DE3032072C2

DE3032072C2 - Method for the analysis of protein subunits with the aid of electrophoresis on thin layers which contain tetramethylurea or similar urea derivatives

Info

Publication number: DE3032072C2
Application number: DE19803032072
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Dr. 6900 Heidelberg Grubhofer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-08-26
Filing date: 1980-08-26
Publication date: 1982-10-28
Also published as: DE3032072A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten gemäß dem Gattungsbegriff des Patentanspruchs.The invention relates to a method for analyzing protein subunits according to the generic term of the claim.

Die Elektrophorese von Proteinen, also deren Trennung aufgrund verschiedenen Beweglichkeitsverhaltens im elektrischen Gleichspannungsfeld, hat auf dem Gebiet der Biochemie und der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung erlangt Ein Spezialgebiet besteht hier in der Auftrennung der Untereinheiten von Proteinen, welche dadurch entstehen, daß man die Proteine in eine 50%ige Hamstofflösung bringt Menschliches Hämoglobin zerfällt dabei z. B. in vier Untereinheiten, deren elektrophoretische Analyse bei krankhaften Veränderungen diagnostisch viel klarere Aussagen liefert als die Analyse der ganzen Hämoglobine (Altland, K. und Kämpfer, M. (1979) Human Genetics 53.97-100).The electrophoresis of proteins, i.e. their separation due to different mobility behavior in an electrical direct voltage field, has the field of biochemistry and medical diagnostics has gained great importance. A specialty here consists in the separation of the subunits of proteins, which arise from the fact that one puts the proteins in a 50% urea solution. B. in four Subunits, the electrophoretic analysis of which is much clearer diagnostically for pathological changes The analysis of the whole hemoglobins (Altland, K. and Kämper, M. (1979) Human Genetics 53.97-100).

Führt man diese Trennung an labormäßig frisch hergestellten Schichten von Agarose oder Polyacrylamid durch, so müssen diesa eine entsprechendeIf this separation is carried out on freshly prepared layers of agarose or polyacrylamide in the laboratory, this must be carried out accordingly Beimischung von Harnstoff enthalten, damit die Untereinheiten nicht wieder in natürlicher Weise zusammentreten und den Trennvorgang komplizieren. Will man nun solche Elektrophorese-Schichten gebrauchsfertig für längere Zeit aufbewahren und in einer für den Handel und für den Versand brauchbaren Formen herstellen, so ergibt sich, daß fertige Schichten, welche solch hohe Konzentrationen von Harnstoff enthalten, gravierende Nachteile haben.Contain an admixture of urea so that the subunits do not come together again naturally and complicate the separation process. If one wants to keep such electrophoretic layers ready for a long time and produce in an acceptable trade and shipping forms, it follows that finished layers containing such high concentrations of urea, have serious disadvantages.

1. Harnstoff zerfällt nach folgender Gleichung1. Urea breaks down according to the following equation

H₂N- CO—NH₂ «-»CNCr+ NH₄ ⁺ (1)H ₂ N- CO — NH ₂ «-» CNCr + NH ₄ ⁺ (1)

in Ammoniumcyanat.in ammonium cyanate.

Das freie Cyanat reagiert mit den in den Proteinen enthaltenen freien Aminogruppen sehr rasch in folgender Weise, unter Bildung von Harnstoffderivaten (Carbamylierung):The free cyanate reacts very quickly with the free amino groups contained in the proteins in the following way, with the formation of urea derivatives (carbamylation):

Protein-NHj + O=C=NH -»Protein-NH — CO-NH₂ Protein-NHj + O = C = NH - »Protein-NH - CO-NH ₂

Das führt dazu, daß derartige Lösungen schon im Laufe der Zeitspanne, welche für die Elektrophorese erforderlich ist, neue Umsetzungsprodukte bilden, so daß das Ergebnis der Elektrophorese dann nicht mehr eindeutig ist, weil zusätzlich zunächst im Präparat nicht vorhandene Verbindungen aufgetreten sind. Bei fertig gelieferten Schichten muß damit gerechnet werden, daß diese vor Anwendung monatelang und nicht einmal bei Kühltemperatur gelagert wurde. Aus der bekannten Gleichgewichtslage und den kinetischen Daten für das Gleichgewicht gemäß Gleichung (1) muß mit Konzentrationen bis 5 μπιοΐ/ΐ Cyanat gerechnet werden. Andererseits ist aber bekannt, daß bereits Konzentrationen von 2,5 μΐηοΐ/l Cyanat bei Hämoglobin schon innerhalb der für die Elektrophorese benötigten Zeitspanne mindestens 1 Mol Proteinstickstoff nach Gleichung (2) modifizieren (vgl. Abb. C).This leads to the fact that such solutions already in the course of the period of time which is required for the electrophoresis, new reaction products form, so that the result of the electrophoresis is then no longer unambiguous, because in addition compounds that were not initially present in the preparation appeared. In the case of completely delivered layers, it must be expected that these will be before Use for months and not even stored at refrigerated temperature. From the known equilibrium position and the kinetic data For the equilibrium according to equation (1), concentrations of up to 5 μπιοΐ / ΐ cyanate must be expected. On the other hand, it is known that already concentrations of 2.5 μΐηοΐ / l cyanate Hemoglobin at least 1 mole within the time required for electrophoresis Modify protein nitrogen according to equation (2) (see Fig. C).

