DE3246090A1 - METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF PHOSPHATIDYL GLYCERINE - Google Patents
METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF PHOSPHATIDYL GLYCERINEInfo
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Description
Ohitocho-Mifuku, Tagata-gun, Shizuoka, JapanOhitocho-Mifuku, Tagata-gun, Shizuoka, Japan
"Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidylglycerin" "Method for the quantitative determination of phosphatidylglycerol"
beanspruchte Priorität:claimed priority:
16. Dezember 1981, Japan, Nr. 203074/81December 16, 1981, Japan, No. 203074/81
Die Zahl der Todesfälle von Neugeborenen mit zu geringem Gewicht konnte in letzter Zeit dank der verbesserten Behandlung von Neugeborenen gesenkt werden, jedoch stellt das Atemnot-Syndrom (RDS) in der perinatalen Periode ein großes Problem dar und die dadurch verursachten Todesfälle machen einen hohen Prozentsatz der Gesamttodesfälle aus. Es wird vermutet, daß das Atemnot-Syndrom auf einen Mangel an Lungenbenetzungsmittel zurückzuführen ist. Dieses Mittel ist wichtig zur Verhinderung der Alveolen-Kontraktionen der Lunge, die sich sofort .nach der Geburt ausdehnen. Der Mangel an diesem Lungen-Benetzungsmittel verursacht die Atelektase der Atmung und das Aufkommen von RDS. Folglich könnte das Auftreten von RDS verhindert oder zu einem milden Fall begrenzt werden, wenn das Auftreten von RDS in einer frühen Periode festgestellt werden könnte und die Behandlung des Neugeborenen früh begonnen werden könnte. Dementsprechend ist die Bestimmung dieses Lungen-Benetzungsmittels eine Notwendigkeit. Grob eingeteilt gibt es dazu ein Verfahren zur Bestimmung, in dem die physikalischen Eigenschaften des Lungen-Benetzungsmittels verwendet werden, und ein anderes, in dem die Bestandteile des Lungen-Benetzungsmittels biochemisch untersucht werden. Letztere Methode wurde bisher so durchgclührt, daß das Verhält-The number of deaths of newborn babies who are too light has decreased recently thanks to improved treatment of newborns, however, represents dyspnoea syndrome (IBS) is a major problem in the perinatal period and the deaths it causes make up a high percentage of total deaths. It is thought to be the dyspnoea syndrome is due to a lack of lung wetting agent. This remedy is important in preventing the Alveolar contractions of the lungs that occur immediately after birth expand. The lack of this pulmonary wetting agent causes breathing atelectasis and the emergence of IBS. Consequently, the occurrence of IBS could be prevented or limited to a mild case if the occurrence of IBS is in a early period could be detected and treatment of the newborn could be started early. Accordingly, the Determination of this lung wetting agent a necessity. There is roughly a method for determining, in one in which the physical properties of the lung wetting agent are used, and another in which the ingredients of the lung wetting agent can be examined biochemically. The latter method has so far been carried out in such a way that the
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nis der Lipide bestimmt wurdp, wie das Verhältnis von Lecithin 711 ,'; 11 (11 ii'i'iiiiyo I I π , oilm .lan v«>n IMioHpha I I tly.l-tj ί yonr I η sr.u PhoBphrt'-tidy l-Inosit, oder daß Dipalni Ltoyl-Phosphatidyl-cholin durch Dünnschichtchromatographie quantitativ bestimmt wurde (Am. J. Obstet. Gynecol. , 440, 109 (1971); 613, 125 (1976); 894, 133 (1979); Obstet. & Gynecol., 295, 57 (1981); Am. J. Obstet. Gynecol., 697, 138 (1980)). Aus den Ergebnissen dieser verschiedenen Untersuchungen wurde kürzlich erkannt, daß das Vorhandensein von Phosphatidyl-glycerin ein wichtiger Faktor für das Auftreten von RDS ist. Die quantitative Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin war jedoch sehr schwierig, da die auftretende Menge so gering wie etwa 1/10 der Lecithinmenge ist. Zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-oglycerin ist bisher die Dünnschicht-Chromatographie bekannt, in der, nach Entfernen der Zellen aus dem Fruchtwasser durch Zentrifugieren die Lipide aus dem Überstand extrahiert werden, die Bestandteile dieses Extrakts durch Dünnschichtchromatographie getrennt werden., jedes Phc spho'lipid quantitativ bestimmt wird, die Verhältnisse der verschiedenen Phospholipide berechnet werden und die Menge an Phosphatidyl-glycerin indirekt aus dem Wert der Gesamtphospholipide erhalten wird, der vorher durch quantitative Bestimmung der Phosphorsäure gemäß der Naßverbrennungsmethode erhalten worden ist (Am.J. Obstet. Gynecol. 613, 125 (1976); 1079, 135 (1979); 899, 133 (1979); 440, 109 (1971)}. Ein anderes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-g-lycerin ist die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie (Journal of Chromatography, 277, 223 ' (1981)). Diese Methode der Dünnschichtchromatographie hat jedoch die Nachteile, daß f.ür die Extraktion der Lipid-Komponenten aus dem Fruchtwasser 2 bis 3 Tage benötigt werden, komplizierte Maßnahmen und außerdem ein Erhitzen auf hohe Temperatur zum Flockennachweis notwendig sind. Weitere Nachteile sind, daß sie eine indirekte Methode zur Bestimmung darstellt, die auf den Verhältnissen von relativen Fleckenmengen und Gesamtphospholipid beruht, und daß wegen der Verwendung der Dünnschichtchromatographie nicht gleichzeitig mehrere Proben untersucht werden können.The lipids were determined, as was the ratio of lecithin 711, '; 11 (11 ii'i'iiiiyo I I π, oilm .lan v «> n IMioHpha I I tly.l-tj ί yonr I η sr.u PhoBphrt'-tidy l-inositol, or that dipalni ltoyl-phosphatidyl-choline by Thin layer chromatography was quantified (Am. J. Obstet. Gynecol., 440, 109 (1971); 613, 125 (1976); 894: 133 (1979); Fruit. & Gynecol., 295, 57 (1981); At the. J. Obstet. Gynecol., 697, 138 (1980)). From the results From these various studies it was recently recognized that the presence of phosphatidyl glycerol was an important factor for the occurrence of IBS. However, the quantitative determination of phosphatidyl glycerol was very difficult because the occurring amount is as little as about 1/10 of the amount of lecithin. For the quantitative determination of phosphatidyl-oglycerin is Previously known thin-layer chromatography, in which, after removing the cells from the amniotic fluid by centrifugation the lipids are extracted from the supernatant, the constituents this extract can be separated by thin layer chromatography, each Phc spho'lipid is quantified, the proportions of the various phospholipids can be calculated and the amount of phosphatidyl glycerol indirectly from the value of the Total phospholipids obtained beforehand by quantitative determination of phosphoric acid according to the wet combustion method (Am. J. Obstet. Gynecol. 613, 125 (1976); 1079, 135 (1979); 899, 133 (1979); 440, 109 (1971)}. Another Method for the quantitative determination of phosphatidyl-g-lycerin is high speed liquid chromatography (Journal of Chromatography, 277, 223 '(1981)). This method of Thin-layer chromatography, however, has the disadvantages that for the extraction of the lipid components from the amniotic fluid 2 to 3 days are required, complicated measures and, in addition, heating to a high temperature for flake detection is necessary are. Further disadvantages are that it is an indirect method of determination based on the ratios of relative amounts of stains and total phospholipid, and because of that Using thin layer chromatography, it is not possible to analyze several samples at the same time.
Die Erfinder haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob in der Flüssigkeit, die"verschiedene zu unter-The inventors made various studies in order to determine whether in the liquid the "different to be sub-
suchende Lipide enthält/ wie Fruchtwasser, nur Phosphatidylglycerin quantitativ auf einfache, zweckmäßige und genaue Weise in kurzer Zeit bestimmt werden kann.Seeking lipids contains / like amniotic fluid, only phosphatidylglycerin can be quantified in a simple, convenient and accurate manner in a short period of time.
