DE3104215A1

DE3104215A1 - Process for the preparation of alkaloids in controlled amount and controlled ratio of amounts by fermentation

Info

Publication number: DE3104215A1
Application number: DE19813104215
Authority: DE
Inventors: Miklós Dipl.-Chem. Ing. Budai; György Dr. Fekete; Sándor Dipl.-Chem. Ing. Dr. Görög; Bulcsu Dipl.-Pharm. Herényi; Geb. Cserey Pechany Eva Udvary Dr. Nagy; Géza Wack; Károly Dipl.-Pharm. Budapest Zalai
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1981-02-06
Filing date: 1981-02-06
Publication date: 1982-08-19
Also published as: DE3104215C2

Abstract

The invention relates to a process for the preparation of alkaloids in controlled amount and controlled ratio of amounts by fermentation of variant strains of Claviceps purpurea which, under saprophytic conditions, produce in particular ergocornine, alpha - and beta -ergocryptine, in which the fermentation is controlled by use of one or more compound(s) acting as precursor in the biosynthesis of isoleucine and/or one or more compound(s) stimulating, by biochemical control, the formation of isoleucine.

Description

Patentansprüche und Beschreibung zur Patentanmeldung betreffend Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden in geregelter Menge und geregeltes Mengenverhältnis durch Gärung Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden in geregelter Menge und geregeltem Mengenverhältnis durch Gärung beziehungsweise Fermentation von unter saprophytischen Bedingungen, vor allem Ergocornin 0k- und ß-Ergocryptin erzeugenden, Variantenstämmen von Claviceps purpurea.Claims and description of the patent application relating to methods for the production of alkaloids in regulated quantities and regulated proportions through fermentation Description The invention relates to a method for Production of alkaloids in a regulated quantity and a regulated proportion Fermentation or fermentation under saprophytic conditions, especially Variant strains of Claviceps purpurea which produce ergocornine 0k- and ß-ergocryptine.

Es ist bekannt, daß das Dihydroergotoxinmethansulfonat beziehungsweise Dihydroergotoxinäthansulfonat in der Medizin als Regler des zentralen Stoffwechsels sowie des zentralen und peripheren Kreislaufs verwendet wird. Diese Verbindungen erhöhen die Proteinsynthese des Zentralnervensystemes und hemmen die von den Brenzeatechinaminen angeregte beziehungsweise stimulierte Adenylzyklase. Ferner wirken sie schwach sedativ, hemmen die Reflextachykardie, verbessern die Gehirndurchblutung und senken den Blutdruck. In der Medizin werden sie vor allem zur Behandlung von Krankheiten, welche auf peripheren Kreislauf störungen oder Gehirnkreislaufstörungen beruhen, angewandt. It is known that the dihydroergotoxin methanesulfonate respectively Dihydroergotoxinethanesulfonate in medicine as a regulator of the central metabolism as well as the central and peripheral circulation. These connections increase the protein synthesis of the central nervous system and inhibit that of the brenzeatechinamines excited or stimulated adenyl cyclase. They also have a weakly sedative effect, inhibit reflex tachycardia, improve cerebral blood flow and lower blood pressure. In medicine they are mainly used to treat diseases that are peripheral Circulatory disorders or brain circulatory disorders are applied.

Das Dihydroergotoxin wird durch Hydrieren des Ergotoxines hergestellt. Das erhaltene Produkt ist ein Gemisch aus Dibydroergocristin, Dihydroergocornin und Dihydroergooryptin (ungarische Patentschrift 129 061). The dihydroergotoxin is produced by hydrogenating the ergotoxin. The product obtained is a mixture of dibydroergocristine and dihydroergocornine and dihydroergooryptine (Hungarian patent 129 061).

Das Dihydroergocryptin liegt in 2 verschiedenen Modifikationen («- und ß-Form) vor (Experientia 25 [1967J, 991) und nach neuesten Untersuchungen ist die pharmakologische Wirkung der beiden Formen nicht ganz identisch. Die d-Form erwies sich bei einem Empfängnisverhütungsversuch an Ratten als aktiver, während die ß-Form an enthirnten (decerebrierten) Katzen eine stärkere Vasopressorwirkung hatte (Experientia 33 [i977] 1 552). Aus diesem Grund ist in den Vorschriften für dihydroergotoxinhaltige Präparate das Mengenverhältnis von o- und ß-Dihydroergocryptin festgelegt.The dihydroergocryptin is in 2 different modifications («- and ß-form) (Experientia 25 [1967J, 991) and according to the latest research the pharmacological effect of the two forms is not entirely identical. The d-shape was found to be more active during a contraception attempt on rats the ß-form in cerebral (decerebrated) cats has a stronger vasopressor effect had (Experientia 33 [1977] 1 552). For this reason it is in the regulations for Preparations containing dihydroergotoxin determine the ratio of o- and ß-dihydroergocryptine set.

Für ideal wird das Verhältnis der Form zur ß-Form von 2 : 1 gehalten und das Dihydroergotoxin optimaler Zusammensetzung enthält die Bestandteile Dihydroergocristin, Dihydroergo c ornin, o-Dihydroergocryptin und ß-Dihydroergocryptin im Mengenverhältnis von 3 : 3 : 2 : 1. Die zulässigen Toleranzen bezüglich des Mengenverhältnisses von >-Dihydroergocryptin zu ß-Dihydroergocryptin sind in den einzelnen Ländern verschieden. In den USA und mehreren europäischen Ländern liegen die zulässigen Grenzwerte des Gehaltes an B-Dihydroergocryptin bei 26,7 bis 44 Gew.-% des Gesamtgehaltes an Dihydroergocryptin, während in anderen europäischen Ländern und in Japan die Toleranz bei 28,6 bis 40 Gew.-% liegt.The ratio of the shape to the ß-shape of 2: 1 is believed to be ideal and the optimal composition of the dihydroergotoxin contains the components dihydroergocristin, Dihydroergo cornin, o-dihydroergocryptin and ß-dihydroergocryptin in proportion of 3: 3: 2: 1. The permissible tolerances with regard to the quantity ratio of > -Dihydroergocryptin to ß-Dihydroergocryptin are different in the individual countries. The permissible limit values of the Content of B-dihydroergocryptine at 26.7 to 44 wt .-% of the total content of dihydroergocryptine, while in other European countries and Japan the tolerance is 28.6 to 40 Wt .-%.

