DE2950454A1

DE2950454A1 - Polymeric replica films of specimens for electron microscopy - formed directly on the surface of specimen by plasma polymerisation of organic monomer vapours

Info

Publication number: DE2950454A1
Application number: DE19792950454
Authority: DE
Inventors: Akira Souka Saitama Tanaka
Original assignee: Tokyo Metropolitan Government Tokyo; Tokyo Metropolitan Government
Current assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 1979-12-14
Filing date: 1979-12-14
Publication date: 1981-07-02
Also published as: DE2950454C2

Abstract

A replica film of a specimen for electron microscopy is formed by forming a polymer film of uniform thickness directly on the surface of the specimen by plasma polymerisation of organic monomer vapours by a glow discharge method. Suitable organic monomers are e.g. ethylene, propylene, benzene, toluene, xylene, styrene, chlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene, ferrocene, ethylbenzene, ethylene chloride, propylene oxide, methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, 1,2-epoxybutane and 1,2-epoxyethylbenzene. Process allows uniform replica films to be deposited on substrates such as biomedical specimens. The replica films are amorphous and allow electron microscopy of much higher resolving power than is obtainable e.g. using deposited metal replica films, in which the grains affect the resolution power.

Description

Abdruckfilm für Elektronenmikroskopieverfahren sowie Impression film for electron microscopy procedures as well

Verfahren und Vorrichtung zu seiner Herstellung Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Abdruckfilm für Elektronenmikroskopieverfahren sowie auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung eines solchen Abdruckfilms. Method and apparatus for its manufacture The invention relates to on a new impression film for electron microscopy procedures as well as on a Method and apparatus for making such an impression film.

Speziell bezieht sich die Erfindung auf einen Abdruckfilm gleichmäßiger Dicke von etwa 50 bis 1000 R, der ein hohes Auflösungsvermögen aufweist.More particularly, the invention relates to a more uniform replica film Thickness of about 50 to 1000 R, which has a high resolving power.

Es ist bekannt, daß das Auflösungsvermögen von Durchstrahlungselektronenmikroskopen 1 R oder weniger erreicht und man daher mit solchen Mikroskopen atomare Strukturen spezieller Objekte untersuchen kann. Im allgemeinen lassen zu untersuchende Objekte, speziell biologische Objekte, die volle Ausnutzung des hohen Auflösungsvermögens der zur Verfügung stehenden Durchstrahlungselektronenmikroskope aufgrund der technischen ßrenzen der bisher bekannten Abdruckfilme nicht zu. Wenn beispielsweise die Oberfläche eines biologischen Objekts untersucht werden soll, benutzt man im allgemeinen ein Abtastelektronenmikroskop. Das theoretische Auflösungsvermögen des Abtastelektronenmikroskops ist auf etwa 70 R begrenzt. Das praktische Auflösungsvermögen eines solchen Mikroskops ist indessen weitaus geringer als das theoretische. Daher lassen sich Ultra-Mikro-Strukturen biologischer Objekte nicht untersuchen. Wenn man andererseits die Oberflächenstruktur eines Objekts mit Hilfe eines Durchstrahlungselektronenmikroskops untersuchen will, dann bedient man sich hierzu eines Abdruckfilms aus Metall, der beispielsweise durch ein Vakuumverdampfungsverfahren hergestellt wurde. Da die Körnung des metallischen Abdruckfilms das Auflösungsvermögen beeinträchtigt, ist auch in diesem Falle eine Auflösung nur bis zu 50 R erreichbar.It is known that the resolving power of transmission electron microscopes 1 R or less is reached and one therefore atomic structures with such microscopes can examine special objects. In general, objects to be examined, especially biological objects, the full use of the high resolution of the available transmission electron microscopes due to the technical The previously known impression films are not limited to. For example, if the surface of a biological object is to be examined, one generally uses a Scanning electron microscope. The theoretical resolving power of the scanning electron microscope is limited to about 70 R. The practical resolving power of such a microscope is, however, far less than the theoretical. Hence, ultra-micro-structures can be used Do not examine biological objects. On the other hand, if you look at the surface structure wants to examine an object with the help of a transmission electron microscope, then one uses an impression film made of metal, for example through a vacuum evaporation process was established. Because the grain of the metallic Impression film impaired the resolving power is also in this case Resolution only achievable up to 50 R.

Wenn man die Korngröße im Abdruck film verringern könnte oder wenn man eine amorphe Struktur im Abdruckfilm erzielen könnte, dann würde das Auflösungsvermögen etwa zehnmal so groß oder mehr sein. Hierdurch würden sich speziell auf dem biomedizinischen Gebiet erhebliche Fortschritte bei der Elektronenmikroskopie ergeben.If one could reduce the grain size in the impression film or if one could achieve an amorphous structure in the replica film, then the resolving power would be be about ten times as big or more. This would focus specifically on the biomedical Significant advances in electron microscopy in the field.

Unter Bezugnahme auf die Figuren 1A, 2A und 3A soll nachfolgend die konventionelle Metallabdruckfilmtechnik beschrieben werden.With reference to FIGS. 1A, 2A and 3A, the conventional metal impression film technology will be described.

Fig. 1A zeiqt eine übliche Vakuumverdampfungsvorrichtunq, in der ein Schwermetall 3' unter Vakuum von beispielsweise 10-6 Torr verdampft wird. Das verdampfte Metall trifft unter einem Winkel gegenüber der horizontalen Ebene auf die Oberfläche eines zu untersuchenden Objekts 1 auf, das horizontal in der Vorrichtung placiert ist. Man spricht hier vom sogenannten Schrägbedampfungsverfahren. Dann wird Kohlenstoff 2' verdampft und als Verstärkungsfilm auf die gesamte Oberfläche des Objekts 1 niedergeschlagen. Wie Fig. 2A-(a) zeigt, ergibt sich eine spezielle Struktur auf der Oberfläche des Objekts 1, auf der der niedergeschlagene Metall film 2 und der Kohltnstoffilm 3 teilweise übereinanderliegen. Das Objekt 1 wird dann von den beiden übereinanderliegenden Filmen 2 und 3 gelöst. Das Ergebnis ist in Fig. 2A-(b) dargestellt. Wenn man diesen Abdruckfilm mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachtet, dann ergibt sich eine Differenz in der Elektronendichteverteilung, die in Fig. 2A-(c) dargestellt ist, die aus der ungleichmäßigen Abscheidung des Metalls hervorgeht. Mai erhält ein Stereo- oder dreidimensionales Bild, das in Fig. 2A-(d) dargestellt ist, und zwar aufgrund der Differenz in der Dichte des durchgelassenen Elektronenstrahls.Dies ist das Grundprinzip der konventionellen Metallabdrucktechnik.Fig. 1A shows a common vacuum evaporation device in which a Heavy metal 3 'is evaporated under vacuum of, for example, 10-6 Torr. That evaporated Metal hits the surface at an angle from the horizontal plane of an object 1 to be examined, which is placed horizontally in the device is. One speaks here of the so-called inclined vapor deposition process. Then it becomes carbon 2 'evaporated and deposited on the entire surface of the object 1 as a reinforcing film. As Fig. 2A- (a) shows, there is a special structure on the surface of the Object 1 on which the deposited metal film 2 and the carbon film 3 partially on top of each other. The object 1 is then of the two superimposed Films 2 and 3 solved. The result is shown in Fig. 2A- (b). If you have this Impression film viewed with a transmission electron microscope then reveals becomes a difference in the electron density distribution shown in Fig. 2A- (c) resulting from the uneven deposition of the metal. May receives a stereo or three-dimensional image shown in Figures 2A- (d), and due to the difference in the density of the transmitted electron beam is the basic principle of the conventional metal impression technique.

Wenn man das Objekt 1 nicht vom Film löst, beispielsweise weil es sich davon nicht ablösen läßt, dann wird ein sogenanntes zweistufiges Verfahren durchgeführt, das in Fig. 3A dargestellt ist. Wie Fig. 3A-(a) zeigt, wird ein geeignetes härtbares Material 4, das sich in einem Lösungsmittel auflösen läßt, auf die Oberfläche des Objekts 1 aufgebracht.If the object 1 is not detached from the film, for example because it cannot be detached from it, then a so-called two-stage process is used performed, which is shown in Fig. 3A. As Fig. 3A- (a) shows, a suitable hardenable material 4, which can be dissolved in a solvent, on the surface of the object 1 applied.

