DE29821682U1

DE29821682U1 - Device for the selection of accelerated proliferation of living cells in suspension

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Publication number: DE29821682U1
Application number: DE29821682U
Authority: DE
Original assignee: MUTZEL RUPERT DR; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: MUTZEL RUPERT DR; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2008-12-05

Description

EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYSEUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS

Dr. VOLKER VOSSIUS. Dipl.-Chem.Dr. VOLKER VOSSIUS. Dipl.-Chem.

(bis 1992; danach in anderer Kanzlei) Dr. PAUL TAUCHNER. Dipl.-Chem.(until 1992; then in another law firm) Dr. PAUL TAUCHNER. Dipl.-Chem.

Dr. DIETER HEUNEMANN, Dipl.-Phys.Dr. DIETER HEUNEMANN, Dipl.-Phys.

Dr. PETER A. RAUH. Dipl.-Chem.Dr. PETER A. RAUH. Dipl.-Chem.

Dr. GERHARD HERMANN. Dipl.-Phys.Dr. GERHARD HERMANN. Dipl.-Phys.

JOSEF SCHMIDT, Dipl.-Ing.JOSEF SCHMIDT, Dipl.-Ing.

Dr. HANS-RAINER JAENICHEN, Dipl.-BiOl.Dr. HANS-RAINER JAENICHEN, Dipl.-BiOl.

Dr. ALEXA VON UEXKÜLL. M. Sc.Dr. ALEXA VON UEXKÜLL. M.Sc.

Dr. RUDOLF WEINBERGER. Dipl.-Chem.Dr. RUDOLF WEINBERGER. Dipl.-Chem.

Dr. WOLFGANG BUBLAK, Dipl.-Chem.Dr. WOLFGANG BUBLAK, Dipl.-Chem.

AXEL STELLBRINK. Dipl.-Ing.AXEL STELLBRINK. Dipl.-Ing.

Dr. JOACHIM WACHENFELD, (BiOl.)Dr. JOACHIM WACHENFELD, (BiOl.)

EUROPEAN PATENT ATTORNEYEUROPEAN PATENT ATTORNEY

Dr. RENATE BARTH, Dipl.-Chem.Dr. RENATE BARTH, Dipl.-Chem.

RECHTSANWÄLTELAWYERS

HELGA TREMMELHELGA TREMMEL

BARBARA GUGGENMOS, Dipl.-Chem.BARBARA GUGGENMOS, Dipl.-Chem.

POB 86&Ogr;7 67 81 634 MÜNCHEN GERMANYPOB 86&Ogr;7 67 81 634 MUNICH GERMANY

TELEFON: +49-89-4 13 04-0 FAX G3: +49-89-4 1304-111 FAX G4: +49-89-41304-101PHONE: +49-89-4 13 04-0 FAX G3: +49-89-4 1304-111 FAX G4: +49-89-41304-101

u.Z.: C 2508 GM-DEo.Z.: C 2508 GM-DE

Dsz, 1998Dsz, 1998

Institut Pasteur, Paris, FrankreichPasteur Institute, Paris, France

undand

Dr. Rupert Mutzel, Konstanz, DeutschlandDr. Rupert Mutzel, Constance, Germany

Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in SuspensionDevice for the selection of accelerated proliferation of living cells in suspension

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension.The present invention relates to a device for selecting accelerated proliferation of living cells in suspension.

Herkömmlicherweise wird zwischen seriellen und kontinuierlichen Kulturmethoden unterschieden. Bei der Technik der seriellen Kultur werden Kulturgefäße mit sterilem Wachstumsmedium mit einer Fraktion einer Kultur beimpft, die unter den gleichen Wachstumsbedingungen angezogen wurde. Dieser Zyklus wird wiederholt, wenn die neue Kultur gewachsen ist (Lenski, R.E. und Travisano, M. (1994): Dynamics of adaption andTraditionally, a distinction is made between serial and continuous culture methods. In the serial culture technique, culture vessels containing sterile growth medium are inoculated with a fraction of a culture that was grown under the same growth conditions. This cycle is repeated when the new culture has grown (Lenski, R.E. and Travisano, M. (1994): Dynamics of adaption and

diversification: A 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 6808-6814). Die in der Literatur beschriebenen Experimente zur Proliferation mikrobieller Organismen über die längsten Zeiträume wurden mit dieser Methode durchgeführt (Lenski und Travisano, a.a.O.). Bei kontinuierlichen Kulturmethoden (Dijkuizen, D.E. (1993): Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. Meth. Enzymol. 224, 613-631), wird eine Kultur kontinuierlich nach einem vorgewählten Regime mit frischem Wachstumsmedium verdünnt. In der Literatur sind solche Experimente nur von begrenzter Dauer beschrieben (Dijkuizen, a.a.O.) .diversification: A 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 6808-6814). The experiments on the proliferation of microbial organisms over the longest periods of time described in the literature were carried out using this method (Lenski and Travisano, op. cit.). In continuous culture methods (Dijkuizen, D.E. (1993): Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. Meth. Enzymol. 224, 613-631), a culture is continuously diluted with fresh growth medium according to a preselected regime. In the literature, such experiments are only described for a limited duration (Dijkuizen, op. cit.).

