CH650273A5 - PLASMINOGENIC PREPARATION AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF. - Google Patents

PLASMINOGENIC PREPARATION AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF. Download PDF

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CH650273A5
CH650273A5 CH370/81A CH37081A CH650273A5 CH 650273 A5 CH650273 A5 CH 650273A5 CH 370/81 A CH370/81 A CH 370/81A CH 37081 A CH37081 A CH 37081A CH 650273 A5 CH650273 A5 CH 650273A5
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salt
plasminogen
concentration
lysine
physiologically compatible
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CH370/81A
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Yahiro Uemura
Katsuhiro Uriyu
Satoshi Funakoshi
Ryozo Watanabe
Mitsuomi Ohgaki
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Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Plasminogen-präparate zu entwickeln, die eine verbesserte Beständigkeit gegen Inaktivierung aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, dass bestimmte Verbindungen als Stabilisatoren für Plasminogen wirken, und dass derart stabilisierte Plasminogenpräparate auch einer Wärmebehandlung oder Gefriertrocknung widerstehen. The object of the invention is to develop plasminogen preparations which have an improved resistance to inactivation. This object is achieved by the invention. The solution to this problem is based on the surprising finding that certain compounds act as stabilizers for plasminogen, and that plasminogen preparations stabilized in this way also resist heat treatment or freeze-drying.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. The invention thus relates to the subject matter characterized in the claims.

Als Plasminogen enthaltende wässrige Lösungen können die verschiedensten Lösungen verwendet werden, beispielsweise Lösungen, die bei den verschiedenen bekannten Reinigungsverfahren aus plasminogenhaltigen Fraktionen anfallen, z.B. der Fraktion III, die bei der Alkoholfraktionierung bei niedriger Temperatur nach Cohn von Blutplasmaprotein anfällt, die allgemein zur Herstellung wichtiger biologischer Präparate, wie Serum, Plasma und Ascites menschlichen und tierischen Ursprungs anfallen, ferner z.B. Fibrinogen, Gammaglobulin und Albumin im Blutplasma. Das Plasminogen-Trockenpulver umfasst die Trockenpulver aus den vorstehend beschriebenen wässrigen Lösungen, insbesondere gefriergetrocknete Pulver. A wide variety of solutions can be used as plasminogen-containing aqueous solutions, for example solutions which are obtained from the plasminogen-containing fractions in the various known cleaning processes, e.g. Fraction III, which is obtained from Cohn's low temperature alcohol fractionation of blood plasma protein, which is generally used to produce important biological preparations such as serum, plasma and ascites of human and animal origin, and also e.g. Fibrinogen, gamma globulin and albumin in the blood plasma. The plasminogen dry powder comprises the dry powders from the aqueous solutions described above, in particular freeze-dried powders.

Typische Beispiele für Verfahren zur Reinigung von rohem Plasminogen sind Verfahren unter Verwendung eines fixierten Plasminogenstabilisators (JP-OS 153 592/1980) und die Verwendung von Lysin-Sepharose; vgl. Science, Bd. 170, (1970), S. 1095. Typical examples of processes for the purification of crude plasminogen are processes using a fixed plasminogen stabilizer (JP-OS 153 592/1980) and the use of lysine-Sepharose; see. Science, Vol. 170, (1970), p. 1095.

Als Plasminogenstabilisatoren werden erfindungsgemäss physiologisch verträgliche anorganische Salze, Lysin und dessen Salze, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verwendet. Diese Stabilisatoren können allein oder in Kombination verwendet werden. According to the invention, physiologically compatible inorganic salts, lysine and its salts, phenylmethanesulfonyl fluoride, aprotinin and soybean trypsin inhibitor are used as plasminogen stabilizers. These stabilizers can be used alone or in combination.

Erfindungsgemäss kann jedes anorganische Salz verwendet werden, sofern es physiologisch verträglich ist. Spezielle Beispiele sind Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium- und Calciums-alze und Ammoniumsalze von Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren (Orthoborsäure, Metaborsäure und Tetraborsäure) und Phosphorsäuren (Pyrophosphorsäure, Orthophosphorsäure und Meta-phosphorsäure). Bevorzugte Beispiele für verwendbare Salze sind NaCl, KCl, MgCh, (NHO2SO4, Na2S04, Na2B407, KH2HPO4, K2HPO4, NaH2PC>4 und Na2HPC>4. According to the invention, any inorganic salt can be used if it is physiologically compatible. Specific examples are alkali metal salts such as sodium and potassium salts, alkaline earth metal salts such as magnesium and calcium salts and ammonium salts of mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, boric acids (orthoboric acid, metaboric acid and tetraboric acid) and phosphoric acids (pyrophosphoric acid, orthophosphoric acid) and meta-phosphoric acid. Preferred examples of salts which can be used are NaCl, KCl, MgCh, (NHO2SO4, Na2S04, Na2B407, KH2HPO4, K2HPO4, NaH2PC> 4 and Na2HPC> 4.