Die gehärtete Materialschicht 4 wird dann vom Objekt 1 abgenommen. Die Unterseite der Schicht 4 hat dann exakt die komplementäre Oberflächentopographie des Objekts 1. Auf diese Unterseite der Schicht 4 werden dann die Metallschicht 2 und die Kohlenstoffschicht 3 nach dem oben genannten Verfahren niedergeschlagen. Das Ergebnis ist in Fig. 3A-(c) dargestellt. Durch nachfolgende Auflösung der Schicht 4 ergibt sich ein Abdruckfilm aus zwei Schichten 2 und 3, der in Fig. 3A-(d) dargestellt ist. Wenn man diesen Abdruckfilm mit Hilfe eines Durchstrahlungselektronenmikroskops betrachtet, dann ergibt sich eine Elektronendichteverteilung und ein Stereobild, wie in den Figuren 3A-(e) und (f) dargestellt.The hardened material layer 4 is then removed from the object 1. The underside of the layer 4 then has exactly the complementary surface topography of the object 1. The metal layer is then placed on this underside of the layer 4 2 and the carbon layer 3 deposited by the above-mentioned method. The result is shown in Fig. 3A- (c). By subsequent dissolution of the layer 4 results in a replica film of two layers 2 and 3, which is shown in Fig. 3A- (d) is. If you can see this replica film with the help of a transmission electron microscope considered, the result is an electron density distribution and a stereo image, as shown in Figures 3A- (e) and (f).

Der Kohlenstoffilm hat beim oben beschriebenen Abdruck film eine Struktur, die ähnlich der für elektronenmikroskopische Zwecke erwünschten amorphen Struktur ist. Da die Elektronendichte der Kohlenstoffschicht sehr niedrig ist, gelangt ein relativ hoher Anteil des Elektronenstrahls durch die Kohlenstoffschicht selbst dann hindurch, wenn diese mit relativ großer Dicke niedergeschlagen worden ist. Aus diesem Grunde ist, wie Fig.5A zeigt, kein befriedigendes Stereobild erzielbar. Aus diesem Grunde stellt man üblicherweise Abdruckfilme, mit dem man unebene Oberflächen von Objekten elektronenmikroskopisch darstellen will, mit dem eingangs beschriebenen Schrägbedampfungsverfahren unter Zuhilfenahme von Schwermetallen her, die eine hohe Elektronendichte aufweisen. Wenn man einen so hergestellten Abdruck film mit dem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachtet, ergibt sich ein Stereobild, wie es in Fig. 7A dargestellt ist.The carbon film in the print film described above has a structure similar to the amorphous structure desired for electron microscopy purposes is. Since the electron density of the carbon layer is very low, an relatively high proportion of the electron beam through the carbon layer even then through when this has been deposited with a relatively large thickness. For this Basically, as FIG. 5A shows, no satisfactory stereo image can be achieved. For this Basically, one usually makes impression films with which one can remove uneven surfaces from Wants to represent objects with an electron microscope, with the one described at the beginning Inclined vapor deposition process with the help of heavy metals, which have a high Have electron density. if an impression made in this way film viewed with the transmission electron microscope, the result is a stereo image, as shown in Fig. 7A.

In einem Film, der aus einem Schwermetall hergestellt ist, weisen die Körner jedoch einen Durchmesser von ungefähr 30 R oder mehr auf, so daß der minimale Abstand zwischen benachbarten Körnern wenigstens 50 R beträgt. Damit man einen Abdruckfilm erhält, muß die Menge des niedergeschlagenen Metalls entsprechend groß sein. Dies ruft jedoch ein Problem insofern hervor, als das beobachtete Stereobild sehr stark durch die Unterschiede in der Elektronendichteverteilung des durchgelassenen Elektronenstrahls beeinträchtigt wird, die durch die Unterschiede in den niedergeschlagenen Metallmengen hervorgerufen werden, was von der Schrägbedampfung herrührt.In a film that is made of a heavy metal, point however, the grains have a diameter of about 30 R or more, so that the minimum distance between adjacent grains is at least 50R. So that one To obtain a replica film, the amount of metal deposited must be appropriate be great. However, this creates a problem in that the stereo image observed very much due to the differences in the electron density distribution of the transmitted Electron beam is affected by the differences in the depressed Metal amounts are caused, which comes from the oblique vapor deposition.

Das Auflösungsvermögen des metallischen Abdruck films ist natürlich hierdurch begrenzt. Wie weiterhin der in Fig. 7A durch den Pfeil näher bezeichnete Schattenbereich zeigt, geht in der untersuchten Struktur des Objekts häufig ein Bildteilbereich verloren, was ebenfalls aus der Schrägbedampfung resultiert.The resolving power of the metallic replica film is natural limited by this. As is furthermore indicated in more detail by the arrow in FIG. 7A Shadow area shows, often goes into the examined structure of the object Partial image area lost, which also results from the oblique vapor deposition.

Die Herstellung von metallischen Abdruckfilmen nach dem oben beschriebenen Vakuumverdampfungsverfahren ist vor ungefähr 30 Jahren entwickelt worden und hat sich bis heute nicht grundlegend geändert, obgleich freilich manche Verbesserungen seitdem erreicht worden sind.The manufacture of metallic replica films according to the above Vacuum evaporation process was and has been developed about 30 years ago has not changed fundamentally to this day, although there have been some improvements have since been achieved.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile, die die bekannten Abdruck filme bei der Durchstrahlungselektronenmikroskopie mit sich bringen, zu vermeiden und einen neuen Abdruckfilm anzugeben, der eine einschichtige, amorphe Struktur mit hohem Auflösungsvermögen aufweist.The invention is based on the object of the disadvantages that the known Bring imprint films in transmission electron microscopy, too avoid and specify a new impression film that is a single layer, amorphous Has structure with high resolving power.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Weiterbildungen der Erfindung sowie Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines solchen Abdruck filmes sowie Weiterbildungen davon sind Gegenstand weiterer Ansprüche.This object is achieved by the characterizing features of the patent claim 1 solved. Developments of the invention as well as method and device for production such an imprint film as well as further developments thereof are the subject of further Expectations.

Die Erfindung soll nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigt: Fig. 1B eine Vorrichtung zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Abdruckfilms; Fig. 2B eine schematische Darstellung eines einzelnen Verfahrensablaufs nach der vorliegenden Erfindung; Fig. 3B eine schematische Darstellung eines zweistufigen Verfahrensablaufs nach der vorliegenden Erfindung; Fig. 4 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung eines Abdruckfilms nach der Erfindung; Fig. 5A ein elektronenmikroskopisches Bild in 15000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes der Oberfläche von Steinsalzkristallen, erhalten mit Hilfe eines üblichen Kohlenstoffniederschlagfilmes; Fig. 5B ein elektronenmikroskopisches Abbild in 15000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes der Oberfläche von Steinsalzkristallen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Abdruckfilmes; Fig. 6A ein elektronenmikroskopisches Bild in 200000-facher Vergrößerung eines bekannten metallischen Abdruckfilmes; Fig. 6B ein elektronenmikroskopisches Bild in 250000-facher Vergrößerung eines erfindungsgemäßen Abdruck filmes; Fig. 7A ein elektronenmikroskopisches Bild in 12000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von roten Blutkörperchen einer Maus unter Verwendung eines in einstufiger Verdampfung niedergeschlagenen metallischen Abdruckfilmes; Fig. 7B ein elektronenmikroskopisches Bild in 12000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von roten Blutkörperchen einer Maus, das mit einem erfindungsgemäßen Abdruckfilm erhalten wurde; Fig. 8 ein elektronenmikroskopisches Bild in 40000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes von gekühltem Steinsalz unter Verwendung eines in einstufiger Verfahrensweise hergestellten Abdruckfilmes nach der vorliegenden Erfindung, Fig. 9 ein elektronenmikroskopisches Bild in 13000-facher Vergrößerung eines Abdruckbildes einer gefrorenen Schnittebene einer Rattenniere, das mit Hilfe eines in einstufiger Verfahrensweise hergestellten Abdruckfilmes nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.The invention is described below with reference to the drawings are explained in more detail. It shows: FIG. 1B an apparatus for producing a impression film according to the invention; Figure 2B is a schematic representation of an individual Process sequence according to the present invention; 3B is a schematic illustration a two-step process according to the present invention; Fig. 4 a schematic representation of a device according to the invention for producing a Impression film according to the invention; Fig. 5A is an electron microscope image in 15,000 times Enlargement of a replica image of the surface of rock salt crystals obtained with the aid of a conventional carbon precipitate film; 5B shows an electron microscope Image in 15000 times magnification of an image of the surface of rock salt crystals using an impression film according to the invention; Figure 6A an electron microscope image magnified 200,000 times of a known one metallic replica film; 6B is an electron microscope image in 250,000 times Enlargement of an impression film according to the invention; 7A shows an electron microscope Image magnified 12,000 times of a red blood cell imprint of a Mouse using a metallic precipitated in one-stage evaporation Imprint film; 7B shows an electron microscope image magnified 12,000 times a mouse red blood cell replica image obtained with a Impression film was obtained; Fig. 8 is an electron microscope image in 40,000 times Enlargement of an imprint image of chilled rock salt using a impression film produced in a one-step procedure according to the present invention Invention, FIG. 9 shows an electron microscope image magnified 13,000 times of an imprint of a frozen sectional plane of a rat kidney, which was made with the aid of an impression film produced in a one-step process according to the present invention Invention was obtained.

Zunächst sollen die Figuren 1B, 2B und 3B erläutert werden.First, FIGS. 1B, 2B and 3B will be explained.

