DE2950454C2

DE2950454C2 -

Info

Publication number: DE2950454C2
Application number: DE19792950454
Authority: DE
Inventors: Akira Souka Saitama Jp Tanaka
Original assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Current assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 1979-12-14
Filing date: 1979-12-14
Publication date: 1989-05-11
Also published as: DE2950454A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Erzeugung eines für Strukturuntersuchungen in einem Durchstrahlungs-Elektronenmikroskop geeigneten Abdruckfilmes der im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Art.The invention relates to a device for generating a for structural studies in a transmission electron microscope suitable impression film in the preamble of Claim 1 specified type.

Es ist bekannt, daß das Auflösungsvermögen von Durchstrahlungselektronenmikroskopen 1 Å oder weniger erreicht und man daher mit solchen Mikroskopen atomare Strukturen spezieller Objekte untersuchen kann. Im allgemeinen lassen zu untersuchende Objekte, speziell biologische Objekte, die volle Ausnutzung des hohen Auflösungsvermögens der zur Verfügung stehenden Durchstrahlungselektronenmikroskope aufgrund der technischen Grenzen der bisher bekannten Abdruckfilme nicht zu. Wenn beispielsweise die Oberfläche eines biologischen Objekts untersucht werden soll, benutzt man im allgemeinen ein Abtastelektronenmikroskop. Das theoretische Auflösungsvermögen des Abtastelektronenmikroskops ist auf etwa 70 Å begrenzt. Das praktische Auflösungsvermögen eines solchen Mikroskops ist indessen weitaus geringer als das theoretische. Daher lassen sich Ultra-Mikro-Strukturen biologischer Objekte nicht untersuchen. Wenn man andererseits die Oberflächenstruktur eines Objekts mit Hilfe eines Durchstrahlungselektronenmikroskops untersuchen will, dann bedient man sich hierzu eines Abdruckfilms aus Metall, der beispielsweise durch ein Vakuumverdampfungsverfahren hergestellt wurde. Da die Körnung des metallischen Abdruckfilms das Auflösungsvermögen beeinträchtigt, ist auch in diesem Falle eine Auflösung nur bis zu 50 Å erreichbar. Wenn man die Korngröße im Abdruckfilm verringern könnte oder wenn man eine amorphe Struktur im Abdruckfilm erzielen könnte, dann würde das Auflösungsvermögen etwa zehnmal so groß oder mehr sein. Hierdurch würden sich speziell auf dem biomedizinischen Gebiet erhebliche Fortschritte bei der Elektronenmikroskopie ergeben.It is known that the resolving power of transmission electron microscopes 1 Å or less is reached and therefore with such microscopes atomic structures of special objects can examine. In general, to be examined Objects, especially biological objects, the full exploitation the high resolution of the available Transmission electron microscopes due to the technical Limits of previously known impression films not too. If, for example examined the surface of a biological object is to be used, one generally uses a scanning electron microscope. The theoretical resolution of the Scanning electron microscope is limited to about 70 Å. The practical resolution of such a microscope much less than the theoretical, however. Therefore leave Do not investigate ultra-micro-structures of biological objects. On the other hand, if you look at the surface texture of a Object using a transmission electron microscope wants to investigate, then one uses this purpose an impression film made of metal, for example by a vacuum evaporation process was produced. Because the grain of the metallic Imprint film affects the resolution is also in this case a resolution only up to 50 Å can be achieved. If you could reduce the grain size in the impression film or if you achieve an amorphous structure in the impression film could, then the resolution would be about ten times be that big or more. This would be special significant progress in the biomedical field in electron microscopy.

Unter Bezugnahme auf die Fig. 1A, 2A und 3A soll nachfolgend die konventionelle Metallabdruckfilmtechnik beschrieben werden.With reference to Figs. 1A, 2A and 3A, the conventional metal impression film technique will be described below.

Fig. 1A zeigt eine übliche Vakuumverdampfungsvorrichtung, in der ein Schwermetall 3′ unter Vakuum von beispielsweise 10^-6 Torr verdampft wird. Das verdampfte Metall trifft unter einem Winkel gegenüber der horizontalen Ebene auf die Oberfläche eines zu untersuchenden Objekts 1 auf, das horizontal in der Vorrichtung placiert ist. Man spricht hier vom sogenannten Schrägbedampfungsverfahren. Dann wird Kohlenstoff 2′ verdampft und als Verstärkungsfilm auf die gesamte Oberfläche des Objekts 1 niedergeschlagen. Wie Fig. 2A-(a) zeigt, ergibt sich eine spezielle Struktur auf der Oberfläche des Objekts 1, auf der der niedergeschlagene Metallfilm 2 und der Kohlenstoffilm 3 teilweise übereinanderliegen. Das Objekt 1 wird dann von den beiden übereinanderliegenden Filmen 2 und 3 gelöst. Das Ergebnis ist in Fig. 2A-(b) dargestellt. Wenn man diesen Abdruckfilm mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachtet, dann ergibt sich eine Differenz in der Elektronendichteverteilung, die in Fig. 2A-(c) dargestellt ist, die aus der ungleichmäßigen Abscheidung des Metalls hervorgeht. Man erhält ein Stereo- oder dreidimensionales Bild, das in Fig. 2A-(d) dargestellt ist, und zwar aufgrund der Differenz in der Dichte des durchgelassenen Elektronenstrahls. Dies ist das Grundprinzip der konventionellen Metallabdrucktechnik. Fig. 1A shows a conventional vacuum evaporation apparatus in which a heavy metal 3 'is evaporated under a vacuum of, for example, 10 ^-6 Torr. The evaporated metal strikes the surface of an object 1 to be examined, which is placed horizontally in the device, at an angle to the horizontal plane. One speaks here of the so-called Schrägbedampfungsverfahren. Then carbon 2 'is vaporized and deposited as a reinforcing film on the entire surface of the object 1 . As shown in Fig. 2A- (a), a specific structure is formed on the surface of the object 1 on which the deposited metal film 2 and the carbon film 3 partially overlap each other. The object 1 is then released from the two superimposed films 2 and 3 . The result is shown in Fig. 2A- (b). Looking at this imprint film with a transmission electron microscope, there is a difference in the electron density distribution shown in Fig. 2A - (c) resulting from the uneven deposition of the metal. A stereo or three-dimensional image is obtained, which is shown in Fig. 2A- (d), due to the difference in the density of the transmitted electron beam. This is the basic principle of conventional metal stamping technology.

Wenn man das Objekt 1 nicht vom Film löst, beispielsweise weil es sich davon nicht ablösen läßt, dann wird ein sogenanntes zweistufiges Verfahren durchgeführt, das in Fig. 3A dargestellt ist. Wie Fig. 3A-(a) zeigt, wird ein geeignetes härtbares Material 4, das sich in einem Lösungsmittel auflösen läßt, auf die Oberfläche des Objekts 1 aufgebracht. Die gehärtete Materialschicht 4 wird dann vom Objekt 1 abgenommen. Die Unterseite der Schicht 4 hat dann exakt die komplementäre Oberflächentopographie des Objekts 1. Auf diese Unterseite der Schicht 4 werden dann die Metallschicht 2 und die Kohlenstoffschicht 3 nach dem oben genannten Verfahren niedergeschlagen. Das Ergebnis ist in Fig. 3A-(c) dargestellt. Durch nachfolgende Auflösung der Schicht 4 ergibt sich ein Abdruckfilm aus zwei Schichten 2 und 3, der in Fig. 3A-(d) dargestellt ist. Wenn man diesen Abdruckfilm mit Hilfe eines Durchstrahlungselektronenmikroskops betrachtet, dann ergibt sich eine Elektronendichteverteilung und ein Stereobild, wie in den Fig. 3A-(e) und (f) dargestellt.If one does not detach the object 1 from the film, for example, because it can not be detached from it, then a so-called two-stage process is performed, which is shown in Fig. 3A. As shown in Fig. 3A- (a), a suitable hardenable material 4 which can be dissolved in a solvent is applied to the surface of the object 1 . The hardened material layer 4 is then removed from the object 1 . The underside of the layer 4 then has exactly the complementary surface topography of the object 1 . Then to this underside of the layer 4, the metal layer 2 and the deposited carbon layer 3 according to the above method. The result is shown in Fig. 3A- (c). Subsequent dissolution of the layer 4 results in an impression film of two layers 2 and 3 , which is shown in FIG. 3A- (d). When viewing this impression film by means of a transmission electron microscope, an electron density distribution and a stereo image result as shown in Figs. 3A-e and f.

