DE2927534A1 - OPTICALLY PURE HETEROCYCLIC AMINO ACIDS, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND THEIR USE - Google Patents

OPTICALLY PURE HETEROCYCLIC AMINO ACIDS, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND THEIR USE

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DE2927534A1 DE19792927534 DE2927534A DE2927534A1 DE 2927534 A1 DE2927534 A1 DE 2927534A1 DE 19792927534 DE19792927534 DE 19792927534 DE 2927534 A DE2927534 A DE 2927534A DE 2927534 A1 DE2927534 A1 DE 2927534A1
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Abstract

The invention relates to optically pure heterocyclic amino acid compounds of the Formula I, as described hereinabove as well as a process for their preparation involving subject D, L-compounds to the action of a proteolytic enzyme. The compounds obtained are useful, inter alia, as intermediates for the manufacture of cephalosporins or penicillins.

Description

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, BayerwerkBAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk

Zentralbereich .cCentral area c

Patente, Marken und Lizenzen Jo/Di ' 1^// J97HPatents, trademarks and licenses Jo / Di ' 1 ^ // J97H

Optisch reine heterocyclische Aminosäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungOptically pure heterocyclic amino acids, process for their preparation and their use

Die vorliegende Erfindung betrifft optisch reine heterocyclische Aminosäuren, ein enzymatisches Verfahren zu ihrer Herstellung durch stereoselektive Spaltung geeigneter heterocyclische·D,L-Aminosäure-Derivate und anschließender Umwandlung in die D- bzw. L-Aminosäuren sowie ihre Verwendung als Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln.The present invention relates to optically pure heterocyclic amino acids, an enzymatic process too their preparation by stereoselective cleavage of suitable heterocyclic · D, L-amino acid derivatives and then Conversion into the D- or L-amino acids as well as their Use as intermediate products for the manufacture of pharmaceuticals.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen entsprechen der FormelThe compounds according to the invention correspond to the formula

R1-CH-CO-R2
/\ (I) R 1 -CH-CO-R 2
/ \ (I)

worin R1 einen gesättigten oder ungesättigten, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Rest, der 1 bis 4 gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und/oder Stickstoff enthält, und gegebenenfalls benzokondensiert ist,
Rp Hydroxy, C1-C^-AIkOXy oder N(R,-)p> R, und R^ Wasserstoff, Acyl oder durch C1-C^ Alkoxycarbonyl substituiertes Cp-C^, Alkenyl und > . R5 Wasserstoff oder C1-C^-Alkyl bedeuten und das mit * gekennzeichnete C-Atom entweder in der D- oder L-Form vorliegt;wherein R 1 is a saturated or unsaturated, optionally substituted heterocyclic radical which contains 1 to 4 identical or different heteroatoms from the series oxygen, sulfur and / or nitrogen, and is optionally benzofused,
Rp hydroxy, C 1 -C ^ -AIkOXy or N (R, -) p> R, and R ^ hydrogen, acyl or Cp-C ^ substituted by C 1 -C ^ alkoxycarbonyl, alkenyl and>. R 5 is hydrogen or C 1 -C ^ -alkyl and the carbon atom marked with * is in either the D or L form;

Le A 19 803Le A 19 803

030062/0570030062/0570

Geeignete heterocyclische Reste sind "beispielsweise Pyrazolyl, Imidazolyl, Oxazolyls Oxdiazolyl, Thiazolinyl, Tetrazolyl, Sydnonyl, Pyridyl, Pyrazyl, Pyrimidinyl, Pyridazyl, Chinolyl, Isochinolyl, CTainazolyl, Ihdolyl und Indazolyl sowie besonders bevorzugt Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl und Thiadiazolyl. Die heterocyclischen Reste können einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 2 verschiedene oder insbesondere gleiche Sub&tituenten tragen, wobei als Substituenten beispielsweise Halogen, wie Fluor, Chlor und Brom, Alkyl mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen, Amino, Nitro, Cyano» SuIfο, Cj-C^-Alkylsulfonyl, Hydroxy oder Oxo in Frage kommen.Suitable heterocyclic radicals are "for example, pyrazolyl, imidazolyl, oxazolyl s oxdiazolyl, thiazolinyl, tetrazolyl, sydnonyl, pyridyl, pyrazyl, pyrimidinyl, pyridazyl, quinolyl, isoquinolyl, CTainazolyl, Ihdolyl and indazolyl, and particularly preferably furyl, thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, Isoxazolyl and thiadiazolyl. The heterocyclic radicals can carry one or more, preferably 1 to 2 different or, in particular, the same, substituents, with substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine and bromine, alkyl having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, Amino, nitro, cyano, sulfo, Cj-C ^ -alkylsulphonyl, hydroxy or oxo come into question.

Geeignetes Acyl R^ und R^ ist insbesondere gegebenenfalls substituiertes C-j-Cg-Alkylcarbonyl oder C^-Cg-Alkoxycarbonyl, wobei als Substituenten gegebenenfalls durch Methyl, Methoxy, Chlor r Brom, Nitro oder Cyano substituiertes Phenyl, Carboxy oder Amino in Frage kommen.Suitable acyl R ^ and R ^ is especially optionally substituted Cj-Cg alkylcarbonyl or C ^ -CG-alkoxycarbonyl, possible substituents being optionally substituted by methyl, methoxy, chlorine R is bromine, nitro or cyano-substituted phenyl, carboxy or amino in question.

Vorzugsweise steht R, für Wasserstoff und R^ für Wasserstoff, Formyl, Acetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder l-Methyl-2-Cj-C^ Alkoxycarbonylvinyl.Preferably R, is hydrogen and R ^ is hydrogen, Formyl, acetyl, tert-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl or 1-methyl-2-Cj-C 1-4 alkoxycarbonylvinyl.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf die racemischen Verbindungen der Formel I, worin öedoch Rp nicht Hydroxy und R/ nicht Wasserstoff bedeuten, trägergebundene, proteolytische Enzyme in. einem zweiphasigen Medium, bestehend aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel einwirken läßt, die D—Verbindungen der Formel I, worin R£ nicht Hydroxy und Ri nicht Wasserstoff ist, von den L-Verbindungen der Formel I,. worin Rp Hydroxy ist und R^ nicht Wasserstoff ist, in üblicher Weise abtrennt und die voneinanderThe process according to the invention for the preparation of the compounds of the formula I is characterized in that that one refers to the racemic compounds of the formula I, in which, however, Rp is not hydroxy and R / is not hydrogen mean, carrier-bound, proteolytic enzymes in. a two-phase medium consisting of water and a water-immiscible solvent lets, the D compounds of formula I, in which R £ not Hydroxy and Ri is not hydrogen, from the L-compounds of formula I ,. where Rp is hydroxy and R ^ is not hydrogen is, separates in the usual way and from each other

Le A 19 803 'Le A 19 803 '

030062/QS70 .030062 / QS70.

getrennten D- -und L-Verbindungen gegebenenfalls in üblicher Weise in Verbindungen der Formel I, worin R2 Hydroxy und R, und R^ Wasserstoff bedeuten, überfuhrt.separate D- and L-compounds are optionally converted in the usual manner into compounds of the formula I in which R 2 is hydroxy and R 1 and R 1 are hydrogen.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht also darauf, in den L-Verbindungen die Ester- bzw. Amid-Gruppe CO-R2 in die Carboxylgruppe zu'überführen, während die D-Verbindung dieser Hydrolyse nicht unterliegt. Soll die D-Form optisch rein erhalten werden, so ist auf die vollständige Hydrolyse des L-Derivates zu achten; soll hingegen die L-Form-optisch rein gewonnen werden, so sollte die Hydrolyse der L-Ester und Amide nicht vollständig durchgeführt werden.The process according to the invention is therefore based on converting the ester or amide group CO-R 2 into the carboxyl group in the L compounds, while the D compound is not subject to this hydrolysis. If the D-form is to be obtained optically pure, then the complete hydrolysis of the L-derivative must be ensured; on the other hand, if the L-form is to be obtained optically pure, the hydrolysis of the L-esters and amides should not be carried out completely.