Erfindungsgemäss können auch Lysinsalze verwendet werden, sofern sie physiologisch verträglich sind, beispielsweise Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium- und Calciumsalze. According to the invention, lysine salts can also be used if they are physiologically compatible, for example alkali metal salts, such as sodium and potassium salts, and alkaline earth metal salts, such as magnesium and calcium salts.

Die wirksame Menge des zuzusetzenden Plasminogenstabilisators hängt von der Menge des Plasmins im Plasminogen- The effective amount of plasminogen stabilizer to be added depends on the amount of plasmin in the plasminogen

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3rd

650 273 650 273

präparat und der Art des Stabilisators ab. Die stabilisierende Wirkung nimmt im Falle von Lysin mit ansteigenden Mengen zu. Die Menge des Stabilisators hängt jedoch vom beabsichtigten Verwendungszweck des Plasminogenpräparats ab. Zur Untersuchung der Fibrinolyse ist die Konzentration des Stabilisators vorzugsweise niedriger als der niedrigste Wert, bei dem Fibrinolyse bewirkt wird. Für medizinische Zwecke, d.h. zur Verwendung als Arzneistoff, bei dem das Plasminogenpräparat energischen Behandlungen ausgesetzt wird, beispielsweise einem lOstündigen Erhitzen auf 60 °C zur Inakti-vierung von Viren, wird eine grosse Menge des Stabilisators zugesetzt, und nach der Behandlung des Präparats wird der Stabilisator durch Dialyse oder andere geeignete Methoden abgetrennt. Bei Verwendung von PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), Aprotinin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird deren Menge derart bemessen, dass als Verunreinigung vorliegendes Plasmin vollständig gehemmt wird. preparation and the type of stabilizer. In the case of lysine, the stabilizing effect increases with increasing amounts. However, the amount of stabilizer depends on the intended use of the plasminogen preparation. To examine fibrinolysis, the concentration of the stabilizer is preferably lower than the lowest value at which fibrinolysis is effected. For medical purposes, i.e. a large amount of the stabilizer is added for use as a drug in which the plasminogen preparation is subjected to vigorous treatments, such as heating at 60 ° C for 10 hours to inactivate viruses, and after treatment of the preparation, the stabilizer is dialyzed or otherwise appropriate methods separated. When using PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), aprotinin or soybean trypsin inhibitor, the amount thereof is measured in such a way that plasmin present as an impurity is completely inhibited.

Die speziellen Konzentrationen der erfindungsgemäss verwendeten Stabilisatoren sind nachstehend angegeben. Für wässrige Lösungen von Plasminogen wird ein physiologisch verträgliches anorganisches Salz in einer Endkonzentration von 0,002 bis 0,4 M, vorzugsweise 0,01 bis 0,3 M und insbesondere von 0,05 bis 0,2 M, Lysin in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, PMSF in einer Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin in einer Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml verwendet. Für Plasminogen-Trockenpulverpräparate wird das physiologisch verträgliche anorganische Salz in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, Lysin in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, PMSF in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, Aprotinin in einer Endkonzentration von 0,01 bis 1000 KIU/mg und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Endkonzentration von 0,1 bis 1000 BAEEU/mg verwendet. The specific concentrations of the stabilizers used according to the invention are given below. For aqueous solutions of plasminogen, a physiologically acceptable inorganic salt in a final concentration of 0.002 to 0.4 M, preferably 0.01 to 0.3 M and in particular 0.05 to 0.2 M, lysine in a concentration of 0.001 to 5 wt .-% / Vol .-%, PMSF in a concentration of 0.01 to 100 mmol, aprotinin in a concentration of 0.1 to 1000 KIU / ml and soybean trypsin inhibitor in a concentration of 1 to 1000 BAEEU / ml used. For plasminogen dry powder preparations, the physiologically compatible inorganic salt is used in a final concentration of 0.01 to 10% by weight, lysine in a final concentration of 0.01 to 10% by weight, PMSF in a final concentration of 0.01 to 10% by weight .-%, aprotinin in a final concentration of 0.01 to 1000 KIU / mg and soybean trypsin inhibitor in a final concentration of 0.1 to 1000 BAEEU / mg used.