Der Kohlenstoffilm hat beim oben beschriebenen Abdruckfilm eine Struktur, die ähnlich der für elektronenmikroskopische Zwecke erwünschten amorphen Struktur ist. Da die Elektronendichte der Kohlenstoffschicht sehr niedrig ist, gelangt ein relativ hoher Anteil des Elektronenstrahls durch die Kohlenstoffschicht selbst dann hindurch, wenn diese mit relativ großer Dicke niedergeschlagen worden ist. Aus diesem Grunde ist, wie Fig. 5A zeigt, kein befriedigendes Stereobild erzielbar. Aus diesem Grunde stellt man üblicherweise Abdruckfilme, mit denen man unebene Oberflächen von Objekten elektronenmikroskopisch darstellen will, mit dem eingangs beschriebenen Schrägbedampfungsverfahren unter Zuhilfenahme von Schwermetallen her, die eine hohe Elektronendichte aufweisen. Wenn man einen so hergestellten Abdruckfilm mit dem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachtet, ergibt sich ein Stereobild, wie es in Fig. 7A dargestellt ist.The carbon film in the above-described impression film has a structure similar to the amorphous structure desired for electron microscopic purposes. Since the electron density of the carbon layer is very low, a relatively high proportion of the electron beam passes through the carbon layer even if it has been deposited with a relatively large thickness. For this reason, as Fig. 5A shows, no satisfactory stereo image can be obtained. For this reason, one usually produces impression films, with which one wants to represent uneven surfaces of objects electron microscopically, with the Schrägbedampfungsverfahren described above with the aid of heavy metals ago, which have a high electron density. When viewing an imprint film thus prepared by the transmission electron microscope, the result is a stereo image as shown in Fig. 7A.

In einem Film, der aus einem Schwermetall hergestellt ist, weisen die Körner jedoch einen Durchmesser von ungefähr 30 Å oder mehr auf, so daß der minimale Abstand zwischen benachbarten Körnern wenigstens 50 Å beträgt. Damit man einen Abdruckfilm erhält, muß die Menge des niedergeschlagenen Metalls entsprechend groß sein. Dies ruft jedoch ein Problem insofern hervor, als das beobachtete Stereobild sehr stark durch die Unterschiede in der Elektronendichteverteilung des durchgelassenen Elektronenstrahls beeinträchtigt wird, die durch die Unterschiede in den niedergeschlagenen Metallmengen hervorgerufen werden, was von der Schrägbedampfung herrührt. Das Auflösungsvermögen des metallischen Abdruckfilms ist natürlich hierdurch begrenzt. Wie weiterhin der in Fig. 7A durch den Pfeil näher bezeichnete Schattenbereich zeigt, geht in der untersuchten Struktur des Objekts häufig ein Bildteilbereich verloren, was ebenfalls aus der Schrägbedampfung resultiert.However, in a film made of a heavy metal, the grains have a diameter of about 30 Å or more, so that the minimum distance between adjacent grains is at least 50 Å. In order to obtain an impression film, the amount of the deposited metal must be correspondingly large. However, this causes a problem in that the observed stereo image is greatly affected by the differences in the electron density distribution of the transmitted electron beam caused by the differences in the deposited amounts of metal, which is due to oblique evaporation. The resolving power of the metallic impression film is naturally limited thereby. As further shown by the shaded area indicated by the arrow in Fig. 7A closer, in the examined structure of the object often a partial image area is lost, which also results from the oblique evaporation.

Die Herstellung von metallischen Abdruckfilmen nach dem oben beschriebenen Vakuumverdampfungsverfahren ist vor ungefähr 30 Jahren entwickelt worden und hat sich bis heute nicht grundlegend geändert, obgleich freilich manche Verbesserungen seitdem erreicht worden sind.The production of metallic impression films after the above described vacuum evaporation method is about 30 years and has not developed until today changed fundamentally, although of course some improvements since then have been achieved.

Eine Vorrichtung zur Erzeugung eines für Strukturuntersuchungen in einem Durchstrahlungs-Elektronenmikroskop geeigneten Abdruckfilms der eingangs genannten Art ist aus der Zeitschrift für Physik, Band 129, S. 491-503, (1951) bekannt. Bei dieser bekannten Vorrichtung wird das Objekt auf die positive Elektrode gelegt, da sich herausgestellt hatte, daß die Oberfläche des Objekts bei einer Anordnung desselben auf der negativen Elektrode durch Atome verunreinigt oder beschädigt wird, die aus der negativen Elektrodenplatte und dem Objekt selbst herausgeschlagen werden. Das Auflösungsvermögen des Abdruckfilms, der bei auf der positiven Elektrode angeordnetem Objekt erzeugt wird, ist jedoch unzureichend für Feinstrukturuntersuchungen. Dies trifft auch zu für das Kathodenzerstäubungsverfahren, welches beschrieben ist in L. Reiner: Elektronenmikroskopische Untersuchungs- und Präparationsmethoden, S. 162-185, (1959). Dieses Verfahren sieht eine Kathodenzerstäubung eines Metalls in einer Sauerstoffatmosphäre vor, wobei das Objekt wiederum auf der positiven Elektrode angeordnet ist.A device for generating one for structural investigations in a transmission electron microscope Imprint film of the type mentioned is from the magazine for Physics, Volume 129, pp. 491-503, (1951). In this known device, the object on the placed positive electrode, as it had been found that the surface of the object in an arrangement thereof the negative electrode is contaminated or damaged by atoms is made of the negative electrode plate and the Object itself be knocked out. The resolution of the impression film disposed on the positive electrode Object is generated, but is insufficient for fine structure studies. This is also true for the sputtering process, which is described in L. Reiner: Electron-microscopic examination and preparation methods, Pp. 162-185, (1959). This procedure sees a Sputtering of a metal in an oxygen atmosphere before, with the object in turn on the positive electrode is arranged.

Aus der Zeitschrift Feinwerktechnik und micronic 76 (1972) Heft 7, S. 338-349 ist unter anderem ein Plasmazerstäubungsverfahren bekannt, bei dem die Effektivität der Ionisierung durch eine hochfrequenz-unterstützte Gleichspannungsentladung bei niedrigen Drücken unterstützt ist. Eine für dieses Verfahren verwendete Vorrichtung sieht die Anordnung einer Blende an einem Kollektor vor, der koaxial zu einer Kathode und einer Anode angeordnet ist, welche von einer HF-Spule umgeben ist.From the magazine Feinwerktechnik and micronic 76 (1972) Issue 7, pp. 338-349 is, inter alia, a plasma sputtering method known in which the effectiveness of ionization by a high-frequency-assisted DC discharge is supported at low pressures. One for this procedure used device sees the arrangement of a diaphragm at a collector coaxial with a cathode and a Anode is arranged, which is surrounded by an RF coil.

Geeignete Glimmentladungsbedingungen zur Erzeugung eines für Strukturuntersuchugnen geeigneten Abdruckfilms unter Verwendung beispielsweise der eingangs genannten Vorrichtung sind in den Tabellen zur angewandten Physik, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin (1979), S. 727 angegeben.
s Suitable glow discharge conditions for producing a suitable Abdruckfilms for Strukturuntersuchug using, for example, the device mentioned above are in the tables for applied physics, VEB German publishing house of the sciences, Berlin (1979), p 727 specified.
s

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art dahingehend zu verbessern, daß der mit dieser Vorrichtung erzeugte Abdruckfilm eine einschichtige, amorphe Struktur mit hohem Auflösungsvermögen aufweist. The invention is based on the object, a device of to improve the type mentioned in that the with this impression film produced a single-layer, amorphous structure with high resolution.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Weiterbildungen der Vorrichtung zur Herstellung eines solchen Abdruckfilmes sowie Weiterbildungen davon sind Gegenstand weiterer Ansprüche.This task is characterized by the characterizing features of Patent claim 1 solved. Further developments of Device for producing a Such impression film and developments thereof Subject of further claims.

Die Erfindung soll nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigtThe invention will be described below with reference to the Drawings are explained in more detail. It shows

Fig. 1B eine Vorrichtung zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Abdruckfilms; 1B is an apparatus for producing a print film of the invention.

Fig. 2B eine schematische Darstellung eines einzelnen Verfahrensablaufs nach der vorliegenden Erfindung; Fig. 2B is a schematic representation of a single process flow in accordance with the present invention;

Fig. 3B eine schematische Darstellung eines zweistufigen Verfahrensablaufs nach der vorliegenden Erfindung; Fig. 3B is a schematic representation of a two-stage process flow according to the present invention;

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung eines Abdruckfilms nach der Erfindung; Figure 4 is a schematic representation of an inventive device for manufacturing a mold film according to the invention.