Die Lagerung von Schichten, welche 50% Harnstoff enthalten, ist ohnehin nur bei Zimmertempera- «ι tür möglich. Kühlt man auf die allgemein übliche und auch erforderliche Kühlschranktemperatur von 0—4⁰C ab, so kristallisiert der Harnstoff aus und führt zu irreversiblen Änderungen der Schicht. Es ist bekannt, daß verschiedene Derivate des Harnstoffs ähnliche, zum Teil sogar stärkere »chaotrope« Wirkung haben, welche im Aufbrechen von Wasserstoffbrücken zwischen den Pro-In any case, layers which contain 50% urea can only be stored at room temperature. Is cooled to the common and also required refrigeration temperature of 0-4 ⁰ C., the urea crystallizes out and leads to irreversible changes in the layer. It is known that various derivatives of urea have similar, and in some cases even stronger, "chaotropic" effects, which result in the breaking of hydrogen bonds between the products. teinmolekülen besteht: z. B. Baum, D. und Herkovits T. T. (1947) Biochemistry 13,68 - 78.protein molecules: z. B. Baum, D. and Herkovits T. T. (1947) Biochemistry 13, 68-78.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin ein einwandfrei arbeitendes. Verfahren zurThe object of the present invention is now a properly working. Procedure for Analyse von Protein-Untereinheiten mittels Elektrophorese zu schaffen, bei dem die Gefahr der Bildung unerwünschter und das Ergebnis verfälschender Umsetzungsprodukte weitgehend ausgeschaltet ist.Analysis of protein subunits by means of electrophoresis, in which there is a risk of formation undesirable and the result falsifying reaction products is largely eliminated.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die imThe solution to this problem is provided by the im

Kennzeichen des Patentanspruchs beschriebene technische Lehre vermittelt.Characteristics of the claim conveyed technical teaching described.

Der Harnstoff in Schichten aus wäßrigem Polyamid-Gel oder Agarose kann gemäß Erfindung durch Harnstoff-Derivate ersetzt werden, welche in WasserThe urea in layers of aqueous polyamide gel or agarose can according to the invention through Urea derivatives are substituted for those in water keine Cyanat-Ionen bilden und welche bei tieferer Temperatur nicht auskristallisieren. Es handelt sich hierbei insbesondere um alkylsubstituierte Harnstoffe, nämlich die Derivate:no cyanate ions form and which at lower Do not crystallize out at temperature. These are in particular alkyl-substituted ureas, namely the derivatives:

1 ¹V₄ I-"3 *-Γ»4Γΐ9,1 ¹ V ₄ I- "3 * -Γ» 4Γΐ9,

i \i \

N —CO —NN —CO —N

(3)(3)

Dabei ergibt sich als Vorteil, daß solche Präparate inThe advantage here is that such preparations in

wesentlich verdünnter Lösung ihre dissoziierenden Eigenschaften entfalten, so daß geringe Mengen zugesetzt werden müssen. So genügt beispielsweise beim Tetramethylharnstoff, also Ri — R4 = CH3, bereits eine Konzentration von 50 g/l, um die vollkommene Auflösung in diesem Zustand während der Elektrophorese zu sichern.significantly more dilute solution develop their dissociating properties, so that small amounts must be added. For example, with tetramethylurea, i.e. Ri - R4 = CH3, is already sufficient a concentration of 50 g / l to ensure complete dissolution in this state during electrophoresis to secure.

example 1

Eine zweckmäßig durch Polymerisation von aliphatischen Diolen und Dicarbonsäuren hergestellte Polyesterfolie wird mit einer wäßrigen Schicht von Polyacrylamid-Gel insofern modifiziert, als dem Monomer nach 50 g/l Tetramethylharnstoff in flüssiger Form zugesetzt werden. Die Polymerisation verläuft ähnlich wie die solcher Schichten, welche keinen Tetramethylharnstoff zugesetzt bekommen haben.A polyester film expediently produced by polymerizing aliphatic diols and dicarboxylic acids is coated with an aqueous layer of polyacrylamide gel Modified insofar as tetramethylurea was added in liquid form to the monomer after 50 g / l will. The polymerization proceeds in a similar way to that of layers which do not contain tetramethylurea got added.

Example 2

Eine analog Beispiel 1 hergestellte S-hicht wird dadurch modifiziert, daß dem Monomer 150 g/l Butylharnstoff zugefügt werden.An S-layer produced analogously to Example 1 is modified by adding 150 g / l Butyl urea can be added.