Fig. 1B zeigt zwei im Abstand übereinander angeordnete Entladungselektroden 5, deren untere eine negative und deren obere eine positive Elektrode ist. Diese Elektroden sind in einem Vakuumgefäß angeordnet. Auf der Oberseite der unteren Elektrode liegt ein Objekt 1. Nachdem die Luft aus dem Gefäß herausgepumpt und in ihm ein Hochvakuum erzeugt wurde, wird ein organischer Monomerdampf durch ein Rohr 6 in das Gefäß eingeleitet, bis der Gasdruck darin wieder auf ungefähr 0,1 Torr angestiegen ist. Sodann wird eine Gleichspannung von 0,5 bis 3 kV an die beiden Elektroden angelegt, um eine Glimmentladung zwischen ihnen zu erzeugen.1B shows two discharge electrodes arranged at a distance from one another 5, the lower of which is a negative and the upper of which is a positive electrode. These Electrodes are arranged in a vacuum vessel. On top of the lower electrode lies an object 1. After the air is pumped out of the vessel and into it High vacuum has been created, an organic monomer vapor is passed through a 6 in The vessel was introduced until the gas pressure therein increased again to approximately 0.1 torr is. Then a DC voltage of 0.5 to 3 kV is applied to the two electrodes, to create a glow discharge between them.

Die Glimmentladung wird bei einem Entladungsstrom zwischen 0,1 und 2 mA/cm2 für 1 bis 15 Minuten lang aufrechterhalten, wobei sich die Oberfläche des Objekts 1 in einer Zone zwischen einer negativen Glimmphase und einer Kathodenglimmphase befindet. Es wird auf diese Weise ein im Plasma polymerisierter Film 7 direkt auf der Oberfläche des Objekts 1 ausgebildet, wie Fig. 2B-(a) zeigt. Das Objekt 1 wird dann in einem Lösungsmittel aufgelöst, so daß ein Abdruckfilm entsteht, der nur aus dem dünnen, im Plasma polymerisierten Film 7 besteht. Das Ergebnis ist in Fig. 2B-(b) dargestellt. Als Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel eingesetzt werden, das das Objekt 1 auflöst, ohne den Film 7 zu beschädigen. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Wasser, eine Natriumhypochlorit-Lösung, wässriges Kaliumbichromat, Mineralsäuren, wie Salzsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure, eine wässrige Lösung aus Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid. Die Unterseite des Filmes 7 entspricht exakt der Oberflächentopograhie des Objekts 1. Die Elektronendichteverteilung der diesen Film durchstrahlendenEIektronenstrahlen ist id Fig. 2B-(c) dargestellt, das Stereobild davon ist in Fig. dB-(d) dargestellt.The glow discharge is at a discharge current between 0.1 and Maintain 2 mA / cm2 for 1 to 15 minutes as the surface of the Object 1 in a zone between a negative glow phase and a cathode glow phase is located. In this way, a film 7 polymerized in the plasma is applied directly of the surface of the object 1, as shown in Fig. 2B- (a) shows. The object 1 becomes then dissolved in a solvent, so that an impression film is formed that only consists of the thin film 7 polymerized in the plasma. The result is shown in Fig. 2B- (b). Any solvent can be used as the solvent, that dissolves the object 1 without damaging the film 7. Examples of such solvents are water, a sodium hypochlorite solution, aqueous potassium dichromate, mineral acids, such as hydrochloric acid, nitric acid and sulfuric acid, an aqueous solution of sodium hydroxide or potassium hydroxide. The underside of the film 7 corresponds exactly to the surface topography of the object 1. The electron density distribution of the electron beams transmitting through this film is shown id Fig. 2B- (c), the stereo image thereof is shown in Fig. dB- (d).

Die wirklichen Stereobilder, wie man sie an einem Elektronenmikroskop beobachten kann, sind durch die Photographien der Figuren SB und 7B dargestellt.The real stereo images as seen on an electron microscope can be observed are shown by the photographs of Figures SB and 7B.

Das zweistufige Abdruckverfahren nach der vorliegenden Erfindung kann in der in Fig. 3B dargestellten Weise ähnlich dem vorbeschriebenen Verfahren durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß der Abdruckfilm 7 aus einem im Plasma polymerisierten Material an der Unterseite eines gehärteten Materials 4 in dem Plasmapolymerisationsverfahren, das oben beschrieben wurde, niedergeschlagen wird. Die Elektronendichteverteilung und das Stereobild sind in den Figuren 3B-(e) und (f) dargestellt.The two-step impression process of the present invention can carried out in the manner shown in Fig. 3B similar to the method described above except that the replica film 7 is plasma polymerized Material on the underside of a hardened material 4 in the plasma polymerization process, that has been described above is precipitated. The electron density distribution and the stereo image are shown in Figures 3B- (e) and (f).

Wenn man ein gekühltes oder gefrorenes Objekt untersuchen will oder wenn man eine Reiß- oder Schnittebene eines gefrorenen Objekts, wie beispielsweise ein Gewebsstück untersuchen will, dann muß man den Abdruckfilm unter etwas modifizierten Bedingungen herstellen. Wenn beispielsweise die Entladungsbedingungen die gleichen sind, wie sie bei einem unter gewöhnlicher Temperatur stehenden Objekt gelten, dann kann man einen starken Abdruckfilm erhalten oder auch nicht.If you want to examine a chilled or frozen object or if you have a tear or cut plane of a frozen object, such as If you want to examine a piece of tissue, you have to modify the impression film under something Establish conditions. For example, when the discharge conditions are the same are as they apply to an object under ordinary temperature, then can one get a strong impression film or not.

Wenn die Temperatur niedriger ist als -500 C, dann benötigt man eine hohe Entladungsenergie wegen der Absorption der Polymerisationswärme des organischen monomeren Dampfes. Es sind speziell die Glimmentladungsbedingunc, n während der Anfangszeit der ersten 10 bis 20 Sekunden zur Erzeugung eines starken, festen Abdruckfilms auf der Oberfläche des Objekts am wichtigsten. Wenn erst einmal ein fester ultradünner Film auf der Oberfläche des Objekts niedreschlagen worden ist, dann läßt sich der weitere Niederschlag polymerer Substanz bis zu einer gewünschten Dicke relativ einfach erreichen. Weiter unten ist beschrieben, daß ein Abdruckbild der Oberfläche von Steinsalz, das auf eine Temperatur von -1000 C heruntergekühlt wurde, in Fig. 8 gezeigt ist und ein Abdruckbild der gefrorenen Trennfläche eines Stückes eines Rattennierengewebes, das auf eine Temperatur von -1900 C eingefroren und dann bei einer Temperatur von -1000 C zertrennt wurde, in Fig. 9 gezeigt ist. Man kann daher ein sogenanntes Gefrierätzen beim erfindungsgemäßen Verfahren anwenden.If the temperature is lower than -500 C then you need one high discharge energy due to the absorption of the heat of polymerization of the organic monomeric vapor. There are especially the glow discharge conditions during the Start time of the first 10 to 20 seconds to create a strong, firm impression film most important on the surface of the object. Once a solid ultra-thin Film has been deposited on the surface of the object, then the further deposition of polymeric substance to a desired thickness is relatively easy reach. It is described below that a replica image of the surface of Rock salt, which has been cooled down to a temperature of -1000 C, in Fig. 8 is shown and a replica image of the frozen interface of a piece of rat kidney tissue, that frozen to a temperature of -1900 C and then at a temperature of -1000 C severed is shown in FIG. One can therefore use what is known as freeze etching in the method according to the invention.

Die Plasmapolymerisation organischer monomerer Dämpfe nach dem (.limmentladungsverfahren ist bekannt und ist in letzter Zeit verwendet worden, um beispielsweise Halbleitermaterialien zu ätzen oder um die Oberflächen gewisser Spezialmaterialien, wie beispielsweise kleiner Zahnräder, zu behandeln. Bei diesen Plasmapolymerisationsverfahren ist speziell eine sehr wirksame Hochfrequenz-Entladungsmethode hauptsächlich verwendet und untersucht worden, um dicke Polymerfilme von einigen 10/u Stärke oder mehr zu erzeugen. Es ist bisher aber noch nicht vorgeschlagen worden, einen festen dünnen Abdruckfilm hoher Reinheit und gleichmäßiger Dicke direkt auf der Oberfläche eines Objekts durch Plasmapolymerisation organischen monomeren Dampfes im Glimmentladungsverfahren niederzuschlagen. Es ist auch noch nicht erkannt worden, daß man solche Filme vorteilhaft dazu heranziehen kann, um die ultrafeinen Oberflächenstrukturen von speziellen Objekten mit Hilfe der Durchstrahlungselektronenmikroskopie zu untersuchen.The plasma polymerisation of organic monomeric vapors according to the (.lime discharge process is known and has recently been used to produce, for example, semiconductor materials to etch or around the surfaces of certain special materials, such as small gears to handle. This plasma polymerization process is special a very effective high frequency discharge method mainly used and studied has been used to produce thick polymer films of a few 10 / µ thick or more. It but has not yet been proposed, a strong replica thin film high purity and uniform thickness directly on the surface of an object Plasma polymerisation of organic monomeric vapor in the glow discharge process. It has also not yet been recognized that such films can be used advantageously for this purpose can to help the ultrafine surface structures of special objects to examine the transmission electron microscopy.