Die vorstehend beschriebenen herkömmlichen Techniken haben insbesondere den Nachteil, daß bisher kein Verfahren zur kontinuierlichen Kultur beschrieben wurde, das die permanente Proliferation von Organismen in Suspension gewährleistet. AlleThe conventional techniques described above have the particular disadvantage that no method for continuous culture has been described to date that ensures the permanent proliferation of organisms in suspension. All

beschriebenen Apparaturen selektionieren verdünnungsresistente (statische) Varianten, welche innere Oberflächen der Apparatur besiedeln (Chao, L. and Ramsdell, G. (1985): The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures. J. Gen. Microbiol. 131, 1229-1236). Diese Varianten bilden eine Subpopulation, die den adaptiven Zwängen entkommt, die auf die Organismen in Suspension wirken. Kontinuierliche Kulturen mit konstanter Zelldichte, wie z.B. Turbidostat sind besonders anfällig für eine Invasion durch verdünnungsresistente Varianten und können nur über relativ kurze Zeiträume (etwa 200 Generationen) durchgeführt werden. Die Literatur beschreibt diese Schwierigkeiten, hat aber bisher nur untaugliche Lösungsmöglichkeiten angeboten. Aus diesem Grunde werden derartige Verfahren für wissenschaftliche und industrielle Ziele praktisch nicht angewendet, obwohl ihr Potential sehr früh erkannt wurde (Monod,The apparatus described above select dilution-resistant (static) variants that colonize the internal surfaces of the apparatus (Chao, L. and Ramsdell, G. (1985): The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures. J. Gen. Microbiol. 131, 1229-1236). These variants form a subpopulation that escapes the adaptive constraints that act on the organisms in suspension. Continuous cultures with constant cell density, such as turbidostat, are particularly susceptible to invasion by dilution-resistant variants and can only be carried out over relatively short periods of time (about 200 generations). The literature describes these difficulties, but has so far only offered unsuitable solutions. For this reason, such methods are practically not used for scientific and industrial purposes, although their potential was recognized very early on (Monod,

J. (1950): La technique de la culture continue. Theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur 79, 390-410; Novick, A. and Szilard, L. (1950): Description of the chemostat. Science 112, c 715-716). Die serielle Kultur, die man mit der periodischen Erneuerung der Kulturapparatur - in diesem Fall eines einfachen Kulturgefäßes - beschreiben kann, vermeidet die Invasion mit solchen verdünnungsresistenten Varianten. Sie ist jedoch arbeitsaufwendig, d.h. personalintensiv und durch wiederholte Manipulation unter Bedingungen, die absolute Sterilität erfordern, kontaminationsanfällig (Lenski und Travisano, a.a.O.). Robotisierung der seriellen Kultur in einer sterilen Umgebung könnte diese Risiken reduzierten. Sie würde jedoch mit einem großen Aufwand an Kulturgefäßen erkauft und wäre durch die Aufrechterhaltung der mechanischen Präzision des Roboters und die Aufrechterhaltung der sterilen Umgebung limitiert.J. (1950): La technique de la culture continue. Theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur 79, 390-410; Novick, A. and Szilard, L. (1950): Description of the chemostat. Science 112, c 715-716). Serial culture, which can be described as the periodic renewal of the culture apparatus - in this case a simple culture vessel - avoids invasion by such dilution-resistant variants. However, it is labor-intensive, i.e. personnel-intensive, and susceptible to contamination through repeated manipulation under conditions that require absolute sterility (Lenski and Travisano, op. cit.). Robotization of serial culture in a sterile environment could reduce these risks. However, it would come at the cost of a large expenditure of culture vessels and would be limited by maintaining the mechanical precision of the robot and maintaining the sterile environment.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eineIt is an object of the present invention to provide a

verbesserte Vorrichtung zur Selektion beschleunigterimproved device for selecting accelerated

Proliferation lebender Zellen in Suspension zur Verfügung zuProliferation of living cells in suspension to

stellen. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.This problem is solved with the features of the patent claims.

Dabei geht die Erfindung von den Grundgedanken aus, daß die Vorrichtung eine Suspension von Zellen dauernd in Proliferation hält. In keinem Teil der Apparatur darf eine verdün-30 The invention is based on the basic idea that the device keeps a suspension of cells in constant proliferation. No part of the apparatus may contain a diluted 30

nungsresistente Variante akkumulieren. Ihre Funktion wird durch die Steuerung von Flüssigkeitsströmen (Fluidics) gewährleistet. Unter der Voraussetzung, daß die regelmäßige Nachlieferung von Flüssigkeiten, wie z.B. Nährmedien und 3^ Waschlösungen, und eine kontinuierliche Versorgung mit sterilen Gasen, wie z.B. Luft gewährleistet wird, muß die Apparatur über unbegrenzte Zeitdauer autonom arbeiten. Verschie-sion-resistant variant. Its function is ensured by the control of liquid flows (fluidics). Provided that the regular supply of liquids, such as nutrient media and 3^ washing solutions, and a continuous supply of sterile gases, such as air, is guaranteed, the apparatus must work autonomously for an unlimited period of time. Various

dene Kulturregime, wie z.B. Chemostat oder Turbidostat, können *' angewendet werden. Bei Bedarf können bestimmte Bestandteile von Zellen durch die Wirkung geeigneter Lösungen abgetrennt ,. oder isoliert werden. Bei Bedarf können mehrere der Apparaturen so miteinander verbunden werden, daß der Inhalt oder ein Teil des Inhalts einer Apparatur in eine andere überführt werden kann.Different culture regimes, such as chemostat or turbidostat, can be used. If required, certain components of cells can be separated or isolated by the action of suitable solutions. If required, several of the apparatuses can be connected to one another in such a way that the contents or part of the contents of one apparatus can be transferred to another.