Plasminogen wird leicht bei seiner Herstellung inaktiviert, insbesondere beim Erhitzen oder Gefriertrocknen. Deshalb wird das erfindungsgemässe Verfahren zum Stabilisieren von Plasminogen vorzugsweise nicht nur bei der Wärmebehandlung einer Plasminogen enthaltenden wässrigen Lösung oder beim Gefriertrocknen dieser wässrigen Lösung angewendet, sondern bei allen Herstellungsstufen. Im Falle einer Wärmebehandlung einer plasminogenhaltigen wässrigen Lösung zur Inaktivierung von Viren, beispielsweise beim lOstündigen Erhitzen auf 60 °C, wird die Wärmebehandlung nach Zusatz des Stabilisators und einer Einwirkungs- bzw. Behandlungsdauer von 20 bis 60 Minuten bei 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 durchgeführt. Plasminogen is easily inactivated during its manufacture, especially when heated or freeze-dried. Therefore, the method according to the invention for stabilizing plasminogen is preferably used not only in the heat treatment of an aqueous solution containing plasminogen or in the freeze-drying of this aqueous solution, but in all production stages. In the case of a heat treatment of a plasminogen-containing aqueous solution for inactivating viruses, for example when heating to 60 ° C. for 10 hours, the heat treatment is carried out after addition of the stabilizer and an exposure or treatment time of 20 to 60 minutes at 4 to 37 ° C. and a pH -Value from 2 to 4 carried out.

Die erfindungsgemäss verwendeten Stabilisatoren können nach der Behandlung in den Präparaten verbleiben. Dies trägt zur Erhöhung der Stabilität des Plasminogens beim Stehen bei. The stabilizers used according to the invention can remain in the preparations after the treatment. This contributes to increasing the stability of the plasminogen when standing.

Es liegt auf der Hand, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht nur bei der Herstellung von Plasminogenpräpa-raten, sondern auch in anderen Fällen brauchbar ist, bei denen es auf die Stabilisierung von Plasminogen ankommt. Durch das erfindungsgemässe Verfahren gelingt es, die Stabilität von Plasminogen auf seinen verschiedenen Produktionsstufen, einschliesslich der Wärmebehandlung, Gefriertrocknung und anderen Arbeitsgängen zu erhöhen und auf diese Weise den Verlust an Plasminogen auf ein Mindestmass zu beschränken. Die erfindungsgemäss erhaltenen Plasminogen-präparate zeichnen sich durch eine hohe Lagerstabilität aus. It is obvious that the method according to the invention can be used not only in the production of plasminogen preparations, but also in other cases in which the stabilization of plasminogen is important. The process according to the invention makes it possible to increase the stability of plasminogen at its various production stages, including heat treatment, freeze drying and other operations, and in this way to minimize the loss of plasminogen. The plasminogen preparations obtained according to the invention are distinguished by a high storage stability.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Aktivität von Plasminogen durch die Casein-Einheit (CU; Vox Sang., Bd. 5 (1960), S. 357 bis 376) die Aprotinin-Aktivität durch die KIU-Einheiten (vgl. E.K. Frey, H. Kraut und E. Werle, Kallikrein (Padutil), 1950, Enke Verlag, Stuttgart) und die Aktivität von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor durch die BAEEU-Einheiten (vgl. M. Laskowski, Method in Enzymology, Bd. 2, S. 37, herausgegeben von S.P. Colowick und N.O. Kaplan, New York, Academic Press, Inc.) ausgedrückt. The examples illustrate the invention. In the examples, the activity of plasminogen by the casein unit (CU; Vox Sang., Vol. 5 (1960), pp. 357 to 376), the aprotinin activity by the KIU units (cf. EK Frey, H. Kraut and E. Werle, Kallikrein (Padutil), 1950, Enke Verlag, Stuttgart) and the activity of soybean trypsin inhibitor by the BAEEU units (see M. Laskowski, Method in Enzymology, Vol. 2, p. 37 , edited by SP Colowick and NO Kaplan, New York, Academic Press, Inc.).

Dabei bedeutet 1 KIU-Einheit die Menge Aprotinin, die nötig ist, um die Aktivität von zwei Einheiten Kallidinoge-nase (Kallikrein) bei einem pH-Wert von 8 und bei Raumtemperatur während zwei Stunden auf eine einhalb Mal so grosse Menge zu verringern. 1 KIU unit means the amount of aprotinin that is necessary to reduce the activity of two units of kallidinogenase (kallikrein) at a pH of 8 and at room temperature for two and a half times the amount for two hours.

I BAEEU-Einheit bedeutet die Menge von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, um eine BAE-Einheit Trypsin zu inhibitie-ren, während eine BAE-Einheit die Menge Trypsin angibt, die nötig ist, um 1 Mikromol Alpha-Benzoyl-L-Alginin-Äthyl-Ester bei 25 °C und bei einem pH-Wert von 7,6 während einer Minute zu zersetzen. I BAEEU unit means the amount of soybean trypsin inhibitor to inhibit a BAE trypsin unit, while a BAE unit indicates the amount of trypsin needed to make 1 micromole of alpha-benzoyl-L-alginine Ethyl esters decompose at 25 ° C and at pH 7.6 for one minute.