Fig. 5A ein elektronenmikroskopisches Bild in 15 000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes der Oberfläche von Steinsalzkristallen, erhalten mit Hilfe eines üblichen Kohlenstoffniederschlagfilmes; Fig. 5A is an electron micrograph at 15,000 magnifications of an imprint image of the surface of rock salt crystals obtained by means of a conventional carbon precipitate film;

Fig. 5B ein elektronenmikroskopisches Abbild in 15 000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes der Oberfläche von Steinsalzkristallen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Abdruckfilmes; Fig. 5B is an electron micrograph at 15,000X magnification of an imprint image of the surface of rock salt crystals using an imprint film of the invention;

Fig. 6A ein elektronenmikroskopisches Bild in 200 000facher Vergrößerung eines bekannten metallischen Abdruckfilmes; Fig. 6A is an electron micrograph at 200,000X magnification of a known metal impression film;

Fig. 6B ein elektronenmikroskopisches Bild in 250 000facher Vergrößerung eines erfindungsgemäßen Abdruckfilmes; Fig. 6B is an electron micrograph at 250,000 times magnification of an impression film according to the invention;

Fig. 7A ein elektronenmikroskopisches Bild in 12 000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von roten Blutkörperchen einer Maus unter Verwendung eines in einstufiger Verdampfung niedergeschlagenen metallischen Abdruckfilmes; FIG. 7A is an electron micrograph in magnification of 000 fold 12 print image of red blood cells of a mouse using a single-stage evaporation deposited in metallic replica film;

Fig. 7B ein elektronenmikroskopisches Bild in 12 000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von roten Blutkörperchen einer Maus, das mit einem erfindungsgemäßen Abdruckfilm erhalten wurde; Fig. 7B is an electron micrograph at 12,000X magnification of an imprint image of red blood cells of a mouse obtained with an impression film of the present invention;

Fig. 8 ein elektronenmikroskopisches Bild in 40000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von gekühltem Steinsalz unter Verwendung eines in einstufiger Verfahrensweise hergestellten Abdruckfilmes nach der vorliegenden Erfindung; Fig. 8 is an electron micrograph at 40,000x magnification of an imprinted image of chilled rock salt using a one-step procedure imprinting film of the present invention;

Fig. 9 ein elektronenmikroskopisches Bild in 13 000facher Vergrößerung eines Abdruckbildes einer gefrorenen Schnittebene einer Rattenniere, das mit Hilfe eines in einstufiger Verfahrensweise hergestellten Abdruckfilmes nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Fig. 9 is an electron micrograph at 13,000 times of an imprint image of a frozen cutting plane of a rat kidney, which was obtained by means of a one-step procedure produced impression film according to the present invention.

Zunächst sollen die Fig. 1B, 2B und 3B erläutert werden. First, Figs. 1B, 2B and 3B will be explained.

Fig. 1B zeigt zwei im Abstand übereinander angeordnete Entladungselektroden 5, deren untere eine negative und deren obere eine positive Elektrode ist. Diese Elektroden sind in einem Vakuumgefäß angeordnet. Auf der Oberseite der unteren Elektrode liegt ein Objekt 1. Nachdem die Luft aus dem Gefäß herausgepumpt und in ihm ein Hochvakuum erzeugt wurde, wird ein organischer Monomerdampf durch ein Rohr 6 in das Gefäß eingeleitet, bis der Gasdruck darin wieder auf ungefähr 0,1 Torr angestiegen ist. Sodann wird eine Gleichspannung von 0,5 bis 3 kV an die beiden Elektroden angelegt, um eine Glimmentladung zwischen ihnen zu erzeugen. Die Glimmentladung wird bei einem Entladungsstrom zwischen 0,1 und 2 mA/cm² für 1 bis 15 Minuten lang aufrechterhalten, wobei sich die Oberfläche des Objekts 1 in einer Zone zwischen einer negativen Glimmphase und einer Kathodenglimmphase befindet. Es wird auf diese Weise ein im Plasma polymerisierter Film 7 direkt auf der Oberfläche des Objekts 1 ausgebildet, wie Fig. 2B-(a) zeigt. Das Objekt 1 wird dann in einem Lösungsmittel aufgelöst, so daß ein Abdruckfilm entsteht, der nur aus dem dünnen, im Plasma polymerisierten Film 7 besteht. Das Ergebnis ist in Fig. 2B-(b) dargestellt. Als Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel eingesetzt werden, das das Objekt 1 auflöst, ohne den Film 7 zu beschädigen. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Wasser, eine Natriumhypochlorit- Lösung, wäßriges Kaliumbichromat, Mineralsäuren, wie Salzsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure, eine wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid. Die Unterseite des Filmes 7 entspricht exakt der Oberflächentopographie des Objekts 1. Die Elektronendichteverteilung der diesen Film durchstrahlenden Elektronenstrahlen ist in Fig. 2B-(c) dargestellt, das Stereobild davon ist in Fig. 2B-(d) dargestellt, Die wirklichen Stereobilder, wie man sie an einem Elektronenmikroskop beobachten kann, sind durch die Photographien der Fig. 5B und 7B dargestellt. Fig. 1B shows two spaced-apart discharge electrodes 5 , the lower of which is a negative and the upper is a positive electrode. These electrodes are arranged in a vacuum vessel. On the upper side of the lower electrode is an object 1 . After the air is pumped out of the vessel and a high vacuum is created in it, an organic monomer vapor is introduced through a pipe 6 into the vessel until the gas pressure therein has risen again to approximately 0.1 Torr. Then, a DC voltage of 0.5 to 3 kV is applied to the two electrodes to generate a glow discharge between them. The glow discharge is maintained at a discharge current between 0.1 and 2 mA / cm 2 for 1 to 15 minutes with the surface of the object 1 in a zone between a negative glow phase and a cathode glow phase. In this way, a plasma-polymerized film 7 is formed directly on the surface of the object 1 as shown in Fig. 2B- (a). The object 1 is then dissolved in a solvent to form an impression film consisting only of the thin, plasma-polymerized film 7 . The result is shown in Fig. 2B- (b). As the solvent, any solvent that dissolves the object 1 without damaging the film 7 can be used. Examples of such solvents are water, a sodium hypochlorite solution, aqueous potassium bichromate, mineral acids such as hydrochloric acid, nitric acid and sulfuric acid, an aqueous solution of sodium hydroxide or potassium hydroxide. The underside of the film 7 corresponds exactly to the surface topography of the object 1 . The electron density distribution of the electron beams transmitted through this film is shown in Fig. 2B- (c), the stereo image thereof is shown in Fig. 2B- (d). The actual stereo images as observed on an electron microscope are represented by the photographs of Figs Fig. 5B and 7B shown.

Das zweistufige Abdruckverfahren nach der vorliegenden Erfindung kann in der in Fig. 3B dargestellten Weise ähnlich dem vorbeschriebenen Verfahren durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß der Abdruckfilm 7 aus einem im Plasma polymerisierten Material an der Unterseite eines gehärteten Materials 4 in dem Plasmapolymerisationsverfahren, das oben beschrieben wurde, niedergeschlagen wird. Die Elektronendichteverteilung und das Stereobild sind in den Fig. 3B-(e) und (f) dargestellt.The two-step impression method of the present invention may be carried out in the manner shown in Fig. 3B, similar to the method described above, except that the impression film 7 is made of a plasma-polymerized material at the bottom of a cured material 4 in the plasma polymerization process described above described is knocked down. The electron density distribution and the stereo image are shown in Figs. 3B- (e) and (f).

Wenn man ein gekühltes oder gefrorenes Objekt untersuchen will oder wenn man eine Reiß- oder Schnittebene eines gefrorenen Objekts, wie beispielsweise ein Gewebsstück untersuchen will, dann muß man den Abdruckfilm unter etwas modifizierten Bedingungen herstellen. Wenn beispielsweise die Entladungsbedingungen die gleichen sind, wie sie bei einem unter gewöhnlicher Temperatur stehenden Objekt gelten, dann kann man einen starken Abdruckfilm erhalten oder auch nicht. Wenn die Temperatur niedriger ist als -50°C, dann benötigt man eine hohe Entladungsenergie wegen der Absorption der Polymerisationswärme des organischen monomeren Dampfes. Es sind speziell die Glimmentladungsbedingungen während der Anfangszeit der ersten 10 bis 20 Sekunden zur Erzeugung eines starken, festen Abdruckfilms auf der Oberfläche des Objekts am wichtigsten. Wenn erst einmal ein fester ultradünner Film auf der Oberfläche des Objekts niedergeschlagen worden ist. dann läßt sich der weitere Niederschlag polymer Substanz bis zu einer gewünschten Dicke relativ einfach erreichen. Weiter unten ist beschrieben, daß ein Abdruckbild der Oberfläche von Steinsalz, das auf eine Temperatur von -100°C heruntergekühlt wurde, in Fig. 8 gezeigt ist und ein Abdruckbild der gefrorenen Trennfläche eines Stückes eines Rattennierengewebes, das auf eine Temperatur von -190°C eingefroren und dann bei einer Temperatur von -100°C zertrennt wurde, in Fig. 9 gezeigt ist. Man kann daher ein sogenanntes Gefrierätzen beim erfindungsgemäßen Verfahren anwenden.If one wants to examine a cooled or frozen object, or if one wants to examine a tear or cut plane of a frozen object, such as a piece of tissue, then one must make the impression film under somewhat modified conditions. For example, if the discharge conditions are the same as those applied to an object under ordinary temperature, then a strong impression film may or may not be obtained. When the temperature is lower than -50 ° C, a high discharge energy is required because of the absorption of the heat of polymerization of the organic monomeric vapor. Specifically, the glow discharge conditions during the initial time of the first 10 to 20 seconds are most important for producing a strong, solid print film on the surface of the object. Once a solid ultrathin film has been deposited on the surface of the object. then the further precipitate polymer substance can be achieved relatively easily up to a desired thickness. It is described below that an imprint image of the surface of rock salt cooled down to a temperature of -100 ° C is shown in Fig. 8 and an imprint image of the frozen parting surface of a piece of rat kidney tissue at a temperature of -190 ° C was frozen and then cut at a temperature of -100 ° C, shown in Fig. 9 is shown. It is therefore possible to use so-called freeze-etching in the method according to the invention.