Für die organischen Monomere, die bei der Erfindung Einsatz finden können, kommt jede Verbindung in Betracht, die im Plasma polymerisiert werden kann. Typische Beispiele solcher organischen Monomere sind Äthylen, Propylen, Styrol, Benzol, Toluol, Xylol, Chlorbenzol, 1,2,4-Trichlorbenzol, Ferrocen, Äthylbenzol, Äthylenchlorid, Propylenoxid, Acrylverbindungen, wie beispielsweise Methylmetacrylat, n-Butylmetacrylat, und Epoxyverbindungen, wie beispielsweise 1,2-Epoxybutan und 1,2-Epoxyäthylbenzol. Diese Monomere können jeweils allein oder in beliebiger Mischung verwendet werden oder es kann ein Cemisch von ihnen zusammen mit einem Inertgas, wie beispielsweise Argon, Helium, Neon, Stickstoff u.dgl. eingesetzt werden.For the organic monomers used in the invention any compound that can be polymerized in the plasma can be used. Typical examples of such organic monomers are ethylene, propylene, styrene, Benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene, ferrocene, ethylbenzene, Ethylene chloride, propylene oxide, acrylic compounds such as methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, and epoxy compounds such as 1,2-epoxybutane and 1,2-epoxyethylbenzene. These monomers can be used alone or in any desired mixture can be used or a mixture of them together with an inert gas, such as argon, helium, neon, nitrogen and the like can be used.

Die Abdruckfilme, die für die Erzeugung der in den Figuren 5B, 68, 78, 8 und 9 dargestellten Photographien verwendet wurden, wurden durch Polymerisation in Plasma von Styrol erzeugt.The impression films which are used for the production of the Photographs shown in 78, 8 and 9 were used by polymerization generated in plasma from styrene.

Obgleich die optimalen Glimmentladungsbedingungen zur Erzielung des gewünschten gleichmäßigen Abdruckfilms nach der Erfindung von den eingesetzten organischen Monomeren als auch von der Art des Objekts und des Inertgases abhängen, lassen sich die optimalen Bedingungen sehr schnell durch den Fachmann ermitteln, beispielsweise durch experimentelle Untersuchungen oder Näherungsverfahren.Although the optimal glow discharge conditions to achieve the desired uniform impression film according to the invention from the organic used Monomers as well as the type of object and the inert gas can be used determine the optimal conditions very quickly by the specialist, for example by experimental investigations or approximation methods.

Die Gründe, warum sich der gewünschte gleichmäßige und feste dünne Abdruck film, der exakt der Oberflächentopographie des Objekts entspricht, erzielen läßt, sind noch nicht genau bekannt. Es wird vermutet, daß , weil ein Plasma oder hochionisierte Gasmoleküle eines organischen Monomeren eine hohe mittlere Energie von ungefähr 5 bis 10 eV haben, sie durch Berechnung ermittelt wurde, die sehr viel höher ist als die durchschnittliche Wärmeenergie der Metallmoleküle beim konventionellen Vakuumaufdampfungsverfahren, die bei ungefähr 0,1 eV liegt, die Moleküle beim Niederschlagen auf der Oberfläche des Objekts sofort an Ort und Stelle einer radikalen Polymerisation unterworfen werden und sich zu einem festen Film schließen. In Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Glimmentladungsbedingungen wird das organische Monomere auf jedem Objekt als Polymerfilm niedergeschlagen, ungeachtet der Form, der Temperatur und der Leitfähigkeit des Objekts. Der im Plasma polymerisierte Polymerfilm nach der vorliegenden Erfindung kann sogar auf jegliche unregelmäßig geformte Bereiche der Oberfläche des Objekts in gleichmäßiger Dicke niedergeschlagen werden, was seine Ursache in den den Plasmamolekülen innewohnenden Diffusions- und Dispersionswirkungen hat. Die Festigkeit und Dicke des Abdruckfilms hängen hauptsächlich von den Glimmentladungsbedingungen ab. Der Abdruckfilm nach der vorliegenden Erfindung weist eine amorphe Struktur auf. Korngrößen von 50 wie sie bei den bekannten Filmen hingenommen werden mußten, sind im erfindungsgemäßen Abdruck film nicht enthalten. Dies geht ganz klar aus dem Vergleich der Figuren 6A und 68 hervor.The reasons why you want the uniform and firm thin Achieve an impression film that corresponds exactly to the surface topography of the object lets are not yet exactly known. It is believed that because a plasma or highly ionized gas molecules of an organic monomer have a high average energy of about 5 to 10 eV, it was found by calculation that very much is higher than the average heat energy of the metal molecules in the conventional one Vacuum evaporation process, which is around 0.1 eV, deposition the molecules on the surface of the object immediately in place of radical polymerization are subjected to and form a solid film. In accordance with Under the glow discharge conditions described above, the organic monomer will rise deposited as a polymer film on any object, regardless of shape or temperature and the conductivity of the object. The polymer film polymerized in the plasma after The present invention can even apply to any irregularly shaped areas the surface of the object will be deposited in uniform thickness what its Cause in the diffusion and dispersion effects inherent in the plasma molecules Has. The strength and thickness of the imprint film mainly hang on the glow discharge conditions. The replica film according to the present invention has an amorphous structure. Grain sizes of 50 as in the known films had to be accepted, are not included in the impression film according to the invention. This can be seen quite clearly from the comparison of FIGS. 6A and 68.

Fig. 6A zeigt die niedergeschlagenen Metallkörner mit einer Größe von ungefähr 50 R. Diese lassen sich im Elektronenmikroskop bei 200000-facher Vergrößerung klar erkennen. Bei noch größerer Vergrößerung (250000-fach) lassen sich im Polymerfilm nach der vorliegenden Erfindung sehr kleine Punkte mit einem gegenseitigen Abstand von etwa 1 bis 3 R erkennen.Fig. 6A shows the deposited metal grains with a size of about 50 R. These can be seen in the electron microscope at 200,000 times magnification recognize clearly. At an even higher magnification (250,000 times), in the polymer film according to the present invention, very small dots with a mutual distance recognize from about 1 to 3 rows.

Man sieht hieraus, daß sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Abdruck filme für die Untersuchung der Oberflächentopographie von Objekten das Auflösungsvermögen sehr stark steigern läßt, und im Faktor 10 oder mehr im Vergleich zu der Verwendung üblicher Metallabdruckfilme. Das Auflösungsvermögen der erfindungsgemässen Abdruck filme liegt in der Größenordnung des Auflösungsvermögens eines Elektronenmikroskopes. Letzteres läßt sich daher voll ausnutzen. Es sind daher bemerkenswerte Fortschritte auf dem Gebiet der biomedizinischen Mikroskopie zu erwarten.It can be seen from this that with the help of the impression according to the invention films for the investigation of the surface topography of objects the resolving power can be increased very much, and by a factor of 10 or more compared to the use common metal replica films. The resolving power of the impression according to the invention films is in the order of magnitude of the resolution of an electron microscope. The latter can therefore be fully exploited. It is therefore remarkable progress expected in the field of biomedical microscopy.

Ein Stereobild eines Objekts wird aufgrund der Elektronenstrahlverteilung desjenigen Elektronenstrahls gebildet, der durch einen Abdruck film fällt. Wie oben erwähnt wurde, lassen sich bei Verwendung von metallischen Abdruckfilmen aber nicht die gewünschten Stereoeindrücke vermitteln, weil die Elektronendichte eines Kohlenstoffilmes gering ist. Im Gegensatz dazu ist trotz der wesentlich geringeren Dicke des im Plasma polymerisierten Abdruck films nach der vorliegenden Erfindung mit diesem das gewünschte Stereobild erzielbar. Dies rührt daher, daß die Elektronendichte des vorliegenden Abdruckfilmes hoch ist und daß der Streueffekt der Elektronenstrahlen aufgrund des vorliegenden Filmes sehr groß ist. Die Streuung der Elektronenstrahlen, die durch kleinste Unregelmäßigkeiten in der Oberfläche des Abdruckfilms hervorgerufen werden, haben ein Stereobild zur Folge, in welchem der Kontrast durch den Zerstreuungseffekt der Elektronenstrahlen verstärkt ist. Das heißt, daß zusätzlich zur geeigneten Elektronendichte des vorliegenden dünnen Abdruckfilmes, der aus einer gleichförmigen einzigen Lage besteht, beim Durchtreten der Elektronenstrahlen durch die flachen, geneigten und vertikalen Oberflächenbereiche des vorliegenden Abdruckfilms ein Unterschied in den Durchdringungslängen der Elektronenstrahlen durch Absorption, Diffraktion und Dispersion erzeugt wird. Diese Differenzen verstärken den Bildkontrast und erzeugen die Dichteverteilung der durchtretenden Elektronenstrahlen. Als Folge davon kann man ein Stereobild des Objekts wahrnehmen.A stereo image of an object is created due to the electron beam distribution formed of that electron beam that falls through a print film. As above was mentioned, but cannot be used when using metallic impression films give the desired stereo impressions, because the electron density of a carbon film is low. In contrast, in spite of the considerably smaller thickness of the in the plasma polymerized replica films according to the present invention with this the desired Stereo image achievable. This is because the electron density of the present Replica film is high and that the scattering effect of electron beams due of present film is very large. The scattering of the electron beams that pass through the smallest irregularities are caused in the surface of the impression film, result in a stereo image in which the contrast is created by the diffusion effect the electron beam is amplified. That is, in addition to the appropriate electron density of the present replica thin film composed of a uniform single sheet exists when the electron beams pass through the flat, inclined and vertical surface areas of the present replica film show a difference in the length of penetration of the electron beams through absorption, diffraction and Dispersion is generated. These differences increase and create the image contrast the density distribution of the electron beams passing through. As a result of this can one can perceive a stereo image of the object.