Die Erfinder haben überraschenderweise dabei festgestellt, daß Phospholipase D auf Phosphatidyl-glycerin wirkt und Glycerin und Phosphatidsäure bildet. Sie fanden eine zufriedenstellende Methode zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin durch quantitative Bestimmung des in der Reaktion gebildeten und dann extrahierten Glycerins. Vorzugsweise kann in diesem Verfahren nur Phosphatidyl-glycerin quantitativ sehr zufriedenstellend bestimmt werden durch Einvirkenlassen der Phospholipase D auf die zu untersuchende Flüssigkeit .:ur Bildung von Glycerin, dann Einwirkenlassen von Glycurinkinase auf dieses Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Dcaors, wie Adenosintriphosphat (ATP) , schließlich Einwirkenlassen von Glycerinphosphat-Oxidase auf das Produkt und Bestimmen der verbrauchten Sauerstoffmenge oder des in der Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids. The inventors have surprisingly found that Phospholipase D acts on phosphatidyl glycerin and forms glycerin and phosphatidic acid. They found a satisfactory one Method for the quantitative determination of phosphatidyl glycerol by quantitative determination of that formed in the reaction and then extracted glycerin. Preferably only phosphatidyl glycerol can be quantitatively very satisfactory in this process can be determined by allowing the phospholipase D to act on the liquid to be examined.: ur formation of Glycerin, then allowing glycurine kinase to act on this Glycerine in the presence of a phosphate dancer such as adenosine triphosphate (ATP), finally exposure to glycerine phosphate oxidase on the product and determining the amount of oxygen consumed or the hydrogen peroxide formed in the reaction.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu Untersucheiden Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Glycerin durch die Wirkung eines Enzyms, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von GLycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-glycerin und Wasser spielt, freigesetzt wird und anschließend das freigesetzte Glycerin quantitativ bestimmt wird.The present invention therefore relates to a method for the quantitative determination of phosphatidyl glycerol in the to Investigate a liquid, which is characterized by the fact that glycerin is activated by the action of an enzyme that acts as a catalyst in the reaction to the formation of glycerol and phosphatidic acid from phosphatidyl glycerin and water plays, is released and then the released glycerin quantitatively is determined.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit , das dadurch gekennzeichnet ist, daß folgende Stufen (a), (b), (c) und (d) durchgeführt werden:The invention preferably relates to a method for quantitative Determination of phosphatidyl glycerol in the liquid to be examined, which is characterized in that the following steps (a), (b), (c) and (d) are carried out:
(a) Freisetzen von Glycerin durch Einwirkenlassen von Phospholipase D auf Phosph'atidyl-glycerin;(a) Release of glycerin by exposure to phospholipase D on phosph'atidyl glycerine;
(b) Bilden von Glycerin-3-phosphat durch Einwirkenlasr.en von Glycorinklnase auf das Glycerin in Gegenwart <> Ine; phor,ph,\ il-Donors; (b) Formation of glycerol-3-phosphate by exposure of glycerol nose to the glycerol in the presence of <>Ine; phor, ph, \ il- donors ;
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' (c) Einwirkenlassen von Glycerin-phosphcit-Oxidase auf das GIycerin-3-phosphat und(c) Allowing glycerol-phosphite oxidase to act on the glycerol-3-phosphate and
(d) Bestimmen der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an in der Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid.(d) Determining the amount of oxygen consumed or in hydrogen peroxide formed during the reaction.
Die Erfindung bietet die Vorteile, daß iedes Reagenz für die quantitative Bestimmung in einer Packung vorbereitet werden kann, die quantitative Bestimmung bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt werden kann, sie; außerdem einfach durchzuführen ist und wenig Zeit für die Reaktion benötigt.The invention offers the advantages that each reagent for the quantitative determination can be prepared in a package, the quantitative determination at a temperature of about 37 ° C can be done them; also easy to perform and takes little time to react.
Außerdem kann das Phosphatidyl-glycerin bis zu einer sehr niedrigen Konzentration genau bestimmt werden, der dabei direkt bestimmte Wert für Phosphatidyl-glycerin erweist sich als sehr zweckmäßig. Da die Bestimmung leicht und zweckmäßig in kurzer Zeit durchgeführt werden kann, können gleichzeitig mehrere Proben untersucht werden, d.h. , die Erfindung stellt ein geeignetes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidylglycerin zur Verfügung.In addition, the phosphatidyl glycerin can go down to a very low level Concentration can be precisely determined, the directly determined value for phosphatidyl glycerine turns out to be very expedient. Since the determination can be carried out easily and expediently in a short time, several samples can be carried out at the same time that is, the invention provides a useful method for the quantitative determination of phosphatidylglycerol to disposal.
Fig.1 zeigt die Eichkurve des Beispiels 1, Fig.2 die Ergebnisse einer quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin bei Untersuchung verschiedener Proben von Fruchtwasser-Bestandteilen. Fig.3 zeig: di2 Eichkurve des Beispiels 3.FIG. 1 shows the calibration curve of Example 1, and FIG. 2 shows the results a quantitative determination of phosphatidyl-glycerin when examining different samples of amniotic fluid components. Fig. 3 shows: di2 calibration curve of example 3.
Als Beispiel für das Enzym, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Glyceiin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-gl/cerin und Wasser spielt, kann Phospholipase D stehen. Diese Phospholipase D ist als Enzym bekannt, das die Reaktion von je 1 Mol Phosphatidsäure und Cholin aus je 1 Mol Lecithin und Wasser katalysiert. Als Präparat, das als Katalysator in der erwähnten Enzymreaktion dient, kann jedes Präparat verwendet werden, wie eines, das durch Extraktion von Phospholipase D enthaltenden Zellen erhalten worden ist, oder ein im Handel erhältliches Enzympräparat, z.B. ein aus Mikroorganismen stammendes Enzy \, das aus der Kultur von Phospholipase D produzierenden Mikroor* anismen erhalten worden ist, die zuPhospholipase D can be an example of the enzyme that plays the role of the catalyst in the reaction to form glycine and phosphatidic acid from phosphatidyl-gl / cerin and water. This phospholipase D is known as an enzyme that catalyzes the reaction of 1 mol each of phosphatidic acid and choline from 1 mol each of lecithin and water. As a preparation which serves as a catalyst in the above-mentioned enzyme reaction, each preparation may be used, such as one containing cells by extraction of phospholipase D is obtained, or a commercially available enzyme preparation, for example a derived from microorganisms Enzy \ selected from the culture of phospholipase D producing microorganisms has been obtained that lead to
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der Gattung Streptomyces gehören, wie Streptcmyces hac lijoensis A-1143 (FERM-P No. 1329, vgl. JA-PS 39918/1977), Strep .omyees chromofussus A-0848 (FERM-P Nr. 3519, ungeprüfte JA-Pa.entanmeldung Nr. 130984/1977). Auch ein im Handel erhältliches Phospholipase D-Präparat ist geeignet.belong to the genus Streptomyces, such as Streptcmyces hac lijoensis A-1143 (FERM-P No. 1329, see JA-PS 39918/1977), Strep .omyees chromofussus A-0848 (FERM-P No. 3519, unexamined JA patent registration No. 130984/1977). A commercially available phospholipase D preparation is also suitable.
