DE3501865C2 - - Google Patents

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DE3501865C2
DE3501865C2 DE19853501865 DE3501865A DE3501865C2 DE 3501865 C2 DE3501865 C2 DE 3501865C2 DE 19853501865 DE19853501865 DE 19853501865 DE 3501865 A DE3501865 A DE 3501865A DE 3501865 C2 DE3501865 C2 DE 3501865C2
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DE
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Grant
Patent type
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DE19853501865
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DE3501865A1 (en )
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Christian 5110 Alsdorf De Matschke
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B Braun Melsungen AG
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B Braun Melsungen AG
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Elektrofusion von Zellen. The invention relates to the method defined in claim 1 for the electrofusion of cells. Anspruch 2 betrifft die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach An spruch 1. Die Ansprüche 3 bis 5 betreffen Ausgestaltungen dieser Vorrichtung. Claim 2 relates to the apparatus for performing the method according to demanding 1. The claims 3 to 5 relate to embodiments of this device.

Bisher wird bei der Elektrofusion von Zellen so ver fahren, daß die Zellsuspension auf einer Oberfläche eines Zellträgers aufgebracht wird, die mit mindestens zwei Elektroden versehen ist (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membran Biol. 67, 165 (1982) und U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227- 277 (1982)). So far that the cell suspension is applied to a surface of a cell carrier, which is provided with at least two electrodes (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membrane Biol. 67 is run so ver in the electrofusion of cells, 165 (1982) and U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227- 277 (1982)). Die Zellsuspension verteilt sich dabei so auf der Oberfläche des Zellträgers, daß sie mit den beiden Elektroden in Kontakt kommt. The cell suspension is distributed thereby so on the surface of the cell carrier that it comes into contact with the two electrodes. Das Fusionsvolumen entspricht dabei einem von den beiden Elektroden und der Zellträgerplatte gebildeten Kanal, der von den elektrischen Feldern durchsetzt wird. The fusion volume corresponds to a channel formed by the two electrodes and the cell carrier plate which is penetrated by the electric fields. Nach Anlegen ei nes elektrischen Wechselfeldes werden beispielsweise zu fusionierende Zellen zunächst durch Dielektrophorese aneinandergereiht und im Anschluß daran wird ein die Fusion der Zellen herbeiführender elektrischer Feldim puls appliziert. After applying ei nes alternating electric field, for example, to be fused cells initially strung together by dielectrophoresis and subsequently a fusion of the cell-inducing electrical Feldim pulse is applied.

Es ist auch bekannt (DE 33 17 415 A1), anstelle des Zellträgers mit Elektroden eine Kammer zu verwenden, bei der das Fusionsvolumen durch einen Innenkörper und einen diesen mit gleichbleibendem Ab stand umschließenden Außenkörper begrenzt ist, wobei dieses Fusionsvolumen durch die zwischen dem Innen- und dem Außenkörper spiralförmig angeordneten Elektro den die Form einer mehrgängigen, den Innenkörper um gebenden Schraube besitzt. It is also known (DE 33 17 415 A1) to use a chamber instead of the cell carrier with electrodes, in which the fusion volume is defined by an inner body and this state with a constant rate from surrounding outer body, said fusion volume through between the inner and the outer body spirally arranged electric current the more, the inner body has the shape of a screw to imaging.

Unmittelbar nach einer derartige Fusion sind die neu entstandenen Zellen sehr labil, da durch den Feldimpuls erzeugte Löcher der Zellmembran erst im Laufe der Zeit ausheilen und die fusionierte Zelle noch eine langge streckte, einer Aneinanderreihung der Zellen vor der Fusion ähnelnde Form besitzt, die sich erst nach einiger Zeit abrundet und eine energetisch günstigere und mecha nisch stabilere runde Form einnimmt. Immediately after such fusion the newly formed cells are very unstable, as generated by the field pulse holes in the cell membrane heal only in the course of time and the fused cell or a Langge stretched, a concatenation of the cells having similar prior to fusion form, only to rounding off after some time and occupies an energetically more favorable and more stable mechanical cally round shape.

Trotz dieser Labilität der Zellen ist es notwendig, daß die Zellsuspension nach der Fusion möglichst schnell aus dem Fusionsvolumen entfernt wird. Despite this lability of the cells, it is necessary that the cell suspension is removed as quickly as possible from the fusion volume after fusion. Dies hat zum ei nen den Grund, daß das Fusionsvolumen für die Fusion weiterer Zellen verwendet werden soll, und zum anderen ist dies darin begründet, daß die fusionierten Zellen möglichst schnell in ein Nachbehandlungsmedium überführt werden sollten, da ein zur Herstellung verwendetes und auch für die Durchführung der Fusion erforderliches spezielles Fusionsmedium die neu fusionierten Zellen im Laufe der Zeit schädigt und folglich deren Über lebensrate beträchtlich reduziert. This has to ei nen the reason that the fusion volume for the fusion of further cells to be used, and on the other hand this is due to the fact that the fused cells should be changed soon transferred to a post-treatment medium, as a material used for the production and also for the execution of the merger required special fusion medium damages the newly fused cells over time and consequently their survival rate significantly reduced.

Bisher werden die fusionierten und zum Teil noch leicht an den Elektroden haftenden Zellen dadurch aus dem Fu sionsvolumen in das Sammelvolumen überführt, daß man diese aus dem Fusionsvolumen absaugt - beispielsweise mit einer Mikropipette - oder daß man das Fusionsvolumen ausspült, wobei als Spülmedium beispielsweise das Nach behandlungsmedium verwendet wird. So far, the fused and slightly adhesive to the part of the electrode cells are characterized issue volume of the foot in the collection volume transferred, that sucks it out of the fusion volume - for example, with a micropipette - or in that rinsing the fusion volume, as a flushing medium, for example, the post treatment medium is used. Sowohl beim Ausspülen des Fusionsvolumens wie auch beim Absaugen entstehen jedoch Turbulenzen in der Suspension, die auf die Zellen wirkende Scherkräfte hervorrufen. Both in the rinsing of the fusion volume as well as during aspiration, however, result in turbulence of the suspension, give rise to the shearing forces acting on the cells. Da die Zellmembran, wie bereits erläutert, noch nicht abgerundet und somit auch mechanisch noch sehr labil ist, haben diese Scherkräfte zur Folge, daß ein Teil der fusionierten Zellen beim Ausspülen oder Absaugen aus dem Fusions volumen zerstört wird. Since the cell membrane, as already explained, not rounded, and thus also mechanically is still very unstable, these shear forces have the effect that a part of the fused cells when rinsing or suction from the fusion volume is destroyed.

Es ist ebenfalls bekannt (DE 33 17 415 A1 und R. Schnettler, U. Zimmermann und CC Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), 81-85), die fusio nierten Zellen von dem Fusionsvolumen, in welchem sie in Fusionslösung suspendiert sind, in ein anderes mit Nach behandlungslösung gefülltes Volumen durch die Einwir kung von Zentrifugalkräften zu überführen. It is also known (DE 33 17 415 A1 and R. Schnettler, U. Zimmermann and CC Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), 81-85), the fusio-defined cells in which they are suspended in fusion solution of the fusion volume, to transfer to another treatment solution filled by volume by the Einwir effect of centrifugal forces. Dabei werden jedoch weder die Fusions- noch die Nachbehandlungslösung durch die Einwirkung der Zentrifugalkräfte bewegt, son dern diese beiden Lösungen bleiben als übereinanderge schichtete Lösungen stehen und nur die fusionierten Zellen werden, wie auch bei allen bisher bekannten Zen trifugierverfahren üblich, mittels der Zentrifugalkräfte durch die Fusionslösung hindurch und von dieser in die Nachbehandlungslösung überführt. However, neither the merger nor the post-treatment solution are moved by the action of centrifugal forces remain son countries these two solutions as übereinanderge coated on solutions and only the fused cells, as well as in all previously known Zen trifugierverfahren common means of the centrifugal forces by the Fusion solution therethrough and transferred from this to the post-treatment solution.

Auch bei diesem Verfahren wirken auf die fusionierten Zel len Scherkräfte, die dadurch entstehen, daß diese Zellen durch eine stehende Flüssigkeit mit einer bestimmten Zähigkeit hindurchbewegt werden müssen, so daß außen an der Zellmembran, vor allem bei noch nicht abgerundeten Zellen, große Scherkräfte angreifen. In this method also acting on the fused cell h len shear forces arising from the fact that these cells have to be moved through a stationary liquid with a certain strength, so that the outside of the cell membrane, especially when not rounded cells that attack large shearing forces.