Die optisch reinen Verbindungen der Formel I dienen zur Herstellung von optisch reinen Penicillinen und Cephalosporinen, die bisher nur als Epimeren-Gemische zur Verfügung standen und beispielsweise aus den deutschen Offenlegungsschriften 27 32 283 und 28 10 bekannt sind. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Herstellung bisher nicht bekannter Penicilline und Cephalosporine verwendet werden.The optically pure compounds of the formula I are used to produce optically pure penicillins and Cephalosporins, which were previously only available as mixtures of epimers were available and, for example, from German Offenlegungsschrift 27 32 283 and 28 10 are known. Furthermore, the compounds according to the invention can also be used for the preparation of hitherto unknown Penicillins and cephalosporins are used.

In der Literatur sind bisher einige Beispiele für eine stereospezifische enzymatische Hydrolyse von N-Acyl-L-Aminosäureestern durch Subtilisin oder Chymotrypsin bekannt geworden. Die beschriebenen Fälle betreffen Spaltungen von Derivaten natürlicher, vornehmlich in Proteinen vorkommende Aminosäuren. Für diese Aminosäuren war eine Spaltung anhand der bekannten Spezifität der verwendeten proteolytischen Enzyme mehr oder weniger vorhersehbar (A. Berger, M. Smolarski, M. Kun und H.D. Bosshard, J. Org. Chem., 3838 (1973) 457-- 460, DE-OS 28 04 892, US-PS 39 6? 573, A.O» Barel und AT.N. Glazer, J.Biol. Chem., 24£ (1968), 1344 - 1348, K. Morihara und H. Tsuzuki, Arch. Biochenu Biophys., 129 (1969 >,Some examples of stereospecific enzymatic hydrolysis of N-acyl-L-amino acid esters by subtilisin or chymotrypsin have so far become known in the literature. The cases described relate to cleavage of derivatives of natural amino acids, mainly occurring in proteins. For these amino acids, a cleavage was more or less predictable on the basis of the known specificity of the proteolytic enzymes used (A. Berger, M. Smolarski, M. Kun and HD Bosshard, J. Org. Chem. , 3838 (1973) 457-460, DE-OS 28 04 892, US-PS 39 6? 573, AO »Barel and AT.N. Glazer, J.Biol. Chem., £ 24 (1968), 1344-1348, K. Morihara and H. Tsuzuki, Arch. Biochenu Biophys., 129 (1969>,

Le A 19 803Le A 19 803

030082/0570'030082/0570 '

~ 634, Tc N. Pattabiramari und ¥„B„ Lawson, Biochem. J., 126 (1972), 645 - 657).~ 634, Tc N. Pattabiramari and ¥ „B„ Lawson, Biochem. J., 126: 645-657 (1972)).

Eine Trennung der optischen Antipoden der heterocyclischen Aminosäuren der Formel I war bis jetzt in der Literatur noch nicht beschrieben worden. Nach Chemical Reviews (1950), 69 - 153, insbesondere 119 - 122 waren die erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnisse auch nicht zu erwarten.A separation of the optical antipodes of the heterocyclic amino acids of formula I has been in the literature up to now has not yet been described. According to Chemical Reviews (1950), 69-153, especially 119-122, were the results obtained according to the invention also not expected.

Als Enzyme kommen insbesondere proteolytische Enzyme in Frage, insbesondere Serin- und Sulfhydryl-Proteasen, vorzugsweise Subtilisin (EC 3.4.4.16.), £ -Chymotrypsin (EC 3.4.4.5.), Papin (EC 3.4.4.10.), Ficin oder Bromelain, wobei die ersten beiden einen Serinrest im aktiven Zentrum der Aminosäurekette haben während letztere in der Aminosäurekette Cystein als aktives Zentrum aufweisen. Subtilisin ist bevorzugt.Particularly suitable enzymes are proteolytic enzymes, in particular serine and sulfhydryl proteases, preferably subtilisin (EC 3.4.4.16.), £ -chymotrypsin (EC 3.4.4.5.), papin (EC 3.4.4.10.), ficin or Bromelain, with the first two having a serine residue in the active site of the amino acid chain during the latter have cysteine as an active center in the amino acid chain. Subtilisin is preferred.

Besonders geeignet sind aus Eacillus subtilis und Bacillus licheniformis isolierte proteolytische Enzyme, die den Waschmitteln zur Entfernung von Proteinresten zugesetzt werden. Diese technischen Enzyme sind vornehmlich unter den Firmennahmen Maxatase ^ ' (Hersteller: Gist-Brocade's N.V., Delft / Niederlande), Optimase^ ' (Hersteller; Miles-Kali Chemie, Hannover) und Alcalasev ; (Hersteller: Novo Industrie AS, Kopenhagen / Dänemark) bekannt.Particularly suitable are proteolytic enzymes isolated from Eacillus subtilis and Bacillus licheniformis, which are added to the detergents to remove protein residues. These technical enzymes are mainly under the company names Maxatase ^ ' (manufacturer: Gist-Brocade's NV, Delft / Netherlands), Optimase ^'(manufacturer; Miles-Kali Chemie, Hanover) and Alcalase v; (Manufacturer: Novo Industrie AS, Copenhagen / Denmark) known.

Die Eigenschaften der proteolytischen Enzyme, insbesondere ihrer biochemischen Wirkungen, sind in folgenden Literaturstellen beschrieben: G.E. Perlmann und L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 199 - 215; P. Desnuelle, The Enzymes, 4 (I960) 93 und G.E. Perlmann und L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 226 - 244.The properties of the proteolytic enzymes, in particular their biochemical effects, are given in the following references described: G.E. Perlmann and L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 199-215; P. Desnuelle, The Enzymes, 4 (1960) 93 and G.E. Perlmann and L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 226-244.