Konkret wird die Anforderung, daß eine Population von Zellen unter kontinuierlichen Kulturbedingungen ausschließlich in Suspension profiliert, durch vorzugsweise periodische Überführung der Organismensuspension aus einem ersten Kulturgefäß in ein zweites Kulturgefäß erfüllt. Nach der Überführung wird das erste Kulturgefäß einer sterilisierenden Behandlung unterzogen, das sterilisierende Agens gegebenenfalls neutralisiert, und das erste Kulturgefäß ist dann wiederum bereit für dieSpecifically, the requirement that a population of cells profile under continuous culture conditions exclusively in suspension is met by preferably periodic transfer of the organism suspension from a first culture vessel to a second culture vessel. After the transfer, the first culture vessel is subjected to a sterilizing treatment, the sterilizing agent is neutralized if necessary, and the first culture vessel is then ready for the

Rücküberführung der Kultur aus dem zweiten Kulturgefäß, das 20Transfer the culture back from the second culture vessel, which is 20

anschließend der Sterilisation und Neutralisation unterzogen wird. Dieser Ablauf stellt dabei sicher, daß (i) die Population von Organismen in Suspension zu jedem Zeitpunkt erhalten bleibt und (ii) alle verdünnungsresistenten Varianten in irgend einem Teil der Apparatur während jedem der Zyklen zerstört werden.is then subjected to sterilization and neutralization. This procedure ensures that (i) the population of organisms in suspension is maintained at all times and (ii) all dilution-resistant variants in any part of the apparatus are destroyed during each of the cycles.

Das Verfahren der alternierenden Sterilisierung der Kulturgefäße selektioniert vorzugsweise direkt und regelmäßig gegen Variante Organismen, die Oberflächen in der Apparatur besiedeln und verhindert die Proliferation und Adaption einer statischen, verdünnungsresistenten Population. Jede Vorrichtung zur kontinuierlichen Kultur von Organismen kann als Apparatur betrachtet werden, in der die natürliche Selektion Mutanten bevorzugt, die der Verdünnung widerstehen. Das beschriebene Verfahren bietet der kultivierten Population als einzigeThe method of alternating sterilization of the culture vessels preferentially selects directly and regularly against variant organisms that colonize surfaces in the apparatus and prevents the proliferation and adaptation of a static, dilution-resistant population. Any device for the continuous culture of organisms can be considered an apparatus in which natural selection favors mutants that resist dilution. The method described is the only one that offers the cultured population

Möglichkeit durch eine Erhöhung der Proliferationsrate in Sus- ^: pension der Verdünnung zu widerstehen. Im Unterschied zu einem Fermentationsverfahren beschreibt die Erfindung ein Verfahren c der automatisierten Genetik, das gleichzeitig statische Varianten gegenselektioniert und dynamische Varianten bevorzugt, die immer besser an die Kulturbedingungen angepaßt sind. -Possibility of resisting dilution by increasing the proliferation rate in ^suspension . In contrast to a fermentation process, the invention describes a process of automated genetics that simultaneously counter-selects static variants and favors dynamic variants that are increasingly better adapted to the culture conditions. -

Somit hat die vorliegende Erfindung gegenüber dem Stand der Technik insbesondere den Vorteil, daß ein Regime konstanter Zelldichte (Turbidostat) über unbegrenzte Zeiträume aufrechterhalten werden kann und daß die Wachstumsrate natürlich vorkommender oder gentechnisch veränderter Zellen erhöht werden kann. Ein Beispiel für industrielle Anwendungen ist die Anreicherung natürlicher Varianten, die ein chemisches Produkt (wie z.B. ein Zwischenprodukt chemischer Synthese oder ein Umweltgift) metabolisieren können. Ein weiterer Fall wäre dieThus, the present invention has the particular advantage over the prior art that a regime of constant cell density (turbidostat) can be maintained over unlimited periods of time and that the growth rate of naturally occurring or genetically modified cells can be increased. An example of industrial applications is the enrichment of natural variants that can metabolize a chemical product (such as an intermediate product of chemical synthesis or an environmental poison). Another case would be the

