DE2931378A1

DE2931378A1 - Determn. of adenosine in blood and tissue using adenosine kinase - To convert adenosine to atp and luciferase-luciferin reaction to determine atp concn. by bio:luminescence

Info

Publication number: DE2931378A1
Application number: DE19792931378
Authority: DE
Inventors: Juergen Schrader
Original assignee: SCHRADER JUERGEN PRIV DOZ DR M
Current assignee: SCHRADER JUERGEN PRIV DOZ DR M
Priority date: 1979-08-02
Filing date: 1979-08-02
Publication date: 1981-02-19

Abstract

In a new procedure for the ultra sensitive determination of adenosine in a biological tissue of blood specimen, (A) the adenosine contained in the specimen is converted into adenosine triphosphate (ATP) using an enzyme mixture contg. adenosine kinase, and (B) the ATP contained in the specimen is determined quantitatively using a luciferase-luciferine reaction by measuring the bioluminescence generated by the reaction. Knowledge of tissue and blood adenosine levels is of importance in theoretical and clinical medidine. The procedure is sensitive down to the femtomolar range. Each of the two steps of the procedure is in itself known, but the combination of the two steps is novel.

Description

Verfahren zur ultrasensitiven Bestimmung von Method for the ultra-sensitive determination of

Adenosin in biologischen Geweben Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1. Adenosine in biological tissues The invention relates to a method according to the preamble of claim 1.

Adenosin entsteht im Stoffwechsel als Abbauprodukt aus Adenin-Nucleotiden, wie AZIP, ADP, ATP (Abkürzungen siehe Beiblatt); es ist daher eng mit dem Energiestoffwechsel der Zellen in biologischen Geweben verknüpft. Im Gegensatz zu seinen phosphorylierten Vorläufersubstanzen, permeiert Adenosin die Zellmembranen relativ leicht; es gelangt dadurch in den extrazellulären Raum des biologischen Gewebes, wo es wahrscheinlich erst seine biologische Wirkung entfaltet. So ist z.B. bekannt, daß Adenosin die Durchblutung des Gehirns sowie der Sklett- und der Herzmuskulaturerhöht; es stellt in diesen Organen wahrscheinlich die entscheidende Mittlersubstanz der Durchblutungsregulation dar.Adenosine is formed in the metabolism as a breakdown product from adenine nucleotides, such as AZIP, ADP, ATP (for abbreviations see supplement); it is therefore closely related to the energy metabolism of cells in biological tissues. In contrast to its phosphorylated Precursors, adenosine permeates cell membranes relatively easily; it arrives thereby in the extracellular space of the biological tissue, where it is likely only unfolds its biological effect. For example, it is known that adenosine is the Increased blood flow to the brain as well as to the velcro and heart muscles; it puts Probably the decisive mediator of blood flow regulation in these organs represent.

Adenosin zahlt zu den wirksamsten Stoffen, die am Nervengewebe zu einer Steigerung des Gewebegehaltes an cyklischem AMP führt, dem sogenannten " second messenger n der Hormonvvirkung. Es ist daher anzunehmen, daß Adenosin ein Gewebehormon ist. Ferner führt Adenosin zu einem gesteigerten Abbau von körpereigenen Fettsäuren; es hemmt auch die Aggregation von Blutplrttchen und dürfte daher an dem 5uIechanismus der Blutgerinnung beteiligt sein. Die Änderung der Bildungs- bzw. Abbauraten von Adenosin führt zu speziellen Xrankheitsbildern, wobei tiefreifende Störungen der Immunabwehr im Vordergrund stehen. Die Konzentration von Adenosin im Gewebe ist außerordentlich gering; sie beträgt etwa zwischen 0,3 bis 3 nanohIol/g Beuchtgewicht. In Körperflüssigkeiten ist die Konzentration mit 10 bis 300 picool/ml noch wesentlich geringer.Adenosine is one of the most effective substances on nervous tissue too leads to an increase in the tissue content of cyclic AMP, the so-called "second messenger n the hormonal action. It can therefore be assumed that adenosine is a tissue hormone is. Furthermore, adenosine leads to an increased breakdown of the body's own Fatty acids; it also inhibits the aggregation of blood platelets and is therefore believed to be involved in the mechanism be involved in blood clotting. The change in the formation and / or dismantling rates of Adenosine leads to special syndromes, with deep-reaching disorders of the Immune defense are in the foreground. The concentration of adenosine in the tissue is extremely low; it is approximately between 0.3 and 3 nanoholes / g weight. In body fluids, the concentration of 10 to 300 picool / ml is still essential less.

Aufgrund. der Bedeutung von Adenosin für die theoretische und klinische Medizin, ist eine möglichst genaue quantitative Bestimmung, z.B. in einer Blutprobe wünschenswert; indessen ist jedoch eine hochgenaue quantitative Bestimmung von der in einer Gewebe- bzw. Blutprobe enthaltenen Menge an Adenosin entsprechend schwierig. Es sind zwar Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Adenosin bekannt, denen es jedoch an Empfindlichkeit mangelt; ihr Aufwand ist z.T. groß und nur von hochqualifiziertem Fachpersonal ausübbar. Für die Routine-laxis, z.E. für Reihenuntersuchungen sind die bekannten Verfahren kaum geeignet.Because of. the importance of adenosine for theoretical and clinical Medicine is a quantitative determination that is as precise as possible, e.g. in a blood sample desirable; however, a highly accurate quantitative determination is of the The amount of adenosine contained in a tissue or blood sample is correspondingly difficult. Although there are known methods for the quantitative determination of adenosine, which however, it lacks sensitivity; Their effort is sometimes great and only by highly qualified Skilled personnel can be exercised. For the routine laxis, e.g. for screening are the known methods are hardly suitable.

