DE2855698C2

DE2855698C2 -

Info

Publication number: DE2855698C2
Application number: DE19782855698
Authority: DE
Inventors: Tadakazu Kyoto Jp Suyama
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1978-12-22
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1988-07-21
Also published as: DE2855698A1

Description

Die aus Menschenurin isolierte Urokinase katalysiert die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin. Plasmin seinerseits bewirkt die Proteolyse des Fibrins und vermindert die Faktor-V- und -VIII-Aktivität. Urokinase wird aus menschlichem Urin oder Nierenzellenkulturen isoliert und nach üblichen Methoden gereinigt; vgl. DE-AS 25 02 095. Gereinigte Urokinase wird klinisch zur Therapie von peripheren arteriellen und venösen Thrombosen und in Kombination mit Karzinostatika zur unterstützenden Behandlung maligner Neoplasien verwendet.The urokinase isolated from human urine catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin. Plasmin in turn causes proteolysis of fibrin and reduces it Factor V and VIII activity. Urokinase becomes human Urine or kidney cell cultures isolated and according to usual Methods cleaned; see. DE-AS 25 02 095. Cleaned Urokinase is used clinically to treat peripheral arterial and venous thrombosis and in combination with carcinostatics for supportive treatment malignant neoplasia used.

Die zur Zeit eingesetzten Urokinasepräparate enthalten Urokinasen unterschiedlichen Molekulargewichts. Es sind zwei Arten von Urokinase bekannt, nämlich eine Urokinase mit einem Molekulargewicht von etwa 33 000 ± 10 000 und eine höhermolekulare Urokinase mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 ± 10 000. Diese Urokinasen liegen normalerweise im Gemisch vor und zeigen eine bestimmte Aktivität. Die Existenz von Urokinasen unterschiedlichen Molekulargewichts in den bekannten Urokinase präparaten ist vermutlich der Gegenwart von Isoenzymen, der Transformation zu Untereinheiten unter der Einwirkung von proteolytischen Enzymen im Urin oder anderen Substanzen oder der Zersetzung und Modifizierung während der Gewinnung aus Urin zuzuschreiben.The urokinase preparations currently used contain urokinases different molecular weight. There are two Types of urokinase known, namely a urokinase with a Molecular weight of approximately 33,000 ± 10,000 and a higher molecular weight Urokinase with a molecular weight of approximately 54,000 ± 10,000. These urokinases are usually present in the mixture and show a certain activity. The existence of urokinases different Molecular weight in the known urokinase is presumably the presence of isoenzymes that Transformation to subunits under the influence of proteolytic enzymes in urine or other substances or decomposition and modification during extraction Attributing urine.

Vermutlich besitzen Urokinasepräparate mit unterschiedlichem Molekulargewicht auch unterschiedliche physiologische Eigenschaften und Wirkungen. Bis jetzt gibt es jedoch nur wenige Veröffentlichungen über signifikante Unterschiede in der Wirkung bei in-vitro-Tests nach der Fibrinplattenmethode oder der Zweistufenmethode (vgl. Pharmaceuticals Research, Bd. 5 (1974), S. 295 bis 308), die allgemein zur Standardisierung der enzymatischen Aktivität von Urokinase präparaten angewendet werden. Bei der Verabfolgung von Urokinasepräparaten erfolgte deshalb die Standardisierung durch Einstellung der Gesamtaktivität nach dem in-vitro-Test. Mit anderen Worten, Urokinase wurde trotz der Unterschiede im Molekulargewicht unter der Annahme gegeben, daß seine physiologische Wirkung die gleiche ist, wenn die enzymatische Aktivität in vitro die gleiche ist.Presumably have urokinase preparations with different Molecular weight also has different physiological properties and effects. So far there are however, few publications on significant Differences in effect in in vitro tests after the Fibrin plate method or the two-step method (see Pharmaceuticals Research, Vol. 5 (1974), pp. 295 to 308), which generally refer to Standardization of the enzymatic activity of urokinase preparations are used. When administering Urokinase preparations were therefore standardized by adjusting the overall activity after the in vitro test. In other words, despite the urokinase Given differences in molecular weight assuming that its physiological effect is the same if the enzymatic activity in vitro is the same.

Der vorliegenden Erfindung vorausgehende Arbeiten haben gezeigt, daß ein signifikanter Unterschied zwischen der Aktivität der Urokinase in vitro und dem in vivo-Verhalten je nach dem Molekulargewicht besteht. Es wurde ferner untersucht, ob die enzymatische Aktivität in vitro genau der enzymatischen Aktivität in vivo entspricht, ob Urokinase unterschiedlichen Molekulargewichts die gleiche biologische Wirkung in vivo zeigt, und ob ein anderer enzymologischer Unterschied je nach dem Molekulargewicht besteht. Diese Untersuchungen führten zu folgenden überraschenden Befunden: Es besteht ein ziemlich großer Unterschied hinsichtlich der thrombolytischen Aktivität zwischen Urokinaseproben, die auf die gleiche Aktivität eingestellt worden sind, bezogen auf die nach der Zweistufenmethode oder anderen in-vitro-Tests bestimmten enzymatischen Aktivität. Ferner besteht eine bestimmte Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der thrombolytischen Aktivität der Urokinase. Urokinase mit dem höheren Molekulargewicht zeigt eine höhere thrombo lytische Wirkung, selbst wenn die nach der Zweistufenmethode oder anderen in vitro-Methoden bestimmte Aktivität die gleiche ist. Schließlich wurde festgestellt, daß die Urokinase mit höherem Molekulargewicht auch eine bessere Haltbarkeit besitzt.Work preceding the present invention has shown that a significant difference between the activity the urokinase in vitro and the in vivo behavior ever according to the molecular weight. It was also investigated whether the enzymatic activity in vitro is exactly that enzymatic activity in vivo corresponds to whether urokinase different molecular weight the same biological Effect in vivo shows, and whether another enzymological There is a difference depending on the molecular weight. These Investigations led to the following surprising findings: There is quite a big difference in terms of thrombolytic activity between urokinase samples, which have been set to the same activity on the two-step method or other in vitro tests certain enzymatic activity. There is also a certain relationship between the molecular weight and the thrombolytic activity of urokinase. Urokinase with the higher molecular weight shows a higher thrombo lytic effect, even if according to the two-step method or other in vitro methods determined activity same thing. Finally it was found that urokinase with higher molecular weight also better durability owns.

