführeinrichtung mit einem Ventil verschließbar sind.So that the device can also perform the above quasi-continuous process is suitable, is a feed device for charging of the element with cell suspension and a discharge device for removing the cell suspension provided from the chamber. It is also useful if both the feed device as well as the discharge device can be closed with a valve.

Zum Mischen von Zellen unterschiedlicher Zelltypen vor dem Aufbringen der Suspension auf das Element ist es günstig, wenn die Zuführeinrichtung eine Mischkammer zur Herstellung einer Zellsuspension aus unterschiedlichen Zelltypen umfasst, so daß die unterschiedlichen zelltypen beim Aufbringen auf das Element homogen in der Suspension verteilt sind und folglich die Wahrscheinlichkeit für die Fusion von Zellen unterschiedlicher Zelltypen groß ist.For mixing cells of different cell types before application the suspension on the element, it is favorable if the feed device has a mixing chamber for the production of a cell suspension from different cell types comprises, see above that the different cell types when applied to the element homogeneous in the Suspension are distributed and, consequently, the likelihood of the merger of Cells of different cell types is large.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung sowie der beigefügten zeichnerischen Darstellung einiger Ausführungsformen der Erfindung. In der Zeichnung zeigen: Fig. 1 einen Schnitt (längs Linie 1-1 in Fig. 2) durch ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 2 einen Schnitt längs Linie 2-2 in Fig. 1; Fig. 3 einen Schnitt ähnlich Fig. 1 durch das erste Ausführungsbeispiel sowie durch eine Kontaktiervorrichtung; Fig. 4 eine teilweise aufgebrochene Ansicht einer Zentrifuge für das erste Ausführungsbeispiel; Fig. 5 einen Ausschnitt aus einem ersten Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte mit aufgedampften Elektroden; Fig. 6 einen vergrößerten Ausschnitt der Zellträgerplatte in Fig. 5; Fig. 7 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 8 ein drittes Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 9 ein Aufbringen von Zellsuspension auf die Zellträgerplatte eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 10 ein Entnehmen der Suspension aus fusionierten Zellen aus dem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 11 ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung und Fig. 12 ein drittes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung.Further features and advantages result from the following Description and the accompanying drawings of some embodiments the invention. In the drawing: Fig. 1 shows a section (along line 1-1 in Fig. 2) through a first embodiment of the device according to the invention; FIG. 2 shows a section along line 2-2 in FIG. 1; FIG. 3 shows a section similar to FIG. 1 by the first embodiment and by a contacting device; Fig. 4 is a partially broken away view of a centrifuge for the first embodiment; 5 shows a detail from a first exemplary embodiment of a cell carrier plate with vapor-deposited electrodes; 6 shows an enlarged section of the cell carrier plate in Fig. 5; 7 shows a second exemplary embodiment of a cell carrier plate; Fig. 8 a third embodiment of a cell carrier plate; Fig. 9 an application of cell suspension to the cell carrier plate of a first embodiment the device according to the invention; 10 shows a removal of the suspension from fused Cells from the first embodiment of the device according to the invention; Fig. 11 shows a second exemplary embodiment of the device according to the invention and FIG. 12 a third embodiment of the device according to the invention.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, dargestellt in den Figuren 1 und 2, zeigt im einzelnen ein zu einer Drehachse 20 rotationssymmetrisches,hohlzylindrisch ausgebildetes Gehäuse 22 mit einem Mantel 24, einem bezüglich der Drehachse 20 radial nach innen gezogenem Bodenteil 26, das eine Bohrung 28 aufweist,und einem ebenfalls radial nach innen gezogenen Oberteil 30 mit einer Öffnung 32. Somit ist durch das radial nach innen gezogene Oberteil 30 und das Bodenteil 26 sowie den Mantel 24 in Inneren des Gehäuses 22 ein Ringkanal 34 gebildet, welcher von einem Inneren des Gehäuses in radialer Richtung zugänglich ist.A first embodiment of a device according to the invention, shown in FIGS. 1 and 2, shows in detail an axis of rotation 20 rotationally symmetrical, hollow-cylindrical housing 22 with a jacket 24, a base part 26 drawn radially inward with respect to the axis of rotation 20, the has a bore 28, and a likewise radially inwardly drawn upper part 30 with an opening 32. Thus, through the radially inwardly drawn upper part 30 and the bottom part 26 and the jacket 24 in the interior of the housing 22 are an annular channel 34 formed, which is accessible from an interior of the housing in the radial direction is.

Das Bodenteil 26 trägt auf einer dem Ringkanal 34 zugewandten Innenseite 36 einen sich in Richtung des Oberteils 30 erhebenden ringförmigen Wulst 38, der sich in radialer Richtung im Anschluss an die Bohrung 28 nach aussen erstreckt, so dass auf der Innenseite 36 zwischen dem Wulst 38 und dem Mantel 24 eine zu dem Ringkanal 34 gehörende kreisringförmige Vertiefung 40 gebildet wird.The bottom part 26 carries on an inner side facing the annular channel 34 36 an annular bead 38 rising in the direction of the upper part 30, which extends outward in the radial direction following the bore 28, so that on the inside 36 between the bead 38 and the jacket 24 one to the Annular channel 34 belonging to annular recess 40 is formed.