Die Plasmapolymerisation organischer monomerer Dämpfe nach dem Glimmentladungsverfahren ist bekannt und ist in letzter Zeit verwendet worden, um beispielsweise Halbleitermaterialien zu ätzen oder um die Oberflächen gewisser Spezialmaterialien, wie beispielsweise kleiner Zahnräder, zu behandeln. Bei diesen Plasmapolymerisationsverfahren ist speziell eine sehr wirksame Hochfrequenz-Entladungsmethode hauptsächlich verwendet und untersucht worden, um dicke Polymerfilme von einigen 10 µ Stärke oder mehr zu erzeugen. Es ist bisher aber noch nicht vorgeschlagen worden, einen festen dünnen Abdruckfilm hoher Reinheit und gleichmäßiger Dicke direkt auf der Oberfläche eines Objekts durch Plasmapolymerisation organischen monomeren Dampfes im Glimmentladungsverfahren niederzuschlagen. Es ist auch noch nicht erkannt worden, daß man solche Filme vorteilhaft dazu heranziehen kann, um die ultrafeinen Oberflächenstrukturen von speziellen Objekten mit Hilfe der Durchstrahlungselektronenmikroskopie zu untersuchen.The plasma polymerization of organic monomeric vapors after the glow discharge method is known and is in last Time has been used, for example, semiconductor materials to etch or the surfaces of certain specialty materials, such as small gears to handle. In these Plasma polymerization process is especially a very effective one Radio frequency discharge method mainly used and been investigated to thick polymer films of some 10 μ To create strength or more. It is not yet has been proposed, a solid thin impression film higher Purity and uniform thickness directly on the surface of an object by plasma polymerization of organic monomers Steam in the glow discharge process knock down. It is have not been recognized that such films advantageous to the ultrafine surface structures of special objects by means of transmission electron microscopy to investigate.

Für die organischen Monomere, die bei der Erfindung Einsatz finden können, kommt jede Verbindung in Betracht, die im Plasma polymerisiert werden kann. Typische Beispiele solcher organischen Monomere sind Äthylen, Propylen, Styrol, Benzol, Toluol, Xylol, Chlorbenzol, 1,2,4-Trichlorbenzol, Ferrocen, Äthylbenzol, Äthylenchlorid, Propylenoxid, Acrylverbindungen, wie beispielsweise Methylmetacrylat, n-Butylmetacrylat, und Epoxyverbindungen, wie beispielsweise 1,2-Epoxybutan und 1,2- Epoxyäthylbenzol. Diese Monomere können jeweils allein oder in beliebiger Mischung verwendet werden oder es kann ein Gemisch von ihnen zusammen mit einem Inertgas, wie beispielsweise Argon, Helium, Neon, Stickstoff und dgl. eingesetzt werden. Die Abdruckfilme, die für die Erzeugung der in den Fig. 5B, 6B, 7B, 8 und 9 dargestellten Photographien verwendet wurden, wurden durch Polymerisation in Plasma von Styrol erzeugt.For the organic monomers which can be used in the invention, any compound which can be polymerized in the plasma is contemplated. Typical examples of such organic monomers are ethylene, propylene, styrene, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene, ferrocene, ethylbenzene, ethylene chloride, propylene oxide, acrylic compounds such as methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, and epoxy compounds such as for example, 1,2-epoxybutane and 1,2-epoxyethylbenzene. These monomers may each be used alone or in any mixture, or a mixture of them may be used together with an inert gas such as argon, helium, neon, nitrogen and the like. The impression films used for the production of the photographs shown in Figs. 5B, 6B, 7B, 8 and 9 were produced by polymerization in plasma of styrene.

Obgleich die optimalen Glimmentladungsbedingungen zur Erzielung des gewünschten gleichmäßigen Abdruckfilms nach der Erfindung von den eingesetzten organischen Monomeren als auch von der Art des Objekts und des Inertgases abhängen, lassen sich die optimalen Bedingungen sehr schnell durch den Fachmann ermitteln, beispielsweise durch experimentelle Untersuchungen oder Näherungsverfahren.Although the optimal glow discharge conditions for achieving the desired uniform impression film after the Invention of the organic monomers used as also depend on the nature of the object and the inert gas, the optimal conditions can be passed through very quickly determine the person skilled in the art, for example by experimental Investigations or approximations.

Die Gründe, warum sich der gewünschte gleichmäßige und feste dünne Abdruckfilm, der exakt der Oberflächentopographie des Objekts entspricht, erzielen läßt, sind noch nicht genau bekannt. Es wird vermutet, daß, weil ein Plasma oder hochionisierte Gasmoleküle eines organischen Monomeren eine hohe mittlere Energie von ungefähr 5 bis 10 eV haben, sie durch Berechnung ermittelt wurde, die sehr viel höher als die durchschnittliche Wärmeenergie der Metallmoleküle beim konventionellen Vakuumaufdampfungsverfahren, die bei ungefähr 0,1 eV liegt, die Moleküle beim Niederschlagen auf der Oberfläche des Objekts sofort an Ort und Stelle einer radikalen Polymerisation unterworfen werden und sich zu einem festen Film schließen. In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Glimmentladungsbedingungen wird das organische Monomere auf jedem Objekt als Polymerfilm niedergeschlagen, ungeachtet der Form, der Temperatur und der Leitfähigkeit des Objekts. Der im Plasma polymerisierte Polymerfilm nach der vorliegenden Erfindung kann sogar auf jegliche unregelmäßig geformten Bereiche der Oberfläche des Objekts in gleichmäßiger Dicke niedergeschlagen werden, was seine Ursache in den den Plasmamolekülen innewohnenden Diffusions- und Dispersionswirkungen hat. Die Festigkeit und Dicke des Abdruckfilms hängen hauptsächlich von den Glimmmentladungsbedingungen ab. Der Abdruckfilm nach der vorliegenden Erfindung weist eine amorphe Struktur auf. Korngrößen von 50 Å, wie sie bei den bekannten Filmen hingenommen werden mußten, sind im erfindungsgemäßen Abdruckfilm nicht enthalten. Dies geht ganz klar aus dem Vergleich der Fig. 6A und 6B hervor. Fig. 6A zeigt die niedergeschlagenen Metallkörner mit einer Größe, von ungefähr 50 Å. Diese lassen sich im Elektronenmikroskop bei 200 000facher Vergrößerung klar erkennen. Bei noch größerer Vergrößerung (250 000fach) lassen sich im Polymerfilm nach der vorliegenden Erfindung sehr kleine Punkte mit einem gegenseitigen Abstand von etwa 1 bis 3 Å erkennen. Man sieht hieraus, daß sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Abdruckfilme für die Untersuchung der Oberflächentopographie von Objekten das Auflösungsvermögen sehr stark steigern läßt, und im Faktor 10 oder mehr im Vergleich zu der Verwendung üblicher Metallabdruckfilme. Das Auflösungsvermögen der erfindungsgemäßen Abdruckfilme liegt in der Größenordnung des Auflösungsvermögens eines Elektronenmikroskopes. Letzteres läßt sich daher voll ausnutzen. Es sind daher bemerkenswerte Fortschritte auf dem Gebiet der biomedizinischen Mikroskopie zu erwarten.The reasons why the desired uniform and firm thin impression film, which exactly corresponds to the surface topography of the object, can not be obtained, are not yet precisely known. It is believed that because a plasma or highly ionized gas molecules of an organic monomer have a high average energy of about 5 to 10 eV, it has been determined by calculation much higher than the average heat energy of the metal molecules in the conventional vacuum evaporation process, which is approximately 0.1 eV, the molecules are immediately subjected to radical polymerization upon deposition on the surface of the object and become a solid film. In accordance with the glow discharge conditions described above, the organic monomer is deposited on each object as a polymer film, regardless of the shape, temperature, and conductivity of the object. The plasma polymerized polymer film of the present invention may even be deposited uniformly on any irregularly shaped areas of the surface of the object, due to the diffusion and dispersion effects inherent in the plasma molecules. The strength and thickness of the impression film depend mainly on the glow discharge conditions. The impression film according to the present invention has an amorphous structure. Grain sizes of 50 Å, as had to be tolerated in the known films, are not included in the impression film according to the invention. This is clear from the comparison of Figs. 6A and 6B. Fig. 6A shows the deposited metal grains having a size of about 50 Å. These can be clearly seen in the electron microscope at 200,000 times magnification. At even greater magnification (250,000 times), very small dots with a mutual spacing of about 1 to 3 Å can be seen in the polymer film of the present invention. It can be seen from this that the resolving power can be greatly increased with the aid of the impression films according to the invention for the investigation of the surface topography of objects, and in a factor of 10 or more in comparison to the use of conventional metal impression films. The resolution of the impression films according to the invention is of the order of magnitude of the resolution of an electron microscope. The latter can therefore be fully exploited. Significant advances in biomedical microscopy are therefore expected.