Die Menge an zu verwendender Phospholipase D sollte entsprechend modifiziert und an die für die Bestimmung benötigte Zeit sowie an die Konzentration von Phosphatidyl-Glycerin angepaßt werden; sie unterliegt keiner besonderen Begrenzung. Zum Beispiel kann man für eine Bestimmung Phospholipase D In einer Menge im allgemeinen nicht unter 0,1 Einheiten, vorzugsweise etwa 1 bis 10 Einheiten, verwenden. Außerdem wird diese Phospholipase D vorzugsweise verwendet, nachdem sie in einem Puffer aufgelöst worden ist, wie einem schwach sauren bis schwach alkalischen Tris-SaIzsäurepuffer, Zitronensäure-Puffer, Borsäure-Puffer, PIPES-NaOH-Puffer. oder Imidazol-Puffer und, wenn notwendig, wird d&r Lösung ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie AlkylarylpolyätheralkohoIe (Triton X-100) oder Serum-Albumin, zugesetzt. Die so eingestellte, Phospholipase D enthaltende Enzymlösung und die zu untersuchende Flüssigkeit werden vermischt. In der zu untersuchenden Flüssigkeit bilden sich Glycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-Glycerin unter Verbrauch von Wasser. Das Mischungsverhältnis der beiden ist nicht besonders begrenzt/ man kann sie in einem solchen Verhältnis mischen, daß vorzugsweise etwa 1 bis 10 Einheiten Phospholipase ο je Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit enthalten sind. Die Reaktionstemperatur kann etwa 370C betragen und die Reaktionszeit " sollte für die Freisetzung von Glycerin .The amount of phospholipase D to be used should be modified accordingly and adapted to the time required for the determination and to the concentration of phosphatidyl glycerol; it is not subject to any particular limitation. For example, phospholipase D can be used for a determination in an amount generally not less than 0.1 unit, preferably about 1 to 10 units. In addition, this phospholipase D is preferably used after being dissolved in a buffer such as weakly acidic to weakly alkaline tris-hydrochloric acid buffer, citric acid buffer, boric acid buffer, PIPES-NaOH buffer. or imidazole buffer and, if necessary, a non-ionic surfactant such as alkylaryl polyether alcohol (Triton X-100) or serum albumin is added to the solution. The enzyme solution containing phospholipase D and the liquid to be examined are mixed together. In the liquid to be examined, glycerine and phosphatidic acid are formed from phosphatidyl glycerine with the consumption of water. The mixing ratio of the two is not particularly limited / they can be mixed in such a ratio that preferably about 1 to 10 units of phospholipase ο are contained per sample of the liquid to be examined. The reaction temperature can be about 37 ° C. and the reaction time "should" allow for the release of glycerol.
genügen, im allgemeinen nicht unter 5 Minuten, vorzugsweise nicht unter 10 Minuten. Das durch diese Reaktion freigesetzte Glycerin wird dann quantitativ bestimmt. Aus dem Wert dieser quantitativen Bestimmung erhält man den Wert für Phosphatidyl-Glyoirin in der zu untr rsurhenden Flüssigkeit.suffice, generally not less than 5 minutes, preferably not less than 10 minutes. The one released by this reaction Glycerin is then quantified. The value is obtained from the value of this quantitative determination for phosphatidyl-glyoirin in the liquid to be undersurhed.
Für die quantitative Bestimmung des Glycerins könnenFor the quantitative determination of glycerine you can
verschiedene bekannte Methoden für die quantitative chemischevarious known methods for quantitative chemical
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Bestinimung odor solche, die Enzyme verwenden, eingesetzt werden.. Eine bevorzugte, einfache und zweckmäßige enzymatische Methode zur quantitativen Bestimmung ist die, in der eines oder mehrere Enzyme, deren Substrat Glycerin ist, eingesetzt werden, und dio nachweisbare Änderung der Enzymwirkung in der Reaktion quant .tativ bestimmt wird. Zum Beispiel ist das GK-GPO-Verfahr<:n zur quantitativen.Bestimmung besonders einfach Und zweckmäßig, indem Glycerin-3-phösphat und Adenosin-diphos-Determination or those that use enzymes are used. A preferred, simple and convenient enzymatic method for quantitative determination is that in which one or more enzymes, the substrate of which is glycerol, are used, and the detectable change in the enzyme action in the Reaction is quantitatively determined. For example this is GK-GPO-Verfahr <: n for quantitative determination particularly easy And expedient, by adding glycerine-3-phösphat and adenosine-diphosphate
phat (ADP) aus Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie Adenosin-tr!phosphat (ATP) und Glycerinkinase (GK) gebildet werden, dann Glycerinphosphat-Qxidase (GPO) auf das GIycerin-3-phosphat einwirken gelassen wird, so daß der Sauerstoff in der Reaktionsflüssigkeit zur Bildung von Wasserstoffperoxid verbraucht wird.phate (ADP) from glycerine in the presence of a phosphate donor, such as adenosine triphosphate (ATP) and glycerol kinase (GK) then glycerol phosphate oxidase (GPO) on the glycerol-3-phosphate is allowed to act so that the oxygen in the reaction liquid to form hydrogen peroxide is consumed.
Dabei wird die Menge an in der Reaktionsflüssigkeit verbrauch-The amount of consumable in the reaction liquid is
undand
tem Sauerstoff mit einer Sauerstoffelektrode gemessen, die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid wird mit einer Wasserstoffperoxid-Elektrode als elektrische Veränderung gemessen oder die Menge an Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid wird mit einer Enzymelektrode bestimmt, die mit immobilisierter Glycerinphosphat-Oxidase zu einer Sauerstoff- oder Wasserstoffperoxid-Elektrode kombiniert worden ist. Die immobilisierte GPO kann in einer membranähnlichen, fiberähnlichen/ granulatähnlichen oder röhren ähnlichen Form vorliegen, um das Anbringen des Enzyms im Detektorteil der Sauerstoff- oder Wasserstofffperoxid-Elektrode zu erleichtern. In dieser Anordnung kann die Elektrode mit einer geringen Enzymmenge arbeiten. Phospholipase D oder die verwendete Glycerinkinase können auf gleiche Weise oder entsprechend immobilisiert werden. Immobilisierte Enzyme können auf verschiedene Weise hergestellt werden, z.B. durch Polymerisat-Einschluß in z.B. Acrylamid, durch Vernetzen unter Verwendung eines Vernetzungsmittels für ein Gemisch mit einem Protein, wie Albumin, durch Einschluß unter Verwendung von Collagen oder Fibroin, durch Adsorption oder durch kovalentes Binden auf einem porösen organischen Polymerisat oder durch Einschluß unter Verwendung eines lichthärtenden Harzes odertem oxygen measured with an oxygen electrode, the amount the hydrogen peroxide formed is measured with a hydrogen peroxide electrode measured as an electrical change or the amount of oxygen or hydrogen peroxide is measured with an enzyme electrode determined with immobilized glycerol phosphate oxidase to an oxygen or hydrogen peroxide electrode has been combined. The immobilized GPO can be in a membrane-like, fiber-like / granule-like or tube-like shape to allow the enzyme to be attached to the detector part of the oxygen or hydrogen peroxide electrode to facilitate. In this arrangement, the electrode can operate with a small amount of enzyme. Phospholipase D or the glycerol kinase used can be immobilized in the same way or in the same way. Immobilized enzymes can be made in a number of ways, for example by polymer inclusion in, for example, acrylamide, by crosslinking under Use of a crosslinking agent for a mixture with a protein such as albumin by entrapment using Collagen or fibroin, by adsorption or by covalent bonding on a porous organic polymer or by Inclusion using a photo-curing resin or
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durch kovalentes Binden unter Verwendung eines aminierten Glases.by covalent attachment using an aminated Glass.
Die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid kann auch mit spektrophotometrischen Verfahren, durch Verwenden eines Indikators, der durch die Reaktion mit Wasserstoffperoxid gebildet wird, durchgeführt werden. Als Indikator werden im allgemeinen solche Präparate verwendet, deren Veränderungen quantitativ durch spektroskopische Mittel bestimmt werden können, z.B. eine Farbreagenzmischung, deren Farbe sich, im sichtbaren Bereich verändert, ein Fluoreszenz-Reagenz, das fluoresziert, oder ein durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht Licht erzeugendes Reagenz. Beispielsweise kann man als Farbreagenz ein Material verwenden, das eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und ein Chromogen enthält. Als Substanz mit Peroxidase-Aktivität wird im allgemeinen die aus Meerrettich stammende Peroxidase verwendet und als Chromogen die Kombination eines Elektronenakzeptors und eines Wasser:-toff-Donors. Als Elektronenakzeptor werden solche Verbindungen verwendet, wie z.B. 4-Aminoantipyrin, 2-Hydrazin-benzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolon-hydrazin oder 2-Aminobenzothiazol. Als Wasserstoff -Donor werden Verbindungen verwendet, wie z.B. Phenol, 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-hydroxyäthyl)-anilin, 3,5-Xylenol, N,N-Dimethylanilin oder Ν,Ν-Diäthylanilin.The quantitative determination of hydrogen peroxide can also with spectrophotometric methods, by using an indicator formed by the reaction with hydrogen peroxide will be carried out. As an indicator, such preparations are generally used, their changes can be determined quantitatively by spectroscopic means, e.g. a color reagent mixture whose color is in visible range changed, a fluorescent reagent that fluoresces, or one by irradiating with ultraviolet Light-generating reagent. For example, as Color reagent use a material that is a substance with peroxidase activity and contains a chromogen. The substance from horseradish is generally used as a substance with peroxidase activity derived peroxidase and used as a chromogen the combination of an electron acceptor and a water: -toff donor. Compounds such as 4-aminoantipyrine, 2-hydrazine-benzothiazole and 3-methyl-2-benzothiazolone-hydrazine are used as electron acceptors or 2-aminobenzothiazole. Compounds such as phenol are used as hydrogen donors 3-methyl-N-ethyl-N- (ß-hydroxyethyl) aniline, 3,5-xylenol, N, N-dimethylaniline or Ν, Ν-diethylaniline.