In diesen Stereobildern sind auch die feinsten Strukturen des Objekts enthalten, die durch die bekannten metallischen Abdruckfilme oft teilweise verlorengingen, wie Fig. 7A zeigt. Ein weiterer wichtiger Vorteil, den die Erfindung mit sich bringt, besteht darin, daß feine Strukturen in der Seitenebene des Abdruck filmes ebenfalls betrachtet werden können, indem man den Abdruckfilm um einen geeigneten Winkel während der Beobachtung im Elektronenmikroskop neigt.The finest structures of the object are also in these stereo images which were often partially lost due to the well-known metallic impression films, as Fig. 7A shows. Another important advantage that the invention brings with it, is that fine structures in the side plane of the impression film also can be viewed by turning the replica film at a suitable angle while the observation in the electron microscope tends to.

Eine bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zur Herstellung der beschriebenen Abdruck filme soll nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 4 erläutert werden.A preferred embodiment of an apparatus for manufacturing the impression films described will be explained below with reference to FIG will.

Das Vakuumgefäß 10 besteht aus einer Grundplatte 26 mit einem darauf angeordneten zylindrischen Adapter 41 aus Metall, beispielsweise rostfreiem Stahl, und einer darauf sitzenden Glasqlocke 11. Wenn der Abdruckfilm von einem Objekt gewöhnlicher Temperatur hergestellt werden soll, dann kann man die Glasglocke 11 auch direkt auf die Grundplatte 26 aufsetzen, ohne daß dazu der zylindrische Adapter 41 verwendet werden muß, weil keine Kühlvorrichtung erforderlich ist.The vacuum vessel 10 consists of a base plate 26 with one on top arranged cylindrical adapter 41 made of metal, for example stainless steel, and a bell jar seated on it 11. If the impression film is from an object more ordinary Temperature is to be established, then you can the bell jar 11 also place directly on the base plate 26 without the cylindrical adapter 41 must be used because no cooling device is required is.

Das Vakuumgefäß 10 ist über eine Saugleitung 25 mit einer tildiffusionspumpe 32 und einer tilkreiselpumpe 31 verbunden, -6 womit im Vakuumgefäß ein Unterdruck von etwa 10 6 Torr hergestellt werden kann. Die dlkreiselpumpe 31 ist auch so geschaltet, daß sie allein zur Evakuierung des Vakuumgefäßes 10 verwendet werden kann. Das typische Volumen des Vakuumgefäßes 10 liegt zwischen 2 und 6 Litern, kann jedoch über einen breiten Bereich verändert werden. Auf der Grundplatte 26 des Vakuumgefäßes 10 ist eine Isolierplatte 24 aus hitzerestistentem und elektrisch isolierendem Material angeordnet, auf der negative Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 befestigt sind.The vacuum vessel 10 is connected to a partial diffusion pump via a suction line 25 32 and a centrifugal pump 31 connected, -6 with which a negative pressure in the vacuum vessel of about 10 6 Torr can be produced. The centrifugal pump 31 is also connected so that it can be used solely for evacuating the vacuum vessel 10. The typical Volume of the vacuum vessel 10 is between 2 and 6 liters, but can be about one wide range can be changed. On the base plate 26 of the vacuum vessel 10 is an insulating plate 24 made of heat-resistant and electrically insulating material arranged on which negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 are attached.

Im Vakuumgefäß 10 sind im Abstand übereinander zwei Elektroden angeordnet, und zwar eine obere positive Elektrode 13 und eine untere negative Elektrode 15. Die Elektroden bestehen beispielsweise aus Edelstahl, Aluminium, Duraluminium oder sind mit einer dünnen Platinschicht versehen. Der Abstand der beiden parallel zueinander angeordneten Elektroden ist veränderlich. Obgleich dieser nicht speziell begrenzt ist, sollte er sich doch im Bereich zwischen 20 und 100 mm bei einem Volumen des Vakuumgefäßes zwischen 2 und 6 Litern halten.In the vacuum vessel 10, two electrodes are arranged one above the other at a distance, namely, an upper positive electrode 13 and a lower negative electrode 15. The electrodes consist, for example, of stainless steel, aluminum, or duralumin are provided with a thin layer of platinum. The distance between the two parallel to each other arranged electrodes is changeable. Though not particularly limited is, it should be in the range between 20 and 100 mm with a volume of the Hold the vacuum vessel between 2 and 6 liters.

Typische Abmessungen der Elektroden sind: Durchmesser zwischen 30 und 100 mm und Dicke zwischen 1 und 30 mm. Die positive Elektrode 13 sollte nach Möglichkeit groß und dick sein, während die negative Elektrode 15 klein sein sollte. Diese Bedingungen sind vom Standpunkt der Wärmekal)azität und der Gefahr einer Beschädigung des Objekts her gesehen. In die negative Elektrode 15 ist ein Objekthalter 14 so eingebettet, daß die Bodenfläche des Objekthalters 14 mit der Oberseite eines Metallzylinders in Berührung steht, der mit einer Heizspirale 20 und einem Thermoelement 21 versehen ist. Hierdurch läßt sich die Temperatur des Objekthalters 14 beeinflussen und messen. Die Heizspirale 20 und das Thermoelement 21 sind elektrisch von der negativen Elektrode 15 isoliert und sind mit einem Temperaturregler 34 über eine Steckverbindung 43 verbunden. Der negative Block ist von einem kleinen Entladungsschutzzylinder 17 umgeben, der an der Grundplatte 26 geerdet ist. Der innere Durchmesser dieses Schutzzylinders 17 ist im allgemeinen um 6 bis 10 mm größer als der Durchmesser der negativen Elektrode 15.Typical dimensions of the electrodes are: Diameter between 30 and 100 mm and thickness between 1 and 30 mm. The positive electrode 13 should follow Possibility to be large and thick, while the negative electrode 15 should be small. These conditions are from the standpoint of thermal calness and risk of damage of the object. In the negative electrode 15 is a specimen holder 14 embedded so that the bottom surface of the object holder 14 with the top of a Metal cylinder is in contact with a heating coil 20 and a thermocouple 21 is provided. This allows the temperature of the object holder 14 to be influenced and measure. The heating coil 20 and the thermocouple 21 are electrical from the negative electrode 15 isolated and are connected to a temperature controller 34 via a Plug connection 43 connected. The negative block is from a small anti-discharge cylinder 17, which is grounded to the base plate 26. The inner diameter of this Protective cylinder 17 is generally 6 to 10 mm larger than the diameter the negative electrode 15.

Die positive Elektrode 13 ist von einem kleinen Entladungsschutzzylinder 16 umgeben und wird von einem Elektrodenhalter 22 gehalten.The positive electrode 13 is of a small anti-discharge cylinder 16 and is held by an electrode holder 22.

Die positive Elektrode 13 ist an diesem Elektrodenhalter 22 horizontal beweglich gelagert. Sie ist mit einem geregelten Hochspannungsnetzteil 33 über ein Hochspannungskabel 12 verbunden, das durch den Halter 22 verläuft. Das Hochspannungsnetzteil kann eine Gleich- oder Wechselspannung zwischen 0 und 3 kV liefern. Die Polarität der Gleichspannung läßt sich umpolen. Der zur Verfügung stehende Maximalstrom beträgt beispielsweise 100 mA. Die Spannung für die Glimmentladung kann in den angegebenen Bereich gelegt werden und die Entladungszeit kann man mit Hilfe eines nicht dargestellten Zeitgebers voreinstellen.The positive electrode 13 is horizontal on this electrode holder 22 movably mounted. It is connected to a regulated high-voltage power supply 33 via a High-voltage cable 12 connected, which runs through the holder 22. The high voltage power supply can supply a direct or alternating voltage between 0 and 3 kV. The polarity the DC voltage can be reversed. The maximum current available is for example 100 mA. The voltage for the glow discharge can be in the specified range Area can be placed and the discharge time can be checked with the help of a not shown Preset the timer.