Hinzu kommt der Nachteil, daß das in einer Blut- oder Gewebeprobe enthaltene Adenosin schnell abgebaut wird. Die Wichtbeachtung dieses Umstandes führt schon zu Fehlmessungen.There is also the disadvantage that this is done in a blood or tissue sample contained adenosine is broken down quickly. The importance of this fact leads already to incorrect measurements.

Die Erfindung geht von einem bekannten Verfahren zur quantitativen Bestimmung des in einer biologischen Gewebe- oder Blutprobe enthaltenen Adenosin aus, bei dem man das in der Probe enthaltene Adenosin durch enzymatische Reaktionen umwandelt und aus dem Umwandlungsprodukt mittelbar die in der Probe enthaltene Menge an Adenosin bestimmt. Bei diesem bekannten Verfahren (Olsson, X.h.: Changes in content of purine nucleosides in canine myocardium during coronary occlusion.- Cir.Res. 26: 301 - 306, 1970) wird Adenosin unter Verwendung der Enzyme adenosin-desaminase, Nukleosid-phophorylase und Xanthin-oxydase zu Harnsaure abgebaut. Die Veränderung der Extinktion bei 280,am (Extinktions-Maximum der Harnsäure) wird spektrophotometrisch bestimmt. Unter Verwendung eines Zweistrahl-Zweiwellenlängen-Photometers können nach diesem Verfahren etwa 100 picojMol Adenosin pro Ansatz nachgewiesen werden. Das Verfahren bedingt eine vergleichsweise hohe Konzentration von Adenosin, so daß eine Anreicherung unter Anwendung aktivierter Holzkohle und einer anschließenden dünnschicht-chromatographischen Vortennung erforderlich ist.The invention is based on a known method for quantitative Determination of the adenosine contained in a biological tissue or blood sample in which the adenosine contained in the sample is removed by enzymatic reactions converts and from the conversion product indirectly the amount contained in the sample determined by adenosine. With this known method (Olsson, X.h .: Changes in content of purine nucleosides in canine myocardium during coronary occlusion.- Cir.Res. 26: 301-306, 1970) is adenosine using the enzymes adenosine deaminase, Nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are broken down into uric acid. The change the extinction at 280 am (extinction maximum of uric acid) is spectrophotometric certainly. Using a two-beam two-wavelength photometer you can after this method can detect about 100 picojMol adenosine per batch. That Process requires a comparatively high concentration of adenosine, so that a Enrichment using activated charcoal and a subsequent thin-layer chromatographic Pre-screening is required.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, das in einer biologischen Blut- oder Gewebeprobe enthaltene Adenosin enzymatisch derart umzuwandeln, daß ein hochgenau nachzuweisendes Umwandlungsprodukt entsteht; die Empfindlichkeit soll hierbei im femtomolaren Bereich gelegen sein. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein zur Ausübung dieses Verfahrens dienendes hochreines Enzym, nämlich eine Adenosin-kinase zu schaffen.The invention is therefore based on the object that in a biological To convert blood or tissue sample contained adenosine enzymatically in such a way that a conversion product that can be detected with high accuracy is created; the sensitivity is supposed to be located in the femtomolar area. Another object of the invention is it, a highly pure enzyme serving to carry out this process, namely a To create adenosine kinase.

Auch soll das Verfahren vom Laborpersonal ausübbar sein.The method should also be practicable by laboratory personnel.

Gemäß dem erfinderischen Verfahren bestimmt man die im Blut oder in einem biologischen Gewebe enthaltene Menge an Adenosin durch die Kombination der im Patentanspruch 1 genannten, an sich bekannten Verfahrensschritte, wobei der erstgenannte Verfahrensschritt, ein bisher nicht technisch angewandter, sondern ein sich in bilogischen Geweben vollziehender, natürlicher Prozeß ist.According to the inventive method is determined in the blood or in amount of adenosine contained in a biological tissue by combining the in claim 1 mentioned, known process steps, the former Process step, a so far not technically applied, but a biological one Tissue is an executive, natural process.

Die quantitative Bestimmung von ATP auf enzymatischem Wege, und zwar unter Verwendung von Luciferase-Luceferin, ist in der Analytik bekannt. Die bei der Reaktion von ATP mit der Lösung auftretende Bioluminiszens wird quantitativ gemessen; die Meßrate ist der in der Probe enthaltenen strenge an ATP proportional. Aus der Menge des so bestimmten ATP läßt sich unmittelbar auf die in der Ausgangsprobe enthaltenen /fenge an Adenosin schließen.The quantitative determination of ATP by enzymatic means, namely using luciferase luceferin is known in analytics. The at The bioluminescence that occurs in the reaction of ATP with the solution becomes quantitative measured; the measuring rate is proportional to the strict amount of ATP contained in the sample. The amount of ATP determined in this way can be used directly to determine that in the initial sample contained / fenge close to adenosine.

Die zur Umwandlung von Adenosin in ATP notwendige Adenosinkinase konnte bisher nicht in der erforderlichen Reinheit und Menge - in nur wenigen Verfahrensstufen - hergestellt werden.The adenosine kinase necessary to convert adenosine into ATP could so far not in the required purity and quantity - in just a few process steps - getting produced.