Als leuchtende Substrate in einem Fluoreszenz-Reagenz oder einer Licht erzeugenden Reagenzmischung können verschiedene bekannte Verbindungen verwendet werden, z.B. Bis-(2,4,6-trichlorphenol)-oxalat, Phenylthiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Vanillylamin, 3-Methoxyäthylamin, Phloretinsäure, Hordenin, Luminol-Monoanion oder Lucigenin. Jede dieser Verbindungen kann, wenn es notwendig ist, zusammen mit einem Elektronenakzeptor und/oder einer Substanz mit Peroxidase-Aktivität für die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden.As luminous substrates in a fluorescence reagent or a light-generating reagent mixture, various known compounds are used, e.g. bis (2,4,6-trichlorophenol) oxalate, Phenylthiohydantoin, homovanillic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, vanillylamine, 3-methoxyethylamine, Phloretinic acid, hordenine, luminol monoanion or lucigenin. Each of these connections can, if necessary, together with an electron acceptor and / or a substance with peroxidase activity can be used for the quantitative determination of hydrogen peroxide.
Es besteht keine besondere Begrenzung für die Menge des Enzyms oder des verwendeten Chromogeny. So sollte man ν,.Ίλ. für eine* Untersuchung im allgemeinen nicht weniger als °'ϋ1 Einheiten,There is no particular limit to the amount of enzyme or chromogen used. So one should ν, .Ίλ. for an * examination generally not less than ° ' ϋ1 units,
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vorzugsweise 0,05 bis 100 Einheiten Glycerinkinase, nicht weniger als 0,05 Einheiten, vorzugsweise 0,1 bis 200 Einheiten Glyce::in-phosphat-Oxidase und im allgemeinen nicht weniger als 0,05 3inhe..ten, vorzugsweise 0,1 bis 500 Einheiten, Peroxidase verwe.iden. Auch kann man eine Lösung verwenden, die so eingestellt ist, daß die Konzentration eines Elektronen-Akzeptors oder 2 ines Wasserstoff-Donors im allgemeinen nicht unter 0,1 mMol ist, und eine so eingestellte Lösung, daß die Konzentration eines Phosphat-Donors, wie ATP oder Cytosin-triphosphat, nicht unter 0,1 mMol ist. Vorzugsweise wird zur Erhöhung der Glycerinkinase-Aktivität ein wasserlösliches, Magnesiumionenpreferably 0.05 to 100 units of glycerol kinase, no less than 0.05 units, preferably 0.1 to 200 units of glyce :: in phosphate oxidase and generally not less than 0.05 3inhe..ten, preferably 0.1 to 500 units, peroxidase to refuse. You can also use a solution that is set that way is that the concentration of an electron acceptor or 2 ines hydrogen donor generally not less than 0.1 mmol, and a solution adjusted so that the concentration of a phosphate donor, such as ATP or cytosine triphosphate, is not less than 0.1 mmol. A water-soluble magnesium ion is preferably used to increase the glycerol kinase activity
sz * r, ι z.B.Jiaonesiumchlorid/,, . sz * r, ι e.g. jiaonesium chloride / ,,.
frexsetzendes Salz verwendet,raas in aestilliertem Wasser oder schwach saurem oder schwach alkalischem Puffer gelöst werden kann. Diese; Reagenzien können getrennt von der Phospholipase D -Lösung verwendet oder mit dieser vermischt werden, ferner können diese Reagenzier als integrierte Verbund-Präparate durch Aufbringen auf FJlterpapier oder Filme■ konfektioniert werden.releasing salt used, raas in estilled water or weakly acidic or weakly alkaline buffer can be dissolved. These; Reagents can be used separately from phospholipase D Solution can be used or mixed with it, and these reagents can also be used as integrated compound preparations by applying it to filter paper or films will.
Dieses GK-GPO-Verfahren zur quantitativen Bestimmung zeigt eine hohe Empfindlichkeit für das in der zu untersuchenden Flüssigkeit gebildete Glycerin, und da es durch die Verunreinigungen in der zu untersuchenden Flüssigkeit nicht beeinträchtigt wird, is; es eine ausgezeichnete Methode, die eine genaue Bestimmung erlaubt.This GK-GPO method for quantitative determination shows a high sensitivity for the glycerine formed in the liquid to be examined, and because it is caused by the impurities is not impaired in the liquid to be examined, is; it's an excellent method that one exact determination allowed.
Als Glycerinkinase für diese quantitative Bestimmung kann jedes Enzym verwendet werden, solange es Glycerin-3-phosphat und ADP aus Glycerin und ATP bildet, z.B. Enzyme aus der Leber einer Ratte oder einer Taube,("J.Biol.Chem.", 211, S. 951 (1954) und "Biochem.Z.", 329, S.320 (1957)), Enzyme, die aus Mikroorganismen stammen, z.B. aus dem Kulturmedium von GK-produzierenden Mikroorganismen, wie Candida mycoderma oder Streptomyces canus A-2408 (FERM-P 4977); "Biochem.Z." 333, S. 471 (1961), ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 162987/ 1980)) und im Handel erhältliche Präparate.Any enzyme can be used as the glycerol kinase for this quantitative determination as long as it is glycerol-3-phosphate and ADP forms from glycerol and ATP, e.g. enzymes from the liver of a rat or a pigeon, ("J.Biol.Chem.", 211, P. 951 (1954) and "Biochem.Z.", 329, p.320 (1957)), Enzyme, which originate from microorganisms, e.g. from the culture medium of GK-producing microorganisms such as Candida mycoderma or Streptomyces canus A-2408 (FERM-P 4977); "Biochem.Z." 333, p. 471 (1961), unexamined JA patent application No. 162987 / 1980)) and commercially available preparations.
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
Die für dieses Bestiinimmgsverfahren verwendete Glycerinphophat-Oxidase kann beliebig sein, solange sie die Rolle eines Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid aus Glycerin-3-phosphat und Sauerstoff spielt, und z.B. aus aen Stämmen Streptococcus, Lactobacillus oder Leuconostoc stammen; es kann auch Glycerinphosphat-Oxidase sein, die von Bakterien, die dem Stamm Pediococcus angehören (ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 72892/1978) produziert wird, ein Enzym, d,r;S aus der Kultur von Glycerinphosphat-Oxidase produzier;nden Bakterien erhalten wird, die zum Stanm Aerococcus gehören (Aerococcus viridans IFO 12219 und IFO 12317, ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 15746/1980) und auf dem Markt erhältliche Enzyme.The glycerol phosphate oxidase used for this determination process can be any, as long as it plays the role of a catalyst in the reaction for the formation of dihydroxyacetone phosphate and hydrogen peroxide from glycerol-3-phosphate and oxygen, and originates, for example, from aen strains Streptococcus, Lactobacillus or Leuconostoc; it can also be glycerol phosphate oxidase of bacteria that the strain Pediococcus belong is produced (. 72892/1978 Unexamined JA Patent Application No.), an enzyme, d, r; S from the culture of glycerol phosphate oxidase produzier; ligand bacteria belonging to the Aerococcus Stanm (Aerococcus viridans IFO 12219 and IFO 12317, unexamined JA patent application No. 15746/1980) and enzymes available on the market.