'Le A 19 803'Le A 19 803

0 3 0062/05700 3 0062/0570

Die proteolytischen Enzyme können durch eine kovalente Bindung über einen zur Katalyse nicht essentiellen Lysinrest an den polymeren Träger gekuppelt werden. Die durch kovalente Bindung des Enzyms an den Träger entstehenden trägergebundenen Enzyme verlieren nur sehr langsam nach vielfacher Wiederverwendung ihre Aktivität. Eine weitere Möglichkeit ist, die Adsorption des Enzyms an die Poren eines geladenen Trägers sowie die anschließende Quervernetzung mit Glutardialdehyd.The proteolytic enzymes can be covalent Binding are coupled to the polymeric carrier via a lysine residue, which is not essential for catalysis. The carrier-bound enzymes produced by covalent binding of the enzyme to the carrier only lose their activity very slowly after being reused many times. Another option is adsorption of the enzyme to the pores of a charged carrier and the subsequent cross-linking with glutaraldehyde.

Als Enzymträger kommen polymere, poröse Träger wie Cellulosen, z„ B. DEAE- öder CM-Cellulose, modifizierte Polyacrylamidgele mit Amino- oder Hydroxylgruppen oder organische Copolymerisate aus Acrylamid, Methacrylaten oder Methacrylamid und Maleinsäureanhydrid nach den DE-OS 22 15 539 und 22 15 687 in Frage.Polymeric, porous carriers such as celluloses, for example DEAE or CM cellulose, modified, are used as enzyme carriers Polyacrylamide gels with amino or hydroxyl groups or organic copolymers made from acrylamide, methacrylates or methacrylamide and maleic anhydride according to DE-OS 22 15 539 and 22 15 687 in question.

Das Enzym wird zur Kupplung mit dem polymeren Träger unter optimalen Bedingungen für die Stabilität des Enzyms zur Reaktion gebracht. Die Effektivität der Kupplung kann durch Messung der enzymatischen Aktivität am Polymer und im Waschwasser bestimmt werden. Das polymere Enzym kann bei Verwendung im Batch-Verfahren leicht durch Sedimentation oder Filtration von der Reaktionslösung abgetrennt und mehrfach eingesetzt werden. Der Enzymträger kann auch in Säulen gefüllt und in Gegenwart eines Puffersystems von Substratlösung durchströmt werden.The enzyme is used to couple with the polymeric carrier under optimal conditions for the stability of the Reacted enzyme. The effectiveness of the coupling can be determined by measuring the enzymatic activity can be determined on the polymer and in the wash water. The polymeric enzyme can easily be used in the batch process separated from the reaction solution by sedimentation or filtration and used several times. The enzyme carrier can also be filled into columns and flowed through by substrate solution in the presence of a buffer system will.

Voraussetzung zur Eignung eines Enzymträgers für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein vorheriger Test zur Adsorption der Ausgangs- und Endprodukte. Geeignete Träger dürfen die Ausgangs- und Endprodukte nur in ganz geringem Umfang oder gar nicht adsorbieren.A prior test is a prerequisite for the suitability of an enzyme carrier for the method according to the invention for adsorption of the starting and end products. Suitable carriers are only allowed to use the starting and end products in their entirety adsorb to a small extent or not at all.

Le A 19 803Le A 19 803

030062/0570030062/0570

292?534292-534

Als "besonders gute Träger für die proteolytischen Enzyme haben sich die verschiedenen Cellulosen, derivatisierten · Cellulosen, Amino- und Hydroxylgruppen-haltigen PoIyacrylamidgele sowie die durch Amino- oder Hydroxylgruppen modifizierten Anhydridharze erwiesen. Generell können als Träger alle Amino- und Hydroxylgruppen tragenden polymeren Träger eingesetzt werden, die die Ausgangsund Endprodukte des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht adsorbieren. Der polymere· Träger wird nach an sich bekannten Methoden mit Cyanurchlorid (GB-PS 1.302.706, W.L. Smith und H.M. Lohnhoff, Arch. Biochem., 61 (1974) 392 ~ 415, Τ.Ή. Finlay et al, Arch. Biochem., 87 (1978) 77 - 90) oder verschiedenen Halogenpyrimidinen nach DE-OS 26 19 521 oder DE-OS 26 19 451 aktiviert.As "particularly good carriers for the proteolytic enzymes have the various celluloses, derivatized Celluloses, polyacrylamide gels containing amino and hydroxyl groups and those containing amino or hydroxyl groups modified anhydride resins. In general, all amino and hydroxyl groups can be used as a carrier polymeric carriers are used which are not the starting and end products of the process according to the invention adsorb. The polymeric carrier is treated with cyanuric chloride according to methods known per se (GB-PS 1.302.706, W.L. Smith and H.M. Lohnhoff, Arch. Biochem., 61 (1974) 392 ~ 415, Τ.Ή. Finlay et al, Arch. Biochem., 87 (1978) 77 - 90) or various halogen pyrimidines according to DE-OS 26 19 521 or DE-OS 26 19 451 activated.

Die in iiem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten N-Acylester und -Amide der heterocyclischen Aminosäuren werden durch Acylieren der entsprechenden Aminosäureester- bzw. -amidhydrochloride mit stöchiometrischen Mengen Säureanhydrid wie Acetanhydrid und anschließende Abtrennung des N-Acylderivates aus der wässrigen Phase mit organischen Lösungsmitteln wie Chloroform oder Methylenchlorid gewonnen. : _- "■Those used in the process according to the invention N-acyl esters and amides of the heterocyclic amino acids are obtained by acylating the corresponding amino acid ester or amide hydrochloride with stoichiometric amounts of acid anhydride such as acetic anhydride and subsequent Separation of the N-acyl derivative from the aqueous phase obtained with organic solvents such as chloroform or methylene chloride. : _- "■

Die -enzymatische Spaltung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 - 40°C in einem pH-Bereich von 6 bis 8, wobei der pH-Wert vorzugsweise durch Zuga:be einer starken Base bei 7,0 konstant gehalten wird. Das Substrat wird als ca. 10 - 20 %-ige organische Lösung zu dem ±el Wasser suspendierten Enzym-Träger zugesetzt, wobei der Lösungsmittelanteil bezogen auf das Gesamtvolumen maximal 75 - 80 V0I.-96 betragen kann.. Das Reaktionsmedium wird während der enzymatischem Umsetzung intensiv gerührt ^ Der Verlauf und der Endpunkt der enzymatischen Reaktion kann durch die Neutralisation der entstehenden H+-Ionen Le A 19 8Ό3 /The enzymatic cleavage is preferably carried out at a temperature of 20-40 ° C. in a pH range of 6 to 8, the pH value preferably being kept constant at 7.0 by adding a strong base. The substrate is than about 10 - 20% - ige organic solution to the ± el water suspended enzyme-carrier added, wherein the solvent content based on the total a maximum of 75 - may be 80 V0I.-96 .. The reaction medium during the enzymatic Reaction intensely stirred ^ The course and the end point of the enzymatic reaction can be determined by the neutralization of the H + ions Le A 19 8Ό3 /

0^30062/0570 "0 ^ 30062/0570 "

ΛΌΛΌ

bestimmt werden. Die Neutralisation kann sowohl durch anorganische als auch durch organische Basen erfolgen.to be determined. The neutralization can be done by inorganic as well as organic bases.

Als organische Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren kommen mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Chloroform, Toluol, Benzol, Essigsäureäthylester, Petroläther, Methylisobutylketon oder Isobutanol in Frage.Water-immiscible solvents are used as organic solvents for the process according to the invention such as methylene chloride, chloroform, toluene, benzene, ethyl acetate, petroleum ether, methyl isobutyl ketone or isobutanol in question.