Daher ist es hierbei ebenfalls nicht möglich, die Zellen unmittelbar nach der Fusion in die Nachbehandlungslösung ohne Schädigung zu überführen, sondern es muß, wie bei Schnettler et. Therefore, it is hereby also not possible to transfer the cells immediately after the merger in the post-treatment solution without injury but it must, as with Schnettler et. al. al. ausführlich beschrieben, so lange abge wartet werden, bis die Membranen der fusionierten Zellen sich abgerundet und somit ihre mechanisch stabile Form er reicht haben. are described in detail, as long abge waits until the membranes of the fused cells have rounded and therefore its mechanically stable form he can see.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfah ren der gattungsgemäßen Art zu entwickeln, bei welchem die fusionierten Zellen schonend aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können. The invention is based on the object of a procedural ren of the generic type to develop, in which the fused cells can be gently removed from the fusion volume.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Patentanspruchs 1 gelöst. This object is achieved with the features of the characterizing part of patent claim 1.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß durch die ausschließliche Einwirkung von Zentrifugalkräften die Suspension und mit dieser auch die darin enthaltenen fusionierten Zellen, ohne daß durch äußere Einwirkungen in der Suspension Turbulenzen und somit auf die Zellen wirkende Scherkräfte auftreten, aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können. The advantage of the process of the invention is that are removed by the exclusive action of centrifugal forces, the suspension and with this also the fused cells contained therein without occur by external agents in the suspension turbulence and thus acting on the cells shear forces from the fusion volume can. Dieses Ver fahren ist deshalb so schonend, da durch das Zentrifugieren in sämtlichen Volumenelementen der Zellsuspension und in erster Näherung auch in den Volumenelementen der fusionier ten Zellen denselben Betrag und dieselbe Richtung aufwei sende Kräfte auftreten, die die Zellsuspension mitsamt den darin enthaltenen fusionierten Zellen als Ganzes aus dem Fusionsvolumen hinausbewegen. drive this Ver is so friendly, as caused by centrifugation in all volume elements of the cell suspension and a first approximation in the volume elements of fusionier th cell the same amount and the same direction aufwei send forces that the cell suspension together with the contained fused cells as a whole also move from the fusion volume. Dabei kann durch Wahl der Winkelgeschwindigkeit der Betrag der Zentrifugal kräfte und somit auch eine Fließgeschwindigkeit der Suspension aus dem Fusionsvolumen heraus in einem sehr großen Bereich kontinuierlich variiert werden. In this case, the magnitude of the centrifugal forces can, thus, a flow velocity of the suspension from the fusion volume be varied out continuously in a very wide range by selection of the angular velocity.

Schließlich ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungs gemäßen Verfahrens darin zu sehen, daß das Sammelvolumen gemeinsam mit dem Fusionsvolumen mitrotiert, so daß beim Übergang der Suspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen außer den Zentrifugalkräften keine Kräfte auf die Suspension wirken, wie dies z. Finally, a major advantage of the method according modern is the fact that the collection volume co-rotates together with the merger volume, so that in addition to the centrifugal forces, no forces act in the transition of the suspension of the merger volume in the collection volume on the suspension as such. B. der Fall wäre, wenn das Sammelvolumen gegenüber dem Fusions volumen mit unterschiedlicher Winkelgeschwindigkeit rotieren oder gar stillstehen würde. As would be the case if the collection volume compared to the volume fusion would rotate at different angular velocity or even stand still.

Das erfindungsgemäße Ver fahren kann zur Massenproduktion von fusionierten Zellen eingesetzt werden, wenn es quasikontinuierlich aus geführt wird, wobei ein Zuführen der Zellsuspension in das Fusionsvolumen, ein Fusionieren der Zellen und das Überführen der Zellsuspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen jeweils aufeinanderfolgende und sich in dieser Reihenfolge ständig wiederholende Vor gänge sind. drive the Ver invention can be used for mass production of fused cells when it is performed quasi-continuously, in which a feeding of the cell suspension in the fusion volume, a fusing the cells and transferring the cell suspension from the fusion volume of the collection volume each successive and in this order are repetitive ago transitions.

Bei dieser Verfahrensführung sammelt sich eine immer größere Menge von fusionierten Zellen in dem Sammelvolumen an, so daß das quasikontinuierliche Verfahren nach einigen Durchläufen unterbrochen werden müßte, um die fusionierten Zellen aus dem Sammelvo lumen zu entnehmen. In this procedure, an ever greater amount of fused cells in the collecting volume is accumulated, so that the quasi-continuous process would have to be interrupted after a few runs to remove the fused cells from the Sammelvo lumen. Daher ist es zweckmäßig, wenn sich an das Überführen der Zellen in das Sammelvolumen noch ein Entfernen der Zellsuspension aus dem Sammelvolumen anschließt, so daß die einzelnen Vorgänge bei dem quasi kontinuierlichen Verfahren in beliebiger Zahl und be liebig lange wiederholt werden können und außerdem das Sammelvolumen nur so groß sein muß, daß es die bei einem Durchlauf des quasikontinuierlichen Verfahrens in dieses übergeführte Zellsuspension aufnehmen kann, die dann in einem letzten Schritt des quasikontinuier lichen Verfahrens aus dem Sammelvolumen entfernt wird. Therefore, it is advantageous when in the collecting volume nor removal of the cell suspension from the collecting volume adjoins the transfer of the cells so that the individual operations at the quasi-continuous process in any number, and be can be repeated arbitrarily long and also the collection volume only that it can receive in one pass of the quasi-continuous process in this over-run cell suspension, which is then removed in a final step of the union quasikontinuier process from the collection volume has to be large.

Bei der Erläuterung der bisherigen Führung des erfin dungsgemäßen Verfahrens wurde nicht darauf eingegangen, wie bei Zellen unterschiedlichen Zelltyps zu verfahren ist. In explaining the previous guidance of OF INVENTION to the invention process was not followed on how to proceed in cells of different cell types. Beispielsweise kann bei der Fusion zweier unter schiedlicher Zelltypen jeder Zelltyp in einer getrennten Zellsuspension in das Fusionsvolumen eingebracht werden. For example, in the merger of two under schiedlicher cell types, each cell type may be incorporated in a separate cell suspension in the fusion volume. Weit zweckmäßiger ist es jedoch, wenn bei der Fusion unterschiedlicher Zelltypen diese vor dem Zuführen in das Fusionsvolumen in der Suspension miteinander ver mischt werden. Wide expediently, however, is when they are mixed prior to feeding into the fusion volume of the suspension in each ver in the fusion of different cell types.

Sämtliche Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht auf eine bestimmte Durchführung der Elektrofusion beschränkt, sondern diese kann auf jede bisher bekannte Art und Weise erfolgen. All embodiments of the method according to the invention are not limited to a particular implementation of the electric fusion, but this can be done in any previously known manner. Eine Zu sammenstellung der bisher bekannten Verfahren bei der Elektrofusion findet sich in der Veröffentlichung von U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, Seite 227 bis 277 (1982). A sammenstellung to the previously known methods in electro fusion can be found in the paper by U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, page 227-277 (1982). So kann beispielsweise dem Applizieren des eigentlichen Fusionsimpulses die Bildung von Perlenketten der zu fusionierenden Zellen mit tels Dielektrophorese vorausgehen, es kann aber auch nur mit einer hohen Zelldichte in der Suspension gear beitet werden, so daß sich ein Aneinanderreihen der Zellen erübrigt und die Zellen nach ihrem Durchlöchern statistisch mit einer anderen Zelle in der Umgebung fusionieren, wobei selbstverständlich die Ausbeute an fusionierten Zellen gegenüber einem Fusionsverfahren mit vorhergehender Dielektrophorese weitaus geringer ist. For example, the application of the actual fusion pulse may be preceded by the formation of beads of the cells to be fused with means of dielectrophoresis, but it can also be used only with a high cell density in the suspension gear beitet, so that a juxtaposition of cells is unnecessary, and the cells according to their merge through holes statistically with another cell in the environment, it being understood that the yield of fused cells to a fusion process is much lower with prior dielectrophoresis.

Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich durch die Merkmale des Patent anspruchs 2 aus. The apparatus for carrying out the method according to the invention is characterized by the features of claim 2 made.

Die Vorteile dieser Vorrichtung entsprechen denen des bereits eingangs beschriebenen Verfahrens. The advantages of this device are similar to those of the method already described in the introduction.