Bei einem anderen enzymatischen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin wird Glycerinkinase auf Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie ATP, einwirken gelassen; man erhält Glycerin-3-phosphat und ADP. Dann wird Glycerinphosphat-Dehydrogenase auf dieses Glycerin-3-phosphat einwirken gelasser in Gegenwart von Nikotin-Ädenin-Dinucleotid (NAD) zur Bildung von Dihydroxyaceton - ' · und NADH. Dieses NADH wird dann quantitativ bestimmt und daraus wird die Menge an Glycerin berechnet. Bei der quantitativen Bestimmung des NADH wird im allgemeinen die Absorption beiAnother enzymatic method for the quantitative determination of glycerin uses glycerin kinase for glycerin in Allowed to act in the presence of a phosphate donor such as ATP; glycerol-3-phosphate and ADP are obtained. Then glycerol phosphate dehydrogenase becomes this glycerol-3-phosphate is allowed to act in the presence of nicotine adenine dinucleotide (NAD) to form dihydroxyacetone - '· and NADH. This NADH is then quantified and the amount of glycerol is calculated from this. With the quantitative Determination of the NADH will generally determine the absorption
direkt °^r
etwa 340 nm/gemessen / nach Entwickeln einer Farbe mit einem
wasserlöslichen Tetrazolium-Salz, wie 3-(4,5-Dimethyl)-2-thiazolyl-2H-tetrazolium-bromid,
2-(p-Jodphenyl)-3- (p-Nitrophenyl) -S-phenyl-^H-tetrazolium-chlorid, 3,3 '- (3,'3 '-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis/2-(p-nitrophenyl-5-pheny1-2H-tetrazoliumchloridy
(Nitrototrazoleumblau) oder 2,6-Dichlorphenol-indophenol
in Gegenwart von Diaphcrase oder Phenazinmethosulfat, wobei die Farbe bei Absorptionen gemessen
wird, die den speziellen Absorptionswellenlängen entsprechen.direct ° ^ r
about 340 nm / measured / after developing a color with a water-soluble tetrazolium salt such as 3- (4,5-dimethyl) -2-thiazolyl-2H-tetrazolium bromide, 2- (p-iodophenyl) -3- (p -Nitrophenyl) -S-phenyl- ^ H-tetrazolium chloride, 3,3 '- (3,' 3 '-Dimethoxy-4,4'-biphenylene) -bis / 2- (p-nitrophenyl-5-pheny1- 2H-tetrazoliumchloridy (nitrototrazoleum blue) or 2,6-dichlorophenol-indophenol in the presence of diaphcrase or phenazine methosulphate, the color being measured at absorptions that correspond to the specific absorption wavelengths.
Ein anderes als das erwähnte Verfahren zur quantitativen Bestimmung ist dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin-Dehydrogenase auf Glycerin in Gegenwart von NAD einwirken gelassen wird zur Bildung von Dihydroxyaceton und NAD!' und daß diesesA different method than mentioned for quantitative determination is characterized in that glycerol dehydrogenase is allowed to act on glycerol in the presence of NAD will lead to the formation of dihydroxyacetone and NAD! ' and that this
-KJ-NADII quantitativ bestimmt wird.-KJ-NADII is quantified.
Auch ein anderes Verfahren ist geeignet, in dem Glycerinkinase auf Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie Ai1P, einwirken gelassen wird zur Bildung von Glycerinphosphat und ATP, dann Pyruvatkinase auf dieses ATP in Gegenwart von Phosphorenolpyruvat einwirken gelassen wird zur Bildung/Brenztraubensäure und ADP, wobei diese Brenztraubensäure quantitativ bestimmt wird. Zur quantitativen Bestimmung dieser Brenztraubensäure kann man ein Verfahren verwenden, in dem ein Hydrazin, wie 2,4-Dinitrophenylhydrazin, auf die Brenztraubensäure einwirkt zur Bildung einer Farbe, deren Absorption bei einer Wellenlänge von etwa 440 nin gemessen wird. In einem anderen Verfahren wird Laktat-Dehydrogenase auf die Brenztraubensäure in Gegenwart von NADH einwirken gelassen zur Bildung von NAD und Milchsäure, die verminderte Menge an NAD im Reaktionssystem wird durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm bestimmt. Man kann aber auch Pyruvat-Oxidase auf die Brenztraubensäure einwirken lassen und cie Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an Wasserstoffperoxid im Reaktionssystem durch die elektrische Veränderung messen oder die Brenztraubensäure spektrophotometrisch unter Verwendung eines Indikators für Wasserstoffperoxid bestimmen.Another method is also suitable in which glycerol kinase is allowed to act on glycerol in the presence of a phosphate donor, such as Ai 1 P, to form glycerol phosphate and ATP, then pyruvate kinase is allowed to act on this ATP in the presence of phosphorenolpyruvate to form / pyruvic acid and ADP, this pyruvic acid being quantified. For the quantitative determination of this pyruvic acid, one can use a method in which a hydrazine such as 2,4-dinitrophenylhydrazine acts on the pyruvic acid to form a color, the absorption of which is measured at a wavelength of about 440 nin. In another method, lactate dehydrogenase is allowed to act on pyruvic acid in the presence of NADH to form NAD and lactic acid, and the decreased amount of NAD in the reaction system is determined by measuring the absorption at a wavelength of about 340 nm. But you can also let pyruvate oxidase act on the pyruvic acid and measure the amount of consumed oxygen or hydrogen peroxide in the reaction system through the electrical change or determine the pyruvic acid spectrophotometrically using an indicator for hydrogen peroxide.
Ein anderes als die oben erwähnten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin ist dadurch gekennzeichnet, daß man Glycerin-Oxidase auf Glycerin einwirken läßt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an Wasserstoffperoxid oder an im Reakt.-onssystem gebildetem Glycerinaldehyd bestimmt. A different method than the above-mentioned quantitative method Determination of glycerol is characterized in that glycerol oxidase is allowed to act on glycerol and the The amount of oxygen consumed or of hydrogen peroxide or of glyceraldehyde formed in the reaction system is determined.
was. die Enzyme und Reagenzien betrifft, so ist es einfach und zweckmäßig, die im Handel erhältlichen Präparate zu verwenden und die einzusetzenden Mengen entsprechend zu wählen. Außerdem kann man, wenn es notwendig ist, ein oberflächenaktives Mittel oder einen Stabilisator verwenden.What. As for enzymes and reagents, it's simple and convenient to use the commercially available preparations and to choose the quantities to be used accordingly. You can also use a surfactant if necessary Use agent or stabilizer.
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
Als Flüssigkeit, die im erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden soll, ist jede Probe geeignet, solange sie Phosphatidyl-glycerin enthält, z.B. CörperflüssigkeIten, wie Proben von Fruchtwasser.As a liquid that is examined in the method according to the invention any sample is suitable as long as it contains phosphatidyl glycerine, e.g. body fluids such as Samples of amniotic fluid.
Wird amniotische Flüssigkeit als zu untersucht nde Flüssigkeit verwendet, so wird si& vorzugsweise aus einem Phosphatidyl-glycerin enthaltenden/ entnommen;beisDielsweise können 5-6 ml Fruchtwasser mit 15-18 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1 extrahiert werden; die Chloroformphase wird durch Zentrifugieren bei 2000 UpM gesammelt und unter Stickstoff bis zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise erhält man das Gesamtlipid, das in einer.bestimmten Menge einer Iprozentigen Lösung von Alkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100) gelöstAmniotic fluid is used as the fluid to be studied used, si & is preferably made from a phosphatidyl glycerine containing / removed; for example, 5-6 ml of amniotic fluid can be mixed with 15-18 ml of chloroform / methanol in the ratio 2: 1 can be extracted; the chloroform phase is collected by centrifugation at 2000 rpm and under nitrogen until evaporated to dryness. This is how you get that Total lipid, which in a certain amount of one percent Solution of alkylaryl polyether alcohols (Triton X-100) dissolved
jede
wird* Auf diese Lösung kann/Enzymlösung, wie die der Phospholipase
D oder die der Glycerinphosphat-Oxidase oder der Glycerinkinase
für die quantitative Bestimmung, sowie andere Reagenzien gleichzeitig oder nacheinander einwirken.