Verbesserung eines Enzyms oder eines Stoffwechselweges: wenn 20Improvement of an enzyme or metabolic pathway: if 20

die Umwandlung eines Substrats in ein Produkt der limitierende Schritt im Stoffwechsel einer Zelle ist und die Zelle mit diesem Substrat im Überschuß versorgt werden kann, so wird die kontinuierliche Kultur unter den beschriebenen Bedingungen zu einer Zunahme der Wachstumsrate führen, die aus einer erhöhten Umsatzrate des Substrats resultiert, und diese erhöhte Umsatzrate resultiert aus der Fixierung von aufeinanderfolgenden Mutationen in dem Gen oder den Genen für die Enzyme, die fürthe conversion of a substrate into a product is the limiting step in the metabolism of a cell and the cell can be supplied with this substrate in excess, continuous culture under the conditions described will lead to an increase in the growth rate resulting from an increased turnover rate of the substrate, and this increased turnover rate results from the fixation of successive mutations in the gene or genes for the enzymes responsible for

den zu leistenden Umsatz des Substrats der Selektion unter-30 the turnover of the substrate of selection under-30

liegen.lay.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß mehrere verschiedene Wachstumsmedien der Organismensuspension 5 durch die Apparatur zugeführt werden können. Dies erlaubt, vielfache oder alternierende Adaption durchzuführen und die metabolische Kapazität der kultivierten Organismen zu diversi-A further advantage of the present invention is that several different growth media can be fed to the organism suspension 5 through the apparatus. This allows multiple or alternating adaptation to be carried out and the metabolic capacity of the cultured organisms to be diversified.

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fizieren. Eine vorgewählte Zelldichte kann von anderen Vari- ^: ablen als der Zufuhr frischen Mediums abhängig gemacht werden. Das Erreichen dieser Dichte kann die Wirkung chemischer und ,. physikalischer Agenzien konditionieren, deren Toxizität derart eingestellt ist, daß die Population der Organismen ständig an ihrer Toleranzgrenze ist oder daß zunehmend resistente Varianten selektioniert werden. Zudem können durch die Zufuhr von Detergenzien oder Lösungsmitteln bestimmte Bestandteile von Zellen extrahiert werden. Insbesondere können genetisches Material wie Plasmide oder Viren automatisch extrahiert werden, wobei die Wirtszellen zerstört werden. Auf der anderen Seite können bestimmte Agenzien zugeführt werden, die die Zellen kompetent für genetische Transformation oder Infektion mit natürlichen oder synthetisch hergestellten Nucleinsäuren machen. Dieses genetische Material kann dann in die Population eingeführt werden. Ganz allgemein können zwei oder mehrere Apparaturen miteinander verbunden werden. Damit können verschie-20 A preselected cell density can be made dependent on ^variables other than the supply of fresh medium. The attainment of this density can condition the effect of chemical and physical agents whose toxicity is adjusted in such a way that the population of organisms is constantly at its tolerance limit or that increasingly resistant variants are selected. In addition, certain components of cells can be extracted by the supply of detergents or solvents. In particular, genetic material such as plasmids or viruses can be extracted automatically, destroying the host cells. On the other hand, certain agents can be supplied which make the cells competent for genetic transformation or infection with natural or synthetically produced nucleic acids. This genetic material can then be introduced into the population. In general, two or more apparatuses can be connected to one another. This allows different

dene Organismen automatisch in Kontakt gebracht werden und esorganisms are automatically brought into contact and it

können automatisch verschiedenste genetische Materialien, wie z.B. konjugative Episomen, Phagen, Transposons, usw. eingeführt werden.
25A wide variety of genetic materials, such as conjugative episomes, phages, transposons, etc., can be automatically introduced.
25

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand einer bevorzugten Ausführungsform beispielhaft unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Darin zeigen:The present invention is described below using a preferred embodiment as an example with reference to the drawings. In these:

Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension in einer Ausgangsposition, in der sich die Zellsuspensionen in einem ersten Kulturgefäß befindet; Fig. 1 shows a device according to the invention for the selection of accelerated proliferation of living cells in suspension in a starting position in which the cell suspensions are in a first culture vessel;

Fig. 2 die Vorrichtung von Fig. 1, bei der sich die Zellsuspension in einem zweiten Kulturgefäß befindet,Fig. 2 the device of Fig. 1, in which the cell suspension is in a second culture vessel,

Fig. 3 die Vorrichtung von Fig. 2, wobei das erste Kultur- - gefäß ein sterilisierendes Agens aufweist;Fig. 3 shows the device of Fig. 2, wherein the first culture vessel comprises a sterilizing agent;

Fig. 4 die Sterilisierung einzelner Leitungsabschnitte;
Fig. 5 die Vorrichtung beim Entfernen des sterilisierenden Agens aus dem ersten Kulturgefäß sowie den dazugehörigen Leitungsabschnitten;Fig. 4 the sterilization of individual pipe sections;
Fig. 5 the device during removal of the sterilizing agent from the first culture vessel and the associated line sections;

Fig. 6-8 Schritte zur Entfernung und Neutralisierung von Resten des sterilisierenden Agens aus dem ersten Kulturgefäß und den dazugehörigen Leitungsabschnitten mit einer Waschlösung;Fig. 6-8 Steps for removing and neutralizing residues of the sterilizing agent from the first culture vessel and the associated line sections with a washing solution;

Fig. 9 die Vorrichtung von Fig. 3, bei der das erste Kulturgefäß und die dazugehörigen Leitungsabschnitte sterilisiert und neutralisiert sind; undFig. 9 the device of Fig. 3, in which the first culture vessel and the associated line sections are sterilized and neutralized; and

Fig. 10-16 die entsprechend umgekehrte Vorgehensweise zur Überführung der Kultur aus dem zweiten Kulturgefäß in das erste Kulturgefäß.Fig. 10-16 the corresponding reverse procedure for transferring the culture from the second culture vessel into the first culture vessel.