Die Adenosin-kinase katalysiert die erste Stufe des aus drei Stufen bestehenden Prozesses, der Umwandlung von Adenosin in ATP. Die nachfolgenden Stufen der PhosphoryLerung von Adenosin werden durch die handelsüblichen Enzyme Myokinase und Pyruvatkinase katalysiert.The adenosine kinase catalyzes the first stage of the three stages existing process, the conversion of adenosine to ATP. The following Levels of phosphorylation of adenosine are carried out by commercially available enzymes Catalyzed myokinase and pyruvate kinase.

Diese Verfahrensweise ist gut beherrschbar, sofern Adenosinkinase in der erforderlichen Menge und Reinheit zur Verfügung steht; sie bietet auch die gewünschte Empfindlichkeit, die bei Verwendung eines empfindlichen Bioluminiszens-Meßgerätes und einer zu diesem Zweck dienenden Buciferase-Luciferin-Iösung bei etwa 10 femtoKol pro Ansatz gelegen ist. Die entsprechende Eichkurve für Adenosin ist im Bereich von 10 bis 1000 femto-Mol linear. Die erfinderische Verfahrensweise ist somit umannähernd drei Größenordnungen empfindlicher als die bekannten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Adenosin.This procedure is well manageable, provided adenosine kinase is available in the required quantity and purity; it also offers that Desired sensitivity when using a sensitive bioluminescence measuring device and a buciferase-luciferin solution serving for this purpose at about 10 femtoKol per approach. The corresponding calibration curve for adenosine is in the range from 10 to 1000 femto-moles linear. The inventive procedure is thus approximate three orders of magnitude more sensitive than the known methods for quantitative Determination of adenosine.

Wie vorstehend genannt, wird Adenosin mit Hilfe von drei Enzymen, nämlich Adenosin-kinase, Myokinase und Pyruvatkinase schrittweise zu ATP aufphosphoryliert. Als notwendiger Cofaktor für die Adenosin-kinase dient Uridintriphosphat(UTP). Für die Aktivität der Myokinase sind Spuren von AXP notwendig, die normalerweise in den handelsüblichen UTP-Chargen als Verunreinigung vorliegen und daher nicht speziell zugegeben werden müssen. Bis auf das Enzym Adenosin-kinase sind alle übrigens für die Umwandlung von Adenosin in AXP erforderlichen Stoffe im Handel erhältlich.As mentioned above, adenosine is produced with the help of three enzymes, namely adenosine kinase, myokinase and pyruvate kinase are gradually phosphorylated to ATP. Uridine triphosphate (UTP) serves as a necessary cofactor for adenosine kinase. For the activity of myokinase, traces of AXP are necessary, which are normally found in the commercial UTP batches are present as an impurity and are therefore not specific must be admitted. Apart from the enzyme adenosine kinase, all of them are for the conversion of adenosine into AXP required substances commercially available.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Adenosinkinase ergeben nur eine geringe Ausbeute. Die zur Ausübung des erfinderischen Verfahrens erforderliche Adenosin-kinase muß und soll in solchen Mengen herstellbar sein, daß sich Reihenuntersuchungen biologischer Gewebe- oder Blutproben durchführen lassen; insbesondere muß die Adenosin-kinase hoch angereichert vorliegen und frei von Adenosin-desaminase sein. Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen 2 bis 5 gelöst.The previously known processes for the production of adenosine kinase give only a low yield. To carry out the inventive method required adenosine kinase must and should be producible in such quantities that serial examinations of biological tissue or blood samples can be carried out; in particular, the adenosine kinase must be highly enriched and free from adenosine deaminase be. This object is achieved according to claims 2 to 5.

Zur quantitativen Bestimmung von Adenosin in einer biologischen Gewebe- oder Blutprobe ist es nicht ausreichend, lediglich eine Adenosin-kinase hoher Reinheit zu verwenden, um so, durch hintereinander geschalteter enzymatischer Reaktion, das in der Probe enthaltene Adenosin vollständig in ATP umzuwandeln; es muß insbesondere der Umstand beachtet werden, daß das Adenosin ein labiles Molekül ist und bei der Entnahme einer Probe schnell abgebaut wird. Soll das in einer Blutprobe enthaltene Adenosin mit der gewünschten Empfindlichkeit ( im femtomolaren Bereich ) quantitativ bestimmt werden, so muß der Probe und zwar sofort bei der Entnahme, neben der bekannten " Locke-Lösung " eine, insbesondere das Adenosin schützende Lösung beigemischt werden3 dies geschieht gemäß dem erfinderischen Verfahren der Patentansprüche 9 und 10.For the quantitative determination of adenosine in a biological tissue or blood sample, it is not sufficient, only a high purity adenosine kinase to use in order to, through a series-connected enzymatic reaction, the to completely convert adenosine contained in the sample into ATP; it must in particular the fact that adenosine is a labile molecule and in the Taking a sample is rapidly degraded. Should be contained in a blood sample Quantitative adenosine with the desired sensitivity (in the femtomolar range) must be determined, the sample must be taken immediately, in addition to the known "Locke's solution" a solution, especially adenosine-protecting solution, can be added3 this is done according to the inventive method of claims 9 and 10.