Zahlreiche Substrate und Produkte von Enzymreaktionen sind in Wasser ofer Pufferlösungen nur begrenzt löslich. Aus wirtschaftlichen Gründen sollten aber für die technische Anwendung von Reaktionen mit trägergebundenen Enzymen möglichst konzentrierte Substratlösungen eingesetzt werden.Numerous substrates and products of enzyme reactions have only limited solubility in water or buffer solutions. For economic reasons, however, should be used for the technical application of reactions with carrier-bound Substrate solutions that are as concentrated as possible are used with enzymes.

Es wurden daher zahlreiche Versuche mit Wasser/Lösungsmittelgemischen unternommen, um mit Enzymen höhere Produktkonzentrationen als in wäßriger Lösung erzielen zu können.There have therefore been numerous attempts with water / solvent mixtures undertaken to achieve higher product concentrations with enzymes than in aqueous solution to be able to.

Die Beobachtung zeigt, daß gelöste, solvatisierte Enzyme durch Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril, Dioxan und Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd teilweise oder sollständig unter partiellem oder vollständigem Verlust der Enzymaktivität denaturiert und aus der Lösung ausgefällt werden können.The observation shows that dissolved, solvated enzymes by solvents such as methanol, ethanol, acetone, Acetonitrile, dioxane and dimethylformamide or dimethylsulfoxide partially or completely under partial or complete loss of enzyme activity can be denatured and precipitated from solution.

Durch Bindung des Enzyms an einen polymeren Träger wird die Aggregation der Enzymmoleküle verhindert, so daß trägergebundene Enzyme in wesentlich geringerem Umfang als die freien Enzyme ihre Aktivität (K. Tamizawa und M.L. Bender, J. Biol. Chem. 249 (1974), 2130 - 2134) verlieren. Dennoch wird auch bei trägergebundenen EnzymenBy binding the enzyme to a polymeric carrier, the aggregation of the enzyme molecules is prevented, so that carrier-bound enzymes are much less active than the free enzymes (K. Tamizawa and ML Bender, J. Biol. Chem. 249 (1974), 2130- 2134) lose. However, this is also the case with carrier-bound enzymes

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2327S342327S34

ein mehr oder minder starker Aktivitätsverlust des gebundenen Enzyms durch das Lösungsmittel beobachtet. Es wird entweder eine irreversible oder eine reversible Inaktivierung des Enzyms in Abhängigkeit von der Konzentration des Lösungsmittels beobachtet (H. Kaplan und K.J. Leidler, Canad. J. Chem. 45_ (1967), 547 - 557, G.M. ümezurike, Biocheiru J. 167 (1977), 831 - 833., T.N. Pattabiraman und W.B. Lawson, Blöchern. J. 126 (1972), 645 - 657, G. Fink und H. Thoma, DECHEMA-Monographie 21, 295 - 314, H. Wan und C. Horvath, Biophys. Biochem. Acta 410 (1973), 135 - 140).a more or less pronounced loss of activity of the bound enzyme due to the solvent was observed. Either irreversible or reversible inactivation of the enzyme is observed depending on the concentration of the solvent (H. Kaplan and KJ Leidler, Canad. J. Chem. 45_ (1967), 547-557, GM ümezurike, Biocheiru J. 167 ( 1977), 831-833., TN Pattabiraman and WB Lawson, Blöchern. J. 126 (1972), 645-657, G. Fink and H. Thoma, DECHEMA-Monographie 21, 295-314, H. Wan and C. Horvath, Biophys. Biochem. Acta 410: 135-140 (1973)).

Die Enzymaktivität kann auch durch Veränderung der Porengröße des Enzymträgers als Folge des Lösungsmitteleinflusses verändert werden.The enzyme activity can also be changed by changing the pore size of the enzyme carrier as a result of the influence of the solvent to be changed.

Die oben erwähnten vollständig mit Wasser mischbaren Lösungsmittel weisen jedoch den weiteren technischen Nachteil auf, destillativ schwierig von Wasser abtrennbar zu.sein.However, the above-mentioned completely water-miscible solvents have the further technical Disadvantage of being difficult to separate from water by distillation.

Die Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln in Reaktionen mit trägergebundenen Enzymen ist bisher nur in einem Fall in der Literatur beschrieben (A.Mo Klibanov, G.P. Samokhin, K. Martinek und I.V. Berezin, Biotechnol. Bioeng, ^i (1977) 1351 1361). In der zitierten Arbeit wird die Synthese von N-Acetyl-L-ttryptophanethylester aus N-Acety 1-L-tryptophan und Ethanol mit kovalent an Glas gebundenem Chymotrypsin in Chloroform als Lösungsmittel beschrieben. Um die aus energetischen Gründen ungünstige Synthese des Esters durchführen zu können muß in Abwesenheit von Wasser gearbeitet werden. Diese Literaturstelle gibt daher keinerlei Hinweis auf das erfindungsgemäße Verfahren.The use of water-immiscible solvents in reactions with supported enzymes has so far only been described in the literature in one case (A. Mo Klibanov, G.P. Samokhin, K. Martinek and I.V. Berezin, Biotechnol. Bioeng, ^ i (1977) 1351 1361). In the cited work the synthesis of N-Acetyl-L-ttryptophanethylester from N-Acety 1-L-tryptophan and ethanol with chymotrypsin covalently bound to glass in chloroform as the solvent. To the for energetic reasons unfavorable synthesis of the ester to be able to carry out must be carried out in the absence of water. This reference therefore gives no indication of the method according to the invention.

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Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet alle genannten Nachteile, schützt überdies die N-Acyl-aminosäure ester vor unspezifischer Hydrolyse, so daß die enzymatisch^ Spaltung auch bei höheren pK-Werten ohne Einbuße an Ausbeute durchgeführt werden kann.The method according to the invention avoids all of the above Disadvantages, moreover, protects the N-acyl-amino acid ester from unspecific hydrolysis, so that the enzymatic ^ cleavage even at higher pK values without Loss of yield can be carried out.

Gegen die denaturierende Wirkung von Lösungsmitteln kann das trägergebundene Enzym nach kovalenter Bindung an einem polymeren Träger durch nachträgliche inter- und intramolekulare Quervernetzung mit bi- oder polyvalenten Reagenzien wie Glutardialdehyd oder anderen Reagenzien (F. Wold, Methods in Enzymology I^, 617 640) geschützt werden.The carrier-bound enzyme can counteract the denaturing effect of solvents after covalent binding to a polymeric carrier through subsequent inter- and intramolecular cross-linking with bi- or polyvalent Reagents such as glutaraldehyde or other reagents (F. Wold, Methods in Enzymology I ^, 617 640) to be protected.

Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wird nach dem Absitzen des Enzymharzes die organische Phase abgenommen und die wässrige Reaktionslösung portionsweise noch einmal mit dem zweifachem Volumen am organischem Lösungsmittel extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt. Das Enzymharz wird abfiltriert und die verbleibende wässrige Phase beispielsweise mit Schwefelsäure sauer gestellt und mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die erhaltenen Verbindungen werden dann auf ihre optische Reinheit überprüft .After the enzymatic reaction has ended and the enzyme resin has settled, the organic phase is removed and the aqueous reaction solution again in portions with twice the volume of the organic solvent extracted. The extracts are combined. The enzyme resin is filtered off and the remaining aqueous Phase acidified, for example, with sulfuric acid and extracted with ethyl acetate. The received Connections are then checked for optical purity .

Zur Herstellung der heterocyclischen D- bzw. L-Aminosäuren werden die Schutzgruppen R£ und R^ in der dem Fachmann geläufigen Weise abgespalten. Beispielsweise wird D- <£-FuryigIycin aus D- (£ -Formamidofurylessigsäuremethylester durch Erwärmen mit verdünnter Salzsäure gewonnen. For the production of the heterocyclic D- or L-amino acids the protecting groups R £ and R ^ in the dem Cleaved off in a manner familiar to those skilled in the art. For example, D- <£ -FuryigIycin from D- (£ -formamidofurylacetic acid methyl ester obtained by heating with dilute hydrochloric acid.

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Beispiel 1example 1

200 g Cellulose Avicel (Merck) werden in einer Lösung aus 500 ml Wasser und 500 ml Dioxan suspendiert und mit 20 g Cyanurchlorid versetzt. Der pH-Wert wird mit 2 N NaOH zwischen pH 7,0 und 3,0 gehalten. Nach 45 Minuten Rühren wird die aktivierte Cellulose über eine Fritte abgesaugt und in 800 ml Wasser suspendiert. Es werden 25 g Maxatase (Gist-Brocades N.V,, DeIft/Niederlande) hinzugefügt und es wird 20 Stunden bei Raumtemperatur und pH 7 - 8 gerührt. Danach wird der Enzymträger über eine Fritte abgesaugt, portionsweise mit destilliertem Wasser gewaschen und zuletzt trocken gesaugt. :200 g of Avicel cellulose (Merck) are suspended in a solution of 500 ml of water and 500 ml of dioxane, and 20 g of cyanuric chloride are added. The pH is maintained between pH 7.0 and 3.0 with 2 N NaOH. After stirring for 45 minutes, the activated cellulose is filtered off with suction through a frit and suspended in 800 ml of water. 25 g of Maxatase (Gist-Brocades NV, DeIft / Netherlands) are added and the mixture is stirred at room temperature and pH 7-8 for 20 hours. The enzyme carrier is then suctioned off through a frit, washed in portions with distilled water and finally sucked dry. :

Es werden 600 g feuchte Subtilisin-Cellulose erhalten. Aktivität: 284 ATEE (N-Acetyl-L-tyrosinethylester)-Einheiten/g Enzymträger. Gesamtaktivität: 170 250 ATEE-Einheiten, entsprechend 27,2 % der eingesetzten Aktivität.600 g of moist subtilisin cellulose are obtained. Activity: 284 ATEE (N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester) units / g Enzyme carrier. Total activity: 170 250 ATEE units, corresponding to 27.2% of the used Activity.

Beispiel 2Example 2

100 g DEAE-Cellulose (DE-52-Cellülose, Fa. Whatmann Ltd., Springfield/England) werden in ähnlicher Weise wie : oben beschrieben mit Cyanurchlorid aktiviert. Davon werden 5 g nach Dialyse gegen Wasser lyophilisierte Maxatase oder Alcalase (659 Anson-Einheiten/g, Hersteller Novo AS, Kopenhagen/Dänemark) kovalent gebunden.100 g DEAE cellulose (DE-52 cellulose, Whatmann Ltd., Springfield / England) are activated in a similar way as described above with cyanuric chloride. Of that 5 g are lyophilized after dialysis against water Maxatase or Alcalase (659 Anson units / g, manufacturer Novo AS, Copenhagen / Denmark) covalently bound.

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-Hf--Hf-

14Og feuchtes DE-52-Cellulose-Subtilisin mit 740 g ATEE-Einheiten/g Enzymträger werden nach Filtration erhalten» 14Og moist DE-52 cellulose subtilisin with 740 g ATEE units / g enzyme carrier are obtained after filtration »

Die gesamte Aktivitätsausbeute betrug 1Ο36ΟΟ ATEE-Einheiten entsprechend 16,5 % der eingesetzten Aktivität.The total activity yield was 1,36 ATEE units corresponding to 16.5% of the activity used.

Beispiel 3Example 3

20 g mit Aceton gewaschenes Anhydridharz (80 Gew.-% Tetraethylenglykoldimethacrylat, 10 Gew.-% Methacryl säure und 10 Gew.-% Maleinsäureanhydrid) werden in 50 ml Wasser suspendiert. Es werden 40 ml 10 Gew.-%ige Hexamethylendiamin-Lösung bzw. Ethanolamin-Lösung bei pH 7,0 zugegeben und die Suspension über Nacht bei pH 6,2 durch Titration konstant gehalten= Das Aminharz wird abgesaugt. Mit 1 M NaCl-Lösung wird überschüssiges Hexamethylendiamin ausgewaschen. Anschließend wird mit entsalztem Wasser gewaschen.20 g of anhydride resin washed with acetone (80% by weight of tetraethylene glycol dimethacrylate, 10% by weight of methacrylic acid and 10 wt .-% maleic anhydride) are suspended in 50 ml of water. There are 40 ml of 10 wt .-% hexamethylenediamine solution or ethanolamine solution was added at pH 7.0 and the suspension was added overnight at pH 6.2 kept constant by titration = the amine resin is sucked off. With 1 M NaCl solution, excess becomes Washed out hexamethylenediamine. It is then washed with deionized water.

Das Aminogruppen tragende Anhydridharz wird in 50 ml Wasser und 50 ml Dioxan suspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 2 g Cyanurchlorid bei pH 5,0 aktiviert. Das Harz wird mit Dioxan und Wasser gewaschen und 20 Stunden bei Raumtemperatur mit 2 g Maxatase bei pH 8,O umgesetzt.The anhydride resin carrying amino groups is suspended in 50 ml of water and 50 ml of dioxane and allowed to take 1 hour activated at room temperature with 2 g of cyanuric chloride at pH 5.0. The resin is washed with dioxane and water and reacted with 2 g of Maxatase at pH 8.0 for 20 hours at room temperature.

Es werden 48,2 g feuchtes Harz mit einer Aktivität von 126 ATEE-Einheiten/g Enzymträger erhalten.48.2 g of moist resin with an activity of 126 ATEE units / g of enzyme carrier are obtained.

Die gesamte Aktivitätsausbeute betrug 60.790 ATEE-Einheiten entsprechend 12,1 % der eingesetzten Aktivität.The total activity yield was 60,790 ATEE units, corresponding to 12.1% of the activity used.