Beispiel 1 example 1

Stabilisierung einer Plasminogenlösung Stabilization of a plasminogen solution

Verschiedene Inhibitoren werden einer wässrigen Lösung von 100 CU/ml Plasminogen in Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) zugesetzt. Die Lösungen werden in einem Thermostat bei 37 °C stehengelassen, um die Stabilität zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. Various inhibitors are added to an aqueous solution of 100 CU / ml plasminogen in Tris-HCl buffer (pH 7.8). The solutions are left in a thermostat at 37 ° C to examine the stability. The results are summarized in Table I.

Tabelle I Table I

Inhibitor Inhibitor

Endkonzen Final conc

Restliche Aktivität nach Remaining activity after

tration tration

24stündigem Stehen bei 37 °C, % Standing for 24 hours at 37 ° C,%

Lysin Lysine

0,1%' 0.1% '

95 95

Lysin Lysine

1,0% 1.0%

96 96

PMSF PMSF

0,1 mM 0.1 mM

98 98

PMSF PMSF

1 mM 1 mm

98 98

Aprotinin Aprotinin

1 KIU/ml 1 KIU / ml

89 89

Aprotinin Aprotinin

10 KIU/ml 10 KIU / ml

95 95

Sojabohnen- Soybean

Trypsin-Inhibitor Trypsin inhibitor

10 BAEEU/ml 10 BAEEU / ml

88 88

Sojabohnen- Soybean

Trypsin-Inhibitor Trypsin inhibitor

100 BAEEU/ml 100 BAEEU / ml

92 92

kein Zusatz no addition

- -

43 43

Beispiel 2 Example 2

Stabilisierung von gefriergetrocknetem Plasminogen Stabilization of freeze-dried plasminogen

Die gemäss Beispiel 1 hergestellten Lösungen mit den verschiedenen Inhibitoren werden gefriergetrocknet. Die erhaltenen gefriergetrockneten Präparate werden 1 Monat in einem Thermostat bei 50 °C oder 3 Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt, um die Stabilität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst. The solutions prepared according to Example 1 with the various inhibitors are freeze-dried. The freeze-dried preparations obtained are kept in a thermostat at 50 ° C. for 1 month or at room temperature for 3 months in order to determine the stability. The results are summarized in Table II.

Tabelle II Table II

Inhibitor Restliche Aktivität bei Restliche Aktivität nach Inhibitor residual activity after residual activity after

1 monatigem Stehen bei 3monatigem Stehen bei 50 0 C, % Raumtemperatur, % 1 month standing with 3 months standing at 50 0 C,% room temperature,%

Lysin 97 96 Lysine 97 96

PMSF 94 93 PMSF 94 93

Aprotinin 91 90 Aprotinin 91 90

Sojabohnen- Soybean

Trypsin-Inhibitor 93 91 Trypsin inhibitor 93 91

kein Zusatz 32 25 no addition 32 25

Beispiel 3 Example 3

Die nach der Fraktionierungsmethode von Cohn mit kaltem Äthanol erhaltene Fraktion III wird in einer wässrigen Lösung suspendiert, die 1 Gew.-%/Vol.-% Natriumchlorid Fraction III obtained by the Cohn fractionation method with cold ethanol is suspended in an aqueous solution containing 1% by weight /% by volume sodium chloride

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

650 273 650 273

4 4th

enthält. Danach wird die Suspension einige Zeit gerührt. Hierauf wird der Überstand zentrifugiert. Nach der Methode von D.G. Deutsch u. Mitarb., Science, Bd. 170 (1970), S. 1095, wird der Überstand auf eine Lysin-Sepharose-Säule gegeben, um das Plasminogen zu adsorbieren. Sodann werden als Verunreinigungen vorliegende Proteine mit physiologischer Kochsalzlösung ausgewaschen. Hierauf wird das adsorbierte Plasminogen mit einer wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,002 M c-Aminocapronsäure und 1% Natriumchlorid enthält. contains. The suspension is then stirred for some time. The supernatant is then centrifuged. According to the D.G. German and Mitarb., Science, Vol. 170 (1970), p. 1095, the supernatant is placed on a lysine-Sepharose column in order to adsorb the plasminogen. Proteins present as impurities are then washed out with physiological saline. The adsorbed plasminogen is then eluted with an aqueous solution of pH 7.0, which contains 0.002 M c-aminocaproic acid and 1% sodium chloride.