Die Anfangs stufe der Herstellung von Dihydroergotoxinmethansulfonat beziehungsweise Dihydroergotoxinäthansul fonat ist die Herstellung der nicht hydrierten Mutterkornalkaloide (Ergocristin, Ergocornin, ch- und B-Ergocryptin). The initial stage in the manufacture of dihydroergotoxin methanesulfonate or Dihydroergotoxinäthansul fonat is the production of the non-hydrogenated Ergot alkaloids (Ergocristin, Ergocornin, ch- and B-Ergocryptin).

Diese Alkaloide werden auf biologischem Wege hergestellt. Eine Möglichkeit dazu ist die parasitäre Biosynthese, nach welcher Roggen infiziert und das erzeugte Alkaloid durch Drogenextraktion gewonnen wird. Dieses Verfahren wird hauptsächlich bei der Herstellung von Ergocristin angewandt [verwendete Stämme: der in der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 20103 hinterlegte, in der britischen Patentschrift 1 192 912 beschriebene Stamm und der von Richter Gedeon Yegyeszeti Gyar RT, Budapest, Ungarn unter der Nummer MNG 00163 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orsz&gos Közegészségugugyi Int&zet) .hinterlegte Stamm]. These alkaloids are produced organically. A possibility in addition there is the parasitic biosynthesis by which rye infects and produces Alkaloid is obtained through drug extraction. This procedure is mainly in the production of Ergocristin applied [strains used: which is deposited in the American Type Culture Collection under the number ATCC 20103, strain described in British Patent 1,192,912 and that of Richter Gedeon Yegyeszeti Gyar RT, Budapest, Hungary under the number MNG 00163 in the National Collection of strains of the Hungarian National Institute for Health Care (Orsz & gos Közegészségugugyi Int & zet) .stored trunk].

Ferner kann die Biosynthese auch auf saprophytischem Wege erfolgen, wobei die Alkaloide aus der Gärbriihe isoliert werden. Die bekanntesten Stämme für dieses Verfahren sind der Ergocryptin und Ergotamin erzeugende bei der American Type Culture Colleotion unter der Nummer AXCC 20102 hinterlegte Stamm (britische Patentschrift 1 158 380), der Ergocornin und Ergosin erzeugende bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 20106 hinterlegte Stamm (britische Patentschrift 1 184 039), der Ergocryptin erzeugende bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 20019 hinterlegte Stamm (US-Patentschrift 3 485 772), der ß-Ergocryptin und Ergosin erzeugende Stamm der Soc. Farmaceutici Italia (in deren eigener Sammlung unter Nr. FI 7374 hinterlegt und in der belgischen Patentschrift 824 987 beschrieben). Furthermore, the biosynthesis can also take place in a saprophytic way, whereby the alkaloids are isolated from the fermentation broth. The most famous tribes for these processes are the ergocryptine and ergotamine-producing at the American Type Culture Colleotion deposited under the number AXCC 20102 (British U.S. Patent 1,158,380), the ergocornine and ergosine-producing in American Type Culture Collection strain deposited under number ATCC 20106 (British U.S. Patent 1,184,039), the ergocryptin-producing in American Type Culture Collection under the number ATCC 20019 (U.S. Patent 3,485 772), the ß-ergocryptine and ergosine producing strain of Soc. Farmaceutici Italia (deposited in their own collection under No. FI 7374 and in the Belgian patent specification 824 987).

Daraus ist ersichtlich, daß diese selektierten Stämme nicht nur die für die Herstellung des Ergotoxines wichtigen Alkaloide erzeugen, sondern auch andere Mutterkornalkaloide, das heißt, daß ihre Gärung nicht selektiv auf Ergotoxin orientiert ist. It can be seen from this that these selected strains are not only the produce important alkaloids for the production of ergotoxins, but also others Ergot alkaloids, which means that their fermentation is not selectively oriented towards ergotoxin is.

Von ungarischen Porschern wurden zum ersten Mal Stämme von Claviceps purpurea, die hauptsächlich «, und ß-Ergorcryptin erzeugen, selektiert (ungarische Patentschrift 152 238, Hinterlegungsnummes MNG 0022 bei der Nationalen Staitimsaminlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (OrszAgos EözegsszaEgugyi Intézet); ungarische Patentschrift 164 816, Hinterlegungsnummer MNG 0088 bei der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos EözegwszségügSi Intzet)]. Auch mit diesen Stämmen ist jedoch die Einstellung des Mengenverhältnisses der Alkaloide zueinander während der Gärung nicht geregelt. Das Verhältnis der 3 erzeugten Alkaloide zueinander kann nur nachträglich eingestellt werden, indem daa erhaltene Alkaloidgemisch durch die zur Verfügung stehenden umständlichen Verfahren in seine Bestandteile zerlegt wird und diese im entsprechenden Verhältnis erneut miteinander vermischt werden. Hungarian Porschers became tribes for the first time from Claviceps purpurea, which mainly produce a and ß-ergorcryptin, selected (Hungarian patent specification 152 238, deposit number MNG 0022 with the National Status collection of the Hungarian National Institute for Health Care (OrszAgos EözegsszaEgugyi Intézet); Hungarian patent specification 164 816, accession number MNG 0088 at the National Collection of Stems of the Hungarian National Health Institute (Országos EözegwszségügSi Intzet)]. Even with these tribes, however, the attitude is the proportion of the alkaloids to one another during fermentation is not regulated. The ratio of the 3 generated alkaloids to each other can only be adjusted afterwards be by daa obtained alkaloid mixture through the available cumbersome Process is broken down into its components and these in the appropriate ratio be mixed together again.