Selbstverständlich ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht darauf beschränkt, daß nur ein Element und eine diesem zugeordnete Kammer in dem Gehäuse vorgesehen sind. Of course, the device of the invention is not limited to the fact that only one element and associated therewith a chamber provided in the housing. In dem Gehäuse können auch mehrere Elemente vor gesehen sein und/oder jedem der Elemente kann jeweils eine Kammer zur Aufnahme der fusionierten Zellen des jeweiligen Elements zugeordnet werden. In the housing several elements may be seen and / or each of the elements can each have a chamber for receiving the fused cells of the respective element to be assigned.

Bezüglich einer Ausbildung der Kammer wurden bislang noch keine Angaben gemacht, so daß beliebige Formen denkbar sind. With respect to a configuration of the chamber have so far been no information so that any shapes are possible. Besonders bevorzugt wird jedoch ein Ausführungsbeispiel der Kammer mit den Merkmalen des Anspruchs 3. However, an embodiment of the chamber having the features of claim 3 is particularly preferred.

Im einfachsten Fall ist der Volumenbereich bezüglich des Elements in Richtung der Schwerkraft tie fergelegt, so daß die Suspension nach dem Zentrifugieren nicht zu dem Element zurückfließen kann. In the simplest case, the volume range with respect to the element in the direction of gravity is fergelegt tie, so that the suspension after centrifuging can not flow back to the element.

Das Element zur Aufnahme der Zellsuspension kann unter schiedlich ausgebildet sein. The element for receiving the cell suspension can be formed under different. Es ist ausschließlich er forderlich, daß dieses ein Entweichen der Suspension in Richtung der Zentrifugalkraft ermöglicht. It is only he conducive that this provides for an escape of the suspension in the direction of the centrifugal force. Beispiels weise kann das Element als Rinne, Kanal, Trog oder auch als allseitig geschlossene Behältnis mit einer Öffnung ausgebildet sein, aus welchem die Suspension durch Wirkung der Zentrifugalkraft in die sich in ra dialer Richtung anschließende Kammer entweichen kann. Example as the element as a groove, channel, trough or as a fully enclosed container having an opening may be formed, from which the suspension can escape through action of centrifugal force in the subsequent in ra dialer direction chamber.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Element als Zellträgerplatte ausgebildet ist, die auf einer Ober fläche mit mindestens zwei Elektroden versehen ist. It is particularly advantageous if the element is designed as a cell carrier plate which is provided on a top surface having at least two electrodes. Der Vorteil einer derartigen Zellträgerplatte besteht darin, daß einerseits die Suspension auf diese sehr einfach aufzubringen ist und andererseits die Suspension durch Einwirkung der Zentrifugalkräfte sehr leicht über die Oberfläche dieser Zellträgerplatte in Richtung der Kammer abfließen kann. The advantage of such cell carrier plate consists in the fact that on the one hand, the suspension on this is very easy to apply on the other hand, the suspension can easily flow out by the action of the centrifugal forces on the surface of these cell carrier plate in the direction of the chamber.

Einander zugewandte Seiten der Elektroden, die mit der Zellträgerplatte zusammen das Fusionsvolumen eingrenzen, können in beliebigen Richtungen auf der Zellträgerplatte verlaufen. Mutually facing sides of the electrodes, which together with narrow down of the cell supporting plate, the fusion volume, may run on the cell carrier plate in any direction. Zum Beispiel kann das Fusionsvolumen ein Kanal sein, der zick-zack- oder mäanderförmig über die Zellträgerplatte verläuft. For example, the fusion volume can be a channel extending zigzag or meandering fashion on the cell carrier plate. Ein besonders schonendes Entfer nen der fusionierten Zellen aus dem Fusionsvolumen ist je doch dann möglich, wenn einander zugewandte Seiten der Elek troden auf der Zellträgerplatte, zumindest zu einem wesent lichen Teil ihres Verlaufs, sich ungefähr in radialer Rich tung zu der Drehachse des Gehäuses erstrecken, so daß zwi schen diesen in radialer Richtung verlaufende Kanäle gebil det werden, längs denen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen durch die Zentrifugalkräfte von dem Fusionsvolumen in die Kammer überführt werden kann, ohne daß in der Zellsuspension Turbulenzen und somit Scherkräfte auftreten. A particularly gentle Entfer NEN the fused cells from the fusion volume is ever but possible when mutually facing sides of the elec trodes on the cell carrier plate, at least to a substantial part of its course, is tung approximately in the radial Rich extend to the rotational axis of the housing, so that rule Zvi these running in the radial direction channels are gebil det along which the cell suspension can be transferred together with the fused cells by the centrifugal forces from the fusion volume in the chamber without turbulence and thus shear forces occur in the cell suspension.

Die Elektroden können in unterschiedlichster Weise auf die Zellträgerplatte aufgebracht sein. The electrodes can be applied in unterschiedlichster way to the cell carrier plate. Die einfachste Möglichkeit sind auf der Zellträgerplatte gehaltene Drähte, die jede beliebige Form besitzen können. The easiest way is held on the cell carrier plate wires can have any shape.

Wenn die Elektroden auf die Zellträgerplatte aufgebrachte dünne Schichten sind, können die aufgrund der Zentrifugal kräfte über die Oberfläche der Elektroden hinwegbewegten fusionierten Zellen durch die Oberflächenrauhigkeit dieser Elekroden nicht beschädigt werden. When the electrodes are applied thin layers on the cell supporting plate, the forces due to the centrifugal over the surface of the electrodes away moving fused cells by the surface roughness of these electrodes positioned not be damaged.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung sowie der zeichne rischen Darstellung einiger Ausführungsformen der Er findung. Further features and advantages will become apparent from the following description and the drawings of several embodiments of the He-making. In der Zeichnung zeigt In the drawing

Fig. 1 einen Schnitt (längs Linie 1-1 in Fig. 2) durch ein erstes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung; Fig. 1 is a section (along line 1-1 in Fig. 2) by a first embodiment of the device;

Fig. 2 einen Schnitt längs Linie 2-2 in Fig. 1; Fig. 2 is a section along line 2-2 in FIG. 1;

Fig. 3 einen Schnitt ähnlich Fig. 1 durch das erste Ausführungsbeispiel sowie durch eine Kontaktiervorrichtung; Fig. 3 is a section similar to Figure 1 by the first embodiment and by a contactor.

Fig. 4 eine teilweise aufgebrochene Ansicht einer Zentrifuge für das erste Ausführungsbei spiel; Fig. 4 is a partially broken view of a centrifuge for the first game Ausführungsbei;

Fig. 5 einen Ausschnitt aus einem ersten Aus führungsbeispiel einer Zellträgerplatte mit aufgedampften Elektroden; Fig. 5 is a detail of a first exemplary implementation of a cell from carrier plate with deposited electrodes;

Fig. 6 einen vergrößerten Ausschnitt der Zell trägerplatte in Fig. 5; Fig. 6 is an enlarged section of the cell carrier plate in FIG. 5;

Fig. 7 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 7 shows a second embodiment of a cell carrier plate;

Fig. 8 ein drittes Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 8 shows a third embodiment of a cell carrier plate;

Fig. 9 ein Aufbringen von Zellsuspension auf die Zellträgerplatte eines ersten Aus führungsbeispiels der Vorrichtung; Figure 9 is a depositing cell suspension onto the cell carrier plate from a first guide of the apparatus.

Fig. 10 ein Entnehmen der Suspension aus fusio nierten Zellen aus dem ersten Ausführungs beispiel der Vorrich tung; FIG. 10 is a removal of the suspension of cells fusio ned from the first execution of the example Vorrich tung;

Fig. 11 ein zweites Ausführungsbeispiel der Vorrichtung und Fig. 11 shows a second embodiment of the apparatus and

Fig. 12 ein drittes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung. Fig. 12 shows a third embodiment of the apparatus.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, dargestellt in den Fig. 1 und 2, zeigt im einzelnen ein zu einer Drehachse 20 rotationssymme trisches, hohlzylindrisch ausgebildetes Gehäuse 22 mit einem Mantel 24 , einem bezüglich der Drehachse 20 ra dial nach innen gezogenem Bodenteil 26 , das eine Boh rung 28 aufweist, und einem ebenfalls radial nach innen gezogenen Oberteil 30 mit einer Öffnung 32 . A first embodiment of a device according to the invention, shown in Figs. 1 and 2, showing in detail a rotationssymme to a rotation axis 20 tric, hollow-cylindrically shaped housing 22 with a casing 24, a relative to the rotational axis 20 of ra dial inwardly drawn base part 26, which a Boh tion 28, and in a likewise radially inwardly drawn top part 30 with an opening 32nd Somit ist durch das radial nach innen gezogene Oberteil 30 und das Bodenteil 26 sowie den Mantel 24 im Inneren des Gehäuses 22 ein Ringkanal 34 gebildet, welcher von einem Inneren des Gehäuses in radialer Richtung zu gänglich ist. Thus, by the radially inwardly drawn top part 30 and the bottom portion 26 and the sheath 24 inside the housing 22. An annular channel 34 is formed, which is accessible from an interior of the housing in the radial direction.