In das Innere des Vakuumgefäßes 10 ist ein Einlaßrohr 18 fiir organischen Monomerdampf so eingeführt, daß die Mündung dieses Rohres 18 auf die Mitte zwischen den zwei Elektroden 13 und 15 gerichtet ist. Dieses Einlaßrohr 18 ist mit einem Verdampfer 35 verbunden, in welchem organische monomere kämpfe erzeugt werden. Die organischen monomeren Dämpfe werden bei normaler Temperatur entwickelt oder durch Erwärmen oder Aufheizen eines organischen Monomeren, beispielsweise mit Hilfe einer elektrischen Heizvorrichtung, wie sie in Fig. 4 erkennbar ist. Diese Dämpfe kann man gewünschtenfalls auch verdünnen, beispielsweise mit einem kleinen Anteil Argon oder Stickstoff, das in einer Flasche 36 enthalten ist.In the interior of the vacuum vessel 10 is an inlet pipe 18 for organic Monomer vapor introduced so that the mouth of this tube 18 to the middle between the two electrodes 13 and 15 is directed. This inlet pipe 18 is with a Evaporator 35 connected in which organic monomeric fights are generated. the organic monomeric vapors are normal Temperature developed or by heating or heating an organic monomer, for example with With the aid of an electrical heating device, as can be seen in FIG. These If desired, vapors can also be diluted, for example with a small one Proportion of argon or nitrogen contained in a bottle 36.

Die organischen monomeren Dämpfe oder ein Gemisch daraus mit einem Verdünnungsgas werden in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet. Die Zuflußgeschwindigkeit des organischen Monomeren oder des Gemischs werden mit Hilfe einer Düse 19 oder einer anderen geeigneten Steuerungseinrichtung eingestellt. Der Gasdruck im Vakuumgefäß 10 kann mit Hilfe der Zuströmgeschwindigkeit und der Abpumpgeschwindigkeit eingestellt werden. Auf diese Weise läßt sich ein konstanter elektrischer Entladungsstrom aufrechterhalten. Der elektrische Entladungsstrom und die Entladungsspannung werden im Hochspannungsnetzteil 33 gemessen.The organic monomeric vapors or a mixture thereof with a Diluent gases are introduced into the vacuum vessel 10. The influx rate of the organic monomers or the mixture are with the help of a nozzle 19 or another suitable control device. The gas pressure in the vacuum vessel 10 can be set with the aid of the inflow speed and the pump-out speed will. In this way, a constant electric discharge current can be maintained. The electric discharge current and the discharge voltage are in the high voltage power supply 33 measured.

Wenn ein Abdruck film auf einem gekühlten Objekt erzeugt werden soll, dann wird der zylindrische Adapter 41 eingesetzt und ein dort ausgebildeter Stickstoffeinlaß 40 wird so angeschlossen, daß die negativen Blöcke 14, 15, 20 und 21 gekühlt werden. Das Objekt wird auf den gekühlten Objekt halter 14 aufgelegt. Die Temperaturregelung kann man mit Hilfe der Regeleinrichtung 34 durchführen.If an impression film is to be created on a cooled object, then the cylindrical adapter 41 is inserted and a nitrogen inlet formed there 40 is connected so that the negative blocks 14, 15, 20 and 21 are cooled. The object is placed on the cooled object holder 14. The temperature control can be carried out with the aid of the control device 34.

Wenn man einen Abdruckfilm auf einem gefrorenen Gewebsstück herstellen will, dann wird im Vakuumgefäß 10 zusätzlich eine Einrichtung 37 zum Zerbrechen oder Zerreißen des gefrorenen Objekts und ein Schneidmesser 39 angeordnet. Der Objekthalter 14 ist in diesem Falle so modifiziert, dazu eine Scheibe des Objekts in ein Loch im Objekthalter eingesetzt werden kann. Die Schneideinrichtung 37 kann beispielsweise aus Edelstahl bestehen und zylindrische Gestalt haben vom gleichen Durchmesser wie der kleine Entladungsschutzzylinder 17 für die negative Elektrode. Eine Schneidklinge 38 ist am unteren Bereich der Seitenfläche der Schneideinrichtung 37 angeordnet. Die Schneideinrichtung 37 ist horizontal um einige Millimeter über der Oberfläche des Objekts angeordnet und wird von dem Halter 22 so gehalten, daß die Schneideinrichtung 37 horizontal um den Halter in eine äußere Lage geschwenkt werden kann. Das Objekt, das auf dem Objekthalter 14 liegt, wird durch Bewegung der Schneideinrichtung 37 in Richtung des in Fig. 4 eingezeichneten Pfeiles zerschnitten. Nach dem Schneiden oder Teilen des Objekts wird die Schneideinrichtung 37 vollständig aus der Zone zwischen den zwei Elektroden 13 und 15 herausbewegt, so daß die Glimmentladung nicht gestört wird. Das Schneiden kann man wiederholen. Um das Objekt zu frieren, wird das Gewebsstück in Form einer Säule geschnitten, die einen Durchmesser von ungefähr 2 mm und eine Höhe von etwa 8 mm hat. Dieses so vorbereitete Gewebsstück wird in ein Loch im Objekthalter 14 so eingesetzt, daß ungefähr 3 mm seiner Länge aus den Objekthalter 14 herausschauen. Das Objekt kann für kurze Zeit gefroren werden, indem man flüssigen Stickstoff od.dgl. zusammen mit der Schneideinrichtung 37 einsetzt und dabei die negativen Elektrodenblöcke entfernt.When making an impression film on a frozen piece of tissue want, then in the vacuum vessel 10 is also a device 37 for breaking or tearing the frozen object and a cutting knife 39 is arranged. The object holder 14 is modified in this case by placing a disc of the object in a hole can be used in the object holder. The cutting device 37 can, for example are made of stainless steel and have a cylindrical shape of the same Diameter as the small discharge protection cylinder 17 for the negative electrode. A cutter blade 38 is on the lower portion of the side surface of the cutter 37 arranged. The cutter 37 is horizontal by a few millimeters across the surface of the object and is held by the holder 22 so that the cutter 37 is pivoted horizontally about the holder to an outer position can be. The object lying on the object holder 14 is made by movement the cutting device 37 cut in the direction of the arrow shown in FIG. After cutting or dividing the object, the cutting device 37 becomes complete moved out of the zone between the two electrodes 13 and 15, so that the glow discharge is not disturbed. The cutting can be repeated. To freeze the object the piece of tissue is cut in the form of a column with a diameter of about 2 mm and a height of about 8 mm. This piece of tissue prepared in this way is inserted into a hole in the specimen holder 14 so that about 3 mm of its length look out of the specimen holder 14. The object can be frozen for a short time, by using liquid nitrogen or the like. together with the cutting device 37 begins removing the negative electrode pads.

Der negative Elektrodenblock kann für 5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur von -190° C gekühlt werden. Die Schneideinrichtung 37 und der negative Elektrodenblock werden schnell in das Vakuumgefäß 10 eingebracht und die Atmosphäre darin wird bis auf einen Druck von ungefähr 10 5 Torr gebracht.The negative electrode block can be left on one temperature for 5 to 10 minutes can be cooled from -190 ° C. The cutter 37 and the negative electrode block are quickly introduced into the vacuum vessel 10 and the atmosphere therein becomes up to brought to a pressure of about 10 5 torr.

Die Temperatur des Objekts wird mit Hilfe der Heizspirale 20 auf eine für das Schneiden optimale Temperatur gebracht, beispielsweise auf -1000 C. Die Temperatur des Objekts wird stets mit dem Thermoelement 21 gemessen. Bei der optimalen Schneidtemperatur wird es mit Hilfe der Schneideinrichtung 37 und eines SchneidhebeSs 39 zerschnitten. Die gefrorene Schnittebene des Objekts wird dann einem Vakuumätzvorgang unterworfen, beispielsweise für einige Sekunden bis einige Minuten. Sodann werden vorgewärmte organische monomere Dämpfe in das Vkuumgefäß 10 eingeleitet und darin ein Druck von ungefähr 0,1 Torr mit einer Gleichspannung von beispielsweise 1,3 bis 3 kV wird eine Glimmentladung zwischen den Elektroden erzeugt, bei der ein Strom zwischen 0,4 bis 1 mA/cm2 5 bis 15 Minuten lang fließt. Diese Glimmentladungsbedingungen sind höher angesetzt als die bei einem Objekt gewöhnlicher Temperatur.The temperature of the object is with the help of the heating coil 20 to a brought optimal temperature for cutting, for example to -1000 C. The The temperature of the object is always measured with the thermocouple 21. At the optimal It becomes the cutting temperature with the aid of the cutting device 37 and a cutting lifter 39 cut up. The frozen one The cutting plane of the object is then subjected to a vacuum etching process, for example for a few seconds to a few Minutes. Preheated organic monomeric vapors are then drawn into the vacuum vessel 10 initiated and therein a pressure of about 0.1 Torr with a DC voltage of, for example, 1.3 to 3 kV, there is a glow discharge between the electrodes at which a current between 0.4 to 1 mA / cm2 flows for 5 to 15 minutes. These glow discharge conditions are set higher than those of a more common object Temperature.