Example 3

Bei der Herstellung einer wäßrige Harnstoff-Derivate gemäß Formel (3) (Tetramethylharnstoff) enthaltenden Schicht von Polyacrylamid-Gel auf einer Polyester-Folie gemäß Beispiel 1 mit Haftvermittler wurden vor der Polymerisation noch drei Gewichtsprozent (bezogen auf Festkörper) eines Ampholyten gemäß Patent 21 37 617 zugemischt, und zwar insbesondere ein gemäß Beispiel 5c der Patentschrift hergestellter Schnitt zwischen pH 6 und 6,9.In the preparation of an aqueous urea derivative of the formula (3) containing (tetramethylurea) Layer of polyacrylamide gel on a polyester film According to Example 1 with adhesion promoter, three percent by weight (based on on solids) of an ampholyte according to patent 21 37 617 admixed, in particular according to Example 5c of the patent specification produced cut between pH 6 and 6.9.

Example 4

Auf eine gemäß Beispiel 1 bis 3 hergestellte Tetramethylharnstoff und Ampholyte zwischen pH 6 und 6,9 enthaltende wäßrige Schicht von Polyacrylamid-Gel auf einer Kunststoff-Folie mit Haftvermittler wurden in einer Elektrophorese-Apparatur Proben von 5 μΐ einer Lösung von Hämoglobin eines menschlichen Neugeborenen in 50% Harnstoff aufgetragen. Einzelheiten siehe Altland, K. und Kaempfer, N. (1980) Electrophoresis 1, 57-62. Sie wurden der Elektrophorese unterworfen.On a tetramethylurea and ampholyte prepared according to Example 1 to 3 between pH 6 and 6.9 containing aqueous layer of polyacrylamide gel on a plastic film with an adhesion promoter samples of 5 μΐ of a solution of hemoglobin from a human were in an electrophoresis apparatus Newborns applied in 50% urea. For details see Altland, K. and Kaempfer, N. (1980) Electrophoresis 1, 57-62. They were subjected to electrophoresis.

Vergleichsversuch:Comparative experiment:

Zum Nachweis des technischen Fortschritts wurden in einem Vergleichsversuch drei verschieden hergestellte dünne Schichten von wäßrigem Polyacrylamid-Gel auf Polyester-Folien miteinander verglichen, welche folgende Zusätze enthielten:To prove the technical progress, three differently produced were in a comparative experiment thin layers of aqueous polyacrylamide gel on polyester films compared which contained the following additives:

A) 59% Harnstoff, frisch hergestellt,A) 59% urea, freshly made,

B) 5% Tetramethylharnstoff, anschließend 126 TageB) 5% tetramethylurea, then 126 days

bei 18° C gelagertstored at 18 ° C

C) 50% Harnstoff, anschließend 126 Tage bei 18° C gelagert.C) 50% urea, then stored at 18 ° C for 126 days.

Alle drei Schichten wurden unter einheitlichen Bedingungen gemäß Beispiel 4 zur Elektrophorese der Globinfragmente in neonatalem menschlichen Blut verwendet Die Zonen wurden photometriert, wobei in bezug auf die Details auf die deutschen Patentschriften 2127 617 und 23 30 743 hingewiesen wird. Aus den Abbildungen A-C (Fig. I-III) ersieht man, daß eine unter ungünstigen Bedingungen gelagerte Schicht mit Harnstoffgehalt die Auflösung der Globinkomponenten praktisch verhindert, während die unter denselben Bedingungen gelagerte erfindungsgemäß mit Tetramethylharnstoff hergestellte Schicht im Vergleich zu einer nach den gegenwärtig üblichen Methoden frisch mit Harnstoff bereiteten Schicht sich nicht unterscheidet, also eine viermonatige Lagerung bei Raumtemperatur ohne Beeinträchtigung übersteht.All three layers were electrophoresed under uniform conditions according to Example 4 for the Globin fragments used in neonatal human blood The zones were photometry, with in reference is made to German patents 2127 617 and 23 30 743 for the details. From the Figures A-C (Figs. I-III) it can be seen that a Layer with urea content stored under unfavorable conditions, the dissolution of the globin components practically prevented, while the inventively stored under the same conditions with tetramethylurea produced layer compared to a layer freshly produced by the currently customary methods Urea-prepared layer does not differ, i.e. four months of storage at room temperature survives without impairment.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patentanspruch:Claim:

Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten mit Hilfe der Elektrophorese an dünnen Schichten unter Verwendung von Schichten wäßriger Polyacrylamid-Gele auf Polyesterfolien, insbesondere durch Polymerisation aliphatischen Diole mit Dicarbonsäuren gewonnenen Polyesterfolien,Method for the analysis of protein subunits using electrophoresis on thin Layers using layers of aqueous polyacrylamide gels on polyester films, in particular by polymerizing aliphatic diols polyester films obtained with dicarboxylic acids, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele substituierte Harnstoffderivate enthalten, in welchen die freien Wasserstoffmoleküle des Harnstoffs teilweise oder ganz durch Alkylreste mit geraden oder verzweigten Ketten ersetzt sind, welche 1 bis 4 Kohlenstoffreste enthalten.characterized in that the gels contain substituted urea derivatives, in which the free hydrogen molecules of urea are partially or completely replaced by alkyl radicals with straight or branched chains, which 1 to 4 Contains carbon residues.