Ein Stereobild eines Objekts wird aufgrund der Elektronenstrahlverteilung desjenigen Elektronenstrahls gebildet, der durch einen Abdruckfilm fällt. Wie oben erwähnt wurde, lassen sich bei Verwendung von metallischen Abdruckfilmen aber nicht die gewünschten Stereoeindrücke vermitteln, weil die Elektronendichte eines Kohlenstoffilmes gering ist. Im Gegensatz dazu ist trotz der wesentlich geringeren Dicke des im Plasma polymerisierten Abdruckfilms nach der vorliegenden Erfindung mit diesem das gewünschte Stereobild erzielbar. Dies rührt daher, daß die Elektronendichte des vorliegenden Abdruckfilmes hoch ist und daß der Streueffekt der Elektronenstrahlen aufgrund des vorliegenden Filmes sehr groß ist. Die Streuung der Elektronenstrahlen, die durch kleinste Unregelmäßigkeiten in der Oberfläche des Abdruckfilms hervorgerufen werden, haben ein Stereobild zur Folge, in welchem der Kontrast durch den Zerstreuungseffekt der Elektronenstrahlen verstärkt ist. Das heißt, daß zusätzlich zur geeigneten Elektronendichte des vorliegenden dünnen Abdruckfilms, der aus einer gleichförmigen einzigen Lage besteht, beim Durchtreten der Elektronenstrahlen durch die flachen, geneigten und vertikalen Oberflächenbereiche des vorliegenden Abdruckfilms ein Unterschied in den Durchdringungslängen der Elektronenstrahlen durch Absorption, Diffraktion und Dispersion erzeugt wird. Diese Differenzen verstärken den Bildkontrast und erzeugen die Dichteverteilung der durchtretenden Elektronenstrahlen. Als Folge davon kann man ein Stereobild des Objekts wahrnehmen.A stereo image of an object becomes due to the electron beam distribution of the electron beam formed, the falls through an impression film. As mentioned above, let but not when using metallic impression films convey the desired stereo impressions, because the electron density a carbon film is low. In contrast to is despite the much smaller thickness of the polymerized in the plasma Imprint film according to the present invention with this the desired stereo image achievable. This is because that the electron density of the present impression film high is and that the scattering effect of the electron beams due of the present film is very large. The dispersion of Electron beams, the smallest irregularities be caused in the surface of the impression film, have a stereo image in which the contrast amplified by the scattering effect of electron beams is. That is, in addition to the appropriate electron density the present thin impression film, the consists of a uniform single layer, when passing the electron beams through the flat, inclined and vertical surface areas of the present impression film a difference in the penetration lengths of the electron beams by absorption, diffraction and dispersion is produced. These differences reinforce the image contrast and generate the density distribution of the passing electron beams. As a result, you can get a stereo image of the Perceive object.

In diesen Stereobildern sind auch die feinsten Strukturen des Objekts enthalten, die durch die bekannten metallischen Abdruckfilme oft teilweise verlorengingen, wie Fig. 7A zeigt. Ein weiterer wichtiger Vorteil, den die Erfindung mit sich bringt, besteht darin, daß feine Strukturen in der Seitenebene des Abdruckfilmes ebenfalls betrachtet werden können, indem man den Abdruckfilm um einen geeigneten Winkel während der Beobachtung im Elektronenmikroskop neigt.These stereo images also contain the finest structures of the object which were often partially lost by the known metallic impression films, as shown in FIG. 7A. Another important advantage that the invention entails is that fine structures in the side plane of the impression film can also be viewed by tilting the impression film at an appropriate angle during observation in the electron microscope.

Eine bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zur Herstellung der beschriebenen Abdruckfilme soll nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 4 erläutert werden.A preferred embodiment of a device for producing the described impression films will be explained below with reference to FIG. 4.

Das Vakuumgefäß 10 besteht aus einer Grundplatte 26 mit einem darauf angeordneten zylindrischen Adapter 41 aus Metall, beispielsweise rostfreiem Stahl, und einer darauf sitzenden Glasglocke 11. Wenn der Abdruckfilm von einem Objekt gewöhnlicher Temperatur hergestellt werden soll, dann kann man die Glasglocke 11 auch direkt auf die Grundplatte 26 aufsetzen, ohne daß dazu der zylindrische Adapter 41 verwendet werden muß, weil keine Kühlvorrichtung erforderlich ist.The vacuum vessel 10 consists of a base plate 26 with a cylindrical adapter 41 arranged thereon made of metal, for example stainless steel, and a bell jar 11 seated thereon. If the impression film is to be produced by an ordinary temperature object, then the bell jar 11 can also be placed directly on the base plate 26 , without the need for use of the cylindrical adapter 41 , because no cooling device is required.

Das Vakuumgefäß 10 ist über eine Saugleitung 25 mit einer Öldiffusionspumpe 32 und einer Ölkreiselpumpe 31 verbunden, womit im Vakuumgefäß eIn Unterdruck von etwa 10^-6 Torr hergestellt werden kann. Die Ölkreiselpumpe 31 ist auch so geschaltet, daß sie allein zur Evakuierung des Vakuumgefäßes 10 verwendet werden kann. Das typische Volumen des Vakuumgefäßes 10 liegt zwischen 2 und 6 Litern, kann jedoch über einen breiten Bereich verändert werden. Auf der Grundplatte 26 des Vakuumgefäßes 10 ist eine Isolierplatte 24 aus hitzeresistentem und elektrisch isolierendem Material angeordnet, auf der negative Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 befestigt sind.The vacuum vessel 10 is connected via a suction line 25 to an oil diffusion pump 32 and an oil circulation pump 31 , whereby in the vacuum vessel eA vacuum of about 10 ^-6 Torr can be produced. The oil circulation pump 31 is also connected so that it can be used alone for evacuation of the vacuum vessel 10 . The typical volume of the vacuum vessel 10 is between 2 and 6 liters, but can be varied over a wide range. On the base plate 26 of the vacuum vessel 10 , an insulating plate 24 of heat-resistant and electrically insulating material is arranged, are mounted on the negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 .

Im Vakuumgefäß 10 sind im Abstand übereinander zwei Elektroden angeordnet, und zwar eine obere positive Elektrode 13 und eine untere negative Elektrode 15. Die Elektroden bestehen beispielsweise aus Edelstahl, Aluminium, Duraluminium oder sind mit einer dünnen Platinschicht versehen. Der Abstand der beiden parallel zueinander angeordneten Elektroden ist veränderlich. Obgleich dieser nicht speziell begrenzt ist, sollte er sich doch im Bereich zwischen 20 und 100 mm bei einem Volumen des Vakuumgefäßes zwischen 2 und 6 Litern halten. Typische Abmessungen der Elektroden sind: Durchmesser zwischen 30 und 100 mm und Dicke zwischen 1 und 30 mm. Die positive Elektrode 13 sollte nach Möglichkeit groß und dick sein, während die negative Elektrode 15 klein sein sollte. Diese Bedingungen sind vom Standpunkt der Wärmekapazität und der Gefahr einer Beschädigung des Objekts her gesehen. In die negative Elektrode 15 ist ein Objekthalter 14 so eingebettet, daß die Bodenfläche des Objekthalters 14 mit der Oberseite eines Metallzylinders in Berührung steht, der mit einer Heizspirale 20 und einem Thermoelement 21 versehen ist. Hierdurch läßt sich die Temperatur des Objekthalters 14 beeinflussen und messen. Die Heizspirale 20 und das Thermoelement 21 sind elektrisch von der negativen Elektrode 15 isoliert und sind mit einem Temperaturregler 34 über eine Steckvrbindung 43 verbunden. Der negative Block ist von einem kleinen Entladungsschutzzylinder 17 umgeben, der an der Grundplatte 26 geerdet ist. Der innere Durchmesser dieses Schutzzylinders 17 ist im allgemeinen um 6 bis 10 mm größer als der Durchmesser der negativen Elektrode 15.In the vacuum vessel 10 , two electrodes are arranged at a distance one above the other, namely an upper positive electrode 13 and a lower negative electrode 15 . The electrodes consist for example of stainless steel, aluminum, duralumin or are provided with a thin platinum layer. The distance between the two electrodes arranged parallel to one another is variable. Although this is not particularly limited, it should still be in the range between 20 and 100 mm for a volume of the vacuum vessel between 2 and 6 liters. Typical dimensions of the electrodes are: diameter between 30 and 100 mm and thickness between 1 and 30 mm. The positive electrode 13 should be large and thick, if possible, while the negative electrode 15 should be small. These conditions are seen from the standpoint of heat capacity and the danger of damaging the object. In the negative electrode 15 , an object holder 14 is embedded so that the bottom surface of the object holder 14 is in contact with the top of a metal cylinder provided with a heating coil 20 and a thermocouple 21 . As a result, the temperature of the object holder 14 can be influenced and measured. The heating coil 20 and the thermocouple 21 are electrically isolated from the negative electrode 15 and are connected to a temperature controller 34 via a connector 43 . The negative block is surrounded by a small discharge protection cylinder 17 which is grounded to the base plate 26 . The inner diameter of this protective cylinder 17 is generally larger by 6 to 10 mm than the diameter of the negative electrode 15 .