Das Bodenteil 26 trägt auf einer dem Ringkanal 34 zuge wandten Innenseite 36 einen sich in Richtung des Ober teils 30 erhebenden ringförmigen Wulst 38 , der sich in radialer Richtung im Anschluß an die Bohrung 28 nach außen erstreckt, so daß auf der Innenseite 36 zwischen dem Wulst 38 und dem Mantel 24 eine zu dem Ringkanal 34 gehörende kreisringförmige Vertiefung 40 gebildet wird. The base part 26 bears on a the annular channel 34 facing the inner side 36 a in the direction of the upper part 30 rising annular bead 38, which extends in a radial direction subsequent to the bore 28 to the outside, so that on the inner surface 36 between the bead 38 and the jacket 24 a belonging to the annular channel 34 annular recess is formed 40th

Der vom Oberteil 30 den geringsten Abstand aufweisende Teil des Wulstes 38 trägt eine zur Drehachse 20 kon zentrische Ringnut 42 zur Aufnahme einer kreisscheiben förmigen Zellträgerplatte 44 , die sich senkrecht zur Dreh achse 20 erstreckt. The upper part 30 having the shortest distance from the portion of the bead 38 carries a con centric to the rotation axis 20 annular groove 42 for receiving a circular disk-shaped cell carrier plate 44, which is perpendicular to the rotational axis of which extends 20th Diese ist in der Ringnut 42 so ge halten, daß eine dem Oberteil 30 zugewandte Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 einen geringeren Abstand von dem Oberteil 30 aufweist als der sich in radialer Richtung außen an die Zellträgerplatte 44 anschließende Teil des Wulstes 38 . This is held in the annular groove 42 so-that a the upper part 30 facing surface 46 of the cell carrier plate 44 has a smaller distance from the upper part 30 than in the radial direction on the outside of the cell supporting plate 44 adjoining part of the bead 38th Damit ist sichergestellt, daß bei zur Richtung der Schwerkraft parallel stehender Dreh achse 20 eine die Zellträgerplatte 44 in radialer Rich tung verlassende Zellsuspension ein Gefälle vorfindet, durch welches sie über den Wulst 38 in Richtung der Vertiefung 40 geleitet wird. This ensures that, in the direction of gravity parallel upright axis of rotation 20 a cell supporting plate 44 in the radial Rich tung leaving cell suspension finds a gap through which it is passed over the bead 38 in the direction of the recess 40th

Bevorzugterweise ist die Zellträgerplatte 44 in der Ringnut 42 auswechselbar gehalten, wobei es im allge meinen ausreichend ist, wenn die Ringnut 42 so ausge bildet ist, daß sie einen Paßsitz für die Zellträger platte 44 darstellt, die bei diesem Ausführungsbeispiel von oben, dh von seiten des Oberteils 30 , in die Ring nut 42 einsetzbar ist. Preferably, the cell supporting plate is exchangeably held in the annular groove 42 44, wherein it is sufficient in general mean when the annular groove 42 forms so out is that it is a snug fit for the cell supporting plate 44, which in this embodiment from above, ie from the side of the upper part 30, in the ring nut 42 can be inserted.

Zum Verschließen der Öffnung 32 in dem Oberteil 30 ist ein Deckel 48 vorgesehen, welcher in die Öffnung 32 einsetzbar ist und in radialer Richtung das Oberteil 30 auf einer Außenseite 50 übergreifende Randbereiche 52 besitzt, die verhindern, daß der Deckel 48 auf der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufsteht. For closing the opening 32 in the upper part 30, a lid 48 is provided, which is inserted into the opening 32 and has, in radial direction, the upper part 30 on an outer side 50 across edge portions 52 which prevent the lid 48 on the surface 46 of the cell carrier plate 44 rises.

Die Zellträgerplatte 44 ist auf ihrer Oberfläche 46 mit zwei Elektroden 54 und 56 versehen, welche eine beliebige Form besitzen können, jedoch in ihren einan der zugewandten Bereichen so aneinander anzupassen sind, daß zwischen diesen Elektroden 54, 56 ein Spalt 58 entsteht, der stets ungefähr dieselbe Breite aufweist. The cell carrier plate 44 is provided on its surface 46 with two electrodes 54 and 56 which can have any shape, but are adjusted in their Einan the regions facing each other so that between these electrodes 54, 56 a gap 58 is formed which always approximately having the same width. Die einzelnen Formen der Elektroden 54 und 56 werden später im einzelnen beschrieben. The individual shapes of the electrodes 54 and 56 will be described later in detail.

Die Kontaktierung der Elektroden 54 und 56 erfolgt durch in dem Deckel 48 vorgesehene und bevorzugterweise parallel zur Drehachse 20 stehende Kontaktstifte 60 und 62 . The contacting of the electrodes 54 and 56 takes place through openings provided in the lid 48 and standing preferably parallel to the rotational axis 20 of contact pins 60 and 62nd Diese sind in jeweils ihrem Durchmesser angepaß ten Bohrungen 64 und 66 verschieblich gelagert, so daß sie beim Aufsetzen des Deckels 48 auf die den Kontaktstif ten 60 und 62 zugeordneten Elektroden 54 bzw. 56 drücken und mit diesen einen elektrischen Kontakt herstellen können. These are mounted displaceably in each case their diameter angepaß ten bores 64 and 66, so that it when the cover 48 to the Kontaktstif th 60 and 62 associated electrodes can press 54 and 56, and make electrical contact therewith. Um die Kontaktstifte 60 und 62 bei Abnahme des Deckels 48 gegen ein Durchrutschen durch die Bohrungen 64 und 66 zu sichern, sind diese an einem der Zellträgerplatte 44 abgewandten Ende mit einem Kopf 68 bzw. 70 versehen, der teilweise in dem Deckel 48 versenkt ist. In order to secure the contact pins 60 and 62 when removing the cover 48 from slipping through the holes 64 and 66, this end facing away at one of the cell supporting plate 44 are provided with a head 68 or 70 which is partially sunk in the lid 48th

Zur Versorgung der Elektroden 54 und 56 mit für eine Fusion der Zellen notwendigen Spannungen ist eine in Fig. 3 dargestellte Halterung 72 vorgesehen, in welche das Gehäuse 22 mit bereits geschlossenem Deckel 48 ein setzbar ist. For supply to the electrodes 54 and 56 required for a fusion of cell voltages of a holder 72 shown in Fig. 3 is provided, into which the housing 22 is a settable with already closed cover 48. Die Halterung 72 umfaßt eine Grundplatte 74 , auf welcher das Gehäuse 22 mit seinem Bodenteil 26 steht. The holder 72 comprises a base plate 74 on which the housing 22 is with its bottom part 26th Gleichzeitig sind an der Halterung 72 bügel ähnliche Federkontakte 76 und 78 gehalten, welche den Deckel 48 des Gehäuses 22 übergreifen und eine elektri sche Verbindung mit dem Kopf 68 bzw. dem Kopf 70 der Kontaktstifte 60 bzw. 62 herstellen. At the same time 72 clip-like spring contacts are held on the holder 76 and 78, which engage over the cover 48 of the housing 22 and establish a specific electrical connection with the head 68 and the head 70 of the contact pins 60 and 62 respectively. Diese Federkontakte 76 und 78 stehen ihrerseits wieder mit einem Spannungs generator 80 in Verbindung, der die zu einer Elektro fusion erforderlichen Spannungen und Spannungsimpulse liefert. These spring contacts 76 and 78 are provided in turn with a voltage generator 80 in connection which provides the necessary voltages to an electric fusion and voltage pulses.

Fig. 4 zeigt eine Zentrifuge 82 , die einen Motor 84 und einen durch diesen antreibbaren Rotor 86 besitzt, in welchen das Gehäuse 22 nach Durchführung der Elekrofusion ein setzbar und zum Entfernen fusionierter Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 zentrifugierbar ist. Fig. 4 shows a centrifuge 82, which is a centrifuged a motor 84 and a driven rotor 86 has therethrough, in which the housing 22 after performing the Elekrofusion settable and removal of fused cells from the surface 46 of the cell carrier plate 44.