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Beispiel 4Example 4

300 g mit Diethylentriamin umgesetztes Polyacrylnitrilharz wird wie oben angegeben im gewichtsmäßigen Verhältnis Träger ; Cyanurchlorid (10 % 1) aktiviert und mit 30 g Maxatase bei 250C, pH 8,0 und 16 Stunden zur Umsetzung gebracht»300 g of polyacrylonitrile resin reacted with diethylenetriamine is, as indicated above, in a weight ratio of carrier; Cyanuric chloride (10 % 1) activated and made to react with 30 g Maxatase at 25 0 C, pH 8.0 and 16 hours »

Es werden 288,5 g feuchtes Enzymharz erhalten.288.5 g of moist enzyme resin are obtained.

Die proteolytische Aktivität am Träger betrug 81,0 ATEE-Einheiten/g Enzymharz, insgesamt 23.383 ATEE-Einheiten entsprechend 3,1% der insgesamt eingesetzten Aktivität. .The proteolytic activity on the support was 81.0 ATEE units / g Enzyme resin, a total of 23,383 ATEE units corresponding to 3.1% of the total activity used. .

Beispiel 5.1Example 5.1

D,L- aC-FormamidofurylessigsäuremethylesterD, L-aC-formamidofurylacetic acid methyl ester

j)CH-COOCH3
NH-CHO j) CH-COOCH 3
NH-CHO

Zu 810 ml Essigsäureanhydrid werden bei 350C 390 ml Ameisensäure getropft. Anschließend wird das Gemisch eine Stunde bei 550C gerührt« 14,1 g DjL-cC-Furylgl werden in 100 ml des obigen gemischten Anhydrids portionsweise eingetragen, die Temperatur soll dabei 300C nicht übersteigen. Ca. 6 Minuten nach der letzten Zugabe beginnt die Abscheidung der formylierten Aminosäure. Nach 3-stündigem Rühren wird abgesaugt, zweimal390 ml of formic acid are added dropwise at 35 ° C. to 810 ml of acetic anhydride. Subsequently, the mixture is stirred for one hour at 55 0 C "14.1 g DJL-CC Furylgl are dissolved in 100 ml of the above mixed anhydride was added portionwise, the temperature should not exceed 30 0 C. The deposition of the formylated amino acid begins approx. 6 minutes after the last addition. After stirring for 3 hours, it is suctioned off, twice

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mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 13,2 g (78 % d. Th.) beige Kristalle vom Schmelzpunkt 170 - 1720C (Zers„).washed with diethyl ether and air dried. This gives 13.2 g (78% of theory..) Of beige crystals of melting point 170-172 0 C (dec ").

13,0 g der vorstehend erhaltenen Verbindung werden in 40 ml Dimethylsulfoxid gelöst und unter Eiskühlung portionsweise mit einer Lösung von 3,08 g Natriumhydroxid in 17 ml Wasser versetzt. Dann werden 32,7 g Methyljodid zugegeben, wobei sich zwei Phasen bilden. Nach 50-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung in 150 ml Wasser gegossen und fünfmal mit je 200 ml Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden dann zweimal mit je 50 ml 2 %-iger Natriumsulfit-Lösung geschüttelt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen erhält man 10,6 g (75,3 % d. Th.)als Öl, das beim Animpfen kristallisiert; Schmp. 52 - 550C .13.0 g of the compound obtained above are dissolved in 40 ml of dimethyl sulfoxide and, while cooling with ice, a solution of 3.08 g of sodium hydroxide in 17 ml of water is added in portions. Then 32.7 g of methyl iodide are added, two phases being formed. After stirring for 50 hours at room temperature, the reaction mixture is poured into 150 ml of water and extracted five times with 200 ml of methylene chloride each time. The combined organic phases are then shaken twice with 50 ml of 2% sodium sulfite solution each time and dried over sodium sulfate. After concentration, 10.6 g (75.3 % of theory ) are obtained as an oil which crystallizes on seeding; Mp. 52 - 55 0C.

Beispiel 5.2Example 5.2

D- cCr-FormamidofurylessigsäuremethylesterD-cCr-formamidofurylacetic acid methyl ester

30,0 g des nach Beispiel 5.1 erhaltenen Produktes werden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst und bei pH 6,5 und 250C mit 132,5 g Cellulose-Subtilisin (105 ATEE-Einheiten) gespalten. Der pH-Wert wird mit 25 %-igem NH7 konstant bei 6,5 gehalten. Nach 2,5 Stunden wird der Enzym-Träger abfiltriert und mit zweimal 100 ml Wasser gewaschen. Aus dem Filtrat wird die gewünschte Verbindung mit viermal 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Ausbeute beträgt 11,2 g (74 % d. Th.).30.0 g of the product obtained according to Example 5.1 Cellulose subtilisin (10 5 ATEE units) cleaved dissolved in 800 ml of distilled water and 6.5 g and 25 0 C and at pH 132.5. The pH is kept constant at 6.5 with 25% NH 7. After 2.5 hours, the enzyme carrier is filtered off and washed twice with 100 ml of water. The desired compound is extracted from the filtrate with four 100 ml portions of methylene chloride. The yield is 11.2 g (74 % of theory ).

/~c£_7 25 C = -179,8°, c=1 in Methanol 578nm/ ~ c £ _7 25 C = -179.8 °, c = 1 in methanol 578 nm

Die wässrige Phase wird mit Schwefelsäure auf pH 1,5 eingestellt und viermal mit je 100 ml EssigsäureäthylesterThe aqueous phase is adjusted to pH 1.5 with sulfuric acid and four times with 100 ml of ethyl acetate each time

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extrahiert. Die vereinigten Essigsäureäthyl-ester-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Ausbeute an L-<L-Formamidofurylessigsäure beträgt 11 g (79 % d, Tn.)extracted. The combined ethyl acetate extracts are evaporated to dryness in vacuo. The yield of L- <L-formamidofurylacetic acid is 11 g (79 % of theory ).

/~cC_7 25 C = -162,7°, c=1 in Methanol 578 nm/ ~ cC_7 25 C = -162.7 °, c = 1 in methanol 578 nm

Beispiel 5.3Example 5.3

D- dZ -Furylglyc in-hydr ochlor idD- dZ -Furylglyc in-hydr ochlor id

44,0 g des nach Beispiel 5.2 erhaltenen Produktes werden in der Wärme in 440 ml 2 -N Salzsäure gelöst, 70 Minuten auf 80°C gehalten, mit Tierkohle entfärbt und eingeengt.44.0 g of the product obtained according to Example 5.2 dissolved in the warmth in 440 ml of 2N hydrochloric acid, kept at 80 ° C. for 70 minutes, decolorized with animal charcoal and concentrated.

Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus 80 Teilen Aceton und 40 Teilen Äthanol digeriert und abfiltriert. Das Produkt wird mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 26,0 g (61 ld, Th.) D- -X. -Furylglyc inhydrochlorid mit einem Schmelzpunkt 193 - 195°C (Zers.).The residue is digested with a mixture of 80 parts of acetone and 40 parts of ethanol and filtered off. The product is washed with acetone and dried in vacuo. 26.0 g (61 ld, theory) of D- -X are obtained. -Furylglycine hydrochloride with a melting point 193-195 ° C (decomp.).