Ferner ist ein Verfahren, bei welchem 2 Stämme, von denen der eine Ergocornin, Ergocryptin und deren Isomere und der andere Ergocristin erzeugt, gleichzeitig gegoren werden, bekannt (schweizerische Patentschrift 577 556). Furthermore, a method in which 2 strains, one of which Ergocornine, ergocryptine and their isomers and the other ergocristine produced, simultaneously be fermented, known (Swiss patent 577 556).

Aus der gemeinsamen Kulturflüssigkeit der beiden Stämme werden die aufgeführten Alkaloide in einem nicht näher bezeichneten Verhältnis gewonnen. Eine Regelung dieses Verhältnisses wird auch bei diesem Verfahren. nicht erreicht.From the common culture fluid of the two strains the listed alkaloids obtained in an unspecified ratio. One Regulation of this relationship is also used in this procedure. not reached.

Problematisch ist ferner, daß die Gärung beim gleichzeitigen Einsatz von 2 Stämmen viel schwerer beherrscht werden kann als in einem Verfahren, bei welchem nur das Züchtungsoptimum eines einzigen Stammes berücksichtigt werden muß.Another problem is that the fermentation when used at the same time can be controlled much more difficultly by 2 tribes than in one procedure in which only the optimal breeding of a single strain has to be taken into account.

Von H. Kobel wurde (in seinem 1977 in Basel auf der Sitzung der Federation of the European Microbiological Societies gehaltenen Vortrag) festgestell, daß die Biosynthese der Peptidalkaloide durch bestimit) Aminosauren beeinflußt werden kann. Die Biosynthese des im Peptidteil Valin enthaltenden Ergocornins kann durch Ziistz' v''on -Valin und die Biosynthese des Leucin enthaltenden $-Ergooryptines durch Zusatz von Leucin gefördert werden. Hingegen kann die Biosynthese des Isoleucin enthaltenden ß-Ergiocryptines durch Zusatz von Isoleucin nicht beeinflußt werden. Als wahrscheinlicher Grund für diese merkwurde Erscheinung wurde von Kobel angegeben, daB das Wachstum der zur Erzeugung von ß-Ergocryptin befähigten Stämme durch Isoleucin gehemmt wird. From H. Kobel (in his 1977 in Basel at the meeting of the Federation of the European Microbiological Societies held lecture) that the biosynthesis of the peptide alkaloids are influenced by certain amino acids can. The biosynthesis of the ergocornine contained in the peptide part valine can by Ziistz 'v''on -Valin and the biosynthesis of leucine-containing $ -ergooryptine be promoted by adding leucine. On the other hand, the biosynthesis of isoleucine containing ß-Ergiocryptines are not influenced by the addition of isoleucine. The likely reason for this strange phenomenon was given by Kobel, that the growth of the strains capable of producing ß-ergocryptine by isoleucine is inhibited.

Da in den Kulturbrühen der bekannten Ergocryptin oder Ergocornin und Ergocryptin erzeugenden Stämme eben der Anteil des ß-Ergocryptines kleiner als erforderlich ist, konnte das geeignete Verhältnis weiterhin nicht eingestellt werden. As in the culture broths of the well-known Ergocryptin or Ergocornin and ergocryptin-producing strains, the proportion of ß-ergocryptin is less than is required, the appropriate ratio could still not be established.

Auch hinsichtlich der erzeugten Menge der gewünschten Alkaloide insgesamt lassen die bekannten Verfahren zu wunschen übrig. Also with regard to the total amount of the desired alkaloids produced the known processes leave something to be desired.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden-durch Gärung von unter saprophytischen Bedingungen, vor allem Ergocornin, dr und ß-Ergocryptin erzeugenden, Variantenstämmen von Claviceps purpurea, bei welchem diese Gärung in günstiger Richtung, das heißt im Sinne der höheren Erzeugung des ß-Ergocryptines und/oder der Erzeugung der einzelnen Alkaloide im für die Ergotoxinerzeugung gewünschten Mengenverhitnis und/oder der höheren Erzeugung der für das Ergotoxin gebrauchten Alkaloide insgesamt beeinflußt wird, zu schaffen. The invention is based on the object while eliminating the disadvantages State of the art a process for the production of alkaloids-by fermentation from under saprophytic conditions, especially ergocornine, dr and ß-ergocryptine producing, variant strains of Claviceps purpurea, in which this fermentation in more favorable direction, that is, in the sense of higher generation of ß-ergocryptines and / or the production of the individual alkaloids as desired for the production of ergotoxins Quantity ratio and / or the higher generation for the ergotoxin used alkaloids overall is influenced to create.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht. The above has surprisingly been achieved by the invention.

Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß der zu geringe Anteil an B-Ergocryptin in der Gärbrühe ansteigt, wenn die Alkaloiderzeugung der Variantenstämme von Claviceps purpurea statt mit Isoleucin mit 1 oder mehr in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkenden Verbindung(en) beeinflußt wird. Die Vorstufen des Isoleucines hemmen demnach das Wachstum der genannten Stämme nicht. It was found, surprisingly, that the too low The proportion of B-ergocryptin in the fermentation broth increases when the alkaloid production of the Variant strains of Claviceps purpurea instead of isoleucine with 1 or more in the Biosynthesis of isoleucines acting as precursor compound (s) is influenced. The isoleucine precursors therefore do not inhibit the growth of the strains mentioned.