Zu diesem Zweck wurden u. a. folgende Versuche durchgeführt:For this purpose u. a. carried out the following experiments:

Gruppen von Beagle-Hunden wird intravenös Urokinase mit höherem Molekulargewicht (54 000) und Urokinase mit niederigerem Molekulargewicht (33 000) gegeben. Die Urokinasepräparate sind jeweils mit ¹²⁵J markiert. Sodann wird der Abfall der Aktvität jeder Urokinase im Blut bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Urokinase mit höherem Molekulargewicht länger im Blut verbleibt und ihre Halbwertszeit etwa doppelt so groß ist wie die Urokinase mit niedrigerem Molekulargewicht.Groups of beagle dogs are given intravenous urokinase higher molecular weight (54,000) and urokinase with lower Given molecular weight (33,000). The urokinase preparations are each marked with ¹²⁵J. Then the Decrease in the activity of each urokinase in the blood. It the urokinase was found to be of higher molecular weight stays in the blood longer and their half-life is about twice as large as the urokinase with lower molecular weight.

In Fig. 1 ist die Beziehung zwischen dem pH-Wert einer wäßrigen Urokinaselösung und dem Verhältnis der verbleibenden Aktivität wiedergegeben. Fig. 2 zeigt die Abnahme der mit ¹²⁵J markierten Urokinasen mit unterschiedlichem Molekulargewicht im Blut von Beagle-Hunden nach intravenöser Injektion. Fig. 1 shows the relationship between the pH of an aqueous urokinase solution and the ratio of the remaining activity. Fig. 2 shows the decrease in ¹²⁵J marked urokinases with different molecular weights in the blood of beagle dogs after intravenous injection.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein stabiles Urokinasepräparat zur Verfügung zu stellen, das als Haupt bestandteil eine Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 enthält, und das als wirksames Fibrinolytikum und Thrombolytikum eingesetzt werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.The invention is therefore based on the object of being stable Urokinase preparation to provide that as the main component of a urokinase with a molecular weight of Contains 54,000 ± 10,000, and that as an effective fibrinolytic and Thrombolytic can be used. This task will solved according to the invention.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen 1 und 3 gekennzeichneten Gegenstand. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung nach Anspruch 1. The invention thus relates to that in claims 1 and 3 featured item. Claim 2 calls an embodiment of the invention according to claim 1.

Die Gewinnung eines Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 enthaltenden Präparats ist nicht auf ein spezielles Ausgangsverfahren beschränkt, wenn es nicht auf die Ausbeute ankommt. Die Urokinase kann in üblicher Weise aus Menschenurin durch Abtrennen, Konzentrieren und Reinigen gewonnen werden. Rohe Urokinase wird zunächst nach üblichen Methoden durch Behandlung mit Ionenaustauschern, speziellen Adsorptionsmitteln oder Sepharose 4B stark gereinigt. Zur weiteren Reinigung wird die Urokinase einer Behandlung unterworfen, um ein Enzym mit dem vorgeschriebenen Molekulargewicht abzutrennen und zu isolieren, beispielsweise der Fraktionierung durch Gelfiltration, der Chromatographie an Ionenaustauschern, der Affinitätschromatographie oder fraktionierenden Fällung.Obtaining a urokinase with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 containing preparation is not on one special initial process, if not limited to the yield arrives. The urokinase can be derived from human urine in the usual way obtained by separating, concentrating and cleaning will. Raw urokinase is first made using standard methods by treatment with ion exchangers, special adsorbents or Sepharose 4B heavily cleaned. For further Purification is subjected to treatment to urokinase to separate an enzyme with the prescribed molecular weight and isolate, for example by fractionation Gel filtration, chromatography on ion exchangers, Affinity chromatography or fractional precipitation.

In der Praxis wird die Gelfiltration bevorzugt. Beispiele für geeignete Adsorptionsmittel zur Gelfiltration sind vernetzte Dextrangele, Polyacrylamidgele und Agarosegele, die zur Behandlung von Substanzen von einem Molekulargewicht von 1000 bis 150 000 geeignet sind. Das Filtermaterial wird in eine Säule eingefüllt und mit einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt und einem pH-Wert von 5,5 bis 9,5 äquilibriert. Aus der Säule wird Urokinase mit einer wäßrigen Lösung eluiert, und die Urokinasefraktion mit einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 wird aufgefangen. Zur Verbesserung der Ausbeute wird in jeder Behandlungsstufe der pH-Wert der wäßrigen Urokinaselösung im Bereich von 5,5 bis 12 gehalten, insbesondere während der Dialysestufe zur Abtrennung von Salzen. Unter diesen Bedingungen wird eine Urokinase mit guter Stabilität und einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 erhalten. Dies geht aus dem nachstehenden Versuchsbeispiel 1 hervor.In practice, gel filtration is preferred. Examples for suitable adsorbents for gel filtration cross-linked dextran gels, polyacrylamide gels and agarose gels, those for the treatment of substances of a molecular weight from 1000 to 150,000 are suitable. The filter material is filled into a column and with a buffer solution with low salinity and a pH of 5.5 equilibrated to 9.5. The column becomes urokinase an aqueous solution, and the urokinase fraction with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 is collected. To improve the yield is in each treatment stage the pH of the aqueous urokinase solution kept in the range of 5.5 to 12, especially during the dialysis stage for the separation of salts. Under these A urokinase with good stability and one conditions Obtained molecular weight of 54,000 ± 10,000. This goes out experimental example 1 below.

Experimental example 1 Relationship between pH and ratio of the remaining Urokinase activity and molecular weight distribution

Urokinase, die aus Menschenurin durch Adsorption Kieselgel isoliert worden ist, wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Extraktlösung wird auf eine Urokinaseaktivität von 9800 IE eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 40 Stunden bei 4°C gegen Wasser, eine 1 molare Natriumacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 11,0, oder 12,0 oder eine 1/15 molare Phosphatpufferlösung dialysiert. Die äußere Flüssigkeit wird in Zeitabständen von 8 Stunden erneuert. Nach beendeter Dialyse wird das Verhältnis der verbleibenden Aktivität und die Molekulargewichtsverteilung durch Gelfiltration bestimmt. Das Verhältnis der verbleibenden Aktivität und die Molekulargewichtsverteilung der Urokinase-Fraktionen, bezogen auf Standardproben mit bekanntem Molekulargewicht, sind in Tabelle I zusammengefaßt. Urokinase derived from human urine by adsorption Silica gel has been isolated with ammonium sulfate fractionated. The extract solution is indicated for urokinase activity set from 9800 IU. The solution obtained is 40 hours at 4 ° C against water, a 1 molar sodium acetate buffer solution pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 11.0, or 12.0 or a 1/15 molar phosphate buffer solution dialyzed. The external fluid is at intervals renewed by 8 hours. After dialysis has ended the ratio of remaining activity and the molecular weight distribution by gel filtration certainly. The ratio of the remaining activity and the molecular weight distribution of the urokinase fractions, based on standard samples with known molecular weight, are summarized in Table I.