Das Verhältnis von zu untersuchender Flüssigkeit zu Enzymlösung ist nicht besonders begrenzt, im allgemeinen werden etwa
0,1 bis 3 ml Enzymlösung für 0,01 bis 1 m. zu untersuchender Flüssigkeit verwendet. Die Bestimmung wird vorzugsweise bei
einer Temperatur von etwa 370C durchgeführt, die Reaktionszeit
kann beliebig sein, solange die Reaktion vollständig abgelaufen ist; sie beträgt im allgemeinen nicht unter 5 Minuten,
vorzugsweise nicht unter 10 Minuten. Als Reaktionsmedium kann Wasser oder eine schwach saure oder schwach alkalische Pufferlösung
als Lösungsmittel für jedes Reagenz dienen.every
* This solution can / enzyme solution, such as that of phospholipase D or that of glycerol phosphate oxidase or glycerol kinase for quantitative determination, as well as other reagents act simultaneously or one after the other. The ratio of the liquid to be examined to the enzyme solution is not particularly limited, in general, about 0.1 to 3 ml of the enzyme solution is used for 0.01 to 1 ml of the liquid to be examined. The determination is preferably carried out at a temperature of about 37 ° C., the reaction time can be as long as the reaction is complete; it is generally not less than 5 minutes, preferably not less than 10 minutes. The reaction medium used can be water or a weakly acidic or weakly alkaline buffer solution as a solvent for each reagent.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit kann direkt in sehr kurzer Zeit durchgeführt werden, man kann so geringe Konzentrationen an Phosphatidyl-glycerin wie 2,0 η Mol, d.h. Phosphatidyl-glycerin in einer Menge von 0,03 mg/dl in einer Fruchtwasserprobe von 5 bis 6 ml bestimmen. Das bedeutet, daß die Menge an Phosphatidylglycerin extrem niedrig ist, verglichen mit einem Wert von 0,2 mg/1, der als kritischer Wert für das Auftreten von RDSThe method according to the invention for quantitative determination of phosphatidyl-glycerin in the liquid to be examined can be carried out directly in a very short time, man can contain concentrations of phosphatidyl-glycerin as low as 2.0 η mol, i.e. phosphatidyl-glycerin in one Determine the amount of 0.03 mg / dl in an amniotic fluid sample of 5 to 6 ml. That means the amount of phosphatidylglycerin is extremely low compared to a value of 0.2 mg / 1, which is the critical value for the occurrence of IBS
BAD ORfGlNAtBAD ORfGlNAt
-Yi--Yi-
- 4- - 4-
angeschen wird. Außordem sind keine- komplizierten Maßnahmen notwendig, das Verfahren kann bei normaler Temperatur durchgeführt werden.is scared at. Extraordinary measures are not complicated necessary, the procedure can be carried out at normal temperature.
Die Aktivität der Phospholipase D und die Aktivität der Glycerinphosphat-Oxidase und der Glycer; nkinase können wie folgt bestimmt werden:The activity of phospholipase D and the activity of glycerol phosphate oxidase and the glycer; nkinase can be determined as follows:
(a) Aktivität der Phospholipase D(a) Phospholipase D activity
0,1 ml einer 4prozentigen Lösung von Phosphatidyl-äthanolamin aus Eidotter werden mit 0,8 ml 0,05 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 7,5, 0,3 ml einer Iprozentigen Lösung von Alkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100), 0,3 ml Wasser und 0,2 ml einer wässrigen,0,01 m Calciumchloridlösung versetzt und vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten ultrabeschallt, dann mit 0,2 ml Äthyläther und 0,1 ml Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 370C reagieren gelassen, dann mit 0,3 ml 20prozentiger Trichloressxgsaure zur Unterbrechung der Reaktion versetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wird 2 Mal mit je 4 ml Äthyläther gewaschen. 1 ml der wässrigen Phase wird mit 0,5 ml 0,2 η citratpuffer, pH 5,0, versetzt, dann werden 0,1 ml einer 2prozentigen wässrigen Zinnchlorid-Lösung und 2 ml einer 2prozentigen Ninhydrin-Lösung zugegeben. Das Gemisch wird Minuten bei 1000C erhitzt, um das Äthanolamin zu extrahieren, dessen Farbreaktion mit Ninhydrin bei einer Absorption OD = 570 πιμ gemessen wird. Die Aktivität des Enzyms, das 1 μg Äthanolamin je Minute freisetzt, ist als eine Einheit definiert.0.1 ml of a 4 percent solution of phosphatidylethanolamine from egg yolk are mixed with 0.8 ml of 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 0.3 ml of a 1 percent solution of alkylaryl polyether alcohols (Triton X-100), 0, 3 ml of water and 0.2 ml of an aqueous, 0.01 M calcium chloride solution are added and mixed. The mixture is sonicated for 10 minutes, then 0.2 ml of ethyl ether and 0.1 ml of enzyme solution are added. The mixture is for 20 minutes at 37 0 C allowed to react, then treated with 0.3 ml meant a 20 percent Trichloressxgsaure to interrupt the reaction. The reaction liquid is washed twice with 4 ml of ethyl ether each time. 1 ml of the aqueous phase is mixed with 0.5 ml of 0.2% citrate buffer, pH 5.0, then 0.1 ml of a 2% aqueous tin chloride solution and 2 ml of a 2% ninhydrin solution are added. The mixture is heated at 100 0 C minutes to extract the ethanolamine, the color reaction is measured with ninhydrin at an absorbance OD 570 = πιμ. The activity of the enzyme that releases 1 μg of ethanolamine per minute is defined as one unit.
(b) Aktivität der Glycerinkinase(b) Glycerol kinase activity
Aus folgenden Reagenzien wird ein Reaktionsgemisch hergestellt: A reaction mixture is prepared from the following reagents:
0,2 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 9,0 0,4 ml0.2 M tris-hydrochloric acid buffer, pH 9.0 0.4 ml
0,1 m Glycerin 0,05 ml0.1 m glycerine 0.05 ml
10 mMol ATP 0,1 ml10 mmol ATP 0.1 ml
10 mMol MgCl2 0,1 ml10 mmol MgCl 2 0.1 ml
Nitrotetrazolium-Blau (0,25%ig) 0,1 mlNitrotetrazolium Blue (0.25%) 0.1 ml
Rinder-Serumalbumin dprozentig) 0,14 mlBovine serum albumin d percent) 0.14 ml
10 mMol NAD 0,1 ml10 mmol NAD 0.1 ml
BAD ORIGiNALORIGINAL BATHROOM
Phenazin-methosulfat (0,05%ig) 0,01 ml Glycerinphosphat-Dehydrogenase (hergestellt von Boehringer & Sohn AG, 2 mg/ml, 65 U/ml) 5 μΐPhenazine methosulfate (0.05%) 0.01 ml Glycerol phosphate dehydrogenase (manufactured by Boehringer & Sohn AG, 2 mg / ml, 65 U / ml) 5 μΐ
Ein ml dieses Reaktionsgemisches wird während 5 Minuten bei 370C vorinkubiert und mit 50 μΐ einer Glycerinkinase-Lösung versetzt (10 mMol Phosphatpuffer, der 10 mMol Glycerin enthält und entsprechend auf einen pH 7,5 verdünnt worden ist). Das Gemisch wird 10 Minuten bei 370C reagieren gelassen, dann wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 η Salzsäure unterbrocher. Die entwickelte Farbe wird bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen (A 550 nm). Eine Einheit Glycerinkinase ist definiert als die Aktivität, die 1 μΜοΙ Glycerin-3-phosphat je Minute produziert. Die Aktivität wird nach folgender Gleichung berechnet :One ml of this reaction mixture is pre-incubated for 5 minutes at 37 0 C with 50 μΐ a glycerol kinase solution (containing 10 mM phosphate buffer containing 10 mmol of glycerol and has been suitably diluted to pH 7.5). The mixture is allowed to react for 10 minutes at 37 ° C., then the reaction is interrupted by adding 0.1 η hydrochloric acid. The developed color is measured at a wavelength of 550 nm (A 550 nm). One unit of glycerol kinase is defined as the activity that produces 1 μΜοΙ glycerol-3-phosphate per minute. The activity is calculated according to the following equation:
χ 1 ψ χ 1 ψ
U/ml = χ 1 ψ χ Verdünnungs. U / ml = χ 1 ψ χ dilution .