Mit der Erfindung lassen sich einstufig und zweistufig hergestellte Abdruckfilme von Objekten beliebiger Art herstellen, die sich mit den erwähnten Vorteile mit dem Elektronenmikroskop betrachten lassen.With the invention can be produced in one and two stages Make imprint films of objects of any kind that deal with the aforementioned Have a look at the advantages with the electron microscope.

Nachfolgend sollen noch einige Beispiele, die Erfindung betreffend, angegeben werden.A few more examples relating to the invention are given below can be specified.

Beispiel 1 Herstellung eines Abdruck filmes einer Oberfläche Oberflächenstruktur eines gewöhnlichen Musters Durch Verwendung der Vorrichtung nach Fig. 4 wurden Abdruckfilme von verschiedenen Objekten einschließlich Steinsalz und roten Blutkörperchen von Mäusen hergestellt.Example 1 Production of an impression film of a surface Surface structure of an ordinary pattern By using the apparatus of Fig. 4, replica films were made of various objects including rock salt and red blood cells of Mice made.

Jedes Objekt wurde auf den Objekthalter 14 im Vakuumgefäß 10 placiert. Mit Hilfe der Ulkreiselpumpe 31 und der Oldiffusionspumpe 32 wurde der Druck im Vakuumgefäß 10 auf 10 bis 10 - Torr gebracht. Der Abstand zwischen den Elektroden war zwischen 30 und 60 mm einstellbar. Die Hochspannung zwischen den Elektroden betrug zwischen 0 und +3 kV und zwischen 0 und 3 kV Wechselspannung. Die Temperatur der Objekte, die gemessen werden konnte, lag zwischen -200° C und +300 C.Each object was placed on the object holder 14 in the vacuum vessel 10. With the help of the centrifugal pump 31 and the diffusion pump 32, the pressure in the Vacuum vessel 10 brought to 10 to 10 Torr. The distance between the electrodes was adjustable between 30 and 60 mm. The high voltage between the electrodes was between 0 and +3 kV and between 0 and 3 kV alternating voltage. The temperature the Objects that could be measured were between -200 ° C and +300 C.

Styrolmonomerdampf, der mit Stickstoff verdünnt war, wurde in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet, um darin einen Gasdruck von ungefähr 1 Torr einzustellen. Während der Druck durch Regelung der Styroldampfzuführungsgeschwindigkeit auf ungefähr 1 Torr eingeregelt wurde, wurde eine Glimmentladung ungefähr 10 Minuten lang mit einer Stromdichte von ungefähr 0,4 mA/cm2 durchgeführt. In der Zone ungefähr 1 cm über der Oberfläche der negativen Elektrode ließ sich eine negative violette Climmphase beobachten. Die Oberfläche des Objekts lag in dieser Zone. Beschädigungen des Objekts und der negativen Elektrode, die durch den Niederschlag der Plasmamoleküle verursacht worden wären, konnten nicht beobachtet werden. Der Temperaturanstieg an der Oberfläche des Objekts betrug nur etwa 150 C. Sobald die Glimmentladung begonnen hatte, bildete sich auf dem Objekt ein dünner Styrolpolymerfilm. Dieser Polymer film wuchs auf eine Dicke von ungefähr 300 R in der beschriebenen Entladungszeit an. Die Dicke dieses Filmes sollte im Bereich zwischen 100 und 500 Ä liegen, damit der Film beim nachfolgenden Auflösen des Objekts nicht beschädigt wird. Man kann die Dicke dieses Polymerfilmes durch die gewählte Entladungszeit beeinflussen.Styrene monomer vapor diluted with nitrogen was released into the Vacuum vessel 10 introduced to set a gas pressure of about 1 Torr therein. While printing by regulating the styrene steam feed rate to approximately 1 Torr was controlled, a glow discharge was performed for about 10 minutes at a current density of approximately 0.4 mA / cm2. In the zone about 1 cm Above the surface of the negative electrode there was a negative purple climbing phase watch. The surface of the object lay in this zone. Damage to the object and the negative electrode caused by the precipitation of the plasma molecules could not have been observed. The rise in temperature on the surface of the object was only about 150 C. As soon as the glow discharge had started, formed a thin film of styrene polymer will form on the object. This polymer film grew up a thickness of about 300 R in the described discharge time. The fat this film should be in the range between 100 and 500 Å, so that the film with subsequent dissolution of the object is not damaged. You can see the thickness of this Influence the polymer film through the selected discharge time.

Nachdem der Abdruckfilm durch Plasmapolymerisation in der vorbeschriebenen Weise erzielt worden war, wurde der Unterdruck aus dem Vakuumgefäß entfernt und das Objekt wurde dann in einem Lösungsmittel aufgelöst, das den Polymer film nicht angriff. Diese Lösungsmittel richten sich nach der Art des Objektes und dem verwendeten Polymermaterial.After the impression film by plasma polymerization in the above-described Manner had been achieved, the negative pressure was removed from the vacuum vessel and the object was then dissolved in a solvent that did not film the polymer attack. These solvents depend on the type of object and the one used Polymer material.

Im Falle von Kochsalzkristallen als Objekt wurde der Polymerfilm direkt auf der Schnittfläche des Kochsalzes einer Größe von 10 x 10 x 2 mm niedergeschlagen. Diese Schnittfläche wurde zuvor leicht mit Sandpapier aufgerauht. Dann wurde das Kochsalz mit dem niedergeschlagenen Polystyrolfilm darauf in Wasser aufgelöst, wodurch man den Abdruckfilm aus Polystyrol zurückbehielt. Ein elektronenmikroskopisches Abbild in 15000-facher Vergrößerung dieses Abdruckfilmes ist in Fig. SB gezeigt.In the case of saline crystals as an object, the polymer film became direct deposited on the cut surface of the table salt with a size of 10 x 10 x 2 mm. This cut surface was previously lightly roughened with sandpaper. Then it became Table salt with the deposited polystyrene film on it dissolved in water, causing the polystyrene replica film was retained. An electron microscope An image of this replica film magnified 15,000 times is shown in FIG. 5B.

Im Falle der roten Blutkörperchen einer Maus wurde das Blut eine Stunde lang in einer 2 eigen wässrigen Glutaraldehyd-Pufferlösung fixiert und dann gewaschen. Dieses Objekt wurde dann einer alkoholischen Dehydrierung unterworfen und das Lösungsmittel wurde dann durch ein Lösungsmittel ersetzt, das rasch und einfach auftrocknet, wie beispielsweise Aceton, Propylenoxid u.dgl. Die so erhaltene Lösung wurde dann schnell auf Kochsalz oder Kristallzucker getropft. Dieses Objekt trocknete auf dem Kochsalz oder Kristallzucker auf, das nun als Objektträger diente. Auf diesem Objekt wurde dann der Polystyrolfilm mit der Glimmentladung unter den oben beschriebenen Bedingungen aufgebracht. Das mit der Polymerschicht bedeckte Objekt wurde dann aus dem Vakuumgefäß herausgenommen und in Wasser gelöst. Das Kochsalz bzw. der Kristallzucker wurde in Wasser gelöst, so daß Blutzellen mit dem Abdruckfilm darauf übrigblieben. Dieses Objekt wurde dann in einer 1 bis 5 zeigen wässrigen Natriumhypochlorit-Lösung 30 bis 60 Minuten lang gelöst, wodurch nur der Abdruckfilm aus Polystyrol übrigblieb. Diesen Abdruckfilm konnte man mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop betrachten, nachdem er in Wasser qewaschen worden war. Das Bild davon ist in Fig. 7B dargestellt.In the case of the red blood cells of a mouse, the blood was one hour fixed in a 2 own aqueous glutaraldehyde buffer solution for a long time and then washed. This object was then subjected to alcoholic dehydration and the solvent was then replaced by a solvent that dries up quickly and easily, such as for example, acetone, propylene oxide, etc. The resulting solution then became rapid dripped on table salt or granulated sugar. This object dried on the table salt or granulated sugar, which now served as a slide. On this object was then the polystyrene film with the glow discharge under the conditions described above upset. The object covered with the polymer layer was then removed from the vacuum vessel taken out and dissolved in water. The table salt or the granulated sugar was dissolved in water so that blood cells remained with the imprint film thereon. This The object was then placed in a 1 to 5 point aqueous sodium hypochlorite solution 30 dissolved for up to 60 minutes, leaving only the polystyrene replica film. This replica film could be viewed with a transmission electron microscope, after being washed in water. The picture thereof is shown in Fig. 7B.