Durch den Zusatz der Substanzen 4-nitrobenzyl-thioinosine und EHNA zur Locke-Lösung wird erreicht, daß die nachfolgend beschriebene Bestimmung der in der Blutprobe enthaltenen Menge an Adenosin, den bei der Blutentnahme vorliegenden Konzentrationswert des Adenosin entsprechen. Die Substanz FRZA hemmt das im Blut enthaltene Enzym Adenosin-desaminase. Es wird so verhindert, daß das Adenosin zu Inosin abgebaut wird. Die Substanz 4-nitrobenzyl-thioinosine hemmt die Aufnahme von Adenosin in die zellulären Bestandteile des Blutes. Zum Ausfällen der Plasmaproteine extrahiert man das klare Blutplasma - welches durch Zentrifugieren gewonnen wurde - mit Perchlorsäure und neutralisiert es anschließend. Nach dem erfinderischen Merkmal des Patentanspruches 11, wird vor der 3estimmung von Adenosin der neutralisierte Extrakt noch von sdenin-Nucleotiden gereinigt, die das Meßergebnis erheblich beeinträchtigen würden.By adding the substances 4-nitrobenzyl-thioinosine and EHNA for Locke's solution it is achieved that the determination of the Amount of adenosine in the blood sample that was present when the blood was taken Concentration value of the adenosine correspond. The substance FRZA inhibits this in the blood contained enzyme adenosine deaminase. It prevents the adenosine from increasing Inosine is broken down. The substance 4-nitrobenzyl-thioinosine inhibits absorption of adenosine in the cellular components of the blood. To precipitate the plasma proteins one extracts the clear blood plasma - which was obtained by centrifugation - with perchloric acid and then neutralizes it. According to the inventive feature of claim 11, before the determination of adenosine, the neutralized Extract still purified from sdenine nucleotides, which considerably impair the measurement result would.

Zur quantitativen Bestimmung des in der so aufbereiteten Probe enthaltenen Adenosin, bildet man nun einen bemessenen Reaktionsansatz, gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 6. Zur Aufnahme des Reaktionsgemisches benutzt man eine glasklare, in ein Bioluminiszensw eßgerät einsetzbare und mit diesem geeichte Küvette, in der man die Reaktion ablaufen läßt. Durch enzymatische Umwandlung wird das in der Probe enthaltene Adenosin zu ATP aufphosphoryliert. Gemäß dem Merkmal des Patentanspruches 7, dient die gleiche Rüvette mit dem darin enthaltenen Reagenz auch zur Bestimmung der nunmehr in der Probe enthaltenen Menge an ÄTP.For the quantitative determination of what is contained in the sample prepared in this way Adenosine, one now forms a measured reaction mixture, according to the characteristics of the Claim 6. To receive the reaction mixture, a crystal-clear, in a Bioluminiszensw eßgerät insertable and calibrated with this cuvette, in the the reaction is allowed to proceed. This is done in the sample through enzymatic conversion contained adenosine is phosphorylated to ATP. According to the feature of the claim 7, the same cell with the reagent it contains is also used for the determination the amount of ÄTP now contained in the sample.

Hierzu wird die Küvette in das Bioluminizzensw eßgerat eingesetzt; die die Bioluminiszens auslösende Luciferase -uciferin- Lösung wird sodann der Probe zugesetzt und die dabei auftretende Bioluminiszens gemessen. letztere ist unter Berücksichtigung der mittels einer Adenosin-standard Lösung erhobenen Eichkurve,der in der Probe enthaltenen Menge an A2P und somit auch indirekt der in der susgangsprobe enthaltenen Menge an Adenosin proportional.For this purpose, the cuvette is inserted into the Bioluminizzensw eßgerat; the luciferase-uciferin solution which triggers the bioluminescence is then added to the sample added and the resulting bioluminescence measured. the latter is under Consideration of the calibration curve obtained by means of an adenosine standard solution, the Amount of A2P contained in the sample and thus indirectly also that in the susceptibility sample contained amount of adenosine proportionally.

Weitere Einzelheiten des erfinderischen Verfahrens sind aus den Unteransprüchen ersichtlich.Further details of the inventive method can be found in the subclaims evident.

Im Nachfolgenden wird das erfinderische Verfahren an Hand eines Beispieles und von Zeichnungen näher erläutert; es zeigen: Fig. 1 ein Schaubild zur Herstellung der Adenosin-kinase, Fig. 2 ein Schaubild zur Xufbereitung einer Blutprobe und Pig. 3 ein Schaubild zur quantitativen Bestimmung der in der Blutprobe enthaltenen I¢Ienge an Adenosin.The method according to the invention is described below using an example and explained in more detail by drawings; The figures show: FIG. 1 a diagram for production of adenosine kinase, FIG. 2 a diagram for the preparation of a blood sample and pig. 3 shows a diagram for the quantitative determination of the amount contained in the blood sample of adenosine.