Der vom Oberteil 30 den geringsten Abstand aufweisende Teil des Wulstes 38 trägt eine zur Drehachse 20 konzentrische Ringnut 42 zur Aufnahme einer kreisscheibenförmigen Zellträgerplatte 44, die sich senkrecht zur Drehachse 20 erstreckt. Diese ist in der Ringnut 42 so gehalten, daß eine dem Oberteil 30 zugewandte Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 einen geringeren Abstand von dem Oberteil 30 aufweist als der sich in radialer Richtung außen an die Zellträgerplatte 44 anschließende Teil des Wulstes 38. Damit ist sichergestellt, daß bei zur Richtung der Schwerkraft parallel stehender Drehachse 20 eine die Zellträgerplatte 44 in radialer Richtung verlassende Zellsuspension ein Gefälle vorfindet, durch welches sie über den Wulst 38 in Richtung der Vertiefung 40 geleitet wird.That part of the bead which is closest to the upper part 30 38 carries an annular groove 42 concentric to the axis of rotation 20 for receiving a circular disk-shaped one Cell carrier plate 44, which extends perpendicular to the axis of rotation 20. This is in the annular groove 42 held so that the upper part 30 facing surface 46 of the Cell carrier plate 44 has a smaller distance from the upper part 30 than that in the radial direction on the outside of the cell carrier plate 44 adjoining part of the Bead 38. This ensures that when parallel to the direction of gravity standing axis of rotation 20 is a cell carrier plate 44 leaving in the radial direction Cell suspension finds a gradient through which it over the bead 38 in the direction the recess 40 is passed.

Bevorzugterweise ist die Zellträgerplatte 44 in der Ringnut 42 auswechselbar gehalten, wobei es im allgemeinen ausreichend ist, wenn die Ringnut 42 so ausgebildet ist, daß sie einen Paß sitz für die Zellträgerplatte 44 darstellt, die bei diesem Ausführungsbeispiel von oben, d.h. von seiten des Oberteils 30, in die Ringnut 42 einsetzbar ist.The cell carrier plate 44 is preferably exchangeable in the annular groove 42 held, it is generally sufficient if the annular groove 42 is formed is, that it is a fitting seat for the cell support plate 44, which in this embodiment can be inserted into the annular groove 42 from above, i.e. from the side of the upper part 30.

Zum Verschließen der öffnung 32 in dem Oberteil 30 ist ein Deckel 48 vorgesehen, welcher in die Öffnung 32 einsetzbar ist und in radialer Richtung das Oberteil 30 auf einer Außenseite 50 übergreifende Randbereiche 52 besitzt, die verhindern, daß der Deckel 48 auf der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufsteht.A cover is used to close the opening 32 in the upper part 30 48 is provided, which can be inserted into the opening 32 and in the radial direction the upper part 30 has on an outer side 50 overlapping edge regions 52 which prevent the cover 48 from standing up on the surface 46 of the cell carrier plate 44.

Die Zellträgerplatte 44 ist auf ihrer Oberfläche 46 mit zwei Elektroden 54 und 56 versehen, welche eine beliebige Form besitzen können, jedoch in ihren einander zugewandten Bereichen so aneinander anzupassen sind, daß zwischen diesen Elektroden 54,56 ein Spalt 58 entsteht, der stets ungefähr dieselbe Breite aufweist.The cell support plate 44 is on its surface 46 with two electrodes 54 and 56 provided, which can have any shape, but in their facing areas are to be adapted to one another that between them Electrodes 54, 56 a gap 58 is created which always has approximately the same width.

Die einzelnen Formen der Elektroden 54 und 56 werden später im einzelnen beschrieben.The individual shapes of the electrodes 54 and 56 will be discussed in detail later described.

Die Kontaktierung der Elektroden 54 und 56 erfolgt durch in dem Deckel 48 vorgesehene und bevorzugterweise parallel zur Drehachse 20 stehende Kontaktstifte 60 und 62. Diese sind in jeweils ihrem Durchmesser angepassten Bohrungen 64 und 66 verschieblich gelagert, so dass sie beim Aufsetzen des Deckels 48 auf die den Kontaktstiften 60 und 62 zugeordneten Elektroden 54 bzw. 56 drücken und mit diesen einen elektrischen Kontakt herstellen können. Um die Kontaktstifte 60 und 62 bei Abnahme des Deckels 48 gegen ein Durchrutschen durch die Bohrungen 64 und 66 zu sichern, sind diese an einem der Zellträgerplatte 44 abgewandten Ende mit einem Kopf 68 bzw. 70 versehen, der teilweise in dem Deckel 48 versenkt ist.The electrodes 54 and 56 are contacted through in the cover 48 provided and preferably parallel to the axis of rotation 20 contact pins 60 and 62. These are each adapted to their diameter holes 64 and 66 slidably mounted so that when the cover 48 is placed on the Press electrodes 54 and 56 assigned to contact pins 60 and 62 and press them with them a can make electrical contact. To the contact pins 60 and 62 when removed to secure the cover 48 against slipping through the bores 64 and 66, are these at an end facing away from the cell carrier plate 44 with a head 68 or 70 is provided, which is partially sunk into the cover 48.

Zur Versorgung der Elektroden 54 und 56 mit für eine Fusion der Zellen notwendigen Spannungen ist eine in Fig. 3 dargestellte Halterung 72 vorgesehen, in welche das Gehäuse 22 mit bereits geschlossenem Deckel 48 einsetzbar ist. Die Halterung 72 umfasst eine Grundplatte 74, auf welcher das Gehäuse 22 mit seinem Bodenteil 26 steht. Gleichzeitig sind an der Halterung 72 bügelähnliche Federkontakte 76 und 78 gehalten, welche den Deckel 48 des Gehäuses 22 übergreifen und eine elektrische Verbindung mit dem Kopf 68 bzw. dem Kopf 70 der Kontaktstifte 60 bzw. 62 herstellen. Diese Federkontakte 76 und 78 stehen ihrerseits wieder mit einem Spannungsgenerator 80 in Verbindung, der die zu einer Elektrofusion erforderlichen Spannungen und Spannungsimpulse liefert.To supply the electrodes 54 and 56 with for a fusion of the cells necessary voltages a holder 72 shown in Fig. 3 is provided, in which the housing 22 can be inserted with the cover 48 already closed. the Bracket 72 comprises a base plate 74 on which the housing 22 with his Bottom part 26 is standing. At the same time there are clip-like spring contacts on the holder 72 76 and 78 held, which overlap the cover 48 of the housing 22 and an electrical Establish a connection with the head 68 and the head 70 of the contact pins 60 and 62, respectively. These spring contacts 76 and 78 are in turn connected to a voltage generator 80 in connection, which provides the voltages and voltage pulses required for an electrofusion supplies.