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Alkaloiderzeugung auch mit Verbindungen, die durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregen beziehungsweise stimulieren, geregelt werden kann. It was also surprisingly found that the alkaloid production also with compounds which, through biochemical regulation, lead to the formation of isoleucines stimulate or stimulate, can be regulated.

Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die inder Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende(n) Verbindung(en) beziehungsweise durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregende(n) Verbindung(en) auch eine höhere Erzeugung der für das Ergotoxin gebrauchten Alkaloide insgesamt erreicht werden kann. Furthermore, it was surprisingly found that by the Indian Biosynthesis of isoleucines acting as precursor (s) compound (s) or through biochemical regulation the formation of the isoleucine stimulating compound (s) also a higher production of the alkaloids used for the ergotoxine overall can be reached.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden in geregelter Menge und geregeltem Mengenverhältnis durch Gärung von unter saprophytischen Bedingungen, vor allem Ergocornin, o(- und ß-Ergocryptin erzeugenden, Variantenstämmen von Claviceps purpurea, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß bei der Gärung als Regler 1 oder mehr in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindung(bn>oundoier 1 oder mehr durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregende beziehungsweise stimulierende Verbindung(en) verwendet wird beziehungsweise werden. The invention therefore relates to a method for production of alkaloids in regulated quantities and regulated proportions through fermentation from under saprophytic conditions, especially ergocornine, o (- and ß-ergocryptine generating, variant strains of Claviceps purpurea, which is characterized is that with the Fermentation as regulator 1 or more in biosynthesis of isoleucines acting as a precursor compound (bn> oundoier 1 or more through biochemical regulation stimulating or stimulating the formation of isoleucines Compound (s) is or will be used.

In der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkunde Verbindungen sind in Lehninger, Biochemistry, Worth Publ. Inc. N. Y. (1975], Seite 704 beschrieben. Compounds effective as a precursor in the biosynthesis of isoleucine are described in Lehninger, Biochemistry, Worth Publ. Inc. N.Y. (1975], p. 704.

Als in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindungen und durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregende Verbindungen werden vor allem Ketosäuren, IIydrosäuren,und Aminosäuren mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, deren Biosynthese von der Asparaginsäure oder deren Phosphat ausgeht, verwendet. As compounds acting as a precursor in the biosynthesis of isoleucine and compounds stimulating the formation of isoleucine through biochemical regulation are mainly keto acids, hydroacids, and amino acids with 4 to 6 carbon atoms, whose biosynthesis starts from aspartic acid or its phosphate, is used.

Die in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkenden Verbindungen sind in der Reihenfolge ihrer Bildung die folgenden: Vber Homoserin und Threonin oder 3-Methylasparaginsäure (2-Amino-3-methylbernsteinsäure und Methyloxalessigsäure (2-Methyl-3-oxobernsteinsäure) α-Ketobuttersäure, daran anschließend α-Acetyl-α-hydroxybuttersäure, α,ß-Dihydroxy-ß-mathylvaleriansäure und -Keto-ß-methyvaleriansäure. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird beziehungsweise werden bevorzugt Methyloxalessigsäure, 0k-Ketobuttersäure, Threonin und/oder Homoserin verwendet. The compounds that act as a precursor in the biosynthesis of isoleucines are the following in the order of their formation: Vber homoserine and threonine or 3-methylaspartic acid (2-amino-3-methylsuccinic acid and methyloxalacetic acid (2-methyl-3-oxosuccinic acid) α-ketobutyric acid, followed by α-acetyl-α-hydroxybutyric acid, α, ß-dihydroxy-ß-mathylvaleric acid and keto-ß-methyvaleric acid. In the invention Process is or are preferred methyloxaloacetic acid, 0k-ketobutyric acid, Threonine and / or homoserine used.

Die durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregenden beziehungsweise stimulierenden Verbindungen gehören biochemisch den sogenannten Aspartaten, das heißt Verbindungen, deren Biosynthese von der Asparaginsäure oder deren Phosphat ausgeht, an. In erster Linie handelt es sich um Ketosäuren, Hydroxysäuren und Aminosäuren mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt wird beziehungsweise werden erf-indungsgemäß Homocystein und/oder Methionin verwendet. The biochemical regulation stimulates the formation of isoleucines or stimulating compounds belong biochemically to the so-called Aspartates, that is, compounds whose biosynthesis depends on the Aspartic acid or whose phosphate runs out. First and foremost, they are keto acids, Hydroxy acids and amino acids with 4 to 6 carbon atoms. Is preferred or homocysteine and / or methionine are used according to the invention.

Vorzugsweise wird beziehungsweise werden der beziehungsdie Eine Regler in AnPr Menge von 0,01 bis 10 kWm3 Fermentbrühe, insbesondere 0,05 b 5,0 kg/m³ Bermentbruhe, verwendet. Es ist auch bevorzugt, den Regler in Form einer wäßrigen, gegebenenfalls schwach sauren Lösung nach dem Sterilisieren des Nährmediums zuzusetzen, und zwar auf einmal, in mehreren Portionen oder in einer der Perioden der Gärung kontinuierlich. Preferably, the relationship is or will be the one controller In AnPr amount of 0.01 to 10 kWm3 fermentation broth, in particular 0.05 to 5.0 kg / m³ fermentation broth, used. It is also preferred to use the regulator in the form of an aqueous, if appropriate add weakly acidic solution after sterilizing the nutrient medium, namely all at once, in several servings or in one of the periods of fermentation continuously.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt die folgenden Variantenstämme von Claviceps purpurea verwendet: Claviceps purpurea, hinterlegt am 24. April 1963 unter der Bezeichnung MNG 0022, Claviceps purpurea, hinterlegt am 25. Januar 1972 unter der Bezeichnung MNG 0088 und Claviceps purpurea, hinterlegt am 9. Mai 1979 unter der Bezeichnung MNG 00186, jeweils bei der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos Közegszségügyi Intézet). The following variant strains are preferred in the method according to the invention used by Claviceps purpurea: Claviceps purpurea, deposited on April 24, 1963 under the designation MNG 0022, Claviceps purpurea, deposited on January 25, 1972 under the designation MNG 0088 and Claviceps purpurea, deposited on May 9, 1979 under the designation MNG 00186, in each case at the National Tribal Collection of the Hungarian National Health Institute (Országos Közegszségügyi Intézet).