Tabelle I Table I

Urokinasepräparate aus Menschenurin können durch pathogene Viren verunreinigt sein. Deshalb muß Urokinase in an sich bekannter Weise 8 bis 12 Stunden auf 50 bis 70°C erhitzt werden, um Viren zu inaktivieren. Während dieser Wärmebehandlung ist es zweckmäßig, die wäßrige Urokinaselösung mit einer Pufferlösung mit einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,3 molar auf einen pH-Wert von 6 bis 8 einzustellen, um die Urokinase zu stabilisieren. Eine besonders gute Stabilisierung gegen Wärme wird durch Zusatz eines Proteins, einer Aminosäure, eines Saccharids oder eines Neutralsalzes zusätzlich zur pH-Werteinstellung erreicht.Urokinase preparations from human urine can be caused by pathogenic viruses may be contaminated. Therefore urokinase in a known manner 8 to 12 hours at 50 to 70 ° C. be heated to inactivate viruses. During this Heat treatment is useful, the aqueous urokinase solution with a buffer solution with a salt concentration from 0.01 to 0.3 molar to a pH of 6 to 8, to stabilize urokinase. A special one good stabilization against heat is achieved by adding a Protein, an amino acid, a saccharide or one Neutral salt achieved in addition to pH adjustment.

Bevorzugte Beispiele für Wärmestabilisatoren sind Glykokoll, Lysin, Arginin, Saccharose, Mannit, Natriumchlorid, Albumin und Gelatine.Preferred examples of heat stabilizers are Glycocoll, lysine, arginine, sucrose, mannitol, sodium chloride, Albumin and gelatin.

Die spezifische Aktivität der Urokinase beträgt vorzugsweise mindestens 200, insbesondere mindestens 1000 IE/mg. Diese Werte sind allerdings nicht kritisch. Der Anteil an der Urokinase in der zu erhitzenden Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0,001 bis 5 Gew.-%/Volumen, vorzugsweise 0,01 bis 1 Gew.-%/Volumen, ausgedrückt durch den Proteingehalt. Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung wird vorzugsweise mit einer Phosphatpufferlösung einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,3 molar auf 6 bis 8 einge stellt.The specific activity of urokinase is preferably at least 200, in particular at least 1000 IU / mg. However, these values are not critical. The share of the urokinase in the solution to be heated generally lies in the range of 0.001 to 5% by weight / volume, preferably 0.01 to 1% by weight / volume through the protein content. The pH of the solution to be heated is preferably with a phosphate buffer solution Salt concentration from 0.01 to 0.3 molar to 6 to 8 poses.

Die Wärmestabilisatoren werden im allgemeinen in folgenden Mindestmengen verwendet:The heat stabilizers are generally described in the following Minimum quantities used:

5% bei Glucose, Saccharose und Mannit;
0,1 molar bei Lysin und Arginin;
0,15 molar bei Natriumchlorid und
0,1% bei Albumin und Gelatine.5% for glucose, sucrose and mannitol;
0.1 molar for lysine and arginine;
0.15 molar for sodium chloride and
0.1% for albumin and gelatin.

Bei Verwendung geringerer Mengen an Wärmestabilisator geht die Wirkung allmählich verloren. Hinsichtlich der Höchstmenge der zu verwendenden Wärmestabilisatoren bestehen keine Be schränkungen, abgesehen von dem erhöhten Aufwand der Abtrennung des Stabilisators aus dem Präparat.If smaller amounts of heat stabilizer are used the effect gradually lost. Regarding the maximum amount of the heat stabilizers to be used do not exist restrictions, apart from the increased effort of the separation the stabilizer from the preparation.

Die Temperatur der Wärmebehandlung zur Inaktivierung von Viren liegt bei 50 bis 70°C, vorzugsweise 55 bis 65°C, und die Erhitzungszeit beträgt 8 bis 12, vorzugsweise 9 bis 11 Stunden. Die hitzebehandelte Urokinase wird durch Dialyse von Salzen und Wärmestabilisatoren befreit. Die erhaltene hochgereinigte Urokinase wird zur Herstellung von Arznei präparaten in Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet.The temperature of the heat treatment to inactivate Viruses is at 50 to 70 ° C, preferably 55 to 65 ° C, and the heating time is 8 to 12, preferably 9 to 11 hours. The heat treated urokinase is dialysis freed from salts and heat stabilizers. The received highly purified urokinase is used to manufacture medicinal products preparations filled into ampoules and freeze-dried.

Zur Bestimmung der Wirkung des Erhitzens auf die Infektiosität von Viren, die möglicherweise in Urokinasepräparaten vorliegen können, werden Versuche in Gegenwart und Abwesenheit von Wärmestabilisatoren durchgeführt. Der wäßrigen Urokinaselösung werden Pockenvirus, Mumpsvirus, Masernvirus, vesikuläres Stomatitisvirus, Chikungunyavirus, japanisches Encephalitisvirus, Hepatitis B-Virus, Rötelnvirus, Poliovirus, Coxsackievirus und Echovirus zugegeben. Die Wärmebehandlung wird 10 Stunden bei 60°C durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wird die verbleibende Infektiosität bestimmt. Innerhalb 10 Stunden geht die Infektiosität vollständig verloren, gleichgültig, ob ein Wärmestabilisator vorliegt oder nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse ist zu vermuten, daß die Wärmebehandlung auch andere Viren als die vorgenannten Viren inaktiviert.To determine the effect of heating on infectivity viruses that may be present in urokinase preparations experiments in the presence and absence of Heat stabilizers performed. The aqueous urokinase solution pox virus, mumps virus, measles virus, vesicular Stomatitis virus, chikungunya virus, Japanese encephalitis virus, Hepatitis B virus, rubella virus, poliovirus, coxsackievirus and added echovirus. The heat treatment will Performed at 60 ° C for 10 hours. Periodically the remaining infectivity is determined. Within 10 hours the infectivity is completely lost, indifferent, whether there is a heat stabilizer or not. Because of These results suggest that the heat treatment also inactivates viruses other than the aforementioned viruses.