Fig. 4 zeigt eine Zentrifuge 82, die einen Motor 84 und einen durch diesen antreibbaren Rotor 86 besitzt, in welchen das Gehäuse 22 nach Durchführung der Elektrofusion einsetzbar und zum Entfernen fusionierter Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 zentrifugierbar ist.Fig. 4 shows a centrifuge 82, which has a motor 84 and a through this drivable rotor 86 has, in which the housing 22 after implementation can be used for electrofusion and to remove fused cells from the surface 46 of the cell carrier plate 44 can be centrifuged.

Ein erstes Ausführungsbeispiel für die Ausbildung der Elektroden 54 und 56 auf der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 zeigt Fig. 5. Die Elektrode 54 umfasst dabei einen am äußeren Rand der Zellträgerplatte 44 entlanglaufenden Kreisring 90, von welchem aus strahlenförmig in radialer Richtung weitere Elektroden 92 nach innen verlaufen. Die Elektrode 56 weist eine konzentrisch auf der Zellträgerplatte 44 angeordnete Kreisfläche 94 auf, von welcher aus sich in radialer Richtung strahlenförmige Elektroden 96 erstrecken, die zwischen den jeweiligen Elektroden 92 liegen. Die Form der Elektroden 92 und 96 ist dabei so gewählt, daß der Spalt 58 zwischen einander zugewandten Elektroden ungefähr dieselbe Breite besitzt, wie auch der vergrößerte Ausschnitt in Fig. 6 zeigt.A first exemplary embodiment for the formation of the electrodes 54 and 56 on the surface 46 of the cell support plate 44, Fig. 5 shows the electrode 54 comprises one running along the outer edge of the cell carrier plate 44 Annular ring 90 from which further electrodes radiate in the radial direction 92 run inwards. The electrode 56 has a concentric surface on the cell support plate 44 arranged circular surface 94, from which radially outward in the radial direction Electrodes 96 extend between the respective electrodes 92. the The shape of the electrodes 92 and 96 is chosen so that the gap 58 between one another facing electrodes has approximately the same width as the enlarged one Section in Fig. 6 shows.

Selbstverständlich müssen die Kontaktstifte 60 und 62 in dem Deckel 48 so angeordnet sein, daß jeder der Kontaktstifte 60 und 62 nur auf einer der Elektroden 54 bzw. 56 aufsitzt. Wie Fig. 1 zeigt, ist beim ersten Ausführungsbeispiel bevorzugterweise der Kontaktstift 62 konzentrisch zur Drehachse 20 angeordnet, so daß er auf der Fläche 94 der Elektrode 56 aufsteht und der Kontaktstift 60 so angeordnet ist, daß er auf den kreisringförmigen Teil 90 der Elektrode 54 aufsitzt.Of course, the contact pins 60 and 62 must be in the cover 48 be arranged so that each of the contact pins 60 and 62 only on one of the electrodes 54 or 56 is seated. As shown in FIG. 1, is preferred in the first embodiment the contact pin 62 is arranged concentrically to the axis of rotation 20 so that it is on the Surface 94 of the electrode 56 stands up and the contact pin 60 is arranged so that it is seated on the annular part 90 of the electrode 54.

Prinzipiell können die Elektroden 54 und 56 beliebig gestaltet sein, denn es ist einzig und allein der Spalt 58 zwischen den Elektroden 54 und 56 maßgebend.In principle, the electrodes 54 and 56 can be designed as desired, because only the gap 58 between the electrodes 54 and 56 is decisive.

Fig. 7 zeigt beispielsweise einen mäanderförmigen Verlauf des Spaltes 58 und Fig. 8 einen schneckenförmigen Verlauf dieses Spaltes 58.7 shows, for example, a meandering course of the gap 58 and FIG. 8 show a helical course of this gap 58.

Die Zellträgerplatte 44 besteht bevorzugterweise aus einer Glasplatte oder Quarzglaspiatte, auf welche die Elektroden 54 und 56 durch Aufdampfen oder durch ein fototechnisches Verfahren aufgebracht werden können. Die Dicke derartiger aufgedampfter Schichten beträgt ungefähr 5 bis 40 Cim. Vorteilhafterweise wird als Material für die Elektroden Chrom verwendet.The cell carrier plate 44 preferably consists of a glass plate or quartz glass plate, on which the electrodes 54 and 56 by vapor deposition or can be applied by a photo-technical process. The thickness of such vapor deposited layers is approximately 5 to 40 cim. Advantageously, as Material used for the electrodes chrome.

Die Breite des Spalts 58 oder der Abstand der Elektroden muss nach der Grösse der zu fusionierenden Zellen und nach den zur Verfügung stehenden Ausgangsspannungen des Spannungsgenerators 80 gewählt werden. Beispielsweise werden für Bakterien und Hefezellen Elektrodenabstände von 30 um und für Pflanzenprotoplasten Elektrodenabstände bis zu 500 um verwendet. Es sind jedoch auch Elektrodenabstände im Bereich von 1 bis 5 mm denkbar, die den Vorteil haben, dass die entstehenden Felder wesentlich homogener sind als bei geringeren Abständen, jedoch muss dann mit hohen Suspensionsdichten gearbeitet werden.The width of the gap 58 or the spacing of the electrodes must follow the size of the cells to be fused and the available output voltages of the voltage generator 80 can be selected. For example, for bacteria and Yeast cells electrode spacings of 30 µm and, for plant protoplasts, electrode spacings used up to 500 µm. However, there are also electrode spacings in the range of 1 up to 5 mm conceivable, which has the advantage that the resulting fields are significant are more homogeneous than with smaller distances, but must then have high suspension densities to be worked.