Nach dem Dialysieren gegen destilliertes Wasser wird die gereinigte Plasminogenlösung in zahlreiche Proben unterteilt, die ihrerseits in vier Gruppen unterteilt wurden. Diese Gruppen wurden unter folgenden Bedingungen behandelt: After dialyzing against distilled water, the purified plasminogen solution is divided into numerous samples, which in turn were divided into four groups. These groups were treated under the following conditions:

Bedingung Den Proben dieser Gruppe werden verschiedene D Stabilisatoren einverleibt, und die erhaltenen Condition Various D stabilizers are added to the samples in this group, and the ones obtained

Lösungen werden 10 Stunden auf 60 °C erhitzt. Bedingung Den Proben dieser Gruppe werden verschiedene B Stabilisatoren einverleibt. Die erhaltenen Solutions are heated to 60 ° C for 10 hours. Condition Various B stabilizers are added to the samples in this group. The received

Lösungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 3,0 stehengelassen. Hierauf werden die Proben 10 Stunden auf 60 °C erhitzt. Solutions are left for 30 minutes at room temperature and a pH of 3.0. The samples are then heated to 60 ° C for 10 hours.

Bedingung Die Proben dieser Gruppe werden 30 Minuten C bei einem pH-Wert von 3,0 stehengelassen. Condition The samples in this group are left to stand for 30 minutes at pH 3.0.

Sodann werden die Proben mit Stabilisatoren versetzt und die erhaltenen Lösungen werden 10 5 Stunden auf 60 ° C erhitzt. Stabilizers are then added to the samples and the solutions obtained are heated at 60 ° C. for 10 5 hours.

Bedingung Die Proben dieser Gruppe werden mit A verschiedenen Stabilisatoren versetzt, jedoch keiner weiteren Behandlung unterworfen. Condition The samples in this group are mixed with A different stabilizers, but are not subjected to any further treatment.

io Danach wird die restliche Aktivität der Proben bestimmt. io The remaining activity of the samples is then determined.

Die Überstände der unter den Bedingungen D, B, C und A erhaltenen Proben werden auf einen pH-Wert von 7,0 ± 0,2 eingestellt. Sodann wird die restliche Aktivität dieser Überstände bestimmt. The supernatants of the samples obtained under conditions D, B, C and A are adjusted to a pH of 7.0 ± 0.2. The remaining activity of these supernatants is then determined.

15 Die Proben der unter der Bedingung B erhaltenen Lösungen werden gefriergetrocknet (Bedingung E) und die restliche Aktivität wird bestimmt. 15 The samples of the solutions obtained under condition B are freeze-dried (condition E) and the remaining activity is determined.

Die Proben der Bedingung E werden nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C (Bedingung F) untersucht. 20 Die Aktivitätsbestimmung erfolgt nach der Casein-Spal-tungsmethode gemäss Sgouris u. Mitarb., Vox Sang., Bd. 5 (1960), S. 357. In Tabelle III ist die restliche Aktivität der verschiedenen Proben zusammengefasst, die bei der Behandlung unter den sechs Bedingungen erhalten werden. Die restliche 25 Aktivität wird in % bezogen auf die Aktivität eines nicht erhitzten, keine Zusatzstoffe enthaltenden Plasminogenpräpa-rats ausgedrückt. The samples of condition E are examined after storage for 6 months at 4 ° C. (condition F). 20 The activity is determined using the casein cleavage method according to Sgouris u. Mitarb., Vox Sang., Vol. 5 (1960), p. 357. Table III summarizes the residual activity of the various samples obtained in the treatment under the six conditions. The remaining 25 activity is expressed in% based on the activity of a non-heated plasminogen preparation containing no additives.

Tabelle III Table III

Restliche Aktivität in % nach Behandlung unter verschiedenen Bedingungen % Remaining activity after treatment under different conditions

Zusatzstoff Konzentration Bedingung A Bedingung B Bedingung C Bedingung D Bedingung E Bedingung F Additive Concentration Condition A Condition B Condition C Condition D Condition E Condition F

kein Zusatz no addition

100 100

27 27th

27 27th

20 20th

- -

NaCl NaCl

(0,05 M) (0.05 M)

100 100

72 72

25 25th

23 23

- -

NaCl NaCl

(0,10 M) (0.10 M)

100 100

90 90

30 30th

35 35

9! 9!

90 90

NaCl NaCl

(0,15 M) (0.15 M)

100 100

95 95

24 24th

25 25th

94 94

93 93

KCl KCl

(0,10 M) (0.10 M)

97 97

88 88

32 32

25 25th

88 88

87 87

(NH4>SC>4 (NH4> SC> 4

(0,02 M) (0.02 M)

97 97

80 80

33 33

35 35

81 81

80 80

(NH4>S04 (NH4> S04

(0,05 M) (0.05 M)

95 95

95 95

25 25th

27 27th

93 93

94 94

(NH4)2S04 (NH4) 2S04

(0,10 M) (0.10 M)

100 100

95 95

25 25th

20 20th

94 94

93 93

Na2SC>4 Na2SC> 4

(0,02 M) (0.02 M)