Die positive Elektrode 13 ist von einem kleinen Entladungsschutzzylinder 16 umgeben und wird von einem Elektrodenhalter 22 gehalten.The positive electrode 13 is surrounded by a small discharge protection cylinder 16 and held by an electrode holder 22 .

Die positive Elektrode 13 ist an diesem Elektrodenhalter 22 horizontal beweglich gelagert. Sie ist mit einem geregelten Hochspannungsnetzteil 33 über ein Hochspannungskabel 12 verbunden, das durch den Halter 22 verläuft. Das Hochspannungsnetzteil kann man eine Gleich- oder Wechselspannung zwischen 0 und 3 kV liefern. Die Polarität der Gleichspannung läßt sich umpolen. Der zur Verfügung stehende Maximalstrom beträgt beispielsweisse 100 mA. Die Spannung für die Glimmentladung kann in den angegebenen Bereich gelegt werden und die Entladungszeit kann mit Hilfe eines nicht dargestellten Zeitgebers voreinstellen.The positive electrode 13 is mounted horizontally movable on this electrode holder 22 . It is connected to a regulated high voltage power supply 33 via a high voltage cable 12 passing through the holder 22 . The high voltage power supply can deliver a DC or AC voltage between 0 and 3 kV. The polarity of the DC voltage can be reversed. The available maximum current is for example 100 mA. The voltage for the glow discharge can be placed in the specified range and the discharge time can preset by means of a timer, not shown.

In das Innere des Vakuumgefäßes 10 ist ein Einlaßrohr 18 für organischen Monomerdampf so eingeführt, daß die Mündung dieses Rohres 18 auf die Mitte zwischen den zwei Elektroden 13 und 15 gerichtet ist. Dieses Einlaßrohr 18 ist mit einem Verdampfer 35 verbunden, in welchem organische monomere Dämpfe erzeugt werden. Die organischen monomeren Dämpfe werden bei normaler Temperatur entwickelt oder durch Erwärmen oder Aufheizen eines organischen Monomeren, beispielsweise mit Hilfe einer elektrischen Heizvorrichtung, wie sie in Fig. 4 erkennbar ist. Diese Dämpfe kann man gewünschtenfalls auch verdünnen, beispielsweise mit einem kleinen Anteil Argon oder Stickstoff, das in einer Flasche 36 enthalten ist. Die organischen monomeren Dämpfe oder ein Gemisch daraus mit einem Verdünnungsgas werden in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet. Die Zuflußgeschwindigkeit des organischen Monomeren oder des Gemischs werden mit Hilfe einer Düse 19 oder einer anderen geeigneten Steuerungseinrichtung eingestellt. Der Gasdruck im Vakuumgefäß 10 kann mit Hilfe der Zuströmgeschwindigkeit und der Abpumpgeschwindigkeit eingestellt werden. Auf diese Weise läßt sich ein konstanter elektrischer Entladungsstrom aufrechterhalten. Der elektrische Entladungsstrom und die Entladungsspannung werden im Hochspannungsnetzteil 33 gemessen.In the interior of the vacuum vessel 10, an inlet pipe 18 for the organic monomer vapor is introduced so that the mouth of this tube 18 is directed to the center between the two electrodes 13 and 15 °. This inlet pipe 18 is connected to an evaporator 35 , in which organic monomeric vapors are generated. The organic monomeric vapors are developed at normal temperature or by heating or heating an organic monomer, for example by means of an electric heater, as can be seen in Fig. 4. If desired, these vapors may also be diluted, for example with a small amount of argon or nitrogen contained in a bottle 36 . The organic monomeric vapors or a mixture thereof with a diluent gas are introduced into the vacuum vessel 10 . The feed rate of the organic monomer or mixture is adjusted by means of a nozzle 19 or other suitable control means. The gas pressure in the vacuum vessel 10 can be adjusted by means of the inflow velocity and the pumping rate. In this way, a constant electric discharge current can be maintained. The electric discharge current and the discharge voltage are measured in the high voltage power supply 33 .

Wenn ein Abdruckfilm auf einem gekühlten Objekt erzeugt werden soll, dann wird der zylindrische Adapter 41 eingesetzt und ein dort ausgebildeter Stickstoffeinlaß 40 wird so angeschlossen, daß die negativen Blöcke 14, 15, 20 und 21 gekühlt werden. Das Objekt wird auf den gekühlten Objekthalter 14 aufgelegt. Die Temperaturregelung kann man mit Hilfe der Regeleinrichtung 34 durchführen.When an impression film is to be formed on a cooled object, the cylindrical adapter 41 is inserted and a nitrogen inlet 40 formed thereon is connected so as to cool the negative blocks 14, 15, 20 and 21 . The object is placed on the cooled object holder 14 . The temperature control can be carried out with the aid of the control device 34 .

Wenn man einen Abdruckfilm auf einem gefrorenen Gewebsstück herstellen will, dann wird im Vakuumgefäß 10 zusätzlich eine Einrichtung 37 zum Zerbrechen oder Zerreißen des gefrorenen Objekts und ein Schneidmesser 39 angeordnet. Der Objekthalter 14 ist in diesem Falle so modifiziert, daß eine Scheibe des Objekts in ein Loch im Objekthalter eingesetzt werden kann. Die Schneideinrichtung 37 kann beispielsweise aus Edelstahl bestehen und zylindrische Gestalt haben vom gleichen Durchmesser wie der kleine Entladungsschutzzylinder 17 für die negative Elektrode. Eine Schneidklinge 38 ist am unteren Bereich der Seitenfläche der Schneideinrichtung 37 angeordnet. Die Schneideinrichtung 37 ist horizontal um einige Millimeter über der Oberfläche des Objekts angeordnet und wird von dem Halter 22 so gehalten, daß die Schneideinrichtung 37 horizontal um den Halter in eine äußere Lage geschwenkt werden kann. Das Objekt, das auf dem Objekthalter 14 liegt, wird durch Bewegung der Schneideinrichtung 37 in Richtung des in Fig. 4 eingezeichneten Pfeiles zerschnitten. Nach dem Schneiden oder Teilen des Objekts wird die Schneideinrichtung 37 vollständig aus der Zone zwischen den zwei Elektroden 13 und 15 herausbewegt, so daß die Gimmentladung nicht gestört wird. Das Schneiden kann man wiederholen. Um das Objekt zu frieren, wird das Gewebsstück in Form einer Säule geschnitten, die einen Durchmesser von ungefähr 2 mm und eine Höhe von etwa 8 mm hat. Dieses so vorbereitete Gewebsstück wird in ein Loch im Objekthalter 14 so eingesetzt, daß ungefähr 3 mm seiner Länge aus den Objekthalter 14 herausschauen. Das Objekt kann für kurze Zeit gefroren werden, indem man flüssigen Stickstoff oder dgl. zusammen mit der Schneideinrichtung 37 einsetzt und dabei die negativen Elektrodenblöcke entfernt. Der negative Elektrodenblock kann für 5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur von -190°C gekühlt werden. Die Schneideinrichtung 37 und der negative Elektrodenblock werden schnell in das Vakuumgefäß 10 eingebracht und die Atmosphäre darin wird bis auf einen Druck von ungefähr 10^-5 Torr gebracht. Die Temperatur des Objekts wird mit Hilfe der Heizspirale 20 auf eine für das Schneiden optimale Temperatur gebracht, beispielsweise auf -100°C. Die Temperatur des Objekts wird stets mit dem Thermoelement 21 gemessen. Bei der optimalen Schneidtemperatur wird es mit Hilfe der Schneideinrichtung 37 und eines Schneidhebels 39 zerschnitten. Die gefrorene Schnittebene des Objekts wird dann einem Vakuumätzvorgang unterworfen, beispielsweise für einige Sekunden bis einige Minuten. Sodann werden vorgewärmte organische monomere Dämpfe in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet und darin ein Druck von ungefähr 0,1 Torr mit einer Gleichspannung von beispielsweise 1,3 bis 3 kV wird eine Glimmentladung zwischen den Elektroden erzeugt, bei der ein Strom zwischen 0,4 bis 1 mA/cm² 5 bis 15 Minuten lang fließt. Diese Glimmentladungsbedingungen sind höher angesetzt als die bei einem Objekt gewöhnlicher Temperatur.If one wants to produce an impression film on a frozen tissue piece, then a device 37 for breaking or tearing the frozen object and a cutting knife 39 are additionally arranged in the vacuum vessel 10 . The object holder 14 is modified in this case so that a disc of the object can be inserted into a hole in the object holder. For example, the cutter 37 may be made of stainless steel and have a cylindrical shape of the same diameter as the small discharge electrode 17 for the negative electrode. A cutting blade 38 is disposed at the lower portion of the side surface of the cutter 37 . The cutter 37 is disposed horizontally a few millimeters above the surface of the object and is held by the holder 22 so that the cutter 37 can be horizontally pivoted about the holder in an outer position. The object lying on the object holder 14 is cut by moving the cutting device 37 in the direction of the arrow shown in FIG. 4. After cutting or dividing the object, the cutter 37 is completely moved out of the zone between the two electrodes 13 and 15 , so that the glow discharge is not disturbed. The cutting can be repeated. To freeze the object, the tissue piece is cut into a column having a diameter of about 2 mm and a height of about 8 mm. This tissue piece prepared in this way is inserted into a hole in the object holder 14 so that approximately 3 mm of its length can be seen from the object holder 14 . The object can be frozen for a short time by using liquid nitrogen or the like together with the cutter 37 , thereby removing the negative electrode blocks. The negative electrode block can be cooled to a temperature of -190 ° C for 5 to 10 minutes. The cutter 37 and the negative electrode block are quickly introduced into the vacuum vessel 10 and the atmosphere therein is brought to a pressure of about 10 ^-5 torr. The temperature of the object is brought by means of the heating coil 20 to an optimum temperature for cutting, for example to -100 ° C. The temperature of the object is always measured with the thermocouple 21 . At the optimum cutting temperature, it is cut by means of the cutter 37 and a cutting lever 39 . The frozen section plane of the object is then subjected to a vacuum etching process, for example for a few seconds to a few minutes. Then, preheated organic monomeric vapors are introduced into the vacuum vessel 10 and therein a pressure of about 0.1 torr with a DC voltage of, for example, 1.3 to 3 kV, a glow discharge is generated between the electrodes, in which a current between 0.4 to 1 mA / cm² for 5 to 15 minutes. These glow discharge conditions are set higher than those of an ordinary temperature object.