Damit ist zur Aufnahme der zu fusionierenden Zellen auf der Zellträgerplatte 44 ein System von kanalartigen Vertiefungen vorgesehen, die seitlich durch Ränder der ungefähr 5-40 um dicken Elektroden 54 und 56 begrenzt sind und eine Bodenfläche besitzen, die durch die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 gebildet ist, wobei deren Breite der obengenannten Breite des Spalts 58 entspricht.This is for receiving the cells to be fused on the cell carrier plate 44 a system of channel-like depressions is provided, which laterally through edges of the approximately 5-40 µm thick electrodes 54 and 56 are delimited and a bottom surface have, which is formed by the surface 46 of the cell support plate 44, wherein the width of which corresponds to the width of the gap 58 mentioned above.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Elektroden 54 und 56 so gestaltet sind, dass die Vertiefungen im wesentlichen, wie in Fig. 5 dargestellt, in radialer Richtung verlaufen, so dass beim Zentrifugieren die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen in einer Längsrichtung der Vertiefungen strömen kann und nur am Rand der Zellträgerplatte 44 eine durch den Kreisring 90 der Elektrode 54 gebildete Barriere überwinden muss. Dies ist jedoch unproblematisch, da sich beim Zentrifugieren die Zellsuspension in diesem Bereich aufstaut und somit diese Barriere leicht überwindet, ohne dass in der Zellsuspension die fusionierten Zellen schädigende Turbulenzen entstehen.It is particularly advantageous if the electrodes 54 and 56 are designed in this way are that the depressions are essentially, as shown in Fig. 5, in radial direction Direction run so that when centrifuging the cell suspension together with the fused Cells can flow in a longitudinal direction of the wells and only at the edge of the Cell carrier plate 44 forms a barrier formed by circular ring 90 of electrode 54 must overcome. However, this is not a problem since the centrifugation causes the Cell suspension accumulates in this area and thus easily overcomes this barrier, without turbulence damaging the fused cells in the cell suspension develop.

Bei einem ersten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung des vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsbeispiels wird folgendermassen verfahren: Zuerst wird, wie in Fig. 9 dargestellt, der Deckel 48 von dem Gehäuse 22 abgenommen, so daß die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 von oben zugänglich ist. Dies hat unter sterilen Bedingungen zu erfolgen, um zu verhindern, daß die aufzutragende Zellsuspension infiziert wird, wobei selbstverständlich bereits vorher das Gehäuse 22 und der Deckel 48 sterilisiert wurden.In a first embodiment of the method according to the invention using the above-described first embodiment becomes as follows Procedure: First, as shown in FIG. 9, the cover 48 is removed from the housing 22 removed so that the surface 46 of the cell carrier plate 44 is accessible from above is. This has to be done under sterile conditions to prevent the to be applied cell suspension is infected, of course before the housing 22 and the cover 48 have been sterilized.

Mittels einer Pipette 100 wird eine so große Menge von Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgetragen, daß diese im wesentlichen vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist.Such a large amount of cell suspension is dispensed by means of a pipette 100 applied to the surface 46 of the cell carrier plate 44 that this essentially is completely covered with cell suspension.

Anschliessend wird der Deckel 48 aufgesetzt, der vorteilhafterweise das Gehäuse 22 steril abschliesst.Then the cover 48 is put on, which is advantageously the housing 22 closes in a sterile manner.

Zur Fusion wird das verschlossene Gehäuse 22 in die Halterung 72 (Fig. 3) eingesetzt. Dadurch sind die beiden Elektroden 54 und 56 über die Kontaktstifte 60 una 62 und die Federkontakte 76 und 78 mit dem Spannungsgenerator 80 verbunden, so dass die zur Elektrofusion erforderlichen Spannungsimpulse angelegt werden können, die zwischen den Elektroden 54 und 56 elektrische Felder erzeugen, durch welche die Fusion erfolgt. Bei einer vorteilhaften Gestaltung der Elektroden 54 und 56 gemäss den Fig. 5, 7 und 8 wird dabei eine für die Fusion ausreichende elektrische Feldstärke im wesentlichen nur zwischen den Rändern der Elektroden 54, 56, d.h. im Bereich des Spalts 58 erreicht, so dass nur die in diesem Bereich vorliegenden Zellen fusioniert werden. Je nach dem verwendeten Elektrofusionsverfahren wird entweder mit einer hohen Zelldichte gearbeitet, bei welcher sich die Dielektrophorese erübrigt, so dass sofort die Fusionsimpulse angelegt werden können, die zu einem Durchlöchern der Membranen der im elektrischen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 befindlichen Zellen führen, oder es werden vor der Fusion, vor allem bei geringen Zelldichten in der Zellsuspension, mittels Dielektrophorese die Zellen in sogenannten Perlenketten aneinandergereiht, wie sie in Fig.6 zu sehen sind.For the fusion, the closed housing 22 is inserted into the holder 72 (Fig. 3) used. This places the two electrodes 54 and 56 over the contact pins 60 and 62 and the spring contacts 76 and 78 are connected to the voltage generator 80, so that the voltage pulses required for electrofusion can be applied, which generate electric fields between electrodes 54 and 56, through which the merger takes place. In an advantageous configuration of the electrodes 54 and 56 According to FIGS. 5, 7 and 8, an electrical one which is sufficient for the fusion is achieved Field strength essentially only between the edges of electrodes 54, 56, i. reached in the area of the gap 58, so that only those present in this area Cells are fused. Depending on the electrofusion process used, either worked with a high cell density, in which the dielectrophoresis is unnecessary, so that immediately the fusion impulses can be applied leading to a perforation of the membranes located in the electric field between electrodes 54 and 56 Cells lead, or there will be, prior to fusion, especially at low cell densities in the cell suspension, the cells in so-called pearl necklaces by means of dielectrophoresis lined up as they can be seen in Fig.6.