Experimental example 2 Dependence of the stability of urokinase during heat treatment of the pH

Eine wäßrige Urokinaselösung (spezifische Aktivität 15 000 IE/mg; Proteinkonzentration 0,02 Gew.-%/Volumen) wird in verschiedenen Konzentrationen mit einer Phosphatpufferlösung versetzt. Es werden auf diese Weise Pro ben von Urokinaselösungen mit einem pH-Wert von 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 hergestellt. Jede Probe wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt. Sodann wird die verbleibende Aktivität gemessen. Nach der Wärmebehandlung wird der Wärmestabilisator durch Dialyse abgetrennt und die Urokinaseaktivität gemessen, um das Verhältnis der verbleibenden Aktivität zu bestimmen. Die spezifische Aktivität vor dem Erhitzen wird zu 100% angenommen. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß die Urokinaselösungen bei einem pH-Wert von 6, 7 und 8, 52%, 65% bzw. 50% der anfänglichen Aktivität aufweisen. Dies zeigt, daß die Einstellung der wäßrigen Urokinaselösung auf einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 besonders günstig ist.An aqueous urokinase solution (specific activity 15,000 IU / mg; protein concentration 0.02% by weight / volume) is mixed with a phosphate buffer solution in various concentrations. In this way, samples of urokinase solutions with a pH of 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 are produced. Each sample is heated to 60 ° C for 10 hours. The remaining activity is then measured. After the heat treatment, the heat stabilizer is removed by dialysis and the urokinase activity is measured to determine the ratio of the remaining activity. The specific activity before heating is assumed to be 100%. From Fig. 1 it can be seen that the urokinase solutions at pH 6, 7 and 8 have 52%, 65% and 50% of the initial activity, respectively. This shows that the adjustment of the aqueous urokinase solution to a pH in the range from 6 to 8 is particularly favorable.

Experimental example 3 Effect of heat stabilizers

In diesem Beispiel wird die Wirkung verschiedener Wärmestabilisatoren bestimmt. Nach der Wärmebehandlung wird der Wärmestabilisator durch Dialyse abgetrennt und das Verhältnis der verbleibenden Aktivität bestimmt, wobei die spezifische Aktivität vor der Wärmebehandlung zu 100% angenommen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Als Viren werden ebenso wie in Versuchsbeispiel 1 die vorstehend genannten Viren verwendet.In this example the effect of different heat stabilizers certainly. After the heat treatment, the Heat stabilizer separated by dialysis and the ratio the remaining activity is determined, with the specific 100% activity assumed prior to heat treatment becomes. The results are summarized in Table II. As Viruses become the same as in Experimental Example 1 mentioned viruses used.

Im Kontrollversuch (1) wird kein Wärmestabilisator verwendet und der pH-Wert der wäßrigen Urokinaselösung wird mit 0,1 molarer Phosphatpufferlösung auf 6,8 eingestellt. Im Kontrollversuch (2) wird die wäßrige Urokinaselösung nicht mit Phosphatpufferlösung versetzt. Deshalb ist der pH-Wert der Lösung nicht auf einen bestimmten Wert eingestellt. Die verbleibende Urokinaseaktivität beträgt 65 bis 75%, 78% bzw. 79% bei Verwendung von Glykokoll, Lysin bzw. Arginin, 75 bis 78%, 78% und 71 bis 75% bei Verwendung von Gauchanose, Mannit bzw. Natriumchlorid und 88 bis 100% bei Verwendung von Gelatine. Dies zeigt, daß sämtliche Substanzen wirksame Wärmestabilisatoren sind. Eine auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellte wäßrige Urokinaselösung behält 65% der anfänglichen Aktivität in Abwesenheit eines Wärmestabilisators bei. Dies zeigt, daß die Einstellung der wäßrigen Urokinaselösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eine günstige Wirkung auf die Stabilisierung der Aktivität hat.In the control experiment ( 1 ), no heat stabilizer is used and the pH of the aqueous urokinase solution is adjusted to 6.8 with 0.1 molar phosphate buffer solution. In the control experiment ( 2 ), the aqueous urokinase solution is not mixed with phosphate buffer solution. Therefore the pH of the solution is not adjusted to a specific value. The remaining urokinase activity is 65 to 75%, 78% and 79% when using glycocoll, lysine or arginine, 75 to 78%, 78% and 71 to 75% when using gauchanose, mannitol or sodium chloride and 88 to 100 % when using gelatin. This shows that all substances are effective heat stabilizers. An aqueous urokinase solution adjusted to pH 6.8 retains 65% of the initial activity in the absence of a heat stabilizer. This shows that adjusting the aqueous urokinase solution to a pH of 6 to 8 has a favorable effect on stabilizing the activity.

Tabelle II Table II

Mit Urokinase eines Molekulargewichts von 54 000 ± 10 000 werden Untersuchungen zur Bestimmung der thrombolytischen Aktivität, der Halbwertzeit im Blut nach intravenöser Gabe, Stabilität, Toxizität, Dosis und Verabreichungsart in vitro und in vivo durchgeführt. Die Versuchsmethodik und die Ergebnisse sind nachstehend beschrieben.With urokinase with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 are investigations to determine the thrombolytic Activity, the half-life in the blood after intravenous administration, Stability, toxicity, dose and mode of administration in vitro and performed in vivo. The experimental methodology and the results are described below.

Experimental example 4 Determination of thrombolytic activity by the method by Chandler

Gereinigte Urokinase wird zu Fraktionen mit Molekulargewichten von 33 000 ± 10 000 (hauptsächlich 33 000), 54 000 ± 10 000 (hauptsächlich 54 000) und etwa 100 000 fraktioniert. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000 wird nur in sehr geringer Menge gefunden. Sie scheint aus einem Assoziat von Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 zu bestehen. Die Gewinnung dieser Fraktion aus Urin ist technisch zu aufwendig. Jede Fraktion wird in physiologischer Kochsalzlösung zu Proben unterschiedlicher Aktivität gelöst:Purified urokinase becomes fractions with molecular weights of 33,000 ± 10,000 (mainly 33,000), 54,000 ± 10,000 (mainly 54,000) and about 100,000 fractionated. The fraction with a molecular weight of approximately 100,000 is found only in very small quantities. It appears an associate of urokinase with a molecular weight to exist of 54,000. Obtaining this fraction from Technically, urine is too expensive. Each faction is in physiological saline to different samples Activity solved:

Probe (1) 18,75 IE/ml;
Probe (2) 37,5 IE/ml;
Probe (3) 75,0 IE/ml;
Probe (4) 150 IE/ml;
Probe (5) 300 IE/ml, Kontrollprobe mit physiologischer Koch salzlösung.Sample (1) 18.75 IU / ml;
Sample (2) 37.5 IU / ml;
Sample (3) 75.0 IU / ml;
Sample (4) 150 IU / ml;
Sample (5) 300 IU / ml, control sample with physiological saline.

