DE2842179A1 - Somatic-hybrids between tomato and potato - prepd. by fusing protoplasts with equal number of chromosomes - Google Patents
Somatic-hybrids between tomato and potato - prepd. by fusing protoplasts with equal number of chromosomesInfo
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Abstract
Description
Somatische Hybriden aus Kartoffeln und Tomaten sowie Somatic hybrids from potatoes and tomatoes as well
ein reproduzierbares Verfahren zu deren Züchtung Die vorliegende Erfindung betrifft somatische Hybriden aus Kartoffeln und Tomaten sowie ein reproduzierbares Verfahren zu deren Züchtung. a reproducible method for their cultivation The present The invention relates to somatic hybrids of potatoes and tomatoes and a reproducible one Process for their breeding.
Es ist bekannt, daß man Pflanzen durch Stecklinge vermehren kann, wobei die neuen Pflanzen haploid sind. Man kann aber auch andere Wege gehen, beispielsweise den von Guha und Maheswari aufgefundenen Weg, bei dem Pflanzen durch Aufzucht aus den Staubbeuteln entstehen. Die auf diese Weise gebildeten Pflanzen sind ebenfalls haploid. Mit Hilfe der letzteren Methode bietet sich eine Züchtungsmethode an, die eine erhebliche Verkürzung des Zeitaufwandes für Kombinationszüchtungen möglich macht.It is known that plants can be propagated by cuttings, the new plants being haploid. But you can also go other ways, for example the way found by Guha and Maheswari, in which plants by rearing out the anthers arise. The plants formed in this way are also haploid. With the help of the latter method, there is a breeding method that a considerable reduction in the time required for combination breeding is possible power.
Wenn man also, wie Guha und Maheswari dies getan haben, von den Kindern einer Kreuzung keine Enkel aufzieht, sondern Pflanzen aus den Gonen, den Produkten der Reduktionsteilung, so ergeben sich beispielsweise anstelle von 16 nur 4 Kombinationen und,was'noch wichtiger ist, man erkennt sofort an den Merkmalen dieser Pflanzen die gewünschte Kombination, und zwar unabhängig von den Dominanzverhältnissen. Um diese Pflanzen dann durch Samen fortpflanzen zu können, muß man sie wieder diploid machen, was mittels des 1937 entdeckten Colchicins kein Problem mehr ist. Das Colchicin wird dabei einfach auf das Sproßregenerat getropft, wodurch die Zellen diploid werden.So if, as Guha and Maheswari did, from the children at an intersection does not raise grandchildren, but rather Plants from the Gonen, the products of the reduction division, for example, instead of 16 only 4 combinations and, what is even more important, you can tell immediately from the features of these plants the desired combination, regardless of the dominance relationships. In order to be able to reproduce these plants through seeds, they have to be diploid again do what is no longer a problem with colchicine, which was discovered in 1937. The colchicine is simply dripped onto the regenerated shoots, making the cells diploid.
Leider sind jedoch bisher -verhältnismänig wenig Pflanzen bekannt, bei denen diese Methode leicht angewendet werden kann, Bei Solanaceen, wie z.B. Tabak, geht es gut, aber bei den für die Ernährung so wichtigen Pflanzen wie Reis, Mais, Weizen, Kartoffeln usw. ist ein erheblicher Aufwand nötig, um die richtigen Bedingungen zur Aufzucht von haploiden Pflanzen aus den Staubbeuteln aufzufinden. Die Blütenbeuteln müssen beispielsweise zum richtigen Augenblick steril präpariert und auf sterilen Nährböden unter antiseptischen Bedingungen ausgelegt werden. Große Serien von Variationen der Temperatur, des Lichts und vor allem der Medien, auf denen die Gonen zur abnormen Embryonalentwicklung angeregt werden sollen, müssen geprüft werden, bevor man mit Sicherheit sagen kann, ob diese Methode für die Züchtung anwendbar ist oder nicht.Unfortunately, relatively few plants are known to date, in which this method can easily be applied, in Solanaceae, e.g. Tobacco is fine, but with plants that are so important for nutrition as rice, Corn, wheat, potatoes, etc., a significant effort is needed to get the right ones To find conditions for growing haploid plants from the anthers. The flower bags, for example, have to be prepared sterile at the right moment and placed on sterile culture media under antiseptic conditions. Size Series of variations in temperature, light and, above all, media which the gons are to be stimulated to abnormal embryonic development must be examined before one can say with certainty whether this method is suitable for breeding is applicable or not.