Die Dielektrophorese hat bei den als vorteilhaft beschriebenen Ausführungsformen gemäss den Fig. 5, 7 und 8 der Elektroden 54 und 56 zur Folge, dass die Zellen7 aufgrund des Verlaufs der Inhomogenität des elektrischen Feldes, zwischen derartig gestalteten Elektroden auch aus einer über den Vertiefungen und den Elektroden 54 und 56 stehenden Schicht aus Zellsuspension in die Vertiefungen hineingezogen und an den Rändern der Elektroden 54 und 56 zu Perlenketten aneinandergereiht werden.The dielectrophoresis has in the embodiments described as advantageous 5, 7 and 8 of the electrodes 54 and 56 result in the cells 7 due to the course of the inhomogeneity of the electric field, between such shaped electrodes also from one above the recesses and the electrodes 54 and 56 standing layer from cell suspension into the wells drawn in and strung together at the edges of the electrodes 54 and 56 to form pearl necklaces will.

In beiden Fällen wird eine Membran der Zellen durchlöchert, so dass die benachbarten Zellen miteinander fusionieren, d.h. eine gemeinsame Zellmembran bilden. Die gemeinsame Zellmembran hat, wie bereits eingangs beschrieben, zunächst noch eine langgestreckte, der Perlenkette ähnliche Form und ist aus diesem Grund noch sehr labil.In both cases a membrane of the cells is perforated so that the neighboring cells fuse with each other, i.e. a common cell membrane form. As already described at the beginning, the common cell membrane initially has is still an elongated shape, similar to a pearl necklace, and for this reason it is still very unstable.

Zum Entfernen der Zellsuspension mit den fusionierten Zellen wird das Gehäuse 22 aus der Halterung 72 entnommen und in den Rotor 86 der Zentrifuge 82 eingesetzt. To remove the cell suspension with the fused cells is used the housing 22 is removed from the holder 72 and inserted into the rotor 86 of the centrifuge 82 used.

Eine Drehzahl des Motors 84 der Zentrifuge 82 kann so gewählt werden, daß auf die auf der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 befindliche Zellsuspension und die darin enthaltenen fusionierten Zellen so große Zentrifugalkräfte wirken, daß diese in radialer Richtung der Zellträgerplatte 44 nach außen getrieben werden, sich auf der Innenseite 36 des Bodenteils 26 in den Ringkanal 34 bewegen und sich dort im Bereich des Mantels 24 und der Vertiefung 40 sammeln. Dabei wird solange zentrifugiert, bis die ganze Zellsuspension von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 entfernt wurde. Bevorzugte Werte für die Drehzahl der Zentrifuge 82 liegen im Bereich von 100-500 Umdrehungen pro Minute.A speed of the motor 84 of the centrifuge 82 can be selected so that on the cell suspension located on the surface 46 of the cell carrier plate 44 and the fused cells contained therein act so great centrifugal forces, that these are driven outward in the radial direction of the cell carrier plate 44, move on the inside 36 of the bottom part 26 in the annular channel 34 and collect there in the area of the jacket 24 and the recess 40. This is as long as centrifuged until all of the cell suspension is off surface 46 of the cell support plate 44 was removed. Preferred values for the speed of the centrifuge 82 are in Range from 100-500 revolutions per minute.

Wenn der Rotor 86 wieder zum Stillstand gekommen ist, sammelt sich die Zellsuspension mit den fusionierten Zellen in der durch den Wulst 38 und den Mantel 24 gebildeten Vertiefung 40 des Ringkanals 34 an, wobei durch die Vertiefung 40 verhindert wird, daß die Zellsuspension wieder auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 zurückfließt.When the rotor 86 has come to a standstill again, accumulates the cell suspension with the fused cells in the by the bead 38 and the Sheath 24 formed recess 40 of the annular channel 34, wherein through the recess 40 prevents the cell suspension from falling back onto the surface 46 of the cell carrier plate 44 flows back.

Das Entnehmen der Zellsuspension aus dem Ringkanal 34 kann beispielsweise wie in Fig. 10 dargestellt erfolgen.The removal of the cell suspension from the annular channel 34 can, for example as shown in FIG.

Dazu wird das Gehäuse 22 um seine Drehachse 20 gekippt, so daß sich die Zellsuspension an einer tiefsten Stelle des Ringkanals 34 sammelt. Nach Abnehmen des Deckels 48 wird dann, ebenfalls unter sterilen Bedingungen, die Zellsuspension vorsichtig mittels einer Pipette 100 abgesaugt.For this purpose, the housing 22 is tilted about its axis of rotation 20 so that the cell suspension collects at a deepest point of the annular channel 34. After losing weight the cover 48 is then, also under sterile conditions, the cell suspension carefully sucked off by means of a pipette 100.

Ein zweites Ausführungsbsispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Fig. 11 dargestellt. Identische Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen wie beim ersten Ausführungsbeispiel bezeichnet und werden nicht mehr gesondert erläutert. Der einzige Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel ist darin zu sehen, daß das Innere des Gehäuses 22 durch drei in radialer Richtung von der Drehachse 20 zu dem Mantel 24 verlaufende Trennwände 102 in drei Volumenbereiche aufgeteilt ist. Die Zellträgerplatte 44 besitzt ebenfalls in jedem der Volumenbereiche zwei Elektroden 54 und 56, wobei entweder alle drei Sätze von Elektroden 54 und 56 parallel geschaltet oder durch eine entsprechende Anzahl von Kontaktstiften direkt kontaktiert und separat mit entsprechenden Spannungen versorgt werden können.A second exemplary embodiment of the device according to the invention is shown in FIG. Identical parts are given the same reference symbols as in the first embodiment and are no longer explained separately. The only difference to the first embodiment is that the Inside of the housing 22 by three in the radial direction from the axis of rotation 20 to the Jacket 24 extending partition walls 102 is divided into three volume areas. the Cell carrier plate 44 also has two electrodes in each of the volume areas 54 and 56, with either all three sets of electrodes 54 and 56 connected in parallel or contacted directly and separately by a corresponding number of contact pins can be supplied with appropriate voltages.