Im Falle der Verwendung des Variantstammes Claviceps purpurea MNG 00186 wird das ß-Ergo¢ryptin bereits ohne Regler in hohem Mengenanteil erhalten. Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß in diesem Falle bei Verwendung der erfindungsgemäß festgelegten Regler das Mengenverhältnis der erzeugten Alkaloide sich kaum ändert, die Gesamtmenge der Alkaloide und damit auch der für das Ergotoxin gebrauchten Alkaloide in der Gärbrühe sich jedoch erhöht. In the case of using the variant strain Claviceps purpurea MNG 00186, the β-ergotin is obtained in large proportions even without a regulator. According to the invention it has now surprisingly been found that in this case when using the regulators defined according to the invention, the quantitative ratio of the generated alkaloids hardly changes, the total amount of alkaloids and thus also however, the alkaloids used for the ergotoxin in the fermentation broth increase.

Zweckmäßig wird die Gärung in submerser Kultur unter aeroben Bedingungen an einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze sowie gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden flüssigen Nährmedium, vorzugsweise bei 20 bis 260C und einem pH-Wert von 5,2 bis 6,8 4 bis 8 Tage lang, durchgeführt. Fermentation in submerged culture under aerobic conditions is expedient on a carbon and nitrogen source and mineral salts as well as optionally Liquid nutrient medium containing other additives, preferably at 20 to 260C and a pH of 5.2 to 6.8 for 4 to 8 days.

Im Schrifttum wird der Gehalt der Gärbrühe an Alkaloidsn häufig durch spektrophotometrisch gemessene Werte angegeben. Der Gesamtalkaloidgehalt wurde auch im vorliegenden Falle spektrophotometrisch gemessen, die Meßergebnisse waren jedoch nicht spezifisch. In the literature, the alkaloid content of fermentation broth is often through values measured spectrophotometrically are given. The total alkaloid content was also in the present case measured spectrophotometrically, but the measurement results were not specific.

Die einzelnen Ergotoxinbestandteile wurden durch Elutionschromatographie beziehungsweise quantitative Flüssigkeitschromatographie getrennt bestimmt. The individual ergotoxin components were determined by elution chromatography or quantitative liquid chromatography determined separately.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. The invention is explained in more detail by means of the following examples.

Beispiel 1 Es wurden 200 cm3 eines weiter unten beschriebenen Nährmediums GK in einem 500 cm3 Erlenmgrerkolben mit einer auf einem weiter unten beschriebenen Agarnährmedium AIC gezüchteteten Kultur des Stammes Claviceps purpurea MNG 0022 geimpft. Der Erlenmeyerkolben wurde bei 24°C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 300 Minute 1 3 Tage lang bebrütet. Das dabei erhaltene Impfmaterial beziehungsweise Inoculum wurde auf 5 1 eines weiter unten beschriebenen Nährmediums St in einer 10 1 Gärvorrichtung überimpft. Die Kultur wurde bei 24°C und einer Rührgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen/Minute unter Belüftung mit 0,5 1 Luft je 1 Gärbrühe und Minute 7 Tage lang gezüchtet. In der 40-sten, 64-sten, 88-sten und 112-sten Stunde wurde der Gärbrühe als in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindung eine 10%-ige wäßrige Lösung von Methyloxalessigsäure in einer 0,5 g Methyloxalessigsäure (rockensubstanz)/l Gärbrühe entsprechenden Menge zugesetzt. Das Mengenverhältnis der Alkaloide Ergocornin und Ergocryptin' erreichte am 7-ten Tag der Gärung den gewünschten Wert. Der mittels Farbreaktion meßbare Gesamtgehalt an Alkaloiden betrug 1 150 #/cm³. Example 1 There were 200 cm3 of a nutrient medium described below GK in a 500 cm3 Erlenmgr flask with one on one described below Agar medium AIC grown culture of the strain Claviceps purpurea MNG 0022 vaccinated. The Erlenmeyer flask was at 24 ° C on a shaker table with a frequency incubated from 300 minutes 1 for 3 days. The inoculation material obtained in this way, respectively Inoculum was on 5 l of a nutrient medium St described below in a 10 1 fermenter inoculated. The culture was at 24 ° C and a stirring speed of 240 revolutions / minute with aeration with 0.5 1 air per 1 fermentation broth and minute Grown for 7 days. In the 40th, 64th, 88th and 112th hours, the fermentation broth as a precursor in the biosynthesis of isoleucine a 10% aqueous solution of methyloxalacetic acid in 0.5 g of methyloxalacetic acid (dry substance) / l of fermentation broth added in the appropriate amount. The quantity ratio the alkaloids ergocornine and ergocryptine reached the 7th day of fermentation desired value. The total content of alkaloids, which can be measured by means of the color reaction, was 1 150 # / cm³.

Die dünnschichtchromatographische Bestimmung (J. oi Chrom.The thin-layer chromatographic determination (J. oi Chrom.

87 [1973], 433) ergab 300 g/cm3 Ergocornin, 180 [/cm3 Ergocryptin und 110 /cm³ von deren rechtsdrehendem Epimer. Das Verhältnis von d-Ergocryptin zu ß-Ergocryptin betrug gemäß der Untersuchung mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (J. Pharm. Sal. 67 [19781, 98) 66 s 34.87 [1973], 433) gave 300 g / cm3 ergocornine, 180 [/ cm3 ergocryptine and 110 / cc of its dextrorotatory epimer. The ratio of d-ergocryptine to β-ergocryptine was according to the investigation by high pressure liquid chromatography (J. Pharm. Sal. 67 [19781, 98) 66 p. 34.