0,05 χ 10 verhältnis0.05 χ 10 ratio
(c) Aktivität der Glycerinphosphat-Oxidase 1 ml das folgenden Reaktionsgemisches wird in einem kleinen Proberöhrchen 3 Minuten bei 370C vorinkubiert:(c) activity of the glycerol phosphate oxidase 1 ml of the following reaction mixture is preincubated in a small test tube for 3 minutes at 37 0 C:
0,2 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 8,0, 0,2 ml0.2 M Tris-hydrochloric acid buffer, pH 8.0, 0.2 ml
Peroxidase (0,5 mg/ml , 45 U/ml) 0,1 mlPeroxidase (0.5 mg / ml, 45 U / ml) 0.1 ml
0,3 g/100 ml 4-Aminoantipyrin 0,1 ml0.3 g / 100 ml 4-aminoantipyrine 0.1 ml
0,1 m DL-Glycerin-3-phosphat 0,1 ml0.1 m DL-glycerol-3-phosphate 0.1 ml
0,2vol.%iges N,N-Dimethylanilin 0,2 ml0.2% by volume N, N-dimethylaniline 0.2 ml
destilliertes Wasser 0,3 mldistilled water 0.3 ml
Dieses Gemisch wird mit 20 μΐ Enzymlösung versetzt und 10 Minuten reagieren gelassen. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 2,0 ml 0,25 g/100 ml Natrium-laurylbenzol-sulfonat unterbrochen, die Absorption des Produkts wird bei einer Wellenlänge von 565 nm gemessen.This mixture is mixed with 20 μΐ enzyme solution and 10 Minutes left to react. The reaction is then interrupted by adding 2.0 ml of 0.25 g / 100 ml of sodium laurylbenzene sulfonate, the absorbance of the product is measured at a wavelength of 565 nm.
Die Aktivität des Enzyms wird nach folgender Gleichung berechnet; The activity of the enzyme is calculated using the following equation;
J.ktivität des Enzyms (D/ml) = ^- x {Ά- J. Activity of the enzyme (D / ml) = ^ - x {Ά-
6 , O 1 °6, O 1 °
wobei Aa die Absorption während 10 Minuten bei einer Wellenlänge von 56 5 nm ist.where Aa is the absorption for 10 minutes at one wavelength of 56 is 5 nm.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.
Erstellen einer EichkurveCreation of a calibration curve
Folgende Lösungen werden hergestellt:The following solutions are produced:
(1) Phosphatidyl-glycerin enthaltende Lösung(1) Solution containing phosphatidyl glycerol
Es wird eine Lösung hergestellt, die 1,0 μΜοΙ/ml Phosphatidyl-glycerin und 1,0% Alkylarylpolyätheralkohole (Triton X-100) enthäLt.(Der Gehalt an Phosphatidyl-glycerin wird durch quantitat .ve Bestimmung des Phosphats festgestellt).A solution is made that contains 1.0 μΜοΙ / ml of phosphatidyl glycerol and 1.0% alkylaryl polyether alcohols (Triton X-100). (The content of phosphatidyl glycerine is determined by quantitat .ve determination of the phosphate determined).
(2) Ci -Ionen enthalten es Pufferreaktionsmedium(2) Ci ions contain buffer reaction medium
0,1 Mol Tris-HC:-Puffer (pH 8) 1 Mol CaCl2
destilliertes Wasser0.1 mol Tris-HC: buffer (pH 8) 1 mol CaCl 2
distilled water
10 ml10 ml
(3) Phosph ilipase D enthaltende Lösung(3) Solution containing phosph ilipase D
ml ■ml ■
Es werden 1 0/ einer Lösuig (pH 8) verwendet,die aus 121,1 mg Tr is-Puffer bes.eht und 3 5 U/.nl(0,6 mg/ml) Phospholipase D, 50,0 rg Rinder-tarumalbumin, ( , 5 ml einer 20prozentigen Lösung von J.lkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100) und Wasser enthält.10% of a solution (pH 8) is used, which consists of 121.1 mg of Tris buffer bes.eht and 3 5 U / .nl (0.6 mg / ml) phospholipase D, 50.0 rg bovine tarum albumin, (, 5 ml of a 20 percent solution of J.lkylarylpolyether alcohols (Triton X-100) and water.
(4) 60 mMol EDTA(4) 60 mmol EDTA
(5) Eine Lösung, die 40 mMol MgCl2 und 160 mMol ATP enthält Dazu werden 1,0 ml 0,2 Mol ATP, 0,10 ml 0,5 Mol MgCl2 und 0,15 ml destilliertes Wasser vermischt, so daß 1,25 ml der Lösung erhalten werden.(5) A solution containing 40 mmol of MgCl 2 and 160 mmol of ATP. For this, 1.0 ml of 0.2 mol of ATP, 0.10 ml of 0.5 mol of MgCl 2 and 0.15 ml of distilled water are mixed so that 1 , 25 ml of the solution can be obtained.
BAD . BATHROOM .
- YS- - YS-
. 41. . 41.
(6) Glycerinkinase-Lösun'j(6) Glycerine kinase solution
Es wird eine Lösung verwendet, die in 10 mMol Tris-HCl-Puffer 2 mg/ml Glycerinkinase enthält (pH 8).A solution is used which is in 10 mmol Tris-HCl buffer Contains 2 mg / ml glycerine kinase (pH 8).
(7) Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung(7) glycerol phosphate oxidase solution
10 ml einer Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung, die aus 10 mg Rinder-Serumalbumin besteht, das 3 mg/ml Glycerinphosphat-Oxidase, 560,75 mg Ammoniumsulfat, 1,0 ml nines 0,1 m Tris-Salzsäurepuffer,pH 8,und 9 ml Wasser enthält, werden hergestellt.10 ml of a glycerol phosphate oxidase solution consisting of 10 mg Bovine serum albumin, which contains 3 mg / ml glycerol phosphate oxidase, 560.75 mg ammonium sulfate, 1.0 ml of nine 0.1 M tris-hydrochloric acid buffer, pH 8, and contains 9 ml of water, are prepared.
(8) Flüssiges, Glycerin^hosphat-Oxidase enthaltendes Indikatorgemisch (8) Liquid indicator mixture containing glycerol phosphate oxidase
4-Aminoantipyrin4-aminoantipyrine
wässrige Phenollösung (10 mg/ml)aqueous phenol solution (10 mg / ml)
%ige
1,25 / Alkylarylpolyätheralkohol-Lösung% ige
1.25 / alkylaryl polyether alcohol solution
(Triton X-100)(Triton X-100)
0,5 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0.5 m Tris-HCl buffer, pH 8,
Peroxidase (90 U/ml in destilliertem Wasser) 0,8 Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung (3 mg/ml)Peroxidase (90 U / ml in distilled water) 0.8 glycerol phosphate oxidase solution (3 mg / ml)
destilliertes Wasserdistilled water
20,0 ml20.0 ml
Zu je 0 bis 0,1t?ml der Phosphatidyl-glycerin enthalte nden Lösung wird Iprozentige Alkylarylpolyätheralkohol-Lösung (Triton X-100) zugegeben, so daß die Gesamtmenge 0,1 ml beträgt. Dieses Gemisch wird mit 0,1 ml Ca -Puffer versetzt und 5 Minuten auf 37°C erhitzt. Es werden 0,05 ml Phospholipase D-Lösung zugegeben, das Gemisch wird 10 Minuten bei 370C reagieren gelassen. Nach der Reaktion werden 0,04 ml 60 mMol EDTA und 0,075 ml einer 0,04 m Magnesiumchlorid-· Lösung, die 160 mMol ATP und 0,03 ml der Glycerinkinase-Lösurg enthält,zu9e^eken· Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Nach der Reaktion wird 1,0 m., de; Indikatorgemisches zugegeben, das Gemisch wird 20 Minuten bei 370C reagieren gelassen, dann wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 500 nm (OD 500) gemessen.1 percent alkylaryl polyether alcohol solution (Triton X-100) is added to every 0 to 0.1 ml of the solution containing phosphatidyl glycerol, so that the total amount is 0.1 ml. This mixture is mixed with 0.1 ml Ca buffer and heated to 37 ° C. for 5 minutes. 0.05 ml of phospholipase D solution are added, and the mixture is allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes. After the reaction, 0.04 ml of 60 mM EDTA and 0.075 ml of a 0.04 M magnesium chloride · solution containing 160 mM ATP, and 0.03 ml of the glycerol kinase contains Lösurg to 9 e ^ e k · s The mixture is Left to react for 10 minutes at 37 ° C. After the reaction, 1.0 m., De; Indicator mixture is added, the mixture is left to react for 20 minutes at 37 ° C., then the absorption is measured at a wavelength of 500 nm (OD 500).