Beispiel: Die zur Ausübung des Verfahrens benotigte, hochreine Adenosinkinase wird gemäß der Fig. 1 wie folgt hergestellt. Leber -enthält, im V-ergleich zu anderen biologischen Geweben, einen hohen Anteil an Adenosin-kinase. Man nimmt Leber 1, von z.B. zwei Ratten; die frische Leber wird mit einer Schere in kleine Stücke geschnitten - wie bei 2 angedeutet - die man sodann in ein Gefäß 3 eingibt. Die zerkleinerte Leber wird dort in 40 ml eines 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4 aufgenommen, der außerdem 0,25 M Sucrose und 1 SI EDTA enthält. Es erfolgt nunmehr das Aufschließen des Gewebes bei einer Temperatur von etwa 273 K in einem Kolbenhub-Homogenisator 4; er ist handelsüblich mit einem aus Polytetrafluoräthylen gebildeten Kolben ausgerüstet, der mit 1500 Upm angetrieben wird. Die Dauer der Homogenisierung beträgt annähernd 1 Minute. Das Homogenisat 5 wird - wie bei 6 dargestellt - 10 Minuten mit 7500 x g zentrifugiert; dabei werden die groben U;embracbestandteile des Gewebes abgetrennt. Es erfolgt nunmehr ein zweitesZentrifugieren des Überstandes 8 in einer Ultrazentrifuge 7.Example: The high-purity adenosine kinase required to carry out the procedure is produced according to FIG. 1 as follows. Liver -contains, compared to others biological tissues, high in adenosine kinase. One takes liver 1, from, for example, two rats; the fresh liver is cut into small pieces with scissors - as indicated at 2 - which you then enter into a vessel 3. The crushed Liver is taken up there in 40 ml of a 10 mM Hepes buffer, pH 7.4, which also Contains 0.25 M sucrose and 1 SI EDTA. The tissue is now opened up at a temperature of about 273 K in a piston-stroke homogenizer 4; it is customary equipped with a piston made of polytetrafluoroethylene, the 1500 RPM is driven. The homogenization takes approximately 1 minute. The homogenate 5 is - as shown at 6 - centrifuged for 10 minutes at 7500 x g; in the process, the coarse U; embrac components of the tissue are separated. It takes place now a second centrifugation of the supernatant 8 in an ultracentrifuge 7.

Man zentrifugiert den ;bestand etwa 35 Minuten mit 200 000 x g.Centrifuge the and insist at 200,000 x g for about 35 minutes.

Der sich hierbei bildende klare Überstand 9 dient als Ausgangsmaterial 10 zur Aufbereitung der für das Verfahren benötigten angereicherten und hochreinen Adenosin-kinase. Das Ausgangsmaterial kann in diesem Zustand entweder bei etwa 253 K in einem Kühlschrank 11 gelagert oder sofort - wie durch die gestriehelte Linie 10' angedeutet - weiter verarbeitet werden. Zur Reinigung und Anreicherung der Adenosin-kinase nutzt man die besondere Affinität der Adenosin-kinase zu AM?. Letztere Substanz koppelt man an eine hochmolekulare Trägersubstanz - hier an Sepharose (handelsüblich). Durch die Anwendung des ansich bekannten Verfahrens der Affinitäts-chromatographie wird es ermöglicht, die Adenosin-kinase aus dem Ausgangsmaterial 10', in nur einem chromatographischen Schritt, auf das Vierhundertfache anzureichern.The clear supernatant 9 that forms in the process serves as the starting material 10 for the preparation of the enriched and high-purity required for the process Adenosine kinase. The starting material can either be in this state at about 253 K stored in a refrigerator 11 or immediately - as indicated by the hatched line 10 'indicated - further processed. For the purification and enrichment of the adenosine kinase do you use the special affinity of adenosine kinase for AM ?. The latter substance it is coupled to a high-molecular carrier substance - here to Sepharose (commercially available). By using the known method of affinity chromatography it enables the adenosine kinase from the starting material 10 ', in just one chromatographic step to enrich to four hundred fold.

Hierzu werden 20 ml des Ausgangsmaterials auf eine.Chromatographiesäule 12 - mit den Dimensionen 0,5 x 12 cm - aufgebracht, die vorher mit N6 - (6-aminohexyl-) 5-LwIP Sepharose 4B (handelsüblich-Firma Pharmacia, Freiburg) gefüllt und mit einem 20 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0 äqulibriert wurde. Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule so lange mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min eluiert, bis die Extinktion - wie bei 12'angedeutet -im Säuleneffluat 13 konstante Werte erreicht. Durch diese Verfahrensweise reichert sich die Adenosin-kinase am Säulemnaterial an, während die Adenosin-desaninase 13'eluiert wird. Zur Gewinnung der Adenosin-kinase werden nunmehr 10 ml einer 1 mÇI ATP, 0,1 mM Adenosin und 1 inM MgOl2-enthaltenden Lösung-über die Säule 12 geleitet. Das hierbei resultierende Eluat 14, das die angereicherte, gereinigte Adenosin-kinase enthält, wird durch Ultrafiltration auf 1 ml eingeengt. Hierzu benutzt man einen Ultrafilter 15 mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 1o4 . Diese so erhaltene Menge wird zur Ab trennung des noch in ihr enthaltenen ATP, Adenosin und MgOl2 über eine Gelchromatographie -Säule 16 (z.B. Sephadex G-25, handelsüblich,Firma Pharmacia, Freiburg) geleitet, die man zuvor mit Hepes-Puffer 10mai, pH 7,4 äqulibriert.For this purpose, 20 ml of the starting material are applied to a chromatography column 12 - with the dimensions 0.5 x 12 cm - applied previously with N6 - (6-aminohexyl-) 5-LwIP Sepharose 4B (commercially available from Pharmacia, Freiburg) and filled with a 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0 was equilibrated. After applying the sample the column is eluted at a rate of 1 ml / min until the Extinction - as indicated at 12 '- reached 13 constant values in the column effluate. Through this procedure, the adenosine kinase accumulates in the column material while the adenosine deaninase 13 'is eluted. To obtain the adenosine kinase 10 ml of a 1 ml ATP, 0.1 mM adenosine and 1 inM MgOl2-containing Solution-passed over the column 12. The resulting eluate 14, which contains the enriched, contains purified adenosine kinase is concentrated to 1 ml by ultrafiltration. An ultrafilter 15 with a molecular exclusion limit of 1o4. This amount obtained in this way is used to separate what is still contained in it ATP, adenosine and MgOl2 over a gel chromatography column 16 (e.g. Sephadex G-25, commercially available, from Pharmacia, Freiburg), which you previously had with Hepes buffer 10 times, pH 7.4 equilibrated.