98 98

77 77

17 17th

23 23

76 76

77 77

Na2SC>4 Na2SC> 4

(0,05 M) (0.05 M)

100 100

85 85

17 17th

26 26

84 84

83 83

Na2SC>4 Na2SC> 4

(0,20 M) (0.20 M)

100 100

90 90

20 20th

' 30 '30

91 91

90 90

Na2B4C>7 Na2B4C> 7

(0,10 M) (0.10 M)

99 99

92 92

20 20th

27 27th

90 90

89 89

KH2PO4 KH2PO4

(0,02 M) (0.02 M)

95 95

85 85

25 25th

24 24th

83 83

84 84

KH2PO4 KH2PO4

(0,05 M) (0.05 M)

97 97

96 96

25 25th

31 31

94 94

93 93

KH2PO4 KH2PO4

(0,15 M) (0.15 M)

95 95

96 96

27 27th

35 35

94 94

94 94

Lysin Lysine

(0,003 M) (0.003 M)

95 95

89 89

28 28

25 25th

87 87

86 86

CHaCOONa CHaCOONa

(0,10 M) (0.10 M)

97 97

40 40

12 12

30 30th

- -

- -

Glucose glucose

(0,10 M) (0.10 M)

98 98

15 15

11 11

27 27th

- -

- -

Glycin Glycine

(0,10 M) (0.10 M)

95 95

17 17th

10 10th

25 25th

- -

- -

Mannit Mannitol

(0,10 M) (0.10 M)

98 98

15 15

25 25th

25 25th

- -

- -

Na-citrat Na citrate

60,50 M) 60.50 M)

- -

22 22

10 10th

15 15

- -

- -

Na-caprylat Na caprylate

(0,10%) (0.10%)

- -

17 17th

10 10th

20 20th

- -

- -

Polyäthylen- Polyethylene

glykol-400 glycol-400

(2,0%) (2.0%)

35 35

30 30th

25 25th

- -

- -

Aus Tabelle III lässt sich folgendes entnehmen: Plasminogenlösungen kurz nach Zusatz des Stabilisators zeigen eine Aktivität von 95 bis 100%, d.h. praktisch weder eine Aktivitätszunahme noch eine Aktivitätsabnahme (Bedingung A). The following can be seen from Table III: Plasminogen solutions shortly after addition of the stabilizer show an activity of 95 to 100%, i.e. practically neither an increase in activity nor an decrease in activity (condition A).

Plasminogenlösungen mit den Stabilisatoren der Erfindung, die 30 Minuten bei einem pH-Wert von 3,0 behandelt und 10 Stunden auf 60 °C erhitzt worden waren, behalten die Aktivität praktisch bei, auch wenn der pH-Wert auf den Neutralbereich wieder eingestellt wird. Demgegenüber werden bei 65 Plasminogenlösungen, die in gleicher Weise behandelt worden waren, jedoch keinen Zusatzstoff oder nur Essigsäure Glucose, Glycin, Natriumeitrat, Natriumcaprylat oder Poly-äthylenglykol-4000 enthielten, nach der pH-Werteinstellung Plasminogen solutions with the stabilizers of the invention, which had been treated at pH 3.0 for 30 minutes and heated at 60 ° C for 10 hours, practically maintain activity even when the pH is returned to the neutral range. In contrast, 65 plasminogen solutions which had been treated in the same way, but did not contain any additive or only acetic acid, glucose, glycine, sodium citrate, sodium caprylate or poly-ethylene glycol-4000, after the pH adjustment

5 5

650 273 650 273

auf Neutralbereich grosse Mengen an unlöslichen Substanzen und die Aktivität der Überstände ist sehr niedrig (Bedingung B). large amounts of insoluble substances in the neutral range and the activity of the supernatants is very low (condition B).

Plasminogenlösungen, die vor dem Zusatz des Stabilisators 30 Minuten bei einem pH-Wert von 3,0 behandelt worden waren, liefern grosse Mengen an unlöslichen Substanzen nach dem Erhitzen oder nach der pH-Wert-Einstellung auf den Neutralbereich, selbst wenn sie mit der gleichen Menge an Stabilisator versetzt worden sind, wie bei der Bedingung B und die restliche Aktivität der Überstände ist niedrig (Bedingung C). Plasminogen solutions that had been treated at pH 3.0 for 30 minutes prior to the addition of the stabilizer provide large amounts of insoluble substances after heating or after pH adjustment to the neutral range, even if they are the same Amount of stabilizer added as in Condition B and the remaining activity of the supernatants is low (Condition C).