Die Aktivität in Internationale Einheiten wird nach der Zweistufen-Methode in vitro bestimmt. Das zu untersuchende Urokinasepräparat wird mit greinigtem Plasminogen als Substrat unter Bildung von Plasmin umgesetzt. Sodann wird als sekundäres Substrat Fibrin durch das Plasmin abgebaut. Die Aktivität wird aus der Auflösungszeit des Fibrins bestimmt; vgl. Pharmaceuticals Research, Bd. 5 (1974), S. 295 bis 308. Die Beziehung zwischen Internationale Einheiten und den üblichen Plough Units (vgl. B.B.A., Bd. 24 (1975), S. 278 bis 282) ist wie folgt: 5000 Plough Units = 6000 IE. The activity in International Units will start after the Two-step method determined in vitro. The one to be examined Urokinase preparation is used with purified plasminogen Implemented substrate to form plasmin. Then will as a secondary substrate fibrin is broken down by the plasmin. The activity is determined from the dissolution time of the fibrin; see. Pharmaceuticals Research, Vol. 5 (1974), p. 295 to 308. The relationship between international units and the usual plow units (see B.B.A., Vol. 24 (1975), pp. 278 to 282) is as follows: 5000 plow units = 6000 IU.

Die Bildung des Thrombus und die Bestimmung des Auflösungsver hältnisses werden folgendermaßen durchgeführt:The formation of the thrombus and the determination of the dissolution ver Relationships are carried out as follows:

In einen Plastikschlauch mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 270 mm werden 1 ml frisches Blut abgefüllt, das 3,8% eines Citrats und 0,1 ml 0,25 molare Calcium chloridlösung enthält, und es wird eine endlose Schleife gebildet. Durch 30minütiges Drehen der Schleife bei 37°C und 12 U/min entsteht ein Thrombus. In die Schleife wird eine Probe der Urokinaselösungen bzw. die Kontrollprobe injiziert. Sodann wird die Schleife erneut 4 Stunden bei 37°C und 12 U/min gedreht. Danach wird der restliche Thrombus aus dem Schlauch entnommen und während 15 bis 18 Stunden mit Bovin's-Lösung fixiert. Diese Lösung wird durch Vermischen von 75 ml einer gesättigten wäßrigen Pikrinsäurelösung mit 25 ml technischer Formaldehydlösung und 5 ml Eisessig hergestellt. Es wird das Gewicht des Thrombus bestimmt, um die Beziehung zwischen dem IE-Wert, dem Molekulargewicht und der thrombolytischen Aktivität zu untersuchen. Die thrombolytische Aktivität der Urokinase wird ausgedrückt durch das Gewichtsverhältnis des durchschnittlichen Thrombusgewichts der Urokinase enthaltenen Gruppe zum durchschnittlichen Thrombusgewicht der Kontrollgruppe (physiologische Kochsalzlösung). Dieses Verhältnis wird nachstehend als das thrombolytische Verhältnis (in %) bezeichnet. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle III zusammengefaßt.In a plastic tube with an inner diameter of 3 mm and a length of 270 mm, 1 ml of fresh blood are filled, the 3.8% of a citrate and 0.1 ml of 0.25 molar calcium contains chloride solution, and an endless loop is formed. By Turning the loop for 30 minutes at 37 ° C and 12 rpm creates a thrombus. A sample of the urokinase solutions or the Control sample injected. Then the loop again Rotated for 4 hours at 37 ° C and 12 rpm. Then the remaining thrombus removed from the tube and during Fixed with Bovin's solution for 15 to 18 hours. This solution is made by mixing 75 ml of a saturated aqueous Picric acid solution with 25 ml technical formaldehyde solution and 5 ml of glacial acetic acid. It will be the weight of the Thrombus determines the relationship between the IE value, the To investigate molecular weight and thrombolytic activity. The thrombolytic activity of urokinase becomes expressed by the weight ratio of the average Thrombus weight of the group containing urokinase average thrombus weight of the control group (physiological saline). This ratio is shown below referred to as the thrombolytic ratio (in%). The values obtained are summarized in Table III.

Tabelle III Table III

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 eine ausgezeichnete thrombolytische Aktivität besitzt, während Urokinase mit einem Molekularge wicht von 33 000 eine wesentlich niedrigere thrombolytische Aktivität aufweist. Die Bestimmung der thrombolytischen Ak tivität nach der Methode von Chandler wird zwar in vitro durchgeführt, doch ist sie als einfaches und zweckmäßiges Bestimmungsverfahren anerkannt, die einem in vivo Test nahekommt; vgl. J. Exp. Physiol., Bd. 44 (1959), S. 377 bis 384. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen die überraschende Tatsache, daß Urokinase-Präparate, die nach den herkömmlichen Bestimmungsmethoden die gleiche Aktivität aufweisen, je nach dem Molekulargewicht der Urokinase eine unterschiedliche thrombolytische Aktivität zeigen.From Table III it can be seen that urokinase with a molecular weight out of 54,000 an excellent thrombolytic Has activity while urokinase with a molecular gene important of 33,000 a much lower thrombolytic Has activity. Determination of thrombolytic Ak activity according to the Chandler method is in vitro performed, but it is as simple and convenient Determination method recognized that comes close to an in vivo test; see. J. Exp. Physiol., Vol. 44 (1959), pp. 377 to 384. The above results show the surprising fact that urokinase preparations according to the conventional Determination methods have the same activity, depending on a different molecular weight of urokinase Show thrombolytic activity.

Experimental example 5 Thrombolytic effects in rats

Nach der Methode von Y. Sasaki (Thrombosis Res., Bd. 9 (1976), S. 513) und R. N. Chakravart (Atherosclerosis, Bd. 21 (1975), S. 349) wird die fibrinolytische Wirkung von Urokinase an Ratten bestimmt.According to the method of Y. Sasaki (Thrombosis Res., Vol. 9 (1976), p. 513) and R.N. Chakravart (Atherosclerosis, Vol. 21 (1975), p. 349) the fibrinolytic effect of Urokinase determined in rats.