Die so erhaltene Adenosin-kinase-Präperation 17 wird abschliessend in eine 20%ige Glyzerinlösung eingebracht und bei 253 K in einem Kühlschrank 11 bis zur Verwendung gelagert. Das gewonnene Enzym ist um das Vierhundertfache angereichert, besitzt eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein und ist vollständig frei von Adenosin-desaminase. Diese Adenosin-kinase zeigt auch über einen langen Zeitraum von, z.B. drei Monaten, keinen Aktivitätsverlust.The adenosine kinase preparation 17 obtained in this way is final placed in a 20% glycerine solution and at 253 K in a refrigerator 11 stored until use. The enzyme obtained is enriched four hundred times, has a specific activity of 7 U / mg protein and is completely free from Adenosine deaminase. This adenosine kinase also shows over a long period of time of, e.g. three months, no loss of activity.

Gemäß den Darstellungen in der Fig.2, bedient man sich bei der Entnahme einer Blutprobe einer Spritze 19, die zwei Zylinder 20 und 21. aufweist; sie sind hier nur zur besseren Ansicht hintereinander angeordnet. Im Vorratszylinder 21 der Spritze, befindet sich eine, das im Blut enthaltene Adenosin schützende Lösung 24. Wie bei 23 dargestellt, wird beim Aufziehen des Blutes 22, dem in den Zylinder 20 einströmenden Blut die Schutzlösung 24 im Verhältnis 1:1 beigemischt. Als Schutzlösung verwendet man eine spezielle , auf eine Temperatur von etwa 273 K gehaltene physiologische Kochsalzlösung, eine sogenannte 11Locke-Lösung" (siehe Anlageblatt) der zusätzlich 5 µM4-nitrobenzyl-thioinosine sowie 50 µM SANTA EHNA beigemischt wurden. Der Zusatz EHNA hemmt - wie schon vorbemerkt - das im Blut enthaltene Enzym Adenosin-desaminase es wird so verhindert, daß das Adenosin zu Inosin abgebaut wird.According to the representations in FIG. 2, use is made of the removal a blood sample from a syringe 19 having two cylinders 20 and 21; they are here only arranged one behind the other for a better view. In the storage cylinder 21 of the In the syringe, there is a solution that protects the adenosine contained in the blood 24. As shown at 23, when the blood 22 is drawn into the cylinder 20 the protective solution 24 is mixed into the inflowing blood in a ratio of 1: 1. As a protective solution one uses a special physiological one that is kept at a temperature of about 273 K. Saline solution, a so-called 11Locke solution "(see attachment sheet) of the additional 5 µM4-nitrobenzyl-thioinosine and 50 µM SANTA EHNA were added. The addition As already mentioned, EHNA inhibits the enzyme adenosine deaminase contained in the blood this prevents the adenosine from being broken down into inosine.

Die Substanz 4-nitrobenzyl-thioinosine hemmt die Aufnahme von Adenosin in die zellulären Bestandteile des Blutes, insbesondere der Erythrocyten. Zur Abtrennung der in der Probe 25 enthaltenen Erythrocyten wird die Probe bei 26 zentrifugiert. Uan extrahiert den klaren Überstand 27 - wie bei 28 angedeutet - mit X N Perchlorsäure, neutralisiert ihn anschließend mit EICH. Zur Abtrennung des in der Probe enthaltenen Perchloratniederschlages wirdwie bei 29 gezeigt - die Probe 30 nochmals zentrifugiert, worauf man die noch in ihr enthaltenen Adenin-Nucleotide entfernt; sie stören die Bestimmung des in der Probe enthaltenen Adenosin.The substance 4-nitrobenzyl-thioinosine inhibits the uptake of adenosine into the cellular components of the blood, especially the erythrocytes. For separation of the erythrocytes contained in sample 25, the sample is centrifuged at 26. Uan extracted the clear supernatant 27 - as indicated at 28 - with X N perchloric acid, then neutralizes it with EICH. For separating what is contained in the sample Perchlorate precipitate is shown as at 29 - the sample 30 is centrifuged again, whereupon the adenine nucleotides still contained in it are removed; they disturb them Determination of the adenosine contained in the sample.

Hierzu leitet man die Probe - wie bekannt -(.P.iN'agnusson, A.R. POT tis, R.z.. c Carty "Quantitative, analytical seperation of adenine nucleotides by columm chromatography an PEI-ccated cellulose" -Analytical-Biochemistry 72: 653 - 657, 1976) über ein Polyethyleneimine-Cellulose enthaltendes Säulchen 31. Die Probe 32 steht danach zur Bestimmung des Adenosin-Gehaltes bereit.For this purpose, the sample is passed - as is known - (. P.iN'agnusson, A.R. POT tis, R.z .. c Carty "Quantitative, analytical separation of adenine nucleotides by columm chromatography an PEI-cated cellulose "-Analytical-Biochemistry 72: 653 - 657, 1976) about a Containing polyethyleneimine cellulose Column 31. The sample 32 is then ready for the determination of the adenosine content.