Die in den Figuren 1 bis 16 dargestellte Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension kann auch als Kulturapparatur 2 bezeichnet werden. Die Kulturapparatur 2 ermöglicht die Proliferation von Zellen in Suspension über unbegrenzte Zeiträume. Durch die natürliche Selektion werden genetische Varianten angereichert, die zunehmend besser an die gewählten Kulturbedingungen angepaßt sind. Die verwendeten Organismen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Ferner können die verwendeten Organismen natürlich vorkommend oder genetisch verändert sein. Konstante (Kubitschek, H.E. (1970): Introduction to research with continuous cultures. Prentice-Hall; Pirt, S. J. (1975): Principles of microbe and cell cultivation. Blackwell) , periodische (Pirt, a.a.O.) oder konditionale (Bryson, V. (1952): The turbidostatic selector - a device for automated isolation of bacterial variants. Science 116, 48-51; Fraleigh, S.P.,The device shown in Figures 1 to 16 for the selection of accelerated proliferation of living cells in suspension can also be referred to as culture apparatus 2. The culture apparatus 2 enables the proliferation of cells in suspension over unlimited periods of time. Natural selection enriches genetic variants that are increasingly better adapted to the selected culture conditions. The organisms used can be prokaryotic or eukaryotic. Furthermore, the organisms used can be naturally occurring or genetically modified. Constant (Kubitschek, H.E. (1970): Introduction to research with continuous cultures. Prentice-Hall; Pirt, S. J. (1975): Principles of microbe and cell cultivation. Blackwell), periodic (Pirt, a.a.O.) or conditional (Bryson, V. (1952): The turbidostatic selector - a device for automated isolation of bacterial variants. Science 116, 48-51; Fraleigh, S.P.,

Bungay, H.R. and Clesceri, L.S. (1989): Continuous culture, feedback and auxostats. TIBTech. 7, 159-164) Kulturbedingungen können verwendet werden. Physikalische und chemische Charakteristika der benutzten Kulturmedien können vom Benutzer gewählt werden.Bungay, H.R. and Clesceri, L.S. (1989): Continuous culture, feedback and auxostats. TIBTech. 7, 159-164) Culture conditions can be used. Physical and chemical characteristics of the culture media used can be selected by the user.

Der Aufbau und das Funktionsschema der Kulturapparatur 2 wird nachstehend anhand der Figuren 1 bis 16 beschrieben. Die Kulturapparatur 2 weist im wesentlichen ein erstes Kulturgefäß 4 und ein zweites Kulturgefäß 6 auf. Die beiden Kulturgefäße 4 und 6 sind über Leitungen 8 bzw. 10, die vorzugsweise in den unteren Bereich der Kulturgefäße 4 bzw. 6 münden, mit einer unter Überdruck stehenden Gasversorgung 12 verbunden. Des weiteren sind die Kulturgefäße 4 und 6 über Leitungen 14 und 16 jeweils mit einer ebenfalls unter Überdruck stehenden Mediumsquelle 18 verbunden. Die Leitungen 14 und 16 münden vorzugsweise von der Mediumsquelle 18 kommend jeweils in die Lei-The structure and functional diagram of the culture apparatus 2 is described below using Figures 1 to 16. The culture apparatus 2 essentially has a first culture vessel 4 and a second culture vessel 6. The two culture vessels 4 and 6 are connected to a gas supply 12 under overpressure via lines 8 and 10, which preferably open into the lower area of the culture vessels 4 and 6, respectively. Furthermore, the culture vessels 4 and 6 are each connected to a medium source 18, which is also under overpressure, via lines 14 and 16. The lines 14 and 16 preferably open from the medium source 18 into the lines

tungen 8 bzw. 10 zur Verbindung der Gasversorgung 12 mit den beiden Kulturgefäßen 4 bzw. 6. Darüber hinaus ist eine unter Überdruck stehende Quelle 20 für ein sterilisierendes Agens 21 (z.B. NaOH) vorgesehen, die mittels Leitungen 22 und 24 mit den jeweiligen Kulturgefäßen 4 bzw. 6 in Verbindung steht. Vorzugsweise münden die Leitungen 22 und 24 in die Leitungen 8 und 10, wie vorstehend für die Leitungen 14 und 16 beschrieben. lines 8 and 10 for connecting the gas supply 12 to the two culture vessels 4 and 6, respectively. In addition, a source 20 under overpressure for a sterilizing agent 21 (e.g. NaOH) is provided, which is connected to the respective culture vessels 4 and 6 by means of lines 22 and 24. Preferably, the lines 22 and 24 open into the lines 8 and 10, as described above for the lines 14 and 16.