Die Alkaloide wurden aus der Gärbrühe in an sich bekannter Weise isoliert. The alkaloids were made from the fermentation broth in a manner known per se isolated.

Die verwendeten Nährmedien hatten die folgenden Zusammensetzungen: Nährmedium GK Trypcasin 7,0 g Citronensäure 4,1 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,3 g M'agnesiumsulfat 0,3 g Ammoniak bis zur Erreichung eines pH-'Nertes von 5,7 bis 5,8 Wasser bis 840 cm3 Je 84 cm3 oder 168 cm3 des Nährmediums wurden in Kolben gefüllt. In jeden Kolben wurden 16 cm3 beziehungsweise 32 cm3 einer 50%-igen Glucoselösung eingebracht. The nutrient media used had the following compositions: Nutrient medium GK Trypcasin 7.0 g citric acid 4.1 g potassium dihydrogen phosphate 0.3 g magnesium sulfate 0.3 g ammonia up to a pH of 5.7 to 5.8 water up to 840 cm3 Each 84 cm3 or 168 cm3 of the nutrient medium were filled into flasks. In every flask 16 cm3 or 32 cm3 of a 50% glucose solution were introduced.

Agarnährmedium AIC Mannit 40,0 g Citronensäure 7,0 g Maisquellwasser .2,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 1,0 g Magnesiumsulfat 0,3 g Agarpulver (Difco) 25,0 g Ammoniak bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5,2 bis 5,3 Wasser bis 1 000 cm3 Der gewünschte pH-Wert des Nährmediums wurde während des Aufkochens eingestellt. Dann wurde das Nährmedium in Portionen von Je 6 cm3 in Reagenzgläser gefüllt und durch Sahrägstellen der Gläser als Schrägagar erstarren gelassen. Agar medium AIC mannitol 40.0 g citric acid 7.0 g corn steep liquor .2.0 g potassium dihydrogen phosphate 1.0 g magnesium sulfate 0.3 g agar powder (Difco) 25.0 g ammonia up to a pH value of 5.2 to 5.3 water up to 1,000 cm3 The desired pH value of the nutrient medium was set during the boiling. The nutrient medium was then filled into test tubes in portions of 6 cm3 each solidified as a slant by placing the glasses on a slant.

Nährmedium St Saccharose 100,0 g Bernsteinsäure 10,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g Magneßiumsulfat 0,25 B Ammoniumnitrat 1,0 g Calciumchlorid 1,0 g Ammoniak bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5,2 bis 5,3 Wasser bis 1 000 cm3 Das Nährmedium wurde in Portionen von Je 0,1 1 oder 5 1 oder 100 1 sterilisiert. Nutrient medium St sucrose 100.0 g succinic acid 10.0 g potassium dihydrogen phosphate 0.25 g magnesium sulfate 0.25 B ammonium nitrate 1.0 g calcium chloride 1.0 g ammonia until a pH value of 5.2 to 5.3 is reached. Water up to 1 000 cm3 The nutrient medium was sterilized in portions of 0.1 l or 5 l or 100 l each.

Beispiel 2 Es wurden 200 cm3 eines im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums GK in einem 750 cm3 Erlenmeyerkolben mit der auf einem im Beispiel 1 beschriebenen Agarnährmedium AIC gezüchteten Kultur des Variantstammes Claviceps purpurea MNG 0088 geimpft. Die Kultur wurde bei 24°C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 300 Minute 1 3 Tage lang bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde auf 5 1 eines weiter unten beschriebenen Nährmediums TC 54 in einer 10 1 Laboratoriumsgärvorrichtung überimpft. Die Kultur wurde bei 2400 und einer Rührgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen/Minute unter Belüftung mit 0,5 1 Luft Je 1 Gärbrühe und Minute 3 Tage lang bebrütet. Mit dem erhaltenen Impfmaterial beziehungsweise Inoculum wurden 100 1 eines im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums St in einer mit einem Rührer versehenen säurefesten Gärvorrichtung geimpft und die Kultur wurde bei 2400 und einer Rührgeschwindigkeit von 120 Umdrehungen/Minute unter Belüftung mit 0,3 1 Luft je l Gärbrühe und Minute 6 Tage lang gegoren. In den ersten 5 Tagen der Gärung wurde der Kultur als in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindung eine 5%-ige wäßrige α-Ketobuttersäurelösung mit einer Zuführungsgeschwindigkeit von 20 cm³/Stunde zugesetzt. Example 2 200 cm3 of a nutrient medium described in Example 1 were produced GK in a 750 cm3 Erlenmeyer flask with the one described in Example 1 Agar medium AIC grown culture of the variant strain Claviceps purpurea MNG 0088 vaccinated. The culture was at 24 ° C on a shaker table with a frequency incubated from 300 minutes 1 for 3 days. The obtained culture was increased to 5 liters of one Nutrient medium TC 54 described below in a 10 1 laboratory fermentation device inoculated. The culture was started at 2400 and a stirring speed of 240 revolutions / minute incubated for 3 days with aeration with 0.5 l air. 1 fermentation broth per minute. With to the Inoculum or inoculum obtained were 100 1 of a nutrient medium St described in Example 1 in a provided with a stirrer acid-proof fermenter and the culture was at 2400 and a stirring speed of 120 revolutions / minute with aeration with 0.3 1 air per liter of fermentation broth and minute Fermented for 6 days. During the first 5 days of fermentation the culture was considered to be in the Biosynthesis of isoleucines acting as a precursor compound a 5% aqueous α-ketobutyric acid solution at a feed rate of 20 cm³ / hour added.