Es ist ferner bekannt, daß man aus bestimmten Gewebeteilen solche haploiden Pflanzen (dies geht selbstverständlich auch aus Gewebeteilen von normalen Pflanzen) durch Anwendung von im wesentlichen nur zwei Enzymen nackte einzelne Zellen, d,h. solche ohne Zellulosewand, zu Millionen gewinnen kann.It is also known that from certain tissue parts such haploid plants (this can of course also be done from tissue parts of normal Plants) bare single cells by the application of essentially only two enzymes, d, h. those without a cellulose wall can win by the millions.
Man löst dabei durch einen Enzymkomplex, in dem Pectinase die wichtigste Komponente ist, die Pectinmittellamelle der Zellwände auf, wodurch man die Zellen zunächst voneinandertrennen kann. Diese freien Zellen werden durch Cellulase-Präparate ihrer Cellulosewand beraubt, und man erhält aus ihnen die vorstehend angeführten nackten Zellen, auch Protoplasten genannt. Diese nackten Zellen kann man in flüssigen Medien, aber auch in Agarplatten wie Bakterien oder Hefezellen nach bekannter Wiederherstellung der Wand sich zu Zellhaufen teilen lassen. Diese Massenkultur einzelner Zellen funktioniert aber nur bei einigen Pflanzen.One solves this through an enzyme complex, in which pectinase is the most important Component is the pectin middle lamella of the cell walls, which makes the cells can initially separate from each other. These free cells are produced by cellulase preparations Deprived of its cellulose wall, and one gets out them the above listed bare cells, also called protoplasts. These bare cells can in liquid media, but also in agar plates such as bacteria or yeast cells after known restoration of the wall, can be divided into clusters of cells. These However, mass culture of individual cells only works with some plants.
Bei ganz wenigen von diesen Pflanzen, z.B. bei Tabak, kann man nicht nur Zellhaufen (Kallus, Plural Kalli), sondern aus diesen auch wieder durch Behandlung des Sproßregenerats mit Colchicin normale diploide Pflanzen gewinnen.With very few of these plants, e.g. with tobacco, one cannot only cell clusters (callus, plural calli), but from these again through treatment of the regenerated shoots with colchicine, normal diploid plants can be obtained.
Schließlich ist es bekannt, daß man nicht nur zwei Protoplasten gleicher Art, sondern auch solche aus zwei zwar nahe verwandten, doch normalerweise nicht miteinander kreuzbaren Pflanzen verschmelzen, d.h.'fusionieren, kann, wobei sich gegebenenfalls eine neue Pflanze bildet. Allerdings können die nach der vorstehend beschriebenen Methode gewonnenen frischen Protoplasten nicht ohne weiteres fusionieren, da sie eine negative Oberflächenladung haben.After all, it is known that not only two protoplasts are alike Kind, but also from two closely related, but usually not plants that can be crossed with each other can merge, i.e. possibly forms a new plant. However, the after the above do not easily fuse fresh protoplasts obtained from the method described, since they have a negative surface charge.
Bringt man jedoch diese Protoplasten in eine bestimmte Kationenlösung mit einem bestimmten pH-Wert und einem herabgesetzten osmotischen Wert so können sie fusionieren.However, if you bring these protoplasts into a certain cation solution with a certain pH value and a reduced osmotic value so can they merge.
Polyäthylenglycol ist dabei ein gutes Mittel, um die Fusion einzuleiten, manchmal auch, um sie überhaupt erst zustande kommen zu lassen. Nach der Fusion wird die neue Zelle durch chemische Reize dazu veranlaßt, sich wie eine normale befruchtete Eizelle zu teilen, zu entwickeln und zur Pflanze auszuwachsen. Grundsätzlich muß man dabei jedoch beachten, daß sich bei einer solchen Fusion zweier Protoplasten, hergestellt aus dem Gewebe normaler Pflanzen, das Erbgut, d.h. die Anzahl der Chromosomen verdoppelt.Polyethylene glycol is a good means of initiating the fusion, sometimes also to allow it to come about in the first place. After the merger the new cell is caused by chemical stimuli to look like a normal one to divide, develop and grow into a plant. Basically one has to note, however, that with such a fusion of two protoplasts, made from the tissue of normal plants, the genetic material, i.e. the number of chromosomes doubled.
Solche Zellen sind im allgemeinen nicht entwicklungsfähig.Such cells are generally not viable.