An den Kulturgefäßen 4 und 6 ist ferner jeweils eine Ablaßleitung 26 bzw. 28 vorgesehen, um überschüssiges sterilisierendes Agens 21 bzw. Waschlösungen 19 während der Sterilisation und Neutralisation des jeweiligen Kulturgefäßes 4 oder 6 abzuführen. Des weiteren sind Verbindungsleitungen 30, 31, 32 und 33 zwischen den beiden Kulturgefäßen 4 und 6 vorgesehen, um die beiden Kulturgefäße 4 und 6 miteinander in VerbindungFurthermore, a drain line 26 or 28 is provided on the culture vessels 4 and 6 in order to drain off excess sterilizing agent 21 or washing solutions 19 during the sterilization and neutralization of the respective culture vessel 4 or 6. Furthermore, connecting lines 30, 31, 32 and 33 are provided between the two culture vessels 4 and 6 in order to connect the two culture vessels 4 and 6 with one another.

zu bringen. Vorzugsweise weisen mindestens zwei der Verbindungsleitungen einen gemeinsamen Abschnitt 34 und 35 auf, an dem eine Ablaßleitung 36 vorgesehen ist, die der vollständigen Entleerung eines der beiden Kulturgefäße 4 oder 6 oder der Entnahme der Kultur 38 oder eines Teils davon dient.Preferably, at least two of the connecting lines have a common section 34 and 35, on which a drain line 36 is provided, which serves for the complete emptying of one of the two culture vessels 4 or 6 or for the removal of the culture 38 or a part thereof.

Zur Steuerung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension sind ferner in den Leitungen oder Leitungsabschnitten 14, 16, 22, 24, 30, 31, 32, 33, 34, 35 und 36 Ventile (schematisch dargestellt) vorgesehen. Die Ventile können beispielsweise mechanisch betätigt werden oder aber vorzugsweise unter Verwendung einer nicht dargestellten Steuereinrichtung elektrisch bzw. elektronisch vorzugsweise automatisch angesteuert werden.To control the device according to the invention for selecting accelerated proliferation of living cells in suspension, valves (shown schematically) are also provided in the lines or line sections 14, 16, 22, 24, 30, 31, 32, 33, 34, 35 and 36. The valves can be actuated mechanically, for example, or can preferably be controlled electrically or electronically, preferably automatically, using a control device (not shown).

Im folgenden wird anhand der Figuren 1 bis 16 das Funktionsschema der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit der vorste-20 In the following, the functional diagram of the device according to the invention with the above-mentioned 20

hend beschriebenen Kulturapparatur 2 näher erläutert. Dazu ist anzumerken, daß abgesperrte Leitungsabschnitte dünn und durchströmte bzw. durchströmbare Leitungsabschnitte oder Leitungen dick eingezeichnet sind. Die Ventile sind lediglich schematisch dargestellt, so daß aufgrund ihrer Darstellungsform kein Rückschluß auf die verwendete Ventilart gemacht werden sollte. Ebenso ist der Leitungsplan sowie die Ventilanordnung lediglich schematisch. Geeignete Ventile sowie die bestmögliche Leitungsführung sowie Ventilanordnung können je nach Anwendungsfall variieren.The culture apparatus 2 described above is explained in more detail. It should be noted that closed-off pipe sections are shown in thin lines and pipe sections or pipes through which flow or through which flow can occur are shown in thick lines. The valves are only shown schematically, so that no conclusions should be drawn about the type of valve used based on their form of representation. The pipe plan and the valve arrangement are also only schematic. Suitable valves and the best possible pipe routing and valve arrangement can vary depending on the application.

Die Figuren 1 bis 16 stellen die wichtigsten aufeinanderfolgenden Etappen im Kultivierungs/Sterilisierungszyklus dar. Gemäß Fig. 1 befindet sich die Zellsuspension unter vorgewähltem Kulturregime (Chemostat, Turbidostat) im ersten Kulturgefäß 4. Die Ventile sind dabei so angesteuert, daß das er-Figures 1 to 16 represent the most important successive stages in the cultivation/sterilization cycle. According to Fig. 1, the cell suspension is under a preselected culture regime (chemostat, turbidostat) in the first culture vessel 4. The valves are controlled in such a way that the

ste Kulturgefäß 4 sowohl mit der Gasversorgung 12 wie auch mit der Mediumsquelle 18 in Verbindung steht, um der Kultur 38 regelmäßig Flüssigkeiten, wie z.B. Nährmedien und Waschlösungen !- nachzuliefern und eine kontinuierliche Versorgung mit sterilen Gasen, wie z.B. Luft, zu gewährleisten. Die Verbindung des ersten Kulturgefäßes 4 zur Quelle 20 für das sterilisierende Agens 21 ist durch das entsprechende Ventil unterbrochen. Das zweite Kulturgefäß 6 hat eine Verbindung zur Gasquelle 12. Durch die Leitung 36 kann die Kultur 38 oder Teile davon entnommen werden.The first culture vessel 4 is connected to both the gas supply 12 and the medium source 18 in order to regularly supply the culture 38 with liquids such as nutrient media and washing solutions and to ensure a continuous supply of sterile gases such as air. The connection of the first culture vessel 4 to the source 20 for the sterilizing agent 21 is interrupted by the corresponding valve. The second culture vessel 6 is connected to the gas source 12. The culture 38 or parts thereof can be removed through the line 36.