Ein erstes Ausführungsbeispiel für die Ausbildung der Elektroden 54 und 56 auf der Oberfläche 46 der Zellträ gerplatte 44 zeigt Fig. 5. Die Elektrode 54 umfaßt da bei einen am äußeren Rand der Zellträgerplatte 44 ent langlaufenden Kreisring 90 , von welchem aus strahlen förmig in radialer Richtung weitere Elekroden 92 nach innen verlaufen. A first embodiment for forming the electrodes 54 and 56 on the surface 46 of the Zellträ carrier plate 44 shown in FIG. 5. The electrode 54 comprises as in one at the outer edge of the cell carrier plate 44 ent long-running circular ring 90, from which radiate in the radial direction more electrodes positioned run 92 inside. Die Elektrode 56 weist eine konzentrisch auf der Zellträgerplatte 44 angeordnete Kreisfläche 94 auf, von welcher aus sich in radialer Richtung strahlen förmige Elektroden 96 erstrecken, die zwischen den je weiligen Elektroden 92 liegen. The electrode 56 has a concentrically arranged on the cell support board 44 circular surface 94, from which radiate radially shaped electrodes 96 extend, which lie between the electrodes depending weiligen 92nd Die Form der Elektroden 92 und 96 ist dabei so gewählt, daß der Spalt 58 zwi schen einander zugewandten Elektroden ungefähr die selbe Breite besitzt, wie auch der vergrößerte Aus schnitt in Fig. 6 zeigt. The shape of the electrodes 92 and 96 is selected such that the gap 58 Zvi rule electrodes facing each other has about the same width, as well as the enlarged cut off in Fig. 6 shows.

Selbstverständlich müssen die Kontaktstifte 60 und 62 in dem Deckel 48 so angeordnet sein, daß jeder der Kon taktstifte 60 und 62 nur auf einer der Elektroden 54 bzw. 56 aufsitzt. Of course, the contact pins must be 60 and 62 disposed in the cover 48 so that each of the con tact pins 60 and 62 is seated on one of the electrodes 54 and 56 respectively. Wie Fig. 1 zeigt, ist beim ersten Ausführungsbeispiel bevorzugterweise der Kontaktstift 62 konzentrisch zur Drehachse 20 angeordnet, so daß er auf der Fläche 94 der Elektrode 56 aufsteht und der Kontaktstift 60 so angeordnet ist, daß er auf den kreis ringförmigen Teil 90 der Elektrode 54 aufsitzt. As Fig. 1 shows, in the first embodiment, the contact pin 62 preferably arranged concentrically to the axis of rotation 20 so that it rests on the surface 94 of the electrode 56 and the contact pin 60 is arranged so that it on the annular portion 90 of electrode 54 seated.

Prinzipiell können die Elektroden 54 und 56 beliebig gestaltet sein, denn es ist einzig und allein der Spalt 58 zwischen den Elektroden 54 und 56 maßgebend. In principle, the electrodes can be of any 54 and 56, because it is solely the gap 58 between the electrodes 54 and 56 prevail.

Fig. 7 zeigt beispielsweise einen mäanderförmigen Ver lauf des Spaltes 58 und Fig. 8 einen schneckenförmigen Verlauf dieses Spaltes 58 . Fig. 7 shows, for example, a meandering Ver running of the gap 58 and Fig. 8 a helical course of the gap 58.

Die Zellträgerplatte 44 besteht bevorzugterweise aus einer Glasplatte oder Quarzglasplatte, auf welche die Elektroden 54 und 56 durch Aufdampfen oder durch ein fototechnisches Verfahren aufgebracht werden können. The cell carrier plate 44 is preferably made of a glass plate or quartz plate on which the electrodes 54 and 56 are applied by vapor deposition or by a photo industrial process. Die Dicke derartiger aufgedampfter Schichten beträgt ungefähr 5 bis 40 µm. The thickness of such deposited film is about 5 to 40 microns. Vorteilhafterweise wird als Material für die Elektroden Chrom verwendet. Advantageously, is used as the material for the electrodes chromium.

Die Breite des Spalts 58 oder der Abstand der Elektroden muß nach der Größe der zu fusionierenden Zellen und nach den zur Verfügung stehenden Ausgangsspannungen des Spannungsgenerators 80 gewählt werden. The width of the gap 58 or the spacing of the electrodes must be chosen according to the size of the cells to be fused and to the available output voltages of the voltage generator 80th Beispielsweise werden für Bakterien und Hefezellen Elektrodenabstände von 30 µm und für Pflanzenprotoplasten Elektrodenabstände bis zu 500 µm verwendet. For example, electrode spacings of 30 microns and plant protoplasts electrode spacings can be used up to 500 microns for bacteria and yeast cells. Es sind jedoch auch Elektroden abstände im Bereich von 1 bis 5 mm denkbar, die den Vor teil haben, daß die entstehenden Felder wesentlich ho mogener sind als bei geringeren Abständen, jedoch muß dann mit hohen Suspensionsdichten gearbeitet werden. However, also electrode spacings in the range of 1 to 5 mm conceivable that have the part before that the fields produced are much ho mogener than at lower intervals, but then has to be worked with high suspension densities.

Damit ist zur Aufnahme der zu fusionierenden Zellen auf der Zellträgerplatte 44 ein System von kanalartigen Ver tiefungen vorgesehen, die seitlich durch Ränder der unge fähr 5-40 µm dicken Elektroden 54 und 56 begrenzt sind und eine Bodenfläche besitzen, die durch die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 gebildet ist, wobei deren Breite der obengenannten Breite des Spalts 58 entspricht. Thus a system of the channel-like Ver is to receive the cells to be fused on the cell carrier plate 44 depressions are provided which are laterally limited by edges of the unge ferry 5-40 microns thick electrodes 54 and 56 and having a bottom surface defined by the surface 46 of the cell carrier plate 44 is formed, the width of which corresponds to the above-mentioned width of the gap 58th

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Elektroden 54 und 56 so gestaltet sind, daß die Vertiefungen im wesentlichen, wie in Fig. 5 dargestellt, in radialer Richtung verlaufen, so daß beim Zentrifugieren die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen in einer Längsrichtung der Vertiefungen strömen kann und nur am Rand der Zellträgerplatte 44 eine durch den Kreisring 90 der Elektrode 54 gebildete Barriere überwinden muß. It is particularly advantageous if the electrodes 54 and 56 are designed so that the recesses shown substantially as in Fig. 5, extend in the radial direction, so that the cell suspension may flow together with the fused cells in a longitudinal direction of the recesses during centrifugation and a barrier formed by the annulus 90 of the electrode 54 has to overcome only at the edge of the cell carrier plate 44th Dies ist jedoch unproblematisch, da sich beim Zentrifugieren die Zellsuspension in diesem Bereich aufstaut und somit diese Barriere leicht überwindet, ohne daß in der Zellsuspension die fusionierten Zellen schädi gende Turbulenzen entstehen. However, this is not problematic, since the cell suspension dams during centrifugation in this area and thus this barrier easily overcome without the fused cells are produced in the cell suspension material injury constricting turbulence.

Bei einem ersten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemä ßen Verfahrens unter Verwendung des vorstehend beschriebe nen ersten Ausführungsbeispiels wird folgendermaßen verfah ren: In a first embodiment of the inventive SEN method using the above-described NEN first embodiment is as follows ren procedural:

Zuerst wird, wie in Fig. 9 dargestellt, der Deckel 48 von dem Gehäuse 22 abgenommen, so daß die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 von oben zugänglich ist. First, the lid as shown in Fig. 9, 48 removed from the housing 22, so that the surface 46 of the cell carrier plate is accessible from above 44th Dies hat unter sterilen Bedingungen zu erfolgen, um zu ver hindern, daß die aufzutragende Zellsuspension infiziert wird, wobei selbstverständlich bereits vorher das Ge häuse 22 und der Deckel 48 sterilisiert wurden. This must be done under sterile conditions to prevent ver to that to be applied cell suspension is infected, it being understood that the previously Ge housing 22 and the lid were sterilized 48th

Mittels einer Pipette 100 wird eine so große Menge von Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgetragen, daß diese im wesentlichen vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist. By means of a pipette 100 is applied to the surface 46 of the cell carrier plate 44 that it is substantially completely covered with cell suspension so large a quantity of cell suspension.