/~~ cC_7 25 C = -114,90Vc = 1 in Methanol 578 nm/ ~~ cC_7 25 C = -114.9 0 Vc = 1 in methanol 578 nm

In entsprechender Weise wird L-c£-Furylglycin-hydrochlorid gewonnen. 'In a corresponding manner, L-c £ -furylglycine hydrochloride is used won. '

Beispiel 6.1 .'■".-....Example 6.1. '■ ".-....

D,L- <C -t-ButoxycarbonylaminofurylessigsäureD, L- <C -t-butoxycarbonylaminofurylacetic acid

CH-COOH
I
NH-CO-O-CH-COOH
I.
NH-CO-O-

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5,0 g D,L- c£-Furylglycin werden in 10Q ml 80 $~igem wässrigem Dioxan mit 4 N Natronlauge auf pE 8 gebracht. Man gibt 8,0 g 2-(t-Butoxycarbonyloximino)-2-phenylacetonitril zu und erwärmt 2 Stunden auf 700C. Während dieser Zeit wird durch Zugabe von 4 N Natronlauge der obige pH aufrechterhalten. Danach werden 80 ml Wasser zugegeben, das Dioxan abdestilliert und mehrere Male mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die wässrige Phase wird mit 10 %-±gev Zitronensäure auf pH 4 gebracht, mit Kochsalz gesättigt und mit Essigester ausgeschüttelt. Die Essigesterphasen werden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus wenig absolutem Tetrachlorkohlenstoff umkristallisiert. Man erhält 4,3 g D,L-cC-t-Butoxycarbonylaminofurylessigsäure vom Schmp. 99 - 1010C.5.0 g of D, L-furylglycine are brought to pE 8 in 10Q ml of 80% aqueous dioxane with 4N sodium hydroxide solution. One gives 8.0 g of 2- (t-Butoxycarbonyloximino) -2-phenylacetonitrile to and heated for 2 hours at 70 0 C. During this time, is maintained by addition of 4 N sodium hydroxide solution of the above pH. Then 80 ml of water are added, the dioxane is distilled off and extracted several times with ethyl acetate. The aqueous phase is brought to pH 4 with 10% - ± gev citric acid, saturated with sodium chloride and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate phases are dried over sodium sulfate and concentrated. The residue is recrystallized from a little absolute carbon tetrachloride. This gives 4.3 g of D, L-cC-t-Butoxycarbonylaminofurylessigsäure of mp. 99 - 101 0 C.

Beispiel 6.2Example 6.2

D,L-dC-t-ButoxycarbonylaminofurylessigsäuremethylesterD, L-dC-t-butoxycarbonylaminofurylacetic acid methyl ester

Zu einer Lösung von 6,0 g der nach Beispiel 6.1 erhaltenen Verbindung in 100 ml absolutem Diäthyläther wird bis zur bleibenden Gelb-Färbung ätherische I'iazomethan-LÖsung getropft. Dann wird mit verdünnter Natronlauge ausgeschüttelt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält 6,3. g (96 % d. Th.) der gewünschten Verbindung vom Schmp. 63 - 680C.To a solution of 6.0 g of the compound obtained according to Example 6.1 in 100 ml of absolute diethyl ether, essential azomethane solution is added dropwise until it remains yellow. Then it is extracted with dilute sodium hydroxide solution, washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated. 6.3 is obtained. g (96% of theory..) of the desired compound, mp. 63 - 68 0 C.

Beispiel 6.3Example 6.3

Enzymatisch^ Spaltung von D,L-<£, -t-butoxycarbonylaminofurylessigsäuremethylester in Gegenwart von MethylisobutylketonEnzymatic cleavage of D, L- <£, -t-butoxycarbonylaminofuryl acetic acid methyl ester in the presence of methyl isobutyl ketone

20 g der nach Beispiel 6.2 erhaltenen Verbindung werden in einem Gemisch aus 800 ml Wasser und 200 ml Methylisobutylketon gelöst und mit dem nach Beispiel 4 hergestellten Subtilisin-Trägerharz bei pH 7,0 und 370C unter Rühren ge-20 g of the compound obtained according to Example 6.2 are dissolved in a mixture of 800 ml of water and 200 ml of methyl isobutyl ketone and treated with the subtilisin carrier resin prepared according to Example 4 at pH 7.0 and 37 0 C with stirring.

Le A 19 803Le A 19 803

030062/0570030062/0570

spalten. Der pH-Wert wird mit 25 %-igem Ammoniak konstant gehalten. Nach 5 Stunden Reaktionszeit wird der Rührer abgestellt und die organische Phase von der wässrigen Phase abgetrennt« Anschließend wird die wässrige Phase noch zweimal mit je 200 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Ausbeute an D-<£ -t-Butoxycarbonylaminofurylessigsäuremethylester beträgt 10,2 g (68 % d. Th.),columns. The pH is kept constant with 25% ammonia. After a reaction time of 5 hours, the stirrer is switched off and the organic phase is separated off from the aqueous phase. The aqueous phase is then extracted twice with 200 ml of methyl isobutyl ketone each time. The combined organic phases are evaporated to dryness in vacuo. The yield of D- <£ -t-butoxycarbonylaminofurylacetic acid methyl ester is 10.2 g (68 % of theory ),

/ cC_7 = -81,4°, c = 1 in Methanol 578 nm/ cC_7 = -81.4 °, c = 1 in methanol 578 nm

Die verbleibende wässrige Phase wird mit Schwefelsäure auf pH 1,5 eingestellt und mit viermal 100 ml Essigsäureäthylester extrahiert.The remaining aqueous phase is adjusted to pH 1.5 with sulfuric acid and four times with 100 ml of ethyl acetate extracted.

Die Ausbeute an L-cC-t-Butoxycarbonylaminofury!essigsäure beträgt 8,8 g (93 % d. Th.).The yield of L-cC-t-butoxycarbonylaminofury / acetic acid is 8.8 g (93 % of theory ).

25 C = + 104,7°, c = 1 in Methanol 578 nm 25 C = + 104.7 °, c = 1 in methanol 578 nm

Beispiel 6.4Example 6.4

D- <fi -Furylglycin-hydrochloridD- <fi -Furylglycine hydrochloride

10,0 g D-du-t-Butoxycarbonylaminofurylessigsäuremethylester werden in einem Gemisch aus 100 ml 2 N Salzsäure und 45 ml Dioxan warm gelöst, 2 Stunden auf 800C gehalten, mit Aktivkohle behandelt und eingedampft. Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus 20 ml Aceton und 10 ml Äthanol digeriert, abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Man erhält 3,9 g D-oC -Furylglycin-hydrochlorid.10.0 g of methyl D-du-t-butoxycarbonylaminofurylacetate are dissolved in a mixture of 100 ml of 2N hydrochloric acid and 45 ml of dioxane, kept at 80 ° C. for 2 hours, treated with activated charcoal and evaporated. The residue is digested with a mixture of 20 ml of acetone and 10 ml of ethanol, filtered off, washed with acetone and dried. 3.9 g of D-oC furylglycine hydrochloride are obtained.