Nach der Methode von Greenwood et al., Biochem. J., Bd. 89 (1963), S. 114, wird menschliches Fibrinogen mit ¹²⁵J markiert. 4 ml einer 0,4prozentigen ¹²⁵J-Fibrinogenlösung werden mit 200 IE humanen Thrombin vermischt und etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Es bildet sich Fibrin. Nach ausreichendem Entfernen des Wassers mit Filterpapier wird das Fibrin gründlich mit physiologischer Koch salzlösung auf einem Filterpapier gewaschen. Das Filterpapier mit dem Fibrin wird in kleine Stücke zerschnitten, mit 4 ml physiologischer Kochsalzlösung vermischt und zu einer Dispersion von ¹²⁵J-Fibrin mit einem Teilchendurchmesser von 5 bis 10 µ zerkleinert. Der Fibringehalt der Dispersion beträgt 12 mg/ml auf feuchter Basis, und die ¹²⁵J-Radioaktivität hat eine Zählrate von 2,93 × 10⁶/min. According to the method of Greenwood et al., Biochem. J., Vol. 89 (1963), p. 114, human fibrinogen is labeled with ¹²⁵J. 4 ml of a 0.4 percent ¹²⁵J fibrinogen solution mixed with 200 IU human thrombin and about 60 minutes left at room temperature. It forms Fibrin. After sufficient removal of the water with filter paper the fibrin is thoroughly cooked with physiological saline solution washed on a filter paper. The filter paper with the fibrin is cut into small pieces, with Mix 4 ml of physiological saline and make one Dispersion of ¹²⁵J fibrin with a particle diameter crushed from 5 to 10 µ. The fibrin content of the dispersion is 12 mg / ml on a wet basis, and the ¹²⁵J radioactivity has a counting rate of 2.93 × 10⁶ / min.

Männlichen Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 250 g wird durch die Schwanzvene 1 ml der erhaltenen Dispersion und sodann 30 000 IE Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 bzw. 33 000 injiziert. Sodann werden in regelmäßigen Zeitabständen jeweils 0,3 bis 0,5 ml Blut aus der Carotisarterie in ein Reagenzglas entnommen, das einen Tropfen Aprotininlösung (15 000 KIE/ml; ein Antiplasmin) enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Eine Menge von 0,05 ml des abgetrennten Serums wird auf Fibrinzersetzungsprodukte (FDP) durch Bestimmung der Radioaktivität untersucht. Die prozentuale Bildung von ¹²⁵J-FDP im Blut wird in Abhängigkeit von der Zeit aus dem Wert der Radioaktivität/ml Serum und der Gesamtmenge des kreisenden Serums (31,1 ml/kg) bestimmt, wobei die Radio aktivität des verabfolgten Fibrins zu 100% angenommen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.Male Wistar rats weighing 250 g is through the tail vein 1 ml of the dispersion obtained and then 30,000 IU urokinase with a molecular weight of 54,000 and 33,000 injected. Then be in regular Periods of 0.3 to 0.5 ml of blood from each Carotid artery taken from a test tube containing one Drops of aprotinin solution (15,000 KIE / ml; one antiplasmin) contains. The mixture is left to stand at room temperature for 2 hours. An amount of 0.05 ml of the separated serum is determined on fibrin decomposition products (FDP) by determination of radioactivity. The percentage formation of ¹²⁵J-FDP in the blood is dependent on the time from the Radioactivity / ml serum and total amount of circling serum (31.1 ml / kg), the radio activity of the administered fibrin is assumed to be 100%. The results are summarized in Table IV.

Tabelle IV Table IV

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß die hochmolekulare Urokinase FDP früher bildet als die Urokinase vom Molekulargewicht 33 000. Sowohl die Fibrinzersetzungsgeschwindigkeit als auch die Menge an FDP ist bei Verwendung von Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 höher.It can be seen from Table IV that the high molecular urokinase FDP forms earlier than urokinase of molecular weight 33,000. Both the rate of fibrin decomposition as well as the amount of FDP is when using urokinase of molecular weight 54,000 higher.

Die Ergebnisse zeigen, daß Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 in vivo eine höhere fibrinolytische und thrombolytische Aktivität zeigt. The results show that urokinase is of molecular weight 54,000 in vivo higher fibrinolytic and thrombolytic Activity shows.

Experimental example 6 Influence of the molecular weight on the decay of the activity the urokinase in the blood.

Urokinasepräparate unterschiedlichen Molekulargewichts werden nach Greenwood et al., a.a.O., mit ¹²⁵J markiert. Die markierten Urokinasepräparate werden Gruppen von Versuchstieren intravenös injiziert, und das Abklingen der Urokinaseaktivität im Blut wird verglichen.Urokinase preparations of different molecular weights according to Greenwood et al., op. cit., marked with ¹²⁵J. The labeled urokinase preparations become groups of experimental animals injected intravenously, and the decay of urokinase activity in the blood is compared.

Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 und einer spezifischen Aktivität von 100 000 IE/mg Protein sowie einem Molekulargewicht von 33 000 und einer spezifischen Aktivität von 160 000 IE/mg Protein werden mit ¹²⁵J nach der Chloramin T-Methode markiert; vgl. Biochem. J., Bd. 89 (1963), S. 114. Die markierte höhermolekulare Urokinase hat eine spezifische Radioaktivität (Zählrate) von 1,28 × 10⁷/min und pro mg Protein und die markierte Urokinase vom Molekulargewicht 33 000 hat eine spezifische Radioaktivität (Zählrate) von 2,24 × 10⁷/min und pro mg ProteinUrokinase with a molecular weight of 54,000 and one specific activity of 100,000 IU / mg protein and one Molecular weight of 33,000 and a specific activity of 160,000 IU / mg protein are ¹²⁵J after the Chloramine T method marked; see. Biochem. J., Vol. 89 (1963), p. 114. The labeled higher molecular urokinase has a specific radioactivity (count rate) of 1.28 × 10⁷ / min and per mg protein and the labeled urokinase of molecular weight 33,000 has a specific radioactivity (Counting rate) of 2.24 × 10⁷ / min and per mg protein

Als Versuchstiere werden pro Gruppe drei männliche Beagle- Hunde mit einem Körpergewicht von 12 bis 15 kg verwendet.Three male beagles per group Dogs weighing 12 to 15 kg are used.