Anschließend wird der Deckel 48 aufgesetzt, der vorteil hafterweise das Gehäuse 22 steril abschließt. Subsequently, the cover 48 is placed, the adhesive enough, closes the housing sterile advantageous 22nd

Zur Fusion wird das verschlossene Gehäuse 22 in die Halterung 72 ( Fig. 3) eingesetzt. Fusion to the closed housing 22 is inserted into the holder 72 (Fig. 3). Dadurch sind die beiden Elektroden 54 und 56 über die Kontaktstifte 60 und 62 und die Federkontakte 76 und 78 mit dem Spannungsgenerator 80 verbunden, so daß die zur Elektrofusion erforderlichen Spannungsimpulse angelegt werden können, die zwischen den Elektroden 54 und 56 elektrische Felder erzeugen, durch welche die Fusion erfolgt. Thus, the two electrodes 54 and 56 are connected via the contact pins 60 and 62 and the spring contacts 76 and 78 to the voltage generator 80 so that the information necessary for electrofusion voltage pulses may be applied which produce 54 and 56, electric fields between the electrodes through which the merger takes place. Bei einer vorteilhaften Gestal tung der Elektroden 54 und 56 gemäß den Fig. 5, 7 und 8 wird dabei eine für die Fusion ausreichende elektrische Feldstärke im wesentlichen nur zwischen den Rändern der Elektroden 54, 56 , dh im Bereich des Spalts 58 erreicht, so daß nur die in diesem Bereich vorliegenden Zellen fu sioniert werden. In an advantageous Gestal of the electrodes 54 and 56, processing shown in FIGS. 5, 7 and 8 is in this case sufficient for fusion electric field strength substantially only between the edges of the electrodes 54, 56, that is reached in the region of the gap 58 so that only the present in this area cells are fu-dimensioned. Je nach dem verwendeten Elektrofusions verfahren wird entweder mit einer hohen Zelldichte gear beitet, bei welcher sich die Dielektrophorese erübrigt, so daß sofort die Fusionsimpulse angelegt werden können, die zu einem Durchlöchern der Membran der im elektri schen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 befindli chen Zellen führen, oder es werden vor der Fusion, vor allem bei geringen Zelldichten in der Zellsuspension, mittels Dielektrophorese die Zellen in sogenannten Perlen ketten aneinandergereiht, wie sie in Fig. 6 zu sehen sind. The procedure is according to the used electric fusion either gear beitet with a high cell density, wherein the dielectrophoresis is unnecessary, so that the fusion pulses may be applied immediately, leading to a piercing the membrane of the rule in the electrical field between the electrodes 54 and 56 befindli chen cells lead, or will before the merger, especially at low cell densities in the cell suspension, strung together by dielectrophoresis, cells in the so-called pearl chains, as can be seen in Fig. 6. Die Dielektrophorese hat bei den als vorteilhaft beschrie benen Ausführungsformen gemäß den Fig. 5, 7 und 8 der Elek troden 54 und 56 zur Folge, daß die Zellen, aufgrund des Verlaufs der Inhomogenität des elektrischen Feldes, zwischen derartig gestalteten Elektroden auch aus einer über den Vertiefungen und den Elekroden 54 und 56 stehenden Schicht aus Zellsuspension in die Vertiefungen hineingezogen und an den Rändern der Elektroden 54 und 56 zu Perlenketten aneinandergereiht werden. The dielectrophoresis has trodes in the enclosed advantageous beschrie embodiments according to FIGS. 5, 7 and 8 of Elek 54 and 56 with the result that the cells due to the course of the inhomogeneity of the electric field between such shaped electrodes also consist of a via drawn recesses and the electrodes positioned 54 and 56 standing sheet of cell suspension to the wells and be lined up at the edges of the electrodes 54 and 56 to pearl necklaces.

In beiden Fällen wird eine Membran der Zellen durchlöchert, so daß die benachbarten Zellen miteinander fusionieren, dh eine gemeinsame Zellmembran bilden. In both cases, a membrane of the cells is perforated, so that the adjacent cells fuse with each other, that a common cell membrane form. Die gemeinsame Zellmembran hat, wie bereits eingangs beschrieben, zu nächst noch eine langgestreckte, der Perlenkette ähnliche Form und ist aus diesem Grund noch sehr labil. The common cell membrane has, as already described in the introduction to the next even an elongated, the pearl necklace-like shape and is still very fragile because of this.

Zum Entfernen der Zellsuspension mit den fusionierten Zellen wird das Gehäuse 22 aus der Halterung 72 ent nommen und in den Rotor 86 der Zentrifuge 82 eingesetzt. To remove the cell suspension with the fused cells, the housing 22 is inserted from the bracket 72 and ent taken into the rotor 86 of the centrifuge 82nd Eine Drehzahl des Motors 84 der Zentrifuge 82 kann so gewählt werden, daß auf die auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 befindliche Zellsuspension und die darin enthaltenen fusionierten Zellen so große Zentri fugalkräfte wirken, daß diese in radialer Richtung der Zellträgerplatte 44 nach außen getrieben werden, sich auf der Innenseite 36 des Bodenteils 26 in den Ringkanal 34 bewegen und sich dort im Bereich des Man tels 24 und der Vertiefung 40 sammeln. A speed of the motor 84 of the centrifuge 82 can be selected such that on acting on the surface 46 of the cell carrier plate 44 cell suspension and contained the fused cells contained therein fugalkräfte so large Zentri act that they are driven in the radial direction of the cell supporting plate 44 to the outside, move and collect there in the region of one means of 24 and the recess 40 on the inside 36 of the bottom part 26 into the annular channel 34th Dabei wird so lange zentrifugiert, bis die ganze Zellsuspension von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 entfernt wurde. Here is centrifuged until the entire cell suspension was removed from the surface 46 of the cell carrier plate 44th Bevorzugte Werte für die Drehzahl der Zentrifuge 82 liegen im Bereich von 100-500 Umdrehungen pro Minute. Preferred values for the speed of the centrifuge 82 are in the range of 100-500 revolutions per minute.

Wenn der Rotor 86 wieder zum Stillstand gekommen ist, sammelt sich die Zellsuspension mit den fusionierten Zellen in der durch den Wulst 38 und den Mantel 24 ge bildeten Vertiefung 40 des Ringkanals 34 an, wobei durch die Vertiefung 40 verhindert wird, daß die Zell suspension wieder auf die Oberfläche 46 der Zellträger platte 44 zurückfließt. When the rotor has come to a standstill again 86, the cell suspension 40 of the annular channel 34 collects with the fused cells in the formed by the bead 38 and the shell 24 ge recess on being prevented by the recess 40 that the cell suspension again plate 44 flows back to the surface 46 of the cell carrier.

Das Entnehmen der Zellsuspension aus dem Ringkanal 34 kann beispielsweise wie in Fig. 10 dargestellt erfolgen. The removal of cell suspension from the annular channel 34 can for example be as shown in Figs. 10. Dazu wird das Gehäuse 22 um seine Drehachse 20 gekippt, so daß sich die Zellsuspension an einer tiefsten Stelle des Ringkanals 34 sammelt. For this purpose the housing 22 is tilted about its rotation axis 20, so that the cell suspension collected at a lowest point of the annular channel 34th Nach Abnehmen des Deckels 48 wird dann, ebenfalls unter sterilen Bedingungen, die Zellsuspension vorsichtig mittels einer Pipette 100 ab gesaugt. After removing the cover 48, the cell suspension is then also under sterile conditions, carefully aspirated with a pipette 100 from.

Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Fig. 11 dargestellt. A second embodiment of the device according to the invention is shown in Fig. 11. Identische Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen wie beim ersten Ausführungsbeispiel bezeichnet und werden nicht mehr gesondert erläutert. Identical parts are denoted by the same reference numerals as in the first embodiment and will not be explained separately. Der einzige Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel ist darin zu sehen, daß das Innere des Gehäuses 22 durch drei in radialer Richtung von der Drehachse 20 zu dem Mantel 24 verlaufende Trennwände 102 in drei Volumenbereiche aufgeteilt ist. The only difference from the first embodiment lies in the fact that the interior of the housing 22 is divided by three running in the radial direction from the rotational axis 20 to the jacket 24 into three partitions 102 volume regions. Die Zell trägerplatte 44 besitzt ebenfalls in jedem der Volumen bereiche zwei Elektroden 54 und 56 , wobei entweder alle drei Sätze von Elektroden 54 und 56 parallel geschaltet oder durch eine entsprechende Anzahl von Kontaktstiften direkt kontaktiert und separat mit entsprechenden Span nungen versorgt werden können. The cell carrier plate 44 also has in each of the volume ranges two electrodes 54 and 56, can be 54 and 56 connected in all three sets of electrodes in parallel or contacted directly by a corresponding number of contact pins and separately supplied with corresponding clamping voltages either.

Der Vorteil des zweiten Ausführungsbeispiels besteht darin, daß beispielsweise Suspensionen mit jeweils un terschiedlichen Zellen gleichzeitig zentrifugiert und eventuell auch fusioniert werden können. The advantage of the second embodiment is that, for example, suspensions, each with un terschiedlichen cells were centrifuged at the same time and possibly also can be fused.

Ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt Fig. 12. Auch dort sind mit dem ersten Ausführungsbeispiel identische Teile mit denselben Be zugszeichen versehen und werden nicht mehr beschrieben. A third embodiment of an inventive device, Fig. 12. There, too, identical parts having the same reference numbers Be are provided with the first embodiment and will not be described.

Das Gehäuse 22 entspricht im wesentlichen dem des ersten Ausführungsbeispiels, mit dem Unterschied, daß dieses bei dem dritten Ausführungsbeispiel stationär auf dem Rotor 86 montiert ist. The housing 22 corresponds essentially to the first embodiment, with the difference that it is mounted in the third embodiment, stationary on the rotor 86th Außerdem ist das Bodenteil 26 mindestens an einer Stelle mit einem schräg von der Ver tiefung 40 nach außen verlaufenden Auslaßkanal 104 ver sehen, der in einem an einer Unterseite 106 des Boden teils 26 angeordneten Stutzen 108 endet. In addition, the bottom part is seen ver 26 at least at one point with a helical indentation on the Ver 40 outwardly extending outlet passage 104 which terminates in a cylinder disposed on an underside 106 of the base part 26 neck 108th Eine in der Vertiefung 40 liegende Mündung 110 des Auslaßkanals 104 ist so geformt, daß sie eine Ventilkugel 112 aufnimmt, die die Mündung 110 flüssigkeitsdicht verschließen kann. A lying in the recess 40 port 110 of the exhaust passage 104 is shaped to receive a valve ball 112 which can seal the mouth of a liquid-tight 110th Die Mündung 110 ist dabei so zu formen, daß sich beim Zentrifugieren die Ventilkugel 112 nicht von dieser entfernt, sondern verstärkt auf die Mündung 110 gedrückt wird und diese noch besser abdichtet. The port 110 is to mold so that the valve ball 112 not removed during centrifugation of this, but is increasingly pushed to the port 110 and even better seal them. Vorzugsweise kann auch noch eine die Kugel 112 in Richtung der Mündung 110 beaufschlagende Feder 114 vorgesehen sein, welche sich mit ihrem anderen Ende an dem Oberteil 30 des Ge häuses 22 abstützt. Preferably, a ball 112 110 biasing spring may also be provided in the direction of the mouth 114, which is supported with its other end on the upper part 30 of the Ge häuses 22nd

Zum Entleeren der Vertiefung 40 ist ein auf den Stutzen 108 verschiebliches Rohr 116 vorgesehen, das einen in den Auslaßkanal 104 einführbaren Dorn 118 besitzt, welcher die Ventilkugel 112 aus ihrem die Mündung 110 abdichtenden Sitz herausdrückt, wenn das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben ist. For emptying the recess 40 a displaceable on the connection piece 108 tube 116 is provided which has an insertable into the outlet channel 104 mandrel 118 which the valve ball 112 pushes 110 sealing seat from its the opening, when the pipe is pushed 116 through the pipe 108 , Damit ist der Auslaß kanal 104 freigegeben, so daß die sich in der Vertiefung 40 angesammelte Zellsuspension durch den Auslaßkanal 104 in das Rohr 116 ausströmen kann. Thus, the outlet channel 104 is released, so that the recess 40 in the collected cell suspension can flow through the outlet passage 104 in the tube 116th

Des weiteren unterscheidet sich das dritte Ausführungs beispiel der Vorrichtung von dem ersten Ausführungsbei spiel dadurch, daß der konzentrisch zur Drehachse 20 sitzende Kontaktstift 62 in Richtung der Drehachse 20 nach oben durch ein Rohrstück 120 verlängert ist, des sen zur Drehachse 20 koaxiale Bohrung 122 sich auch in den Kontaktstift 62 hinein bis zur Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 fortsetzt. Furthermore, the third execution differs example of the apparatus of the first Ausführungsbei play characterized in that the concentric fitting to the rotational axis 20 of the contact pin is lengthened 62 in the direction of the axis of rotation 20 upwardly through a pipe section 120, coaxial of the sen to the rotational axis 20 of bore 122 also continues in the contact pin 62 into it up to the surface 46 of the cell carrier plate 44th Damit die Zellsuspension durch die Bohrung 122 auf die Oberfläche 46 der Zell trägerplatte 44 aufgebracht werden kann, ist das auf der Oberfläche 46 aufstehende Ende des Kontaktstifts 62 noch mit in radialer Richtung weisenden Ausnehmungen 124 versehen, welche ausgehend von der Bohrung 122 auf einer Außenseite des Kontaktstifts 62 münden. Thus, the cell suspension support plate through the bore 122 to the surface 46 of the cell 44 can be applied, the upstanding on the surface 46 of the end of the contact pin 62 is further provided with pointing in the radial direction, recesses 124 which starting from the bore 122 on an outer side of the open contact pin 62nd

Die Zufuhr von Zellsuspension erfolgt vorzugsweise über ein Gefäß 126 , welches ein Ansatzstutzen 128 mit ei nem Ventil 130 besitzt, der in das Rohrstück 120 mündet. The supply of the cell suspension takes place preferably via a vessel 126 which has an extension pipe 128 with egg nem valve 130, which flows into the pipe piece 120th

Eine Kontaktierung der Kontaktstifte 60 und 62 erfolgt ebenfalls über Federkontakte 132 bzw. 134 , wobei der zum Kontaktstift 62 führende Federkontakt 134 auch an dessen Rohrstück 120 anliegen kann und nicht notwendiger weise auf dessen Kopf 70 aufliegen muß. A contacting of the contact pins 60 and 62 is also via spring contacts 132 and 134, respectively, wherein the leading to the contact pin 62 spring contact 134 may also lie at the piece of pipe 120, and need not necessarily rest on the head of the 70th Die Federkon takte 132, 134 sind an einer Halterung 136 befestigt, welche beweglich sein muß, damit die Kontakte beim Zen trifugieren, dh beim Drehen des Gehäuses 22 von den Kontaktstiften 60, 62 abgehoben werden können. The Federkon contacts 132, 134 are fixed to a bracket 136, which must be movable so that the contacts at the Zen trifugieren, that when turning the housing 22 can be lifted from the contact pins 60, 62nd Wie beim ersten Ausführungsbeispiel stehen die Federkontakte 132 und 134 mit einem Spannungsgenerator 80 in Verbindung. As in the first embodiment, the spring contacts 132 and 134 are connected to a voltage generator 80th

Ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird unter Verwendung des dritten Ausführungs beispiels der Vorrichtung so geführt, daß die Zellsus pension zunächst in das Gefäß 126 gegeben wird. A second embodiment of the inventive method is performed using the third execution example of the device so that the cell suspension initially in the vessel 126 is given. Dieses kann auch gleichzeitig als Mischkammer dienen, wenn beispielsweise vorgesehen sein soll, Zellen unterschied lichen Typus zu fusionieren. This can also serve simultaneously as a mixing chamber when should be provided, for example, cells differed to merge union type. Dazu werden die Zellen von unterschiedlichem Typus mit der Zellsuspension, in der sie aufgenommen sind, in das Gefäß 126 gegeben und in dieser durch ein übliches Mischverfahren eine ein homo genes Gemisch der Zellen von unterschiedlichem Typus bildende Zellsuspension hergestellt. , The cells of different type with the cell suspension in which they are added, are added to the vessel 126 and produced in this by a conventional mixing method, a cell suspension forming a homo genes mixture of cells of different type.