FUr die erfolgreiche Fusion müssen daher Protoplasten von Pflanzen verwendet werden, denen man bereits vorher, wie eingangs geschildert, die Hälfte der Erbanlagen abgezüchtet hat, sei es durch die Stecklingsvermehrung oder die Vermehrung aus den Staubbeuteln. Leider ist dies jedoch, wie bereits ebenfalls vorstehend ausgeführt wurde, bisher nur in einigen Spezialfällen möglich.For a successful fusion, therefore, protoplasts of plants are required are used, which you have already previously, as described above, half who has bred hereditary traits, be it through the propagation of cuttings or propagation from the anthers. Unfortunately, however, this is how already too was stated above, so far only possible in a few special cases.
Au£gabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren zu schaffen, das es gestattet, mittels Protoplasten-Fusionierung Kartoffeln mit Tomaten unter Bildung lebensfähiger Hybride zu kreuzen, wobei zu bemerken ist, daß es bisher nicht einmal gelungen ist, diese beiden Pflanzen sexuell miteinander zu kreuzen.It is therefore an object of the invention to provide a method that it allows to form potatoes with tomatoes by means of protoplast fusing more viable hybrids, noting that so far not even succeeded in sexually crossing these two plants with each other.
Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß Protoplasten, hergestellt aus Gewebeteilen von Kartoffeln, mit Protoplasten, hergestellt aus Gewebeteilen von Tomaten, fusioniert werden, wobei (a) die aus Kartoffeln hergestellten Protoplasten die gleiche Anzahl von Chromosomen aufweisen, wie die aus Tomaten hergestellten Protoplasten und (b) zur Kultur der Fusionsprodukte eine 8p-Kulturflüssigkeit nach Kao und Michayluk, beschrieben in der Zeitschrift Planta (Berlin) 126, 105 bis 110 (1975), jedoch ohne Riboflavin, eingesetzt wird.This problem was solved by producing protoplasts from pieces of tissue from potatoes, with protoplasts, made from pieces of tissue of tomatoes, where (a) the protoplasts produced from potatoes have the same number of chromosomes as those made from tomatoes Protoplasts and (b) an 8p culture fluid to culture the fusion products Kao and Michayluk, described in the journal Planta (Berlin) 126, 105 to 110 (1975), but without riboflavin, is used.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein reproduzierbares Verfahren zur Züchtung somatischer Hybride aus Kartoffeln und Tomaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Protoplasten, hergestellt aus Gewebeteilen von Kartoffeln, mit Protoplasten, hergestellt aus Gewebeteilen von Tomaten, fusioniert werden, wobei (a) die aus Kartoffeln hergestellten Protoplasten die gleiche Anzahl von Chromosomen aufweisen, wie die aus Tomaten hergestellten Protoplasten und (b) zur Kultur der Fusionsprodukte eine 8p-Kulturflüssigkeit nach Kao und Michayluk, beschrieben in der Zeitschrift Planta (Berlin) 126, 105 bis 110 (1975), jedoch ohne Riboflavin, eingesetzt wird.The invention therefore relates to a reproducible method for breeding somatic hybrids from potatoes and tomatoes, which is characterized by is that protoplasts, made from pieces of tissue from potatoes, with protoplasts, made from pieces of tissue from tomatoes, being fused, with (a) those from potatoes produced protoplasts have the same number of chromosomes as the protoplasts made from tomatoes and (b) for culture of the fusion products a 8p culture fluid after Kao and Michayluk, described in the Planta magazine (Berlin) 126, 105 to 110 (1975), but without riboflavin, used will.
Vorzugsweise sind gemäß der Erfindung sowohl die eingesetzten Kartoffeln-Protoplasten, als auch die Tomaten-Protoplasten dihaploid.Preferably, according to the invention, both the potato protoplasts used, as well as the tomato protoplasts dihaploid.
Die dihaploiden Protoplasten gewinnt man auf bekannte Weise, vorzugsweise aus der dihaploiden Linie HH 258 von Solanum tuberosum L. Die Gewinnung ist von M. Behnke unter dem Titel" "Regeneration in Gewebekulturen einiger dihaploider Splanum tuberosum-Klone" in der Zeitschrift für Pflanzenzüchtung 75, 262 bis 265 (1975) beschrieben.The dihaploid protoplasts are obtained in a known manner, preferably from the dihaploid line HH 258 from Solanum tuberosum L. The extraction is from M. Behnke under the title "" Regeneration in tissue cultures of some dihaploid splanum tuberosum clones "in the magazine for plant breeding 75, 262 to 265 (1975) described.