Beim lOstündigen Erhitzen auf 60 °C unmittelbar nach Zusatz des Stabilisators bilden sich grosse Mengen an unlöslichen Substanzen, wenn der pH-Wert der Lösung auf den Neutralbereich zurückgestellt wird, und die restliche Aktivität des Überstands ist niedrig (Bedingung D). When heated to 60 ° C for 10 hours immediately after adding the stabilizer, large amounts of insoluble substances are formed when the pH of the solution is reset to the neutral range, and the remaining activity of the supernatant is low (condition D).

Aus den vorstehend mitgeteilten Ergebnissen ist ersichtlich, dass vor dem lOstündigen Erhitzen auf 60 °C die Plasmi- From the results communicated above, it can be seen that before heating for 10 hours at 60 ° C., the plasma

nogen-Stabilisatorlösung einer 20- bis 60minütigen Behandlung bei 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 unterworfen werden soll. nogen stabilizer solution should be subjected to a 20- to 60-minute treatment at 4 to 37 ° C and a pH of 2 to 4.

Die restliche Aktivität der erhaltenen Präparate, die durch 5 Gefriertrocknen der unter der Bedingung B behandelten Plasminogenlösungen erhalten worden sind, ist nahezu unverändert, d.h. es wird keine Inaktivierung bei der Gefriertrocknung beobachtet (Bedingung E). The remaining activity of the preparations obtained, which were obtained by freeze-drying the plasminogen solutions treated under condition B, is almost unchanged, i.e. no inactivation during freeze-drying is observed (condition E).

Die gefriergetrockneten Präparate sind auch nach 6mona-lo tiger Lagerung bei 4 °C stabil und zeigen keine Änderung der Aktivität (Bedingung F). The freeze-dried preparations are stable even after 6 months storage at 4 ° C and show no change in activity (condition F).

Die gefriergetrockneten Präparate zeigen keinen Aktivitätsverlust nach dem Auflösen in destilliertem Wasser für Injektionszwecke. Jeweils 1 ml der Lösung wird Mäusen mit 15 einem Körpergewicht von 20 + 2 g injiziert, und die Mäuse werden 7 Tage beobachtet. Während dieser Zeit sind keine anormalen Symptome festzustellen. The freeze-dried preparations show no loss of activity after being dissolved in distilled water for injections. 1 ml of the solution is injected into mice with a body weight of 20 + 2 g, and the mice are observed for 7 days. There are no abnormal symptoms during this time.

G G

Claims (13)