25 c = -109,2°/c = 1 in Methanol 578 nm 25 c = -109.2 ° / c = 1 in methanol 578 nm

A 19 803A 19 803

030062/0570030062/0570

Claims (7)

Patentansprüche:Patent claims: 1)/Optisch reine Verbindungen der Formel1) / Optically pure compounds of the formula R1-CH-CO-R, 1 1 2 R 1 -CH-CO-R, 1 1 2 R3 R4 R 3 R 4 worin R1 einen gesättigten oder ungesättigten, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Rest, der 1 bis gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und/oder Stickstoff enthält, und gegebenenfalls benzokondensiert ist, R2 Hydroxy, C1-C^-AIkOXy oder N(Rc)2, R, und R^ Wasserstoff, Acyl oder durch C1-C^ Alkoxycarbonyl substituiertes C2-C/ Alkenyl und Rj5 Wasserstoff oder C1 -C^-Alkyl bedeuten und das mit * gekennzeichnete C-Atom entweder in der D- oder L-Form vorliegt.wherein R 1 is a saturated or unsaturated, optionally substituted heterocyclic radical which contains 1 to identical or different heteroatoms from the series oxygen, sulfur and / or nitrogen, and is optionally benzofused, R 2 is hydroxy, C 1 -C ^ -AIkOXy or N (Rc) 2 , R, and R ^ are hydrogen, acyl or C 2 -C / alkenyl substituted by C 1 -C ^ alkoxycarbonyl and Rj 5 are hydrogen or C 1 -C ^ -alkyl and the carbon atom marked with * is either is in the D or L shape. 2) Verbindungen nach Anspruch 1, worin R1 einen heterocyclischen Rest aus der Reihe Pyrazolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Oxdiazolyl, Thiazolinyl, Tetrazolyl, Sydnonyl, Pyridyl, Pyrazyl, Pyrimidinyl, Pyridazyl, Chinolyl, Isochinolyl, Chinazolyl, Indolyl, Indazolyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl und Thiadiazolyl bedeutet, der durch Halogen, C-,-C,--Alkyl, Amino, Nitro, Cyano, SuIfο, C1-CA-Alkylsulfonyl, Hydroxy oder Oxo substituiert sein kann, und R^ und Rr Wasserstoff, gegebenenfalls durch Phenyl, Carboxy oder Amino substituiertes C-,-Cg-Alkylcarbonyl oder C-j_-Cg-Alkoxy carbonyl, wobei die Phenylreste2) Compounds according to claim 1, wherein R 1 is a heterocyclic radical from the series pyrazolyl, imidazolyl, oxazolyl, oxdiazolyl, thiazolinyl, tetrazolyl, sydnonyl, pyridyl, pyrazyl, pyrimidinyl, pyridazyl, quinolyl, isoquinolyl, quinazolyl, indolyl, indazole, Thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, isoxazolyl and thiadiazolyl which can be substituted by halogen, C -, - C, - alkyl, amino, nitro, cyano, SuIfο, C 1 -CA-alkylsulphonyl, hydroxy or oxo, and R ^ and Rr hydrogen, optionally substituted by phenyl, carboxy or amino C -, - Cg-alkylcarbonyl or C-j_-Cg-alkoxy carbonyl, the phenyl radicals Le A 19 803Le A 19 803 030062/0570030062/0570 gegebenenfalls durch Methyl, Methoxyy Chlor, Brom, Nitro oder Cyano weiter substituiert sein können, bedeuten,may optionally be further substituted by methyl, methoxy y chlorine, bromine, nitro or cyano, mean 3) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die racemischen Verbindungen der Formel3) Process for the preparation of compounds according to claim 1, characterized in that one is on the racemic compounds of the formula R1-CH-CO-R
1 (R 1 -CH-CO-R
1 ( worin R1 einen gesättigten oder ungesättigten, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Rest, der 1 bis 4 gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und/oder Stickstoff enthält, und gegebenenfalls benzokondensiert ist,wherein R 1 is a saturated or unsaturated, optionally substituted heterocyclic radical which contains 1 to 4 identical or different heteroatoms from the series oxygen, sulfur and / or nitrogen, and is optionally benzofused, R2 C1-C^-AIkOXy oder N(Rc)2?R 2 C 1 -C ^ -AIkOXy or N (Rc) 2 ? R, Wasserstoff, Acyl öder durch C-, -C^ Alkoxycarbonyl substituiertes C2-Ci-Alkenyl,R, hydrogen, acyl or C 2 -Ci-alkenyl substituted by C-, -C ^ alkoxycarbonyl, R^ Acyl oder durch Cj-C^-Alkoxy substituiertes C2-C^- Alkenyl und R ^ acyl or C 2 -C ^ alkenyl substituted by Cj-C ^ -alkoxy and Rc Wasserstoff oder C^-Cr-Alkyl bedeuten, trägergebundene, proteolytische Enzyme in einem zweipha.sigem Medium, bestehend aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel einwirken läßt, die unveränderten D-Verbindungen von den L-Verbindungen der FormelRc denotes hydrogen or C ^ -Cr-alkyl, Carrier-bound, proteolytic enzymes in a two-phase medium consisting of water and allows a water-immiscible solvent to act, the unchanged D-compounds of the L compounds of the formula R1-CH-COOHR 1 -CH-COOH R3
Le A 19 803 R 3
Le A 19 803 R3 R4 R 3 R 4 0300827057003008270570 worin R1, R^ und R^ die vorstehend genannte Bedeutung haben, abtrennt und die voneinander getrennten D- und L-Verbindungen gegebenenfalls in üblicher Weise in Verbindungen der Formel 1, worin R2 Hydroxy und R^ und R^ Wasserstoff bedeuten, überführt.in which R 1 , R ^ and R ^ are as defined above, and the separated D and L compounds are optionally converted in the customary manner into compounds of the formula 1 in which R 2 is hydroxy and R ^ and R ^ are hydrogen . 4- Verfahren nach Anspruch 3 ι dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Subtilisin, oC-Chymotrypsin, Papain, Ficin oder Bromelain einsetzt.4- The method according to claim 3 ι characterized in that the enzyme used is subtilisin, oC-chymotrypsin, papain, ficin or bromelain. 5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als wasser-nicht-mischbares Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform, Toluol, Benzol, Essigsäureethylester, Petrolether, Methylisobutylketon oder Isobutanol einsetzt.5. The method according to claim 3 »characterized in that the water-immiscible solvent is methylene chloride, chloroform, toluene, benzene, ethyl acetate, Petroleum ether, methyl isobutyl ketone or isobutanol is used. 6. Verfahren nach Anspruch 3/ dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger des Enzyms Cellulosen, derivatisierte Cellulosen, amino- oder hydroxyIgruppenhaltxge PoIyacrylamidgele.oder durch Amino- oder Hydroxylgruppen modifizierte Anhydridharze einsetzt.6. The method according to claim 3 / characterized in that celluloses are derivatized as a carrier of the enzyme Celluloses, polyacrylamide gels containing amino or hydroxyl groups, or anhydride resins modified by amino or hydroxyl groups are used. 7. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Zwischenprodukte zur Herstellung optisch reiner acylierter ß-Lactamantibiotika.7. Use of the compounds according to claim 1 as intermediates for the production of optically pure acylated ß-lactam antibiotics. Le A 19 803Le A 19 803 030062/0570030062/0570
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