Beispiel 2 Erzeugung eines Abdruck films auf einer Oberfläche Gekühltes Objekt Mit Hilfe der errichtung nach Fig. 4 wurde ein Abdruckfilm von gekühlLem Steinsalz hergestellt. Das Steinsalz wurde auf eine Größe von 10 x 10 x 2 mm geschnitten und dann wurde die ZU betrachtende Schnittfläche leicht mit Sandpapier aufgerauht.Example 2 Production of an impression film on a surface that is cooled Object With the help of the construction according to FIG Rock salt made. The rock salt was cut to a size of 10 x 10 x 2 mm and then the cut surface to be observed was lightly roughened with sandpaper.

Der Satz negativer Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 wurde aus dem Vakuumgefäß 10 herausgenommen und auf eine Temperatur von -190° C mit Hilfe von flüssigem Stickstoff gekühlt. Die gekühlte negative Elektrode wurde dann in das Vakuumgefäß 10 eingebracht und das Steinsalzobjekt wurde dann auf den Objekthalter 14 gelegt. Das Vakuumgefäß 10 wurde evakuiert und die Temperatur des Objektes wurde auf -100° C mit Hilfe der Heizspirale eingestellt.The set of negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 was derived from the Vacuum vessel 10 removed and brought to a temperature of -190 ° C with the help of liquid nitrogen cooled. The cooled negative electrode was then placed in the Vacuum vessel 10 was placed and the rock salt object was then placed on the object holder 14 placed. The vacuum vessel 10 was evacuated and the temperature of the object was raised set to -100 ° C with the help of the heating coil.

Der Polymer film wurde direkt auf der Schnittfläche des Steinsalzobjektes durch Plasmapolymerisation nach dem Beispiel 1 niedergeschlagen, mit der Ausnahme, daß für die Glimmentladung die folgenden Bedingungen galten: Gleichspannung 1,5 kV Stromdichte der Glimmentladung 0,4 mA/cm2 Glimmentladungszeit 10 Minuten.The polymer film was placed directly on the cut surface of the rock salt object precipitated by plasma polymerization according to Example 1, with the exception that the following conditions were valid for the glow discharge: DC voltage 1.5 kV current density of the glow discharge 0.4 mA / cm2 glow discharge time 10 minutes.

Das elektronenmikroskopische Bild in 4 000-facher Vergrößerung des so erhaltenen Filmes ist in Fig. 8 dargestellt.The electron microscope image in 4,000 times magnification of the thus obtained film is shown in FIG.

Das Objekt war in Wasser aufgelöst worden.The object had been dissolved in water.

Beispiel 3 Herstellung eines Abdruckfilmes eines gefrorenen Objekts Schnittebene von Rattennierengewebe Unter Verwendung der in Fig. 4 dargestellten Vorrichtung wurde ein Abdruck film von der gefrorenen Schnittfläche des Nierengewebes einer Ratte hergestellt. Das gefrorene geschnittene Objekt wurde wie folgt präpariert. Das Nierengewebe einer Ratte wurde in 2 °Óiger wässriger Glutaraldehyd-Lösung eine Stunde lang fixiert und dann in Wasser gewaschen. Das gewaschene Objekt wurde dann 3 Stunden lang in 25 °Óiger wässriger Glycerinlösung eingeweicht. Das so vorbehandelte Objekt auf eine Größe von 2 x 2 x 8 mm geschnitten und in ein Loch eingesetzt, das im Objekthalter angeordnet war. Die negativen Elektrodenblöcke 14, 15, 20 und 21 und die Schneideinrichtung 37 wurden montiert und das Objekt auf eine Temperatur von -190° C mit Hilfe von flüssigem Stickstoff gekühlt. Dieses Frieren kann man außerhalb des Vakuumgefäßes 10 durchführen. Das Vakuumgefäß 10 wurde dann auf einen Druck von ungefähr 10 6 Torr evakuiert. Nachdem dieser Druck mehr als 30 Minuten lang atifrechterhalten worden war, war die Temperatur des Objekts auf -100° C angestiegen. In diesem Zustand wurde das Objekt bei herrschendem Unterdruck mit Hilfe der Schneideinrichtung 37 geschnitten. Unmittelbar danach wurden Styrolmonomerdämpfe in das Vakuumgefäß 10 eingeleitet. Nachdem der Druck im Vakuumgefäß 10 ungefähr 0,1 Torr geworden war, wurde die Glimmentladung durchgeführt nach dem Beispiel 1, jedoch wurden folgende Bedingungen dabei eingestellt: Gleichspannung 2 kV Stromdichte der Glimmentladung 0,5 mA/cm2 Entladungszeit 10 Minuten.Example 3 Manufacture of a replica film of a frozen object Sectional plane of rat kidney tissue using that shown in FIG The device was an impression film of the frozen cut surface of the kidney tissue made of a rat. The frozen cut object was prepared as follows. The kidney tissue of a rat was dissolved in 2 ° aqueous glutaraldehyde solution Fixed for hour and then washed in water. The washed object was then Soaked for 3 hours in 25 ° Ó aqueous glycerine solution. That pretreated Object cut to a size of 2 x 2 x 8 mm and inserted into a hole that was arranged in the object holder. The negative electrode blocks 14, 15, 20 and 21 and the cutter 37 was mounted and the object set to a temperature cooled from -190 ° C with the help of liquid nitrogen. You can get this cold outside of the vacuum vessel 10. The vacuum vessel 10 was then on a Pressure of approximately 10 6 Torr evacuated. After this pressure more than 30 minutes had been maintained for a long time, the temperature of the object had risen to -100 ° C. In this state, the object was cut with the aid of the cutting device with the prevailing negative pressure 37 cut. Immediately thereafter, styrene monomer vapors were drawn into the vacuum vessel 10 initiated. After the pressure in the vacuum vessel 10 became about 0.1 torr, the glow discharge was carried out according to Example 1, but the following Conditions set: DC voltage 2 kV current density of the glow discharge 0.5 mA / cm2 discharge time 10 minutes.

Das Objekt wurde dann mit einem Objektträger aus Kristallzucker in Wasser eingeweicht und dann in 1 °Óige wässrige Natriumhypochlorit-Lösung gebracht, die zuvor auf eine Temperatur von ungefähr -200 C abgekühlt worden war. In dieser Lösung blieb das Objekt 1 Stunde. Hierdurch löste sich das Nierengewebe vollständig auf, so daß nur der Abdruck film übrigblieb. Dieser Abdruckfilm wurde auf einem Maschengitter nach dem Waschen in Wasser mit Hilfe eines Elektronenmikroskopes betrachtet. Ein Abbild des Abdruckfilmes ist in Fig. 9 dargestellt.The object was then placed in granulated sugar with a microscope slide Soaked in water and then placed in 1 ° aqueous sodium hypochlorite solution, which had previously been cooled to a temperature of approximately -200 C. In this The object remained solution for 1 hour. This completely detached the kidney tissue so that only the impression film remained. This replica film was made on a Meshes viewed with an electron microscope after washing in water. An image of the replica film is shown in FIG.

Claims

Claims 1. Impression film for electron microscopy method, consisting made of a polymeric substance made by plasma polymerisation of organic monomeric Vapors obtained by a glow discharge process and produced during polymerization directly on the surface of the object to be examined than a film more evenly Thick was knocked down.

2. impression film according to claim 1, characterized in that the organic Monomer at least one compound from the group of ethylene, propylene, benzene, toluene, Xylene, styrene, chlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene, ferrocene, ethylbenzene, ethylene chloride, Propylene oxide, methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, 1,2-epoxybutane and 1,2-epoxyethylbenzene is.

3. Method of making a replica film of an object for Electron microscopy method using high vacuum with the help of a different polarized electrode pair arranged at a distance from one another, characterized in that that a) the object is placed on the surface of the negative electrode b) the object is exposed to a high vacuum of 10 5 to 10 6 Torr, c) organic monomeric vapors and a mixture of organic monomeric vapors with a small amount of an inert or active gas brought to the object and the prevailing pressure is increased again to 10-2 to 1 Torr, d) to the Electrodes applied a discharge voltage of 0.5 to 3 kV for about 15 minutes and a glow discharge between the electrodes with a discharge current of 2 O, 1 to 2 mA per cm of electrode area is caused by the flow rate of the organic monomeric vapors to the object and the flow rate of the gas pumped from the object in be adjusted appropriately for this purpose, e) the negative pressure is eliminated, and f) the object is dissolved in a solvent that does not attack the polymer film.

4. The method according to claim 3, characterized in that as monomers those specified in claim 2 are used.

5. Apparatus for making an impression film of an object for Electron microscopy method, characterized by a) an upper, positively biased Electrode (13), a lower counter-electrode (15) which is parallel to the upper electrode (13) at a distance, and a vacuum vessel (10) surrounding the electrodes, which is on a base plate (26) and from the electrodes (13,15) electrical and is thermally insulated, b) a high voltage source (33) with electrically connected to the electrodes (13, 15) for the purpose of generating a glow discharge and c) means (31, 32) for evacuating the vacuum vessel (10) and means (18) for introducing organic monomeric vapors into the vacuum vessel (10).

6. Apparatus according to claim 5, characterized in that it has a Contains freezer (40).

7. Apparatus according to claim 6, characterized in that it has a Contains cutting or breaking device (37).