Die markierten Urokinasen werden einer Dosis von 1000 IE/kg durch die Parotisvene injiziert. In regelmäßigen Zeitabständen werden jeweils 5 ml Blut aus der Vene der Vorderpfote mittels einer Spritze entnommen, die 0,5 ml einer 3,8prozentigen Natriumcitratlösung enthält. Das Plasma wird vom Blut durch Zentrifugieren abgetrennt und auf seine Radioaktivität mit einem Scintillationszähler untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt. Die Abkling kurve H der Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 im Blut verläuft flacher als die Kurve L der Urokinase vom Molekulargewicht 33 000. Die Halbwertzeit der Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 ist doppelt so groß wie die der Urokinase vom Molekulargewicht 33 000. The labeled urokinases are injected through the parotid vein at a dose of 1000 IU / kg. At regular intervals, 5 ml of blood are drawn from the vein of the front paw using a syringe containing 0.5 ml of a 3.8 percent sodium citrate solution. The plasma is separated from the blood by centrifugation and checked for radioactivity with a scintillation counter. The results are summarized in Fig. 2. The decay curve H of the urokinase with a molecular weight of 54,000 in the blood is flatter than the curve L of the urokinase with a molecular weight of 33,000. The half-life of the urokinase with a molecular weight of 54,000 is twice as long as that of the urokinase with a molecular weight of 33,000.

Experimental example 7 Molecular weight and stability of the enzymatic activity.

Unter Verwendung technischer Urokinase wird die Beziehung zwischen Molekulargewicht und der Stabilität der enzymatischen Aktivität untersucht. Die technische Urokinase wird zu Fraktionen vom Molekulargewicht 20 000, 33 000, 54 000 und 100 000 durch Gelfiltration an Sephadex G-75 unter Verwendung einer 70 millimolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 fraktioniert. Die Säule hat die Abmessungen 2,6 × 80 cm. Jede Fraktion wird auf 10 000 IE/ml eingestellt (wäßrige Lösung), bei 4°C oder -10°C aufbewahrt, und die Änderung der Aktivität mit der Zeit wird bestimmt. In Tabelle V ist die Zeit angegeben, bis die Aktivität auf 50% abgesunken ist.Using technical urokinase, the relationship between molecular weight and the stability of the enzymatic Activity examined. The technical urokinase is to fractions of molecular weight 20,000, 33,000, 54,000 and 100,000 by gel filtration on Sephadex G-75 using a 70 millimolar phosphate buffer solution from pH 8.0 fractionated. The column has the dimensions 2.6 × 80 cm. Each fraction is set at 10,000 IU / ml (aqueous solution), stored at 4 ° C or -10 ° C, and the change in activity over time is determined. Table V shows the time until the activity begins Has dropped 50%.

Tabelle V Table V

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 eine etwa dreimal größere Stabilität hat, als die Urokinase vom Molekulargewicht 33 000.From Table V it can be seen that the urokinase is of molecular weight 54,000 about three times greater stability has as the urokinase of molecular weight 33,000.

Experimental example 8 toxicity

Zur Bestimmung der Toxizität werden pro Versuchsgruppe 5 Mäuse bzw. 5 Meerschweinchen verwendet. Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 und einer Aktivität von 15 000 IE wird in 25 ml destilliertem Wasser gelöst. Jeder Maus bzw. jedem Meerschweinchen werden subkutan 0,5 bzw. 5 ml der Urokinaselösung injiziert. 7 Tage nach der Urokinasegabe sind noch keine Todesfälle zu beobachten. In diesem Fall beträgt die Urokinasemenge/Maus 300 IE und 3000 IE pro Meerschweinchen.To determine the toxicity, each test group 5 mice or 5 guinea pigs were used. Urokinase with a molecular weight of 54,000 and an activity of 15,000 IU is dissolved in 25 ml of distilled water. Everyone Mouse or each guinea pig is subcutaneously 0.5 or 5 ml of the urokinase solution injected. 7 days after urokinase administration no deaths have been observed yet. In this Case, the urokinase amount / mouse is 300 IU and 3000 IU per guinea pig.

Zur klinischen Verwendung werden 50 bis 30 000 IE des erfindungsgemäßen Urokinasepräparats in 0,5 bis 5 ml destilliertem Wasser gelöst und intravenös oder beispielsweise durch Tropf infusion, subkonjunktivale Injektion oder retrobulbäre Injektion ver abfolgt.For clinical use, 50 to 30,000 IU of the invention Urokinase preparation in 0.5 to 5 ml distilled Water dissolved and intravenously or, for example, by dripping infusion, subconjunctival injection or retrobulbar injection ver follows.

Das erfindungsgemäß hergestellte Urokinasepräparat enthält Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 als Hauptbestandteil mit gleichmäßigem Molekulargewicht, ausgezeichneter Haltbarkeit und hoher thrombolytischer und fibrinolytischer Aktivität.The urokinase preparation produced according to the invention contains Urokinase with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 as a main ingredient with uniform molecular weight, excellent durability and high thrombolytic and fibrinolytic activity.

Die Erfindung wird durch die Beispiele weiter erläutert.The invention is further illustrated by the examples.

Example 1

a) Frischer Urin von Männern wird auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. 5 Liter des erhaltenen Urins werden auf den Kopf einer Säule gegeben, die mit 50 ml L-Argininagarose gefüllt ist. Das Adsorptionsmittel ist vorher mit einer 2prozentigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 äquilibriert worden. Die Urokinase wird an dem Adsorptionsmittel adsorbiert. Sodann wird die Säule mit 100 ml einer 2prozentigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Hierauf wird die Urokinase mit 50 ml einer 1 molaren Kochsalzlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das Eluat wird auf etwa 10 ml eingeengt und sodann auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6 × 80 cm gegeben, die mit Sephadex G-75 gefüllt ist. Das Adsorptionsmittel ist vorher mit einer 70 millimolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden. Die Gelfiltration wird in einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/Std. mit der gleichen Pufferlösung durchgeführt, wie sie zur Äquilibrierung verwendet wird. Das Filtrat wird in 0,5 ml Fraktionen aufgefangen. Es werden die Fraktionen gesammelt, die Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 ± 10 000 enthalten. Die Fraktionen werden vereinigt, und das Molekulargewicht der Urokinase wird nach der vereinfachten Methode durch SDS-Elektrophorese an Polyacrylamidgel bestimmt; vgl. Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Bd. 26 (1972), S. 3. Bei der Elektrophorese zeigt sich ein einziger Peak, der dem Peak einer Standard-Urokinaseprobe mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 entspricht. Die wäßrige Lösung wird gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert und das Retentat gefriergetrocknet. Es wird ein Urokinasepräparat mit einer spezifischen Aktivität von 17 000 IE/mg erhalten.a) Fresh urine from men is adjusted to a pH of 7.2 set. 5 liters of the urine obtained are placed on the Head of a column given with 50 ml of L-arginine agarose is filled. The adsorbent is previously with a 2% saline solution equilibrated to pH 7.2 been. The urokinase is adsorbed on the adsorbent. Then the column with 100 ml of a 2 percent Washed saline with a pH of 7.5. This will the urokinase with 50 ml of a 1 molar saline solution pH 6.0 eluted. The eluate is concentrated to about 10 ml and then on a column of dimensions Given 2.6 × 80 cm, which is filled with Sephadex G-75. The adsorbent is previously 70 millimolar Phosphate buffer solution with a pH of 8.0 was equilibrated. Gel filtration is at a flow rate of 20 ml / hour performed with the same buffer solution, as used for equilibration. The filtrate is collected in 0.5 ml fractions. The factions collected the urokinase with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 included. The factions are united, and the molecular weight of urokinase is simplified according to the Method by SDS electrophoresis on polyacrylamide gel certainly; see. Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Vol. 26 (1972), p. 3. The electrophoresis shows up only peak that is the peak of a standard urokinase sample with a molecular weight of about 54,000. The aqueous solution is against physiological saline dialyzed and the retentate freeze-dried. It will be a Urokinase preparation with a specific activity of 17,000 IU / mg obtained.

