DE3243091A1

DE3243091A1 - Process for the preparation of (R)-4-hydroxy-beta-ionone by microbiological conversion of beta -ionone

Info

Publication number: DE3243091A1
Application number: DE19823243091
Authority: DE
Inventors: Wolf-Rainer Dr. Abraham; Klaus Prof.Dr. 3300 Braunschweig Kieslich; Burkhard Dr. 3308 Königslutter Stumpf
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Priority date: 1982-11-22
Filing date: 1982-11-22
Publication date: 1984-05-24
Also published as: JPS59175892A

Abstract

The invention relates to a process for the preparation of (R)-4- hydroxy- beta -ionone by microbiological conversion of beta -ionone.

Description

Verfahren zur Herstellung von (R)-4-Hydroxy-ß-ionon durchProcess for the preparation of (R) -4-hydroxy-ß-ionone by

mikrobiologische Umwandlung von B-Ionon lonone sind wichtige Komponenten in essentiellen Ölen1>.Microbiological Conversion of B-Ionon Ionones are important components in essential oils1>.

Gemische oxidierter ß-Ionone besitzen in bestimmter Zusammensetzung die Eigenschaften von Tabakaroma2). Derartige Oxidationsprodukte wurden durch mikrobiologische Umwandlungen von ß-Ionon erhalten2-5).Mixtures of oxidized ß-ionones have a certain composition the properties of tobacco flavor2). Such oxidation products have been identified by microbiological Conversions of ß-ionone obtained2-5).

Die bisher verwendeten Mikroorganismen Lasiodiplodia theobromae ATCC 109362-3) greifen 13-lonon in 2-, 3- und 4-Position und an der Seitenkette an, während Aspergillus niger ITS 1914-6) bevorzugt zu 2- und 4-oxigenierten Produkten führt.The previously used microorganisms Lasiodiplodia theobromae ATCC 109362-3) attack 13-ionon in the 2-, 3- and 4-position and on the side chain, while Aspergillus niger ITS 1914-6) preferably leads to 2- and 4-oxygenated products.

Bei dieser Bildung vielfältiger Produktgemische entsteht das (R)-4-Hydroxyprodukt in maximal 45 % Ausbeute4) zusammen mit 2ß-Hydroxy-ß-ionon.This formation of diverse product mixtures produces the (R) -4-hydroxy product in a maximum of 45% yield4) together with 2ß-hydroxy-ß-ionone.

Da Jedoch Aromen optimal eine konstante oder kontrolliert variiebare Zusammensetzung besitzen sollten was bei der vorliegenden Bildung von in ihrer Zusammensetzung schwankenden Gemischen nicht gewährleistet werden kann5 ist die gezielte Herstellung der Hauptkomponente fUr eine mbgliche Aufbesserung der Gemischzusammensetzung technisch wertvoll.However, since flavors are optimally constant or variable in a controlled manner Composition should possess what in the present formation of in their composition Fluctuating mixtures cannot be guaranteed5 is targeted production the main component for a possible improvement of the mixture composition technically valuable.

Erfindungsgemäß wurde demgegenllber eine weitgehende stereospezifische Bildung von (R)-4-Hydroxy-ß-Ionon bei der Fermentation von ß-Ionon mit Gongronella butleri, beispielsweise dem Stamm CBS 157.25 mit nur sehr geringer Nebenproduktbildung gefunden, wobei Ausbeuten von 39 % an Reinprodukt isoliert werden konnten.In contrast, according to the invention, a largely stereospecific Formation of (R) -4-hydroxy-ß-ionone during the fermentation of ß-ionone with Gongronella butleri, for example the strain CBS 157.25 with only very little by-product formation found, yields of 39% pure product could be isolated.

Die Fermentationen entsprechen dem Stand der Technik und werden in dem folgenden Ausführungsbeispiel eingehend beschreiben.The fermentations correspond to the state of the art and are in describe the following embodiment in detail.

Neben dem speziell angegebenen Stamm ist es dem Fachmann routinemäßig mUglich (insbesondere anhand der in Beispiel 1 beschriebenen Farbreaktion des (R)-4-Hydroxy-ß-ionons) weitere brauchbare Stämme von Gongronella butleri zu ermitteln.In addition to the specially specified strain, it is routine for the person skilled in the art possible (especially on the basis of the color reaction of the (R) -4-hydroxy-ß-ionone described in Example 1) identify further usable strains of Gongronella butleri.