Der Vorteil des zweiten Ausführungsbeispiels besteht darin, daß beispielsweise Suspensionen mit jeweils unterschiedlichen Zellen gleichzeitig zentrifugiert und eventuell auch fusioniert werden können.The advantage of the second embodiment is that, for example Centrifuged suspensions with different cells at the same time and can possibly also be merged.

Ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt Fig. 12. Auch dort sind mit dem ersten Ausführungsbeispiel identische Teile mit denselben Bezugszeichen versehen und werden nicht mehr beschrieben.A third embodiment of a device according to the invention shows FIG. 12. There are also parts identical to the first embodiment are provided with the same reference numerals and are no longer described.

Das Gehäuse 22 entspricht im wesentlichen dem des ersten Ausführungsbeispiels, mit dem Unterschied, daß dieses bei dem dritten Ausführungsbeispiel stationär auf dem Rotor b6 montiert ist. Außerdem ist das Bodenteil 26 mindestens an einer Stelle mit einem schräg von der Vertiefung 40 nach außen verlaufenden Auslaßkanal 104 versehen, der in einem an einer Unterseite 106 des Bodenteils 26 angeordneten Stutzen 108 endet. Eine in der Vertiefung 40 liegende Mündung 110 des Auslaßkanals 104 ist so geformt, daß sie eine Ventilkugel 112 aufnimmt, die die Mündung 110 flüssigkeitsdicht verschließen kann.The housing 22 corresponds essentially to that of the first exemplary embodiment, with the difference that this is stationary in the third embodiment mounted on rotor b6. In addition, the bottom part 26 is at least at one point provided with an outlet channel 104 extending obliquely from the recess 40 to the outside, in a connector 108 arranged on an underside 106 of the base part 26 ends. A mouth 110 of the outlet channel 104 located in the recess 40 is like this shaped to receive a valve ball 112 which makes the orifice 110 fluid tight can close.

Die Mündung 110 ist dabei so zu formen, daß sich beim Zentrifugieren die Ventilkugel 112 nicht von dieser entfernt, sondern verstärkt auf die Mündung 110 gedrückt wird und diese noch besser abdichtet. Vorzugsweise kann auch noch eine die Kugel 112 in Richtung der Mündung 110 beaufschlagende Feder 114 vorgesehen sein, welche sich mit ihrem anderen Ende an dem Oberteil 30 des Gehäuses 22 abstützt.The mouth 110 is to be shaped so that during centrifugation the valve ball 112 is not removed from this, but reinforced on the muzzle 110 is pressed and this seals even better. Preferably can even a spring 114 acting on the ball 112 in the direction of the mouth 110 is also provided which is supported with its other end on the upper part 30 of the housing 22.

Zum Entleeren der Vertiefung 40 ist ein auf den Stutzen 108 verschiebliches Rohr 116 vorgesehen, das einen in den Auslaßkanal 104 einführbaren Dorn 118 besitzt, welcher die Ventilkugel 112 aus ihrem die Mündung 110 abdichtenden Sitz herausdrückt, wenn das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben ist. Damit ist der Auslaßkanal 104 freigegeben, so daß die sich in der Vertiefung 40 angesammelte Zellsuspension durch den Auslaßkanal 104 in das Rohr 116 ausströmen kann.For emptying the recess 40, a displaceable on the connector 108 is Tube 116 is provided which has a mandrel 118 which can be introduced into the outlet channel 104, which presses the valve ball 112 out of its seat sealing the opening 110, when the tube 116 is pushed over the nozzle 108. So that is the exhaust port 104 released, so that the cell suspension that has accumulated in the well 40 can flow out through the outlet channel 104 into the pipe 116.

Des weiteren unterscheidet sich das dritte Ausführungsbeispiel der Vorrichtung von dem ersten Ausführungsbeispiel dadurch, daß der konzentrisch zur Drehachse 20 sitzende Kontaktstift 62 in Richtung der Drehachse 20 nach oben durch ein Rohrstück 120 verlängert ist, dessen zur Drehachse 20 koaxiale Bohrung 122 sich auch in den Kontaktstift 62 hinein bis zur Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 fortsetzt. Damit die Zellsuspension durch die Bohrung 122 auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgebracht werden kann, ist das auf der Oberfläche 46 aufstehende Ende des Kontaktstifts 62 noch mit in radialer Richtung weisenden Ausnehmungen 124 versehen, welche ausgehend von der Bohrung 122 auf einer Außenseite des Kontaktstifts 62 münden.Furthermore, the third embodiment of FIG Device of the first embodiment in that the concentric to Axis of rotation 20 seated contact pin 62 in the direction of axis of rotation 20 upwards a pipe section 120 is extended, the bore 122 of which is coaxial with the axis of rotation 20 also into the contact pin 62 up to the surface 46 of the cell carrier plate 44 continues. So that the cell suspension through the bore 122 onto the surface 46 The cell carrier plate 44 can be applied, is that standing on the surface 46 The end of the contact pin 62 still has recesses 124 pointing in the radial direction provided, which starting from the bore 122 on an outside of the contact pin 62 open.

Die Zufuhr von Zellsuspension erfolgt vorzugsweise über ein Gefäß 126, welches einen Ansatzstutzen 128 mit einem Ventil 130 besitzt, der in das Rohrstück 120 mündet.The cell suspension is preferably supplied via a vessel 126, which has an attachment piece 128 with a valve 130 which is inserted into the pipe section 120 opens.