- ver - ' -Μ-- ver - '-Μ-
Die Ergebnisse sind in Fig.1 angegeben. Eine zufriedenstellende lineare Beziehung erhält man im Bereich von 0,005 bis 0,1 ml Phosphatidyl-glycerin enthaltender Lösung (Phosphatidyl-glyceringehalt von I- bis 100 nMol) .The results are given in Figure 1. A satisfactory linear relation is obtained in the range of 0.005 to 0.1 ml phosphatidyl-glycerol-containing solution (phosphatidyl glycerol content of I to 100 nmol).
Man erhält eine lineare Beziehung, wenn der Phosphatidyl-glyceringehalt größer als 2 nMol ist, die Empfindlichkeit ist ausgeprägt.A linear relationship is obtained if the phosphatidyl glycerol content is greater than 2 nmoles, the sensitivity is pronounced.
5 bis 6 ml einer Fruchtwasser-Probe werden in 18 ml Chloroforiti/M-ethanol im Verhältnis 2:1 gelöst und bei 2000UpM zentrifugiert. Es bilden sich 3 Phasen,, wovon die Chloroformphase unter Stickstoffschutz zur Trockene eingedampft wird. Man erhält die Gesamtlipide, die in 0,1 ml Chloroform gelöst und auf eine Kieselgel-Säule (0,3 g) aufgegeben werden. Durch Elution mit 10 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 19:1 erhält man das neutrale Fett, die Phosphatidyl-glycerin enthaltende Fraktion wird durch Elution mit 10 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1 gewonnen. Das Lösungsmittel wird entfernt, der Rückstand wird in 0,1 ml einer Iprozentigen Alkylarylpolyätheralkohol-LÖsung (Triton X-100) gelöst und mit 0,1 ml des Ca -Puffers versetzt. Das Gemisch wird während 5 Minuten auf 370C vorgewärmt, dann mit 0,05 ml der Phospholipase D-Lösung versetzt und 10 Minuten bei 370C reagieren gelassen. Nach der Reaktion werden erst 0,04 ml einer 60 iriMol EDTA enthaltenden Lösung, dann 0,075 ml einer 0,04 m MgCl2-Lösung, die 160 mMol ATP und 0,03 ml der Glycerinkonase-Lösung enthält, zugegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 370C reagieren gelassen, dann mit 1,0 ml dos flüssigen Indikatorgemisches versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 370C reagieren gelassen. Die Absorption wird bei einer Wellenlänge von 500 nm gemessen, der Gehalt an Phosphatidyl-glycerin (mg/dl) in den Fruchtwasser-Proben wird aus der Eichkurve erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig.2 angegeben, wobei X die Todesfälle, O das Auftreten von RDS,^ das Auftreten von milden RDS-Fällen und Φ kein RDS bedeuten.5 to 6 ml of an amniotic fluid sample are dissolved in 18 ml chloroforiti / M-ethanol in a ratio of 2: 1 and centrifuged at 2000 rpm. 3 phases are formed, of which the chloroform phase is evaporated to dryness under nitrogen protection. The total lipids are obtained, which are dissolved in 0.1 ml of chloroform and applied to a silica gel column (0.3 g). The neutral fat is obtained by elution with 10 ml of chloroform / methanol in a ratio of 19: 1, the fraction containing phosphatidylglycerol is obtained by elution with 10 ml of chloroform / methanol in a ratio of 2: 1. The solvent is removed, the residue is dissolved in 0.1 ml of a 1 percent alkylaryl polyether alcohol solution (Triton X-100), and 0.1 ml of the Ca buffer is added. The mixture is preheated to 37 ° C. for 5 minutes, then 0.05 ml of the phospholipase D solution is added and the mixture is left to react at 37 ° C. for 10 minutes. After the reaction, first 0.04 ml of a solution containing 60 mmol of EDTA, then 0.075 ml of a 0.04 M MgCl 2 solution containing 160 mmol of ATP and 0.03 ml of the glycerol conase solution are added. The mixture is left to react for 10 minutes at 37 ° C., then 1.0 ml of the liquid indicator mixture is added. The mixture is left to react at 37 ° C. for 20 minutes. The absorption is measured at a wavelength of 500 nm, the content of phosphatidyl glycerol (mg / dl) in the amniotic fluid samples is obtained from the calibration curve. The results are given in FIG. 2, where X the deaths, O the occurrence of IBS, ^ the occurrence of mild IBS cases and Φ no IBS.
.- -■ - ■-. _ ::/ 3H6090.- - ■ - ■ -. _ :: / 3H6090
- rf-- rf-
Beispiel 3 * 43 ·Example 3 * 43
Aus folgenden Bestandteilen wird ein ReaktLonsgemisch zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-< lycerin hergestellt:A reaction mixture is made from the following components quantitative determination of phosphatidyl- <lycerin produced:
0,2 Mol Tris-HCl-Pi ffer, pH 7,5 0,2 ml0.2 mol Tris-HCl-Pfer, pH 7.5 0.2 ml
10 mMol CaCl2 10 mmoles of CaCl 2
10 mMol MgCl0 10 mmoles of MgCl 0
10*igj§lkylarylpolyätheralkohole (Triton X-100)10 * ig j§lkylarylpolyätheralkohole (Triton X-100)
10 mMol ATP10 mmoles of ATP
Lösung, enthaltend 20 U/ml Phospholipase D, 5 U/ml Glycerinkinase und 50 U/ml Glycerinphosphat-Oxidase Solution containing 20 U / ml phospholipase D, 5 U / ml glycerol kinase and 50 U / ml glycerol phosphate oxidase
45 U/ml Peroxidase45 U / ml peroxidase
%iges
0,3 / 4-Aminoantipyr-in% iges
0.3 / 4-aminoantipyr-in
%iges
0,3 j 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-h/droxyäthyl)anilin 0,2 ml% iges
0.3 j 3-methyl-N-ethyl-N- (ß-h / hydroxyethyl) aniline 0.2 ml
destilliertes Wasserdistilled water
mit
2,0 ml dieses Gemisches werden/50 μΐ dor zu untersuchenden
Flüssigkeit, die verschiedene Mengen an Phosphatidyl-glycerin (von 20 bis 100 nMol enthält) versetzt. Das Gemisch wird 15
Minuten bei 370C reagieren gelassen, dann wird die Absorption
bei einer Wellenlänge von 550 nm (O0C50) gemessen. Die Ergebnisse
sind in Fig.3 dargestellt, man erhält eine Eichkurve, die eine zufriedenstellende lineare Beziehung in bezug auf
den Gehalt an Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit zeigt.with
2.0 ml of this mixture are added / 50 μΐ dor the liquid to be examined, which contains various amounts of phosphatidyl glycerol (from 20 to 100 nmoles). The mixture is left to react for 15 minutes at 37 ° C., then the absorption is measured at a wavelength of 550 nm ( 0 ° C. 50 ). The results are shown in FIG. 3, and a calibration curve is obtained which shows a satisfactory linear relationship with regard to the content of phosphatidyl glycerol in the liquid to be examined.
BAD 0R!6!NAtBAD 0R! 6! NAt
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| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: JUNG, E., DIPL.-CHEM. DR.PHIL. SCHIRDEWAHN, J., DI |
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8125 | Change of the main classification |
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| D2 | Grant after examination | ||
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