Zur quantitativen Bestimmung des in der Probe enthaltenen Adenosin bildet man gemäß Fig.3 einen Ansatz 33 von insgesamt 200 all. Hierzu benutzt man eine glasklare, in ein Bioluminiszens-Meßgerät 37 einsetzbare Küvette 34. Der Ansatz besteht aus 5Opl Probe 32 und 150 sl einer im wesentlichen aus den Enzymen Adenosin-kinase und Myokinase sowie Pyruvat-.For the quantitative determination of the adenosine contained in the sample an approach 33 of a total of 200 is formed according to FIG a crystal clear cuvette 34 which can be inserted into a bioluminescence measuring device 37. The approach consists of 50 μl sample 32 and 150 μl of an essentially composed of the enzymes adenosine kinase and myokinase as well as pyruvate.

kinase gebildeten Lösung 33; die nunmehr bei Raumtemperatur erfolgende Reaktion der Umwandlung von Adenosin in ATP ist bei 35- dargestellt. Im einzelnen bildet man das aus 150oil Lösung bestehende Enzymgemisch in der nachfolgenden Zusammensetzung: 35 mMol/l Hepes-Puffer, pH 7,75 6 sg Adenosin-kinase, spezifische Aktivität 7 U/mg - gemäß dem Verfahren-, 2 sg Xyokinase aus Kaninchenmuskel; spezifische Aktivität ca. 360 U/mg - handelsüblich-(Eoehringer Mannheim) 2,ug Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskel, spezifische sktivität ca. 200 U/mg - handelsüblich-(Boehringer Mannheim) 1 smol Phosphoenolpyruvat 100 nMol UTP, sowie MgC12 in einer Endkonzentration vonsAiol/l Alle Enzyme müssen vor ihrer Verwendung von Glyzerin bzw. vom Ammoniumsulfat gereinigt werden (Die Enzyme Myokinase und Pyruvatkinase werden handelsüblich in gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung geliefert). Hierzu bedient man sich vorteilhaft der Gelchromatographie, wobei man z.B. eine Sephadex G-1G Säule (handelsüblich, Fa. Pharmacia, Freiburg) benutzt, die vorher mit einem 5 mMol Hepes-Puffer, pH 7,75 äquilibriert wurde. Der aus der Probe una dem Enzym gemisch bestehende Reaktionsansatz 33' wird bei 293 K, 45 Minuten inkubiert; in dieser Zeit erfolgt innerhalb der Küvette 34 die schrittweise enzymatische Umwandlung des Adenosins in ATP. Man beläßt das Reaktionsgemisch in der Küvette und setzt diese in die Aufnahme 39 des auf Meßbetrieb geschalteten Bioluminiszens-I.Ießgerätes 37 (beutzt warde ein Gerät "Biolumatl' der Fa. Berthold, Wildbad); der Meßwertsdhreiber 38 ist ebenfalls betriebsbereit. Der Probe bzw. dem Reaktionsgemisch wird nunmehr 100 All Luciferase-Luciferin-Lösung (Fa. Abimed, Düsseldorf, WareA-Bezeichnung " LUMIT PM " ) zugegeben; die enzymatische Reaktion erfolgt unmittelbar, wobei das in der Probe enthaltene ATP mit dem Enzym unter Emission von Lichtquanten reagiert, deren Rate durch die Kurve 38'des Meßwertschreibers 38 angezeigt wird. Für das Bioluminiszens-Meßgerät wird unter Verwendung einer Adenosin-Standard-Lösung zuvor eine Eichkurve erstellt, wobei man diese Lösung - wie vorbeschrieben - in der Küvette 34 enzymatisch zu einer nunmehr A2P enthaltenden Lösung umwandelt und unter Zugabe der Luciferase-Luciferin-Lösung die bei der Reaktion auftretende Bioluminiszens als Meßrate ermittelt. Man wiederholt diesen Vorgang mit verschiedenen Konzentrationen der Adenosin-Standard-Lösung. Aus der so erstellten Eichkurve kann an Hand der Meßrate die in der Ausgangsprobe enthaltene Menge an Adenosin bestimmt werden.kinase formed solution 33; which now takes place at room temperature Adenosine to ATP conversion reaction is shown at 35-. In detail the enzyme mixture consisting of 150oil solution is formed in the following composition: 35 mmol / l Hepes buffer, pH 7.75 6 sg adenosine kinase, specific activity 7 U / mg - according to the method, 2 so-called xyokinase from rabbit muscle; specific activity approx. 360 U / mg - commercially available (Eoehringer Mannheim) 2, ug pyruvate kinase from rabbit muscle, specific activity approx. 200 U / mg - commercially available - (Boehringer Mannheim) 1 smol Phosphoenolpyruvate 100 nmol UTP, as well as MgC12 in a final concentration of sAiol / l All enzymes must be cleaned of glycerine or ammonium sulfate before they can be used (The enzymes myokinase and pyruvate kinase are commercially available in saturated Ammonium sulfate solution). Gel chromatography is advantageously used for this purpose, using, for example, a Sephadex G-1G column (commercially available, Pharmacia, Freiburg) used, which was previously equilibrated with a 5 mmol Hepes buffer, pH 7.75. Of the Reaction mixture 33 'consisting of the sample and the enzyme mixture is at 293 K, incubated 45 minutes; During this time, the cuvette 34 takes place step-by-step enzymatic conversion of adenosine in ATP. The reaction mixture is left in the cuvette and places this in the receptacle 39 of the switched to measuring mode Bioluminescence I.Ießgerätes 37 (a device "Biolumatl" from the company Berthold was used, Wildbad); the measured value driver 38 is also ready for operation. The sample or the Reaction mixture is now 100 All Luciferase-Luciferin solution (Fa. Abimed, Düsseldorf, WareA designation "LUMIT PM") added; the enzymatic reaction takes place immediately, whereby the ATP contained in the sample with the enzyme with the emission of light quanta responds, the rate of which is indicated by the curve 38 ′ of the data recorder 38. For the bioluminescence measuring device, an adenosine standard solution is used previously created a calibration curve, this solution - as described above - in the cuvette 34 enzymatically converts to a solution now containing A2P and with the addition of the luciferase-luciferin solution, the bioluminescence occurring during the reaction determined as the measuring rate. Repeat this process with different concentrations the adenosine standard solution. From the calibration curve created in this way, using the measuring rate the amount of adenosine contained in the initial sample can be determined.