Nach dem Abbrechen der Gärung betrug der Gesamtalkaloidgehalt 920 /cm3. Mit der im Beispiel 1 angegebenen hochdruckflüssigkeitschromatographischen Verfahrens -weise wurden 260 21/cm³ Ergocornin, 155 /cm3 d-Ergocryptin und 95 &/cm3 ß-Ergocryptin nachgewiesen; außerdem war noch ein Gehalt an 80 &/cm3 Ergocorcorninin und Ergocryptinin (Ergocorninincryptinin) meßbar. After the fermentation stopped, the total alkaloid content was 920 / cm3. With the high pressure liquid chromatographic specified in Example 1 Procedure were 260 21 / cm³ ergocornine, 155 / cm3 d-ergocryptine and 95% / cm3 ß-ergocryptin detected; there was also a content of 80 & / cm3 ergocorcorninine and Ergocryptinin (Ergocorninincryptinin) measurable.

Das Nährmedium TC 54 hatte die folgende Zusammensetzung: Saccharose 100,0 g Citronensäure 10,0 g Natriumchlorid 10,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g Magnesiumsulfat 0,5 g Ammoniak bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5,7 bis 5,8 Wasser bis 1 000 cm3 Das Nährmedium wurde in Portionen von je 5 1 in einer Laboratoriumsgärvorrichtung sterilisiert. The nutrient medium TC 54 had the following composition: sucrose 100.0 g citric acid 10.0 g sodium chloride 10.0 g potassium dihydrogen phosphate 0.5 g magnesium sulfate 0.5 g ammonia until a pH value of 5.7 to is reached 5.8 water up to 1,000 cm3 The nutrient medium was fermented in portions of 5 liters each in a laboratory fermentation device sterilized.

Beispiel 3 Es wurden 100 cm3 eines im Beispiel 1 beschriebenen Nihrmediums GK in einem 500 cm3 Erlenmeyerkolben mit der auf einem weiter unten beschriebenen Agarnährmedium St gezüchteten Kultur des Variantstammes Claviceps purpurea MNG 0088 geimpft. Die Kultur wurde bei 2400 auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 300 Minute 1 3 Tage lang bebrütet. 10 cm3 der erhaltenen Kultur wurden auf 100 cm3 eines weiter unten beschriebenen Nährmediums T 25 überimpft. Diese Kultur wurde bei 200C ebenfalls auf dem Schütteltisch 5 Tage lang bebrütet. In der 20-sten Stunde wurde die Gärbruhe mit 0,5 g Threonin als in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindung versetzt. Am 5-ten Tag betrug die Gesamtalkaloidkonzentration 1 200 &/cm3. Mit der im Beispiel 1 angegebenen hochdruckflüssigkeitschromatographischen Verfahrensweise wurden 260 X/cm3 Ergocornin, 140 γ/cm³ «-Ergocryptin und 80 /cm3 ß-Ergooryptin nachgewiesen; der ,Gesamtgehalt an Ergocorninin und Ergocryptinin betrug 130 γ/cm³. Example 3 100 cm3 of a nutrient medium described in Example 1 were obtained GK in a 500 cm3 Erlenmeyer flask with the one described below Agar medium St cultivated culture of the variant strain Claviceps purpurea MNG 0088 vaccinated. The culture was started at 2400 on a shaker table at a frequency of Incubated for 300 minutes for 1 3 days. 10 cm3 of the culture obtained were per 100 cm3 a nutrient medium described below T 25 inoculated. This culture became also incubated at 200C on the shaking table for 5 days. In the 20th hour was the fermentation dregs with 0.5 g threonine as in the biosynthesis of isoleucines as Compound acting in the preliminary stage. On the 5th day, the total alkaloid concentration was 1 200 & / cm3. With the high pressure liquid chromatographic specified in Example 1 Procedure were 260 X / cm3 ergocornine, 140 γ / cm³ «-ergocryptine and 80 / cm3 ß-ergooryptine detected; der, total content of ergocorninine and ergocryptinine was 130 γ / cm³.

Die verwendeten Nährmedien hatten die folgenden Zusammensetzungen: Agrarnährmedium St Das Agarnährmedium St unterschied sich vom im Beispiel 1 beschriebenen flüssigen Nährmedium St darin, daß ihm je Liter 25 g Agarpulver (Difco) zugesetzt wurden. Nach dem Zusatz des Agars wurde das Nährmedium aufgekocht, dann in Portionen von je 6 cm³ in Reagenzgläser gefüllt, sterilisiert und durch Schrägstellen der Gläser zu Schrägagar erstarren gelassen. The nutrient media used had the following compositions: Agar nutrient medium St The agar nutrient medium St differed from that described in Example 1 liquid nutrient medium in that 25 g of agar powder (Difco) are added to it per liter became. After adding the agar, the nutrient medium was boiled, then in portions of 6 cm³ each filled into test tubes, sterilized and by inclining the Glasses allowed to solidify into agar slants.

Nährmedium T 25 Saccharose 300,0 g Oitronensäure 15,0 g Hefeextrakt 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g Magnesiumsulfat 0,5 g Ammoniak bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5,2 bis 5,3 Wasser bis 1 000 cm3 Das Nährmedium wurde in Portionen von je 100 cm3 in Kolben gefüllt und sterilisiert. Nutrient medium T 25 sucrose 300.0 g citric acid 15.0 g yeast extract 1.0 g potassium dihydrogen phosphate 0.5 g magnesium sulfate 0.5 g ammonia until achieved a pH value of 5.2 to 5.3 water up to 1 000 cm3 The nutrient medium was in portions 100 cm3 each filled into flasks and sterilized.