Vergleich der Ausbeuten von Mikami et al. (Literaturstelle 4) und Erfindung Mikami et al. 4) Erfindung 4-Hydroxy-ß-ionon bezogen auf eingesetztes ß-Ionon (% auf Gew.-Basis) 45 39 2-Hydroxy-ß-ionon, bezogen auf eingesetztes X-Ionon (% auf Gew.-Basis) 30 2 Mikami et al.4) Erfindung 4-Hydroxy-ß-ionon, bezogen auf Gesamtmenge der isolierten ß-Ionone (% auf Gew.-Basis) 45 86 Verhältnis 4-Hydroxy- zu 2-Hydroxy-ß-ionon 1,5 16,7 Es ist darauf zu achten, daß bei der Umsetzung keine Verluste an ß-Ionon durch Ausblasung oder Abbau eintreten.Comparison of the yields by Mikami et al. (Reference 4) and Invention Mikami et al. 4) Invention of 4-hydroxy-ß-ionone based on the used ß-ionone (% based on weight) 45 39 2-hydroxy-ß-ionone, based on the X-ionone used (% on a weight basis) 30 2 Mikami et al.4) Invention of 4-hydroxy-ß-ionone, based on the total amount of isolated ß-ionones (% on weight basis) 45 86 ratio 4-Hydroxy- to 2-Hydroxy-ß-ionone 1.5 16.7 It is important to ensure that during the implementation no losses of ß-ionon occur through blowing out or degradation.

Mikami et al. behandeln dieselbe Umsetzung in Appl. and Environm. Microbiol. 41 (1981), 610-617, und korrigieren die Zahlen auf 26,6 bzw. 18,4 % bei einer Wiedergewinnungsrate von 70,6 %. Diese Zahlen erscheinen realistischer.Mikami et al. treat the same implementation in Appl. and Environm. Microbiol. 41 (1981), 610-617, and correct the numbers to 26.6 and 18.4%, respectively a recovery rate of 70.6%. These numbers seem more realistic.

Der wichtigste Unterschied zwischen dem Stand der Technik und der Erfindung aber besteht in der gezielten Bildung von 4-Hydroxy-ß-ionon. Bei allen anderen Arbeiten wird auch 2-Hydroxy-ß-ionon in vergleichbaren Mengen gebildet.The main difference between the prior art and the However, the invention consists in the targeted formation of 4-hydroxy-ß-ionone. At all In other works, 2-hydroxy-ß-ionone is also formed in comparable quantities.

Beispiel 1 Umwandlung von ß-Ionon mit Gongronella butleri CBS 157.25 im 10 1 Fermenter 1) Kulturmedium 1 % Glucose 2 X Malzextrakt 0,3 X Hefeextrakt 1 % Universalpepton 2) Vorkultur Ein 3.000 ml Erlenmeyerkolben, der mit 500 ml Kulturmedium gefüllt war, wurde mit 5 Impfösen einer sngewachso- nen (7 Tage alten) Schrägagarkultur von Gongronella butleri CBS 157.25 beimpft und 86 h bei 27 0C unter SchUtteln im Dunkeln inkubiert. Da dieser Organismus in Submerskultur dazu neigt, die Kulturlösung nicht ho° mogen zu durchwachsen, sondern vielmehr unterschiedlich geformte "Mycelklumpen" auszubilden, wurden diese Kulturen mit Hilfe eines sterilisierbaren, magnetischen Schneidegerätes7) vor Übertragung in den Fermenter zerkleinert.Example 1 Conversion of β-ionone with Gongronella butleri CBS 157.25 in 10 1 fermenter 1) culture medium 1% glucose 2 X malt extract 0.3 X yeast extract 1% universal peptone 2) preculture A 3,000 ml Erlenmeyer flask filled with 500 ml culture medium was filled, was with 5 inoculation loops a sngewachso- nen (7 days old) agar slant culture of Gongronella butleri CBS 157.25 inoculated and 86 h at Incubated 27 0C with shaking in the dark. Since this organism is in submerged culture the culture solution tends not to grow through homogeneously, but rather differently to form shaped "mycelium lumps", these cultures were with the help of a sterilizable, magnetic cutting device7) before being transferred to the fermenter.

3) Fermentation Ein 10 1 Fermenter der Fa. Braun Melsungen wurde mit 10 1 Kulturmedium gefüllt und nach Sterilisation mit der Vorkultur beimpft.3) Fermentation A 10 1 fermenter from Braun Melsungen was with 10 1 culture medium filled and inoculated with the preculture after sterilization.

Anschließend wurde bei 27°C, einer Belüftung von 286 Nl/h und 100 RPM (BlattrUhrer) fermentiert. Nach 97 h Fermentation wurden 2 ml B-Ionen steril zugesetzt, und die Belüftung auf 572 Nl/h erhöht. Nachdem das Edukt vollständig verbraucht war, wurde die Fermentation nach 16 h beendet. Der pH-Wert wurde während der gesamten Fermentationszeit mit 15 % KOH und 15 % H3PO4 bei 6,5 gehalten. This was followed by an aeration of 286 Nl / h and 100 RPM (Blattruhrer) fermented. After 97 hours of fermentation, 2 ml of B ions became sterile added, and the aeration increased to 572 Nl / h. After the educt is completely was used up, the fermentation was ended after 16 h. The pH was during the total fermentation time was kept at 6.5 with 15% KOH and 15% H3PO4.