b) Das gemäß a) erhaltene Urokinasepräparat (17 000 IE/mg) wird in 0,05 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst. Es werden 20 Liter einer wäßrigen Urokinaselösung (3000 IE/ml; Proteingehalt 0,02 Gewichtsprozent/Volumen) erhalten. Die Lösung wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt, sodann in Eiswasser abgekühlt, gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert und durch ein Bakterienfilter filtriert. Das Filtrat wird in 2 ml Anteile unterteilt und gefriergetrocknet. Es wird ein nicht-infektiöses Urokinasepräparat erhalten.b) The urokinase preparation obtained according to a) (17,000 IU / mg) is in 0.05 molar phosphate buffer solution with a pH of 7.0 solved. There will be 20 liters of an aqueous urokinase solution (3000 IU / ml; protein content 0.02% by weight / volume) receive. The solution is heated to 60 ° C for 10 hours, then cooled in ice water, against physiological saline dialyzed and filtered through a bacterial filter. The filtrate is divided into 2 ml portions and freeze-dried. It becomes a non-infectious urokinase preparation receive.

Example 2

Durch Auflösen von roher Urokinase (spezifische Aktivität 400 IE/mg) in 0,0075 molarer Natriumchloridlösung vom pH 7,0 wird eine wäßrige Urokinaselösung (10 000 IE/ml; Proteingehalt 2,5 Gew.-%) hergestellt. Diese Lösung wird auf eine mit 1 kg gepulvertem Bentonit gefüllte Säule aufgebracht. Die Säule wird vorher mit einer 0,0075 molaren Natriumchloridlösung vom pH 7,0 äquilibriert. Die Urokinase wird am Bentonit adsorbiert, Verunreinigungen werden nicht absorbiert und passieren die Säule.By dissolving raw urokinase (specific activity 400 IU / mg) in 0.0075 molar sodium chloride solution of pH 7.0 becomes an aqueous urokinase solution (10,000 IU / ml; Protein content 2.5% by weight). This solution will applied to a column filled with 1 kg of powdered bentonite. The column is previously with a 0.0075 molar Sodium chloride solution of pH 7.0 equilibrated. The urokinase is adsorbed on the bentonite, impurities are not absorbed and pass the column.

Zunächst wird die Säule mit 0,1 molarer Natriumchloridlösung pH 9,0 gewaschen, um restliche Verunreinigungen zu entfernen. Sodann wird die Urokinase mit einer wäßrigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-hydrat (2 Gew.-%) eluiert.First, the column with 0.1 molar sodium chloride solution pH 9.0 washed to remove residual contaminants to remove. Then the urokinase is mixed with an aqueous Solution of 6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate hydrate (2% by weight) eluted.

Die erhaltene Urokinaselösung wird gegen 0,1 molare Phosphatpufferlösung pH 6,8 dialysiert. Das Retentat wird mit 0,3 molarem Natriumchlorid gelöst in 0,1 molarer Phosphatpufferlösung versetzt, gerührt und 20 Stunden auf 60°C erhitzt. Die erhaltene Lösung wird gegen 0,0075 molare Natriumchloridlösung pH 7,0 dialysiert. Die erhaltene Urokinaselösung enthält etwa 70% der im Ausgangsmaterial vorhandenen Urokinase. Die Reinheit beträgt 11 000 IE/mg. Nach Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung wird die Urokinaselösung (d. h. das Retentat) durch einen Bakterienfilter filtriert. Das Filtrat wird in 2 ml Portionen unterteilt und gefriergetrocknet.The urokinase solution obtained is dialyzed against 0.1 molar phosphate buffer solution pH 6.8. The retentate is dissolved in 0.3 molar sodium chloride in 0.1 molar Phosphate buffer solution added, stirred and on for 20 hours Heated to 60 ° C. The solution obtained becomes about 0.0075 molar sodium chloride solution pH 7.0 dialyzed. The received Urokinase solution contains about 70% of that in the starting material existing urokinase. The purity is 11,000 IU / mg. After dialysis against physiological saline, the Urokinase solution (i.e. the retentate) through a bacterial filter filtered. The filtrate is divided into 2 ml portions and freeze-dried.

Ferner wird an einer Probe der erhaltenen Urokinaselösung das Molekulargewicht mittels SDS-Elektrophorese an einem Polyacrylamidgel nach Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Bd. 26 (1972), S. 3 bestimmt. Es zeigt sich ein einziger Peak, der einer Urokinase-Standardprobe mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 entspricht.Furthermore, a sample of the urokinase solution obtained the molecular weight by SDS electrophoresis on one Polyacrylamide gel according to Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Vol. 26 (1972), p. 3. There is only one Peak, which is a standard urokinase sample with a Molecular weight of about 54,000 corresponds.

Claims

1. Process for the preparation of a urokinase with a molecular weight of 54,000 ± 10,000 containing preparation from human urine or raw urokinase

(a) severing,
(b) Concentrate and
(c) Clean

characterized in that one

(d) the one in step
(c) obtained urokinase solution for 8 to 12 hours at a temperature of 50 ° to 70 ° C at a pH of 6 to 8 and
(e) dialyze the heat treated solution at pH 5.5 to 12.

2.A method according to claim 1, characterized in that one before the heat treatment of the aqueous urokinase containing solution glycocoll, lysine, arginine, sucrose, Mannitol, sodium chloride, albumin or gelatin as a heat stabilizer for urokinase.

3. Use of the preparation prepared according to claim 1 as a fibrinolytic and thrombolytic.