Beispiel 4 Es wurde wie im Beispiel 3 beschrieben gearbeitet, jedoch als in der Biosynthese des Isoleucines als Vorstufe wirkende Verbindung 0,5 g Homoserin statt des Threonines verwendet. Am 5-ten Tag der Gärung betrug der Gesamtgehalt an Alkaloiden 880 γ/cm³. Die Gärbrühe enthielt 220 cm3 Ergocornin, 150 t/cm3 G-Ergocryptin und 80 t/cm3 ß-Ergocryptin; Ergocorninin und Ergocryptinin machten zusammen 180 /cm3 aus. Example 4 The procedure described in Example 3 was followed, but as a compound acting as a precursor in the biosynthesis of isoleucine, 0.5 g homoserine used instead of threonines. On the 5th day of fermentation, the total content was of alkaloids 880 γ / cm³. The fermentation broth contained 220 cm3 ergocornin, 150 t / cm3 G-ergocryptine and 80 t / cm3 ß-ergocryptine; Ergocorninine and Ergocryptinine made together 180 / cm3.

Beispiel 5 Es wurde wie im Beispiel 3 beschrieben gearbeitet, jedoch 0,05 g Homocystein als durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregende Verbindung statt des Threonines verwendet. Am 5-ten Tag betrug die Gesamtalkaloidkonzentration 700 t/cm3. Die Gärbrühe enthielt 190 /cm3 Ergocornin, 85 t/cm3 C-Ergocryptin und 90 &/cm3 ß-Ergocryptin; Ergocorninin und Ergocryptinin machten zusammen 150 t/cm3 aus. Example 5 The procedure described in Example 3 was followed, but 0.05 g homocysteine as stimulating the formation of isoleucine through biochemical regulation Compound used instead of the Threonines. On the 5th day, the total alkaloid concentration was 700 t / cm3. The fermentation broth contained 190 / cm3 ergocornine, 85 t / cm3 C-ergocryptine and 90 & / cm3 ß-ergocryptine; Ergocorninine and ergocryptinine together made 150 t / cm3.

Beispiel 6 Es wurden 100 cm3 eines im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums GK in einem 500 cm3 Erlenmeyerkolben mit der auf einem im Beispiel 3 beschriebenen Agarnährmedium St gezüchteten Kultur des Stammes Claviceps purpurea MNG 00186 geimpft. Die Kultur wurde bei 2400 auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 300 Minute 1 4 Tage lang bebrütet. Je 10 cm3 der erhaltenen Kultur wurden in 8 Kolben, die Je 100 cm3 eines im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums St enthielten, eingebracht. Die Kulturen wurden bei 240C, ebenfalls auf dem Schütteltisch 7 Tage lang gegoren. In 4 Kolben wurde keine durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregende Verbindung eingebracht. In die anderen 4 Kolben wurden in der 24-sten und 48-sten Stunde der Gärung je 0,02 g Methionin in Lösung in Je 2 cm3 Wasser eingebracht. Am 7-ten Tag wurde die Gärung abgebrochen. Example 6 100 cm3 of a nutrient medium described in Example 1 were produced GK in a 500 cm3 Erlenmeyer flask with the one described in Example 3 Agar medium St grown culture of the strain Claviceps purpurea MNG 00186 inoculated. The culture was started at 2400 on a shaker table with a frequency of 300 minutes 1 incubated for 4 days. 10 cm3 each of the culture obtained were poured into 8 flasks, the Each 100 cm3 of a nutrient medium St described in Example 1 were introduced. The cultures were fermented at 240C, also on the shaker table, for 7 days. In 4 flasks none of the isoleucines was formed by biochemical regulation stimulating connection introduced. The other 4 flasks were in the 24th During the 48th and 48th hour of fermentation, 0.02 g of methionine in solution was introduced into 2 cm3 of water each. On the 7th day, the fermentation was stopped.

Die ohne Zusatz der durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregenden Verbindung erhaltenen Gärbrühen wurden vereinigt und die Bestimmung ihres Alkaloidgehaltes ergab:- 80 cm3 Ergocornin, 15 /cm3 -Ergocryptin und 30 γ/cm³ ß-Ergocryptin. The formation of the isoleucines without the addition of the biochemical regulation fermentation broths obtained were combined and the determination of their Alkaloid content resulted in: - 80 cm3 ergocornine, 15 / cm3 -ergocryptine and 30 γ / cm³ ß-ergocryptine.

Die mit der durch biochemische Regelung die Bildung des Isoleucines anregenden Verbindung erhaltenen Gärbrühen wurden ebenfalls vereinigt und untersucht. Es wurden 250 /cm3 Ergocornin (durchschnittlicher Gehalt), 50 t/cm3 A-Ergocryptin und 100 γ/cm³ ß-Ergocryptin nachgewiesen. The one with which by biochemical regulation the formation of the isoleucines The fermentation broths obtained from the stimulating compound were also combined and examined. There were 250 / cm3 ergocornine (average content), 50 t / cm3 A-ergocryptine and 100 γ / cm³ ß-ergocryptin detected.

Zusammenfassungsummary

Claims

Claims 1.) Process for the production of alkaloids in a regulated Quantity and regulated quantity ratio through fermentation under saprophytic conditions, especially ergocornine, d- and B-ergocryptine-producing, variant strains of claviceps purpurea, characterized in that the fermentation is 1 or more as a regulator Compound (s) acting as a precursor in the biosynthesis of isoleucine and / or 1 or more compound (s) stimulating the formation of isoleucine through biochemical regulation used.

2.) The method according to claim 1, characterized in that as Compound (s) methyl oxalacetic acid acting as a precursor in the biosynthesis of isoleucine, o (-Ketobutyric acid, threonine and / or homoserine used.

3.) Method according to claim 1 or 2, characterized in that as compounds stimulating the formation of isoleucine through biochemical regulation) llomocysteine and / or methionine are used.

4.) Process according to claim 1 to 3, characterized in that one the regulator in an amount of 0.01 to 10 kg / m3 fermentation broth, in particular 0.05 up to 5.0 kg / m3 fermentation broth, used.

Description