Mit der Erfindung lassen sich einstufig und zweistufig hergestellte Abdruckfilme von Objekten beliebiger Art herstellen, die sich mit den erwähnten Vorteilen mit dem Elektronenmikroskop betrachten lassen.With the invention can be produced in one stage and two stages Make impression films of objects of any kind, dealing with the mentioned advantages with the electron microscope let look at.

Nachfolgend sollen noch einige Beispiele, die Erfindung betreffend, angegeben werden.Below are some examples of the invention, be specified.

Example 1 Production of an impression film of a surface Surface structure of an ordinary pattern

Durch Verwendung der Vorrichtung nach Fig. 4 wurden Abdruckfilme von verschiedenen Objekten einschließlich Steinsalz und roten Blutkörperchen von Mäusen hergestellt.By using the apparatus of Fig. 4, impression films of various objects including rock salt and red blood cells of mice were prepared.

Jedes Objekt wurde auf den Objekthalter 14 im Vakuumgefäß 10 placiert. Mit Hilfe der Ölkreiselpumpe 31 und der Öldiffusionspumpe 32 wurde der Druck im Vakuumgefäß 10 auf 10^-5 bis 10^-6 Torr gebracht. Der Abstand zwischen den Elektroden war zwischen 30 und 60 mm einstellbar. Die Hochspannung zwischen den Elektroden betrug zwischen 0 und ±3 kV und zwischen 0 und 3 kV Wechselspannung. Die Temperatur der Objekte, die gemessen werden konnte, lag zwischen -200°C und +30°C.Each object was placed on the object holder 14 in the vacuum vessel 10 . With the aid of the oil circulation pump 31 and the oil diffusion pump 32 , the pressure in the vacuum vessel 10 was brought to 10 ^-5 to 10 ^-6 torr. The distance between the electrodes was adjustable between 30 and 60 mm. The high voltage between the electrodes was between 0 and ± 3 kV and between 0 and 3 kV AC. The temperature of the objects that could be measured was between -200 ° C and + 30 ° C.

Styrolmonomerdampf, der mit Stickstoff verdünnt war, wurde in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet, um darin einen Gasdruck von ungefähr 1 Torr einzustellen. Während der Druck durch Regelung der Styroldampfzuführungsgeschwindigkeit auf ungefähr 1 Torr eingeregelt wurde, wurde eine Glimmentladung ungefähr 10 Minuten lang mit einer Stromdichte von ungefähr 0,4 mA/cm² durchgeführt. In der Zone ungefähr 1 cm über der Oberfläche der negativen Elektrode ließ sich eine negative violette Glimmphase beobachten. Die Oberfläche des Objekts lag in dieser Zone. Beschädigungen des Objekts und der negativen Elektrode, die durch den Niederschlag der Plasmamoleküle verursacht worden wären, konnten nicht beobachtet werden. Der Temperaturanstieg an der Oberfläche des Objekts betrug nur etwa 15°C. Sobald die Glimmentladung begonnen hatte, bildete sich auf dem Objekt ein dünner Styrolpolymerfilm. Dieser Polymerfilm wuchs auf eine Dicke von ungefähr 300 Å in der beschriebenen Entladungszeit an. Die Dicke dieses Films sollte im Bereich zwischen 100 und 500 Å liegen, damit der Film beim nachfolgenden Auflösen des Objekts nicht beschädigt wird. Man kann die Dicke dieses Polymerfilmes durch die gewählte Entladungszeit beeinflussen.Styrene monomer vapor diluted with nitrogen was introduced into the vacuum vessel 10 to adjust a gas pressure of about 1 Torr therein. While the pressure was controlled to approximately 1 Torr by controlling the styrene vapor supply rate, a glow discharge was conducted for approximately 10 minutes at a current density of approximately 0.4 mA / cm 2. In the zone about 1 cm above the surface of the negative electrode, a negative violet glow phase was observed. The surface of the object was in this zone. Damage to the object and the negative electrode caused by the precipitation of the plasma molecules could not be observed. The temperature rise at the surface of the object was only about 15 ° C. Once the glow discharge had started, a thin styrene polymer film formed on the object. This polymer film grew to a thickness of about 300 Å in the discharge time described. The thickness of this film should be in the range between 100 and 500 Å, so that the film will not be damaged during subsequent dissolution of the object. One can influence the thickness of this polymer film by the selected discharge time.

Nachdem der Abdruckfilm durch Plasmapolymerisation in der vorbeschriebenen Weise erzielt worden war, wurde der Unterdruck aus dem Vakuumgefäß entfernt und das Objekt wurde dann in einem Lösungsmittel aufgelöst, das den Polymerfilm nicht angriff. Diese Lösungsmittel richten sich nach der Art des Objektes und dem verwendeten Polymermaterial. After the impression film by plasma polymerization in the had been achieved, the negative pressure was removed from the vacuum vessel and the object became then dissolved in a solvent containing the polymer film do not attack. These solvents depend on the Type of object and the polymer material used.

Im Falle von Kochsalzkristallen als Objekt wurde der Polymerfilm direkt auf der Schnittfläche des Kochsalzes einer Größe von 10 × 10 × 2 mm niedergeschlagen. Diese Schnittfläche wurde zuvor leicht mit Sandpapier aufgerauht. Dann wurde das Kochsalz mit dem niedergeschlagenen Polystyrolfilm darauf in Wasser aufgelöst, wodurch man den Abdruckfilm aus Polystyrol zurückbehielt. Ein elektronenmikroskopisches Abbild in 15 000facher Vergrößerung dieses Abdruckfilmes ist in Fig. 5B gezeigt.In the case of saline crystals as an object, the polymer film was deposited directly on the cut surface of the saline of a size of 10 × 10 × 2 mm. This cut surface was previously lightly roughened with sandpaper. Then, the common salt with the deposited polystyrene film was dissolved thereon in water, whereby the impression film of polystyrene was retained. An electron micrograph at 15,000 times magnification of this impression film is shown in FIG. 5B.