Entsprechend Fig. 2 ist die Kultur 38 über die Leitungen 32, 34, 35 und 33 in das zweite Kulturgefäß 6 überführt worden, wobei das Öffnen der Leitung 28 einen Druckausgleich gewährleistet. Alle von der Mediumsquelle 18 und der Quelle 20 des sterilisierenden Agens zu den Kulturgefäßen 4 und 6 führendenAccording to Fig. 2, the culture 38 has been transferred to the second culture vessel 6 via the lines 32, 34, 35 and 33, whereby the opening of the line 28 ensures pressure equalization. All lines leading from the medium source 18 and the source 20 of the sterilizing agent to the culture vessels 4 and 6

Leitungen sind abgesperrt.
20Lines are blocked.
20

In der in Fig. 3 dargestellten Situation ist nach Absperren der Leitungen 32, 34, 35 und 33 und Öffnen der Leitungen 22 und 26 das erste Kulturgefäß 4 mit sterilisierendem Agens 21 gefüllt worden; ein Überschuß an sterilisierendem Agens 21 wird über die Ablaßleitung 26 abgeführt. Die Kultur 38 im zweiten Kulturgefäß 6 kann nach Herstellung der Verbindung 16 zwischen der Mediumsquelle 18 und dem Kulturgefäß 6 sowie Absperren der Leitung 28 und Öffnen der Leitungsabschnitte 31, 33, 35 und 36 wieder regelmäßig mit Medium versorgt werden.In the situation shown in Fig. 3, after shutting off the lines 32, 34, 35 and 33 and opening the lines 22 and 26, the first culture vessel 4 has been filled with sterilizing agent 21; an excess of sterilizing agent 21 is discharged via the drain line 26. The culture 38 in the second culture vessel 6 can be regularly supplied with medium again after establishing the connection 16 between the medium source 18 and the culture vessel 6 and shutting off the line 28 and opening the line sections 31, 33, 35 and 36.

Fig. 4 zeigt die Sterilisierung der Leitungen 30, 34 und 36 durch sterilisierendes Agens 21 nach Öffnen der entsprechenden Leitungsabschnitte und Schließen der Ablaßleitung 26.Fig. 4 shows the sterilization of the lines 30, 34 and 36 by sterilizing agent 21 after opening the corresponding line sections and closing the drain line 26.

Das sterilisierende Agens 21 wird nun gemäß Fig. 5 nach Absperren der Leitungen 22, 26 und 30 sowie Öffnen der Leitung 32 aus dem ersten Kulturgefäß 4 entfernt.The sterilizing agent 21 is now removed from the first culture vessel 4 according to Fig. 5 after shutting off the lines 22, 26 and 30 and opening the line 32.

Die Figuren 6 bis 8 zeigen vorzugsweise optionale Schritte zur Entfernung und Neutralisierung von eventuell verbliebenen Resten des sterilisierenden Agens 21 aus dem ersten Kulturgefäß 4 und den dazugehörigen Leitungsabschnitten durch frisches Medium:Figures 6 to 8 preferably show optional steps for removing and neutralizing any remaining residues of the sterilizing agent 21 from the first culture vessel 4 and the associated line sections using fresh medium:

In Fig. 6 wird das erste Kulturgefäß 4 nach Schließen der Leitungen 32 und 36 und Öffnen der Leitung 26 durch Öffnen der Leitung 14 mit Medium gefüllt, überschüssiges Medium wird durch die Ablaßleitung 26 abgeführt. Analog der Situation in Fig. 4 werden nun die Leitungen 30, 34 und 36 mit Medium durchspült (Fig. 7), urn dann das Medium analog der SituationIn Fig. 6, the first culture vessel 4 is filled with medium after closing the lines 32 and 36 and opening the line 26 by opening the line 14, excess medium is drained through the drain line 26. Analogous to the situation in Fig. 4, the lines 30, 34 and 36 are now flushed with medium (Fig. 7), in order to then drain the medium analogously to the situation

in Fig. 5 aus dem Kulturgefäß zu entfernen (Fig. 8).
20in Fig. 5 from the culture vessel (Fig. 8).
20

Nach dem Öffnen der Leitung 26 und Schließen der Leitungen 32 und 34 des Kulturgefäßes 4 ergibt sich eine Situation, die der in Fig. 1 dargestellten spiegelsymmetrisch ist, wobei sich die Zellsuspension nun im zweiten Kulturgefäß 6 befindet. Durch die Leitung 36 kann die Kultur 38 oder Teile davon entnommen werden.After opening the line 26 and closing the lines 32 and 34 of the culture vessel 4, a situation arises that is mirror-symmetrical to that shown in Fig. 1, with the cell suspension now being in the second culture vessel 6. The culture 38 or parts thereof can be removed through the line 36.