4) Analytik Der Verlauf der Umwandlung wurde dUnnschicht-chromatographisch verfolgt.4) Analysis The course of the conversion was determined by thin-layer chromatography tracked.

Dazu wurde 1 ml einer steril entnommenen Probe mit 200 µl Ethylacetat versetzt, 2 min. geschüttelt und 2 min. zentrifugiert. Vom Uberstand wurden 10 /ul auf HPTLC Fertigplatten, Kieselgel 60 (Merck) aufgetragen und 5 cm mit Dichlormethan/Aceton (95 + 5) entwickelt. For this purpose, 1 ml of a sterile sample was mixed with 200 μl of ethyl acetate added, shaken for 2 minutes and centrifuged for 2 minutes. From the supernatant 10 / ul applied to HPTLC ready-made plates, silica gel 60 (Merck) and applied 5 cm with dichloromethane / acetone (95 + 5) developed.

Anschließend wurde die Platte mit folgender Färbelösung besprüht: 0,6 ml Anisaldehyd 1,0 ml Schwefelsäure 50 ml Essigsäure Zur Sichtbarmachung der Flecken wurden 2 min. bei 100 0C inkubiert. The plate was then sprayed with the following staining solution: 0.6 ml anisaldehyde 1.0 ml sulfuric acid 50 ml acetic acid To make the Spots were incubated at 100 ° C. for 2 minutes.

5) Aufarbeitung des präparativen Ansatzes Mycel und Überstand wurden getrennt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt und an Si-60-FertigsSulen der Firma Merck der Korngröße 0,040-0,063 mm chromatographiert. Als Laufmittel wurden in einem Gradienten n-Hexan/Ethylacetat-Gemische mit dem Startverhältnis 19:1 und dem Endverhältnis 3:2 verwandt.5) Working up the preparative approach Mycelium and supernatant were separated and extracted with ethyl acetate. The combined organic phases were concentrated and on Si-60 prefabricated columns from Merck with a grain size of 0.040-0.063 mm chromatographed. The mobile phase used was n-hexane / ethyl acetate mixtures in a gradient related to the starting ratio 19: 1 and the ending ratio 3: 2.

Aus 2 ml ß-Ionon konnten 750 mg (R)-4-Hydroxy-ß-Ionon, 35 mg des entsprechenden Diketons, 25 mg 4-Oxo-7,8-dihydro-ß-ionon, 45 mg (S)-2-Hydroxy-ß-ionon, 14 mg 5,6-Epoxy-dihydro-ionon, 14 mg 5,6-Epoxy-dihydro-ionon und 4 mg 7,13-Epoxy-dihydro-ß-ionon gewonnen werden. From 2 ml ß-ionone 750 mg (R) -4-hydroxy-ß-ionone, 35 mg des corresponding diketones, 25 mg 4-oxo-7,8-dihydro-ß-ionone, 45 mg (S) -2-hydroxy-ß-ionone, 14 mg 5,6-epoxy-dihydro-ionone, 14 mg 5,6-epoxy-dihydro-ionone and 4 mg 7,13-epoxy-dihydro-β-ionone be won.

Literatur: 1) Y.R. Naves Rivista ltaliana 10 505 (1976) 2) V. Krasnobajew, D. Helmlinger Helv. Chem. Acta 65 1590 (1982) 3) V. Krasnobajew Euro. Patentanmeld. 12246 (1979) 4) X. Mikami, E. Watanabe, Y. Fukunaga, T. Kisaki Agr. Biol. Chem. 42 1075 (1978) 5) Y, Mikami, V. Fukunaga, T. Hieda, Y. Obi, T. Kisaki Agr. Biol. Chem. 45 331 (1981) 6) Y. Mikami, Y. Fukunaga, M. Arita, T. Kisaki Appl. a. Environm. Microbiol. 41 610 (1981) 7) B. Stumpf, L. Heuer G 82 16 356.1Literature: 1) Y.R. Naves Rivista ltaliana 10 505 (1976) 2) V. Krasnobajew, D. Helmlinger Helv. Chem. Acta 65 1590 (1982) 3) V. Krasnobajew Euro. Patent pending 12246 (1979) 4) X. Mikami, E. Watanabe, Y. Fukunaga, T. Kisaki Agr. Biol. Chem. 42 1075 (1978) 5) Y, Mikami, V. Fukunaga, T. Hieda, Y. Obi, T. Kisaki Agr. Biol. Chem. 45 331 (1981) 6) Y. Mikami, Y. Fukunaga, M. Arita, T. Kisaki Appl. a. Environm. Microbiol. 41 610 (1981) 7) B. Stumpf, L. Heuer G 82 16 356.1

Claims

PATENT CLAIMS 1. Process for the preparation of (R) -4-hydroxy-ß-ionone from ß-Ionon, which means that ß-Ionon with Gongronella butleri or its enzymes is fermented.

2. The method according to claim 1, characterized in that g 9 k e n n -z e i c h n e t that the strain CBS 157, 25 is used.