Im Falle der roten Blutkörperchen einer Maus wurde das Blut eine Stunde lang in einer 2%igen wäßrigen Glutaraldehyd- Pufferlösung fixiert und dann gewaschen. Dieses Objekt wurde dann einer alkoholischen Dehydrierung unterworfen und das Lösungsmittel wurde dann durch ein Lösungsmittel ersetzt, das rasch und einfach auftrocknet, wie beispielsweise Aceton, Propylenoxid und dgl. Die so erhaltene Lösung wurde dann schnell auf Kochsalz oder Kristallzucker getropft. Dieses Objekt trocknete auf dem Kochsalz oder Kristallzucker auf, das nun als Objektträger diente. Auf diesem Objekt wurde dann der Polystyrolfilm mit der Glimmentladung unter den oben beschriebenen Bedingungen aufgebracht. Das mit der Polymerschicht bedeckte Objekt wurde dann aus dem Vakuumgefäß herausgenommen und in Wasser gelöst. Das Kochsalz bzw. der Kristallzucker wurde in Wasser gelöst, so daß Blutzellen mit dem Abdruckfilm darauf übrigblieben. Dieses Objekt wurde dann in einer 1- bis 5%igen wäßrigen Natriumhypochlorit-Lösung 30 bis 60 Minuten lang gelöst, wodurch nur der Abdruckfilm aus Polystyrol übrigblieb. Diesen Abdruckfilm konnte man mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachten, nachdem er in Wasser gewaschen worden war. Das Bild davon ist in Fig. 7B dargestellt. In the case of red blood cells of a mouse, the blood was fixed in a 2% aqueous glutaraldehyde buffer solution for one hour and then washed. This object was then subjected to alcoholic dehydration, and the solvent was then replaced with a solvent which dries quickly and easily, such as acetone, propylene oxide and the like. The solution thus obtained was then dropped rapidly to brine or granulated sugar. This object dried on the table salt or granulated sugar, which now served as a slide. The polystyrene film with the glow discharge was then applied to this object under the conditions described above. The object covered with the polymer layer was then taken out of the vacuum vessel and dissolved in water. The saline or crystal sugar was dissolved in water so that blood cells with the impression film remained thereon. This object was then dissolved in a 1 to 5% aqueous sodium hypochlorite solution for 30 to 60 minutes leaving only the impression film of polystyrene. This impression film could be observed by a transmission electron microscope after being washed in water. The image thereof is shown in Fig. 7B.

example 2 Creation of an impression film on a surface Chilled object

Mit Hilfe der Vorrichtung nach Fig. 4 wurde ein Abdruckfilm von gekühltem Steinsalz hergestellt. Das Steinsalz wurde auf eine Größe von 10 × 10 × 2 mm geschnitten und dann wurde die zu betrachtende Schnittfläche leicht mit Sandpapier aufgerauht.With the aid of the device according to FIG. 4, an impression film of cooled rock salt was produced. The rock salt was cut to a size of 10 × 10 × 2 mm and then the cut surface to be considered was lightly roughened with sand paper.

Der Satz negativer Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 wurde aus dem Vakuumgefäß 10 herausgenommen und auf eine Temperatur von -190°C mit Hilfe von flüssigem Stickstoff gekühlt. Die gekühlte negative Elektrode wurde dann in das Vakuumgefäß 10 eingebracht und das Steinsalzobjekt wurde dann auf den Objekthalter 14 gelegt. Das Vakuumgefäß 10 wurde evakuiert und die Temperatur des Objektes wurde auf -100°C mit Hilfe der Heizspirale eingestellt. Der Polymerfilm wurde direkt auf der Schnittfläche des Steinsalzobjektes durch Plasmapolymerisation nach dem Beispiel 1 niedergeschlagen, mit der Ausnahme, daß für die Glimmentladung die folgenden Bedingungen galten:The set of negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 was taken out of the vacuum vessel 10 and cooled to a temperature of -190 ° C by means of liquid nitrogen. The cooled negative electrode was then placed in the vacuum vessel 10 and the rock salt object was then placed on the object holder 14 . The vacuum vessel 10 was evacuated and the temperature of the object was adjusted to -100 ° C by means of the heating coil. The polymer film was deposited directly on the cut surface of the rock salt object by plasma polymerization according to Example 1, except that the following conditions applied to the glow discharge:

Gleichspannung|1,5 kVDC voltage | 1.5 kV Stromdichte der GlimmentladungCurrent density of the glow discharge 0,4 mA/cm²0.4 mA / cm² GlimmentladungszeitGlimmentladungszeit 10 Minuten10 mins

Das elektronenmikroskopische Bild in 4000facher Vergrößerung des so erhaltenen Filmes ist in Fig. 8 dargestellt. Das Objekt war in Wasser aufgelöst worden. The electron micrograph at 4000 times magnification of the film thus obtained is shown in FIG . The object had been dissolved in water.

example 3 Production of an impression film of a frozen object Cutting plane of rat kidney tissue

Unter Verwendung der in Fig. 4 dargestellten Vorrichtung wurde ein Abdruckfilm von der gefrorenen Schnittfläche des Nierengewebes einer Ratte hergestellt. Das gefrorene geschnittene Objekt wurde wie folgt präpariert. Das Nierengewebe einer Rate wurde in 2%iger wäßriger Glutaryldehyd- Lösung eine Stunde lang fixiert und dann in Wasser gewaschen. Das gewaschene Objekt wurde dann 3 Stunden lang in 25%iger wäßriger Glycerinlösung eingeweicht. Das so vorbehandelte Objekt wurde auf eine Größe von 2 × 2 × 8 mm geschnitten und in ein Loch eingesetzt, das im Objekthalter angeordnet war. Die negativen Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 und die Schneideinrichtung 37 wurden montiert und das Objekt auf eine Temperatur von -190°C mit Hilfe von flüssigem Stickstoff gekühlt. Dieses Frieren kann man außerhalb des Vakuumgefäßes 10 durchführen. Das Vakuumgefäß 10 wurde dann auf einen Druck von ungefähr 10^-6 Torr evakuiert. Nachdem dieser Druck mehr als 30 Minuten lang aufrechterhalten worden war, war die Temperatur des Objekts auf -100°C angestiegen. In diesem Zustand wurde das Objekt bei herrschendem Unterdruck mit Hilfe der Schneideinrichtung 37 geschnitten. Unmittelbar danach wurden Styrolmonomerdämpfe in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet. Nachdem der Druck im Vakuumgefäß 10 ungefähr 0,1 Torr geworden war, wurde die Glimmentladung durchgeführt nach dem Beispiel 1, jedoch wurden folgende Bedingungen dabei eingestellt: Using the apparatus shown in Fig. 4, an impression film was prepared from the frozen cut surface of kidney tissue of a rat. The frozen cut object was prepared as follows. The kidney tissue of a rate was fixed in 2% aqueous glutaraldehyde solution for one hour and then washed in water. The washed object was then soaked for 3 hours in 25% aqueous glycerol solution. The object pretreated in this way was cut to a size of 2 × 2 × 8 mm and inserted into a hole which was arranged in the object holder. The negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 and the cutter 37 were mounted and the object was cooled to a temperature of -190 ° C by means of liquid nitrogen. This freezing can be carried out outside the vacuum vessel 10 . The vacuum vessel 10 was then evacuated to a pressure of about 10 ^-6 torr. After this pressure had been maintained for more than 30 minutes, the temperature of the object had risen to -100 ° C. In this state, the object was cut under the negative pressure by means of the cutter 37 . Immediately thereafter, styrene monomer vapors were introduced into the vacuum vessel 10 . After the pressure in the vacuum vessel 10 became about 0.1 Torr, the glow discharge was carried out according to Example 1 except that the following conditions were set:

Gleichspannung|2 kVDC voltage | 2 kV Stromdichte der GlimmentladungCurrent density of the glow discharge 0,5 mA/cm²0.5 mA / cm² EndladungszeitEndladungszeit 10 Minuten10 mins

Das Objekt wurde dann mit einem Objektträger aus Kristallzucker in Wasser eingeweicht und dann in 1%ige wäßrige Natriumhypochlorit-Lösung gebracht, die zuvor auf eine Temperatur von ungefähr -20°C abgekühlt worden war. In dieser Lösung blieb das Objekt 1 Stunde. Hierdurch löste sich das Nierengewebe vollständig auf, so daß nur der Abdruckfilm übrigblieb. Dieser Abdruckfilm wurde auf einem Maschengitter nach dem Waschen in Wasser mit Hilfe eines Elektronenmikroskopes betrachtet. Ein Abbild des Abdruckfilmes ist in Fig. 9 dargestellt.The object was then soaked in water with a slide of crystal sugar and then placed in 1% aqueous sodium hypochlorite solution previously cooled to a temperature of about -20 ° C. In this solution, the object remained 1 hour. As a result, the kidney tissue completely dissolved, so that only the impression film remained. This impression film was observed on a mesh after washing in water with an electron microscope. An image of the impression film is shown in FIG. 9.

Claims

1. An apparatus for producing a suitable for structural investigations in a transmission electron microscope impression film from a surface of an object, with two in an evacuable vessel stacked electrodes which are connected with different polarity to a DC high voltage source, and of which the lower electrode of the Object carries, and with an organic monomer which is introduced into the vessel and deposited in a glow discharge between the two electrodes as a polymeric impression film on the object surface, characterized by the combination of the following features:

a) that the lower electrode ( 15 ) carrying the object is at negative potential,
b) that the surface of the object to be coated with the impression is arranged in the negative glow zone of the glow discharge,
c) that each electrode ( 13, 15 ) by a grounded discharge protective cylinder ( 16, 17 ) is surrounded, whose cylinder axis is parallel to the center distance axis of the two electrodes, and
d) applying to the electrodes a discharge voltage of 0.5 to 3 kV for about 15 minutes and causing a glow discharge between the electrodes with a discharge current of 0.1 to 2 mA per cm 2 electrode area.

2. Device according to claim 1, characterized by a freezing device ( 40 ).

3. Apparatus according to claim 2, characterized by a cutting or breaking device ( 37 ).