Eine dosierte Menge von Zellsuspension wird durch ent sprechendes Öffnen des Ventils 130 über die Bohrung 122 und die Ausnehmungen 124 auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgebracht. A metered amount of cell suspension is ent speaking opening the valve 130 via the bore 122 and the recesses applied to the surface 46 of the cell carrier plate 44 124th Die Zellsuspension ver teilt sich dabei wie beim ersten Ausführungsbeispiel gleichmäßig über die gesamte Oberfläche 46 . The cell suspension ver divides it as in the first embodiment, uniformly over the entire surface of the 46th Anschließend wird die Halterung 136 derart bewegt, daß die Federkon takte 132 und 134 mit den Kontaktstiften 60 bzw. 62 eine elektrische Verbindung herstellen und somit die Elek troden 54 und 56 der Zellträgerplatte 44 mit dem Span nungsgenerator 80 verbunden sind, der, wie beim ersten Ausführungsbeispiel, je nach Art des Verfahrens der Elektrofusion Spannungsimpulse erzeugt, so daß die Zel len in dem elektrischen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 miteinander fusionieren. Subsequently, the holder 136 is moved such that the Federkon contacts 132 and 134 make with the contact pins 60 and 62, an electrical connection and hence the elec trodes 54 and 56 of cell carrier plate 44 with the clamping voltage generator 80 are connected, which, as in the first generates embodiment, depending on the nature of the method of electrofusion of voltage pulses, so that the cell h len merge with each other in the electric field between the electrodes 54 and 56th

Das Entfernen der fusionierten Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 erfolgt durch Rotieren des bereits fest auf dem Rotor 86 sitzenden Gehäuses 22 . Removing the fused cells from the surface 46 of the cell carrier plate 44 is accomplished by rotating the already fixed on the rotor housing 86 22nd Dazu muß jedoch zuerst die Halterung 136 soweit ver schoben werden, daß die Federkontakte 132 und 134 nicht mehr die Kontaktstifte 60 bzw. 62 berühren, und außerdem muß das Rohr 116 soweit zurückgezogen werden, daß es den an das Gehäuse 22 angeformten Stutzen 108 freigibt und der Dorn 118 ebenfalls aus dem Auslaßkanal 104 zu rückgezogen ist. For this purpose the holder, however, must first be 136 insofar pushed ver that the spring contacts 132 and 134 do not touch the contact pins 60 and 62, respectively, and further, the pipe must be 116 retracted so far that it releases the integrally formed on the housing 22 nozzles 108 and the mandrel 118 is also to be retracted from the discharge port 104th Dies führt dazu, daß die Ventilkugel 112 auf der Mündung 110 aufsitzt und diese dichtend verschließt. This results in that the valve ball 112 is seated on the orifice 110 and closes it sealingly.

Durch Drehen des Gehäuses 22 mitsamt der Zellträger platte 44 werden die fusionierten Zellen unter Einfluß von Zentrifugalkräften in radialer Richtung wie beim ersten Ausführungsbeispiel des Verfahrens in den Ring kanal 34 überführt und sammeln sich dort nach Beendi gung des Zentrifugierens in der Vertiefung 40 . Plate 44, the fused cells are transferred under influence of centrifugal forces in the radial direction as in the first embodiment of the method in the annular channel 34 by rotating the housing 22 together with the cell carrier and accumulate there after Beendi supply centrifugation in the recess 40th

Zum Abführen der Zellsuspension aus der Vertiefung 40 muß sichergestellt sein, daß das Gehäuse 22 in einer definierten Stellung stehen bleibt, in welcher der Dorn 118 in den Auslaßkanal 104 und das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben werden kann. For removing the cell suspension from the recess 40 is necessary to ensure that the housing remains in a defined position 22, in which the mandrel, the tube 116 can be pushed through the pipe 108 into the outlet passage 104 and 118th Dadurch wird durch den Dorn 118 die Ventilkugel 112 von der Mündung 110 entfernt und gibt den Auslaßkanal 104 frei, durch wel chen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen unter Wirkung der Schwerkraft in das Rohr 116 abfließen kann. Thereby, the valve ball by the mandrel 118 112 from the mouth 110 and the outlet channel 104 are free, the cell suspension by wel chen together with the fused cells under the action of gravity, can flow into the tube 116th Bevorzugterweise kann dabei die Vertiefung 40 so ausgebildet sein, daß ihre tiefste Stellung bezüglich der Richtung der Schwerkraft im Bereich der Mündung 110 liegt, so daß die Zellsuspension aus dem gesamten Ring kanal 34 in Richtung der Mündung 110 abfließt. Preferably, the recess 40 may in this case be formed so that its lowest position with respect to the direction of gravity in the area of the mouth 110 is located so that the cell suspension from the entire annular channel 34 flows in the direction of the mouth of the 110th

Dieses zweite Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht vorteilhafterweise eine quasikon tinuierliche Verfahrensführung, dh, daß die einzelnen Verfahrensschritte, wie das Aufbringen der Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 , das Fu sionieren der Zellen, das Überführen der fusionierten Zellen in die Vertiefung 40 und das Abführen der Zellen aus dieser Vertiefung 40 aufeinanderfolgend beliebig oft erfolgen können. This second embodiment of the inventive method advantageously enables quasikon tinuous process control, that is, the individual process steps, such as the application of the cell suspension onto the surface 46 of the cell carrier plate 44, the Fu sionieren of the cells, transferring the fused cells into the recess 40 and the removing the cells from this recess 40 can be made as many times consecutively.

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist auch darin zu sehen, daß sterile Bedingungen beim Zuführen der Zellen in das Gehäuse 22 und beim Abführen ein facher eingehalten werden können als bei dem ersten Aus führungsbeispiel. Another advantage of this method is also to be seen that sterile conditions during feeding of the cells in the housing 22 and in removing a fold can be maintained than in the first example from the guide.

Schließlich ist das zweite Ausführungsbeispiel des er findungsgemäßen Verfahrens besonders dazu geeignet, automatisiert zu werden, da die Steuerung sämtlicher Verfahrensschritte automatisch erfolgen kann und beispiels weise das Gehäuse 22 zum Fusionieren und zum Zentri fugieren nicht in separate Vorrichtungen eingesetzt werden muß. Finally, the second embodiment of he inventive method is particularly adapted to be automated, since the control of all the process steps can be performed automatically and embodiment, the housing 22 for fusing and Zentri fugieren does not have to be used in separate devices.

Claims (5)

  1. 1. Verfahren zur Elektrofusion von Zellen, bei welchem eine Zellsuspension einem Fusionsvolumen zugeführt wird sowie die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen in dem Fusionsvolumen mittels elektrischer Felder fusioniert werden und an schließend die Zellsuspension aus dem Fusions volumen in ein Sammelvolumen überführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zum Überführen der Zellsuspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen durch Einwirkung von Zentri fugalkräften das Fusionsvolumen und das Sammel volumen in eine Rotationsbewegung um dieselbe Drehachse mit derselben Winkelgeschwindigkeit versetzt werden. 1. A method of electrofusion of cells in which a cell suspension is supplied to a fusion volume and the cells contained in the cell suspension are fused in the fusion volume by means of electrical fields and closing volume, the cell suspension from the fusion is transferred into a collection volume, characterized in that for transferring the cell suspension from the fusion volume in the collecting volume by the action of Zentri the fusion volume and the collecting fugalkräften volume into a rotational movement about the same axis of rotation offset with the same angular velocity.
  2. 2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit einem Element zur Aufnahme einer Zellsuspension und mit mindestens zwei mit der Zellsuspension in Kontakt stehenden Elektroden, zwischen denen eine Fusion der Zellen herbei führende elektrische Felder erzeugbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung ein auf einen Rotor ( 86 ) einer Zentrifuge ( 82 ) aufsetzbares Gehäuse ( 22 ) mit einer zum Rotor ( 86 ) koaxialen Drehachse ( 20 ) umfaßt, das zur Aufnahme des Elements dient, und daß das Gehäuse ( 22 ) eine sich bezüglich seiner Drehachse ( 20 ) in radialer Richtng an das Element anschließende, die Suspension mit den fusionierten Zellen beim Zentrifugieren sammelnde Kammer besitzt. 2. Apparatus for carrying out the method of claim 1, with an element for accommodating a cell suspension, and having at least two are in contact with the cell suspension electrodes between which a fusion of the cells inducing electric fields are generated, characterized in that the device comprises a a rotor (86) of a centrifuge (82) surface-mounted housing (22) with a to the rotor (86) coaxial with the axis of rotation (20), which serves for receiving the element, and that the housing (22) has a (with respect to its axis of rotation 20) subsequent in the radial Richtng to the element, the suspension collecting at the fused cells during centrifuging chamber has.
  3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Kammer einen die gesammelte Suspension nicht zum Element zurückfließen lassenden Volumenbereich besitzt. 3. A device according to claim 2, characterized in that the chamber a, the collected suspension does not flow back to element has transmitting volume range.
  4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Element als Zellträger platte ( 44 ) ausgebildet ist, die auf einer Ober fläche ( 46 ) mit mindestens zwei Elektroden ( 54, 56 ) versehen ist. 4. Apparatus according to claim 2 or 3, characterized in that the element is designed as a cell carrier plate (44) which is provided on a top surface (46) with at least two electrodes (54, 56).
  5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß einander zugewandte Seiten der Elektroden ( 54, 56 ) auf der Zellträgerplatte ( 44 ), zumindest zu einem wesentlichen Teil ihres Ver laufs, sich ungefähr in radialer Richtung zu der Drehachse ( 20 ) des Gehäuses ( 22 ) erstreckend sind. 5. The device according to claim 4, characterized in that mutually facing sides of the electrodes (54, 56) on the cell carrier plate (44), at least to a substantial part of their Ver run, approximately in radial direction to the axis of rotation (20) of the housing (22) are extending.
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