650 273650 273 1. Plasminogenpräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Plasminogen sowie an mindestens einem physiologisch verträglichen anorganischen Salz, Lysin oder dessen Salz, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin oder Sojaboh-nen-Trypsin-Inhibitor als Stabilisatoren. 1. Plasminogen preparation, characterized by a content of plasminogen and at least one physiologically compatible inorganic salt, lysine or its salt, phenylmethanesulfonyl fluoride, aprotinin or soybean trypsin inhibitor as stabilizers. 2. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder ein Ammoniumsalz der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren oder Phosphorsäuren ist. 2. Plasminogen preparation according to claim 1, characterized in that the physiologically compatible inorganic salt is an alkali or alkaline earth metal salt or an ammonium salt of hydrochloric acid, sulfuric acid, boric acids or phosphoric acids. 2 2nd PATENTANSPRÜCHE PATENT CLAIMS 3. Plasminogenpräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz NaCl, KCl, MgCh, (NH^SO-t, Na2SC>4, Na2B407, KH2PO4, K2HPO4, NatLPCh oder Na2HP04 ist. 3. Plasminogen preparation according to claim 2, characterized in that the physiologically compatible inorganic salt is NaCl, KCl, MgCh, (NH ^ SO-t, Na2SC> 4, Na2B407, KH2PO4, K2HPO4, NatLPCh or Na2HP04. 4. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysinsalz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz ist. 4. Plasminogen preparation according to claim 1, characterized in that the lysine salt is an alkali or alkaline earth metal salt. 5. Plasminogenpräparat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz das Natrium- oder Kaliumsalz und das Erdalkalimetallsalz das Magnesiumoder Calciumsalz ist. 5. Plasminogen preparation according to claim 4, characterized in that the alkali metal salt is the sodium or potassium salt and the alkaline earth metal salt is the magnesium or calcium salt. 6. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat in Form einer wässrigen Lösung vorliegt und die physiologisch verträglichen anorganischen Salze eine Konzentration von 0,002 bis 0,4, Lysin oder dessen Salze eine Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, Phenylmethansulfonylfluorid eine Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin eine Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eine Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml aufweisen. 6. Plasminogen preparation according to claim 1, characterized in that the preparation is in the form of an aqueous solution and the physiologically compatible inorganic salts have a concentration of 0.002 to 0.4, lysine or its salts a concentration of 0.001 to 5% by weight / vol .-%, phenylmethanesulfonyl fluoride have a concentration of 0.01 to 100 mmol, aprotinin a concentration of 0.1 to 1000 KIU / ml and soybean trypsin inhibitor have a concentration of 1 to 1000 BAEEU / ml. 7. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat in Form eines Trockenpulvers vorliegt und die Konzentrationen der physiologisch verträglichen anorganischen Salze 0,01 bis 10 Gew.-%, von Lysin 0,01 bis 10 Gew.-%, von Phenylmethansulfonylfluorid 0,01 bis 10 Gew.-%, von Aprotinin 0,01 bis 1000 KIU/mg und von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 0,1 bis 1000 BAEEU/mg betragen. 7. Plasminogen preparation according to claim 1, characterized in that the preparation is in the form of a dry powder and the concentrations of the physiologically acceptable inorganic salts 0.01 to 10 wt .-%, of lysine 0.01 to 10 wt .-%, of phenylmethanesulfonyl fluoride 0.01 to 10 wt .-%, of aprotinin 0.01 to 1000 KIU / mg and of soybean trypsin inhibitor 0.1 to 1000 BAEEU / mg. 8. Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenpräparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Plasminogenlösung mit mindestens einem physiologisch verträglichen anorganischen Salz, Lysin oder dessen Salz, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin oder Sojaboh-nen-Trypsin-Inhibitor als Stabilisatoren versetzt, die erhaltene Lösung während 20 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 behandelt und sodann 10 Stunden auf 60 °C erhitzt und die erhaltene Lösung gefriertrocknet. 8. A process for the preparation of a plasminogen preparation according to claim 1, characterized in that an aqueous plasminogen solution is mixed with at least one physiologically compatible inorganic salt, lysine or its salt, phenylmethanesulfonyl fluoride, aprotinin or soybean trypsin inhibitor as stabilizers, the solution obtained treated for 20 to 60 minutes at a temperature of 4 to 37 ° C and a pH of 2 to 4 and then heated to 60 ° C for 10 hours and the resulting solution freeze-dried. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als physiologisch verträgliches anorganisches Salz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder ein Ammoniumsalz der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren oder Phosphorsäuren verwendet. 9. The method according to claim 8, characterized in that an alkali or alkaline earth metal salt or an ammonium salt of hydrochloric acid, sulfuric acid, boric acids or phosphoric acids is used as the physiologically compatible inorganic salt. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als physiologisch verträgliches anorganisches Salz NaCl, KCl, MgCh, (NH4)iS04, NazSCh, Na2B4Cb, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PC>4 oder Na2HP04 verwendet. 10. The method according to claim 9, characterized in that NaCl, KCl, MgCh, (NH4) iS04, NazSCh, Na2B4Cb, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PC> 4 or Na2HP04 is used as the physiologically compatible inorganic salt. 11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lysinsalz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz verwendet. 11. The method according to claim 8, characterized in that an alkali or alkaline earth metal salt is used as the lysine salt. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Alkalimetallsalz das Natrium- oder Kaliumsalz und als Erdalkalimetallsalz das Magnesium- oder Calciumsalz verwendet. 12. The method according to claim 11, characterized in that the sodium or potassium salt is used as the alkali metal salt and the magnesium or calcium salt as the alkaline earth metal salt. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz, eine Konzentration von 0,002 bis 0,4, Lysin oder dessen Salz eine 13. The method according to claim 8, characterized in that the physiologically acceptable inorganic salt, a concentration of 0.002 to 0.4, lysine or its salt Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, Phenylmethansulfonylfluorid eine Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin eine Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eine Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml aufweisen. Concentration from 0.001 to 5 wt .-% / vol .-%, phenylmethanesulfonyl fluoride a concentration from 0.01 to 100 mmol, aprotinin a concentration from 0.1 to 1000 KIU / ml and soybean trypsin inhibitor a concentration from 1 to 1000 BAEEU / ml. Plasminogen wird durch Urokinase oder durch Streptokinase aktiviert und in Plasmin überführt. Plasmin bewirkt die Proteolyse des Fibrins zu löslichen Substanzen, d.h. es wird Fibrinolyse bewirkt. Plasminogen wird zusammen mit Urokinase und mit Streptokinase als Arzneistoff zur Behandlung von Thrombosen eingesetzt. Es ist bekannt, dass Plasminogen unter bestimmten Bedingungen inaktiviert wird, beispielsweise durch Wärmebehandlung oder Gefriertrocknung oder bei längerer Lagerung. Plasminogen is activated by urokinase or by streptokinase and converted into plasmin. Plasmin causes proteolysis of fibrin to soluble substances, i.e. fibrinolysis is effected. Plasminogen is used together with urokinase and streptokinase as a drug for the treatment of thrombosis. It is known that plasminogen is inactivated under certain conditions, for example by heat treatment or freeze-drying or after prolonged storage.
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