Eine Kontaktierung der Kontaktstifte 60 und 62 erfolgt ebenfalls über Federkontakte 132 bzw. 134, wobei der zum Kontaktstift 62 führende Federkontakt 134 auch an dessen Rohrstück 120 anliegen kann und nicht notwendigerweise auf dessen Kopf 70 auf liegen muß. Die Federkontakte 132, 134 sind an einer Halterung 136 befestigt, welche beweglich sein muß, damit die Kontakte beim Zentrifugieren, d.h. beim Drehen des Gehäuses 22 von den Kontaktstiften 60,62 abgehoben werden können. Wie beim ersten Ausführungsbeispiel stehen die Federkontakte 132 und 134 mit einem Spannungsgenerator 80 in Verbindung.The contact pins 60 and 62 are also contacted via Spring contacts 132 and 134, the spring contact leading to the contact pin 62 134 can also rest on its pipe section 120 and not necessarily on its Head 70 must be on. The spring contacts 132, 134 are attached to a holder 136, which must be movable so that the contacts can be centrifuged, i.e. rotated of the housing 22 can be lifted off the contact pins 60,62. Like the first one In the exemplary embodiment, the spring contacts 132 and 134 are connected to a voltage generator 80 in connection.

Ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird unter Verwendung des dritten Ausführungsbeispiels der Vorrichtung so geführt, daß die Zellsuspension zunächst in das Gefäß 126 gegeben wird. Dieses kann auch gleichzeitig als Mischkammer dienen, wenn beispielsweise vorgesehen sein soll, Zellen unterschiedlichen Typus zu fusionieren. Dazu werden die Zellen von unterschiedlichem Typus mit der Zellsuspension, in der sie aufgenommen sind, in das Gefäss 126 gegeben und in dieser durch ein übliches Mischverfahren eine ein homogenes Gemisch der Zellen von unterschiedlichem Typus bildende Zellsuspension hergestellt.A second embodiment of the method according to the invention is so performed using the third embodiment of the device that the cell suspension is first placed in the vessel 126. This can also be done at the same time serve as a mixing chamber if, for example, it should be provided, cells different Merge type. For this purpose, the cells of different types are combined with the Cell suspension in which they are added to the vessel 126 and in this by a common mixing method, a homogeneous mixture of cells of different Type-forming cell suspension produced.

Eine dosierte Menge von Zellsuspension wird durch entsprechendes Öffnen des Ventils 130 über die Bohrung 122 und die Ausnehmungen 124 auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgebracht. Die Zellsuspension verteil sich dabei wie beim ersten Ausführungsbeispiel gleichmäßig über die gesamte Oberfläche 46. Anschließend wird die Halterung 136 derart bewegt, daß die Federkontakte 132 und 134 mit den Kontaktstiften 60 bzw. 62 eine elektrische Verbindung herstellen und somit die Elektroden 54 und 56 der Zellträgerplatte 44 mit dem Spannungsgenerator 80 verbunden sind, der, wie beim ersten Ausführungsbeispiel, je nach Art des Verfahrens der Elektrofusion Spannungsimpulse erzeugt, so daß die Zellen in dem elektrischen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 miteinander fusionieren.A dosed amount of cell suspension is opened by opening it accordingly of the valve 130 via the bore 122 and the recesses 124 to the surface 46 of the cell carrier plate 44 is applied. The cell suspension is distributed like in the first exemplary embodiment evenly over the entire surface 46. Then the holder 136 is moved so that the spring contacts 132 and 134 with the Contact pins 60 and 62 establish an electrical connection and thus the electrodes 54 and 56 of the cell carrier plate 44 are connected to the voltage generator 80, as in the first embodiment, depending on the type of electrofusion process Voltage pulses generated so that the cells in the electric field between the Fuse electrodes 54 and 56 with one another.

Das Entfernen der fusionierten Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 erfolgt durch Rotieren des bereits fest auf dem Rotor 86 sitzenden Gehäuses 22.Removing the fused cells from the surface 46 of the cell support plate 44 takes place by rotating the housing 22, which is already firmly seated on the rotor 86.

Dazu muß jedoch zuerst die Halterung 136 soweit verschoben werden, daß die Federkontakte 132 und 134 nicht mehr die Kontaktstifte 60 bzw. 62 berühren,und ausserdem muß das Rohr 116 soweit zurückgezogen werden, daß es den an das Gehäuse 22 angeformten Stutzen 108 freigibt und der Dorn 118 ebenfalls aus dem Auslaßkanal 104 zurückgezogen ist. Dies führt dazu, daß die Ventilkugel 112 auf der Mündung 110 aufsitzt und diese dichtend verschließt.To do this, however, the bracket 136 must first be moved so far that the spring contacts 132 and 134 no longer touch the contact pins 60 or 62, and In addition, the tube 116 must be withdrawn so far that it is against the housing 22 releases molded connector 108 and the mandrel 118 also from the outlet channel 104 is withdrawn. This results in the valve ball 112 on the muzzle 110 sits on it and closes it sealingly.

Durch Drehen des Gehäuses 22 mitsamt der Zellträgerplatte 44 werden die fusionierten Zellen unter Einfluß von Zentrifugalkräften in radialer Richtung wie beim ersten Ausführungsbeispiel des Verfahrens in den Ringkanal 34 überführt und sammeln sich dort nach Beendigung des Zentrifugierens in der Vertiefung 40.By rotating the housing 22 together with the cell carrier plate 44 the fused cells under the influence of centrifugal forces in the radial direction transferred into the annular channel 34 as in the first exemplary embodiment of the method and collect there in the well 40 after the centrifugation has ended.

Zum Abführen der Zellsuspension aus der Vertiefungs 40 muß sichergestellt sein, daß das Gehäuse 22 in einer definierten Stellung stehen bleibt, in welcher der Dorn 118 in den Auslaßkanal 104 und das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben werden kann. Dadurch wird durch den Dorn 118 die Ventilkugel 112 von der Mündung 110 entfernt und gibt den Auslaßkanal 104 frei, durch welchen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen unter Wirkung der Schwerkraft in das Rohr 116 abfließen kann. Bevorzugterweise kann dabei die Vertiefung 40 so alnsgebildet sein, daß ihre tiefste Stelle bezüglich der Richtung der Schwerkraft im Bereich der Mündung 110 liegt, so daß die Zellsuspension aus dem gesamten Ringkanal 34 in Richtung der Münduna 110 abfliesst.To discharge the cell suspension from the recess 40 must be ensured be that the housing 22 remains in a defined position in which the mandrel 118 is pushed into the outlet channel 104 and the tube 116 is pushed over the connecting piece 108 can be. As a result, the valve ball 112 is removed from the muzzle by the mandrel 118 110 removes and releases the outlet channel 104 through which the cell suspension together with the fused cells flow off into the tube 116 under the action of gravity can. Preferably, the recess 40 can be formed so that their lowest point with respect to the direction of gravity in the area of the mouth 110 lies, so that the cell suspension from the entire annular channel 34 in the direction of the mouth 110 drains.