In der Beschreibung verwendete Abkürzungen Abkürzungen bedeuten AMP Adenosinmonophosphat ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat UDP Uridindiphosphat UTP Uridintriphosphat EHNA Erythro-9- ( 2-Hydroxy-3-Nonyl) Adenin EDTA Äthylendiamin-tetra-acetat PEI Polyethyleneimine PEP Phosphoenolpyruvat 'Locke-Lösung" Komponenten (in mMol) NaCl (150), KCl(5), NaHCO3(6), Glukose(5,5) CaC12(2,2), Na2HP04(0,9), NaH2F04(O,i), pH-Wert 7,4 Leerseite Abbreviations used in the description Abbreviations mean AMP Adenosine monophosphate ADP adenosine diphosphate ATP adenosine triphosphate UDP uridine diphosphate UTP uridine triphosphate EHNA erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine EDTA ethylenediamine tetra-acetate PEI Polyethyleneimine PEP Phosphoenolpyruvate 'Locke's Solution "Components (in mmol) NaCl (150), KCl (5), NaHCO3 (6), glucose (5.5), CaC12 (2.2), Na2HP04 (0.9), NaH2F04 (O, i), pH 7.4 Blank page

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Procedure for ultra-sensitive determination of adenosine in a biological tissue or blood sample, in which this is done in de: Sample contained adenosine is converted by enzymatic reaction and from the conversion product indirectly determines the amount of adenosine in the initial sample, characterized by the combination of two process steps known per se, according to which a) in the first process step the adenosine contained in the sample is used converts an enzyme mixture containing adenosine kinase into ATP and b) in the second Process step, the ATP contained in the sample using a ljuciferase-iuciferin reaction by measuring the bioluminescence occurring in the reaction quantitatively determined and from this measuring rate the mountains of adenosine contained in the output psobe determined.

2. The method according to claim 1, characterized eekennzeiehnet that to Production of adenosine kinase a) - as is known per se - a biological tissue homogenized and digested, the coarse components removed by centrifugation and by ultracentrifugation, the clear adenosine-enriched supernatant deducted from the centrifugate and b) a measured amount of this supernatant on one with 6 (6-aminohexyl -) 5 'adenosine monophosphate Sepharose 4B filled column and this column is eluted until the extinction in the column effluate has constant values achieved.

3. Process according to Claims 1 and 2, characterized in that the adenosine contained in the tissue or blood sample in several process stages using a mixture containing adenosine kinase, kinase and pyruvate kinase phosphorylated to ATP.

4. Process according to Claims 2 and 3, characterized in that using affinity chromatography that contained in the starting material (10) The amount of adenosine kinase by several hundred times.

5. Process according to Claims 2 and 4, characterized in that using gel chromatography that after affinity chromatography to obtain the adenosine kinase supplied substances, namely ATP, adenosine and separates MgCl2.

6. The method according to claim 1, characterized in that one for quantitative determination of the adenosine contained in the sample (32), a 2C0 sl containing reaction mixture (33 '), the 50 µl sample, 150 µl reaction solution (33), in the molding composition: a) 35 nhMol / l Hepes buffer, pH 7.75 b) 6, g purified adenosine kinase, specific activity 7 U / mg c) 2 µg myckinase, specific activity 36C U / mg d) 2 µg pyruvate kinase, specific activity 200 U / me e) 1 µmol phosphoenclpyruvate f) 100 nmol UTP g) MgCl2 in a final concentration of 25 µmol / @

7. Process according to Claims 1 and 6, characterized in that the reaction of the measured sample (32) with the reaction solution (33) in the measuring cuvette (34) of a bioluminescence measuring device (37) takes place and after the incubation period has expired to the cuvette (34) inserted in the measuring device (37) the buciferase-luciferin solution (36) is added and the bioluminescence occurring during the reaction is quantitative certainly.

8. The method according to claim 1, characterized in that one during the taking of the blood sample, this one that adenosine contained in it protective Solution (24) admixed.

9. The method according to claims 1 and 8, characterized in that as protective solution (24) a) a physiological saline solution known per se, a so-called "Locke solution" is used, which b) an additional 5> µmol of 4-nitrobenzyl-thioinosine and 50 viMol erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) admixed, the pH of the mixed solution is 7.4

10. The method according to claims 8 and 9, characterized in that the adenosine protecting solution (24 ' admixed in a ratio of 1: 0.9 to 1: 1.2.

11. The method according to claims 1 and 8 to 10, characterized in that that from the clear, neutralized blood plasma of the sample (30 ') which is still in the plasma Adenine nucleotides contained in it are removed by placing it over a Polyethyleneinmine-Cellulose containing filter column (31) conducts.