Die Figuren 10 bis 16 stellen die entsprechenden symmetrischen Schritte dar, um zur Ausgangssituation in Fig. 1 zurückzukehren, nämlich: Fig. 10, Überführung der Kultur 38 aus dem zweiten Kulturgefäß 6 in das erste Kulturgefäß 4; Fig. 11, Sterilisieren des zweiten Kulturgefäßes 6 mit sterilisierendem Agens 21; Fig. 12, Sterilisieren der Leitungsabschnitte 31, 35 und 36; Fig. 13, Entfernen des sterilisierenden Agens 21 über die Leitungsabschnitte 33, 35 und 36; Fig. 14, Waschen desFigures 10 to 16 show the corresponding symmetrical steps to return to the starting situation in Fig. 1, namely: Fig. 10, transfer of the culture 38 from the second culture vessel 6 into the first culture vessel 4; Fig. 11, sterilizing the second culture vessel 6 with sterilizing agent 21; Fig. 12, sterilizing the line sections 31, 35 and 36; Fig. 13, removing the sterilizing agent 21 via the line sections 33, 35 and 36; Fig. 14, washing the

Kulturgefäßes 6 und der Ablaßleitung 28 mit frischem Medium; Fig. 15, Waschen der Leitungen 31, 35 und 36 durch frisches Medium und Fig. 16, Entfernen des zum Waschen verwendeten Mediums über die Leitungen 33, 35 und 36. Öffnen der Leitung 14 zum Kulturgefäß 4, Öffnen der Leitungen 30 und 34 und Schließen der Leitungen 26 sowie Öffnen der Leitung 28 und Schließen der Leitungsabschnitte 33 und 35 stellt die Ausgangssituation von Fig. 1 wieder her.culture vessel 6 and the drain line 28 with fresh medium; Fig. 15, washing the lines 31, 35 and 36 with fresh medium and Fig. 16, removing the medium used for washing via the lines 33, 35 and 36. Opening the line 14 to the culture vessel 4, opening the lines 30 and 34 and closing the lines 26 as well as opening the line 28 and closing the line sections 33 and 35 restores the initial situation from Fig. 1.

Anzumerken ist, daß zu jedem Zeitpunkt des vorstehend beschriebenen Verfahrens, zu dem die Ablaßleitung 36 nicht von sterilisierendem Agens durchströmt wird, ein Abführen der KuI-tür 38 durch den jeweiligen Verbindungsabschnitt und die Ablaßleitung 36 gewährleistet ist.It should be noted that at any time during the process described above when the drain line 36 is not flowing with sterilizing agent, the cooling door 38 is ensured to be drained through the respective connecting section and the drain line 36.

Des weiteren ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung zweier Kulturgefäße 4 und 6 beschränkt, sondern esFurthermore, the present invention is not limited to the use of two culture vessels 4 and 6, but

können auch mehrere Kulturgefäße, z.B. in SerienschaltungSeveral culture vessels can also be connected in series, e.g.

und/oder in Parallelschaltung angeordnet sein, so daß mehrere erste Kulturgefäße 4i und mehrere zweite Kulturgefäße 6i vorhanden sind.
25and/or arranged in parallel so that several first culture vessels 4i and several second culture vessels 6i are present.
25

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wäre es möglich, außer dem ersten und zweiten Kulturgefäß mindestens ein weiteres Kulturgefäß vorzusehen, um z.B. ein bereits verwendetes sterilisierendes Agens 21, das jedoch nochmals verwendet werden könnte, zwischenzuspeichern. Auch für etwaige Zwischenschritte wäre es denkbar, ein weiteres Kulturgefäß vorzusehen.In a further embodiment of the present invention, it would be possible to provide at least one further culture vessel in addition to the first and second culture vessels, for example to temporarily store a sterilizing agent 21 that has already been used but could be used again. It would also be conceivable to provide a further culture vessel for any intermediate steps.

Claims

13 Protection claims

1. Device for the selection of accelerated proliferation of living cells in suspension with:

• (a) at least one first and at least one second culture vessel (4, 6) for receiving a culture (38);

(b) a gas source (12);

(c) a medium source (18);

(d) a source (20) of a sterilizing agent (21); and

(e) a line system with means for selectively connecting one of the two culture vessels (4 or 6) to the medium source (18) and the two culture vessels (4, 6) to each other and for selectively connecting the correspondingly other culture vessel (4 or 6) to the source (20) for the sterilizing agent (21).

2. Apparatus according to claim 1, wherein the means for selectively connecting are valves.

3. Device according to claim 1 or 2, wherein between the two culture vessels (4, 6) two connecting lines (30,

32) are provided, which have a common line section (34).

4. Device according to claim 3, wherein a drain line (36) is provided on the common line section (34), through which cultures (38) can be removed from the culture vessels (4, 6).

5. Device according to claim 3 or 4, wherein one of the connecting lines (32) is connected to a lower region of the culture vessels (4, 6) and the other of the connecting lines

(30) is connected to an upper area of the culture vessels (4, 6).

c

6. Device according to one of claims 1 to 5, wherein lines (14, 16) from the medium source (18) and/or lines (22, 24) from the source (20) for the sterilizing agent (21) each open into a line (8, 10) coming from the gas source (12) and associated with the respective culture vessel (4, 6).

7. Device according to one of claims 1 to 6, wherein the lines of the line system which are connected to the gas source (12), the medium source (18) and/or the source (20) are under overpressure.

8. Device according to one of claims 1 to 7, wherein a

Separate, lockable drain line (26, 28) for each of the 20

culture vessels (4, 6).

9. Device according to claim 8, wherein the drain lines (26, 28) open out of the upper region of the culture vessels (4, 6) and/or branch off from the connecting line (30).

10. Device according to one of claims 1 to 9, wherein the means for connecting the lines of the line system can be controlled electrically and/or electronically.

11. Device according to one of claims 1 to 10, wherein several first culture vessels (4i) and/or several second culture vessels (6i) are provided in parallel connection.