Dieses zweite Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht vorteilhafterweise eine quasikontinuierliche Verfahrensführung, d.h., daß die einzelnen Verfahrensschritte,wie das Aufbringen der Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44, das Fusionieren der Zellen, das Überführen der fusionierten Zellen in die Vertiefung 40 und das Abführen der Zellen aus dieser Vertiefung 40 aufeinanderfolgend beliebig oft erfolgen können.This second embodiment of the method according to the invention advantageously enables a quasi-continuous process management, i.e. that the individual process steps, such as the application of the cell suspension to the Surface 46 of the cell support plate 44, the fusion of the cells, the transfer of the fused cells into the well 40 and the removal of the cells the end this recess 40 can take place in succession as often as desired.

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist auch darin zu sehen, daß sterile Bedingungen beim Zuführen der Zellen in das Gehäuse 22 und beim Abführen einfacher eingehalten werden können als bei dem ersten Ausführungsbeispiel.Another advantage of this method can be seen in the fact that sterile conditions when feeding the cells into the housing 22 and when discharging them can be observed more easily than in the first embodiment.

Schließlich ist das zweite Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders dazu geeignet, automatisiert zu werden, da die Steuerung sämtlicher Verfahrensschritte automatisch erfolgen kann und beispielsdiese, das Gehäuse 22 . zum Fusionieren und zum Zentrifugieren nicht in separate Vorrichtungen eingesetzt werden muß.Finally, the second embodiment is the one according to the invention Process particularly suitable to be automated, since the control of all Method steps can take place automatically and, for example, these, the housing 22 . not used in separate devices for fusing and centrifugation must become.

Claims

Claims 1. A method for electrofusion of cells, in which a cell suspension is supplied to a fusion volume as well as that in the cell suspension cells contained in the fusion volume fused by means of electric fields and then the cell suspension from the fusion volume into a collection volume it is convicted that it is not possible to state that the cell suspension by the action of centrifugal forces from the fusion volume into the collection volume is transferred, including the fusion volume and the collection volume in a rotational movement be offset around the same axis of rotation with the same angular velocity.

2. The method according to claim 1, characterized in that this quasi-continuously is performed, wherein a feeding of the cell suspension into the fusion volume, a fusing of the cells and transferring the cell suspension from the fusion volume to the collection volume consecutive and in this order constantly are repetitive operations.

3. The method according to claim 2, characterized in that to transferring the cells into the collection volume or removing the cell suspension from the collection volume.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that in the case of the fusion of different cell types, these are prior to being fed into the fusion volume are mixed together in the suspension.

5. Device for performing the method with an element for Taking up a cell suspension and with at least two with the cell suspension in Contact electrodes, between which a fusion of the cells is brought about electric fields can be generated, characterized in that the device is a on a rotor (86) of a centrifuge (82) attachable housing (22) with a for Rotor (86) comprises coaxial axis of rotation (20) which is used to hold the element (cell carrier plate 44) is used and that the housing (22) with respect to its axis of rotation (20) in radial direction to the element (cell carrier plate 44) adjoining chamber (annular chamber 34), in which the suspension is centrifuged with the fused Cells collects.

6. Apparatus according to claim 5, characterized in that in the Housing (22) several elements are provided.

7. Apparatus according to claim 6, characterized in that each of the elements each have a chamber for receiving the fused cells of the respective Element is assigned.

8. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the chamber (annular chamber 34) has a volume area (recess 40) which is designed in such a way that after centrifugation the in the chamber (annular chamber 34) transferred suspension with fused cells collects and not to the element (Cell support plate 44) flows back.

9. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the element is a cell carrier plate (44) which is on a surface (46) is provided with at least two electrodes (54,56).

10. Apparatus according to claim 9, characterized in that; that each other facing sides of the electrodes (54, 56) on the cell carrier plate (44), at least to a essential part of its course, roughly in a radial direction Direction to the axis of rotation (20) of the housing (22) extend.

11. The device according to claim 9 or 10, characterized in that thin layers applied to the electrodes (54, 56) on the cell carrier plate (44) are.

12. Device according to one of claims 9 to 11, characterized in that that the electrodes (54, 56) are arranged at distances from one another which correspond to a size of the cells in a range from 0.5 ß to several mm.

13. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the element (cell carrier plate 44) on the housing (22) held exchangeably is.

14. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the housing (22) can be closed in a sterile manner.

15. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that a cover (48) of the housing (22) has at least two electrical feedthroughs (Contact pins 60,62), on the one hand with the various electrodes (54,56) of the element (cell carrier plate 44) have contact and on the other hand from outside of the housing (22) can be connected to a voltage source (voltage generator 80).

16. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the element (cell carrier plate 44) overlapping parts (e.g. cover 48) of the Housing (22) are transparent.

17. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the element (cell support plate 44) itself made of transparent material is.

13. Device according to one of the preceding claims, characterized by a feed device (122 to 130) for loading the element (cell carrier plate 44) with cell suspension.

19. Device according to one of the preceding claims, characterized by a discharge device (104, 108 to 118) for removing the cell suspension out of the chamber.

20. The device according to claim 13, characterized in that the Feed device (122 to 130) can be closed.

21. The device according to claim 19, characterized in that the Discharge device (104, 108 to 118) can be closed.

22. Device according to claim 18 or 19 to 21, characterized in that that the feed device (122 to 130) has a mixing chamber (vessel 126) for production a cell suspension from different cell types.