Die gemäß der Erfindung vorzugsweise eingesetzten dihaploiden Mesophyll-Protoplasten wurden in an sich bekannter Weise aus Lycopersicon lycopersicum var. cerasiforme (Dunal) Alef, "mutant yellow green 6" gewonnen. Diese wurden von Dr. C.M. Rick von der Universität Californien zur Verfügung gestellt. Die Pflanzen wurden vorher schattiert im Gewächshaus herangezogen und hatten hell grüne Blätter (unschattiert werden die Blätter gelbgrün bis gelb).The dihaploid mesophyll protoplasts preferably used according to the invention were in a manner known per se from Lycopersicon lycopersicum var. cerasiforme (Dunal) Alef, "mutant yellow green 6" won. These were made by Dr. CM. Rick from made available by the University of California. The plants were shaded beforehand grown in the greenhouse and had light green leaves (the Leaves yellow-green to yellow).
Wie bereits erwähnt, erfolgt die Präparation der Protoplasten und die Fusion in an sich bekannter Weise. Das Fusionsprodukt wird dann in einer 8p-Kulturflüssigkeit nach Kao und Michayluk, beschrieben in der Zeitschrift Planta (Berlin) 126, 105 bis 110 (1975), jedoch ohne Riboflavin, kultiviert, Nachfolgend wird eine stichwortartige Kurzbeschreibung der Präparation der Protoplasten, der Fusion und der Kultivierung des Fusionsproduktes gegeben.As already mentioned, the preparation of the protoplasts takes place the fusion in a manner known per se. The fusion product is then placed in an 8p culture fluid after Kao and Michayluk, described in the journal Planta (Berlin) 126, 105 to 110 (1975), but without riboflavin, cultivated Brief description of the preparation of the protoplasts, the fusion and the cultivation of the fusion product given.
I. Präparation der Protoplasten 1. Von HH 258 submerse Kultur vom 19. 9. 1976 in LS1 (siehe Behnkeo Zeitschrift für Pflanzenzüchtung 75, 262 bis 265 (1975) 50 ml Suspension + 50 ml E4 (E4 = Glucose 0,7 M CaCl2H20 6,0 mM NaH2P04H20 0,7 mM Morphol inoäthansul fonsäure (MES) 3,0 mM PH=5,7 mit NaOH (nach Kao et al, Planta (Berlin) 115, 355 bis 367, 1974)) + Cellulase "Onozuka" R-10 Kinki Yakult MFG Co. Ltd. 8-21 2 % + Rohament P. e Röhm Enzyme 2 % + Pectinase No..P-4625 Sigma St. Louis USA 0,5 % PK = 5,8, 4 1/2 h 2. Von Lycopersicon lycopersicum große Pflanzen, aber noch vor der Blüte, schattiert, vom 29. 12. 1976.I. Preparation of the protoplasts 1. Submerged culture of HH 258 from September 19, 1976 in LS1 (see Behnkeo magazine for plant breeding 75, 262 to 265 (1975) 50 ml suspension + 50 ml E4 (E4 = glucose 0.7 M CaCl2H20 6.0 mM NaH2P04H20 0.7 mM morphol inoethane sulfonic acid (MES) 3.0 mM PH = 5.7 with NaOH (according to Kao et al, Planta (Berlin) 115, 355 to 367, 1974) + cellulase "Onozuka" R-10 Kinki Yakult MFG Co. Ltd. 8-21 2% + Rawament P. e Röhm Enzyme 2% + Pectinase No..P-4625 Sigma St. Louis USA 0.5% PK = 5.8, 4 1/2 h 2. Plants large from Lycopersicon lycopersicum, but before flowering, shaded, from December 29, 1976.
Blätter sterilisiert (nach Keller und Melchers, Z. Naturforsch. 28c, 737 bis 741 (1973). Leaves sterilized (after Keller and Melchers, Z. Naturforsch.28c, 737 to 741 (1973).
Vorinkubation 25 mit 0,5 M Mannitol 250C 0,25 % Driselase Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Pre-incubation 25 with 0.5 M Mannitol 250C 0.25% Driselase Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.
Tokyo, Japan 0,25 % Cellulase (wie oben) 0,3 % Mannitol 0,5 M PH = 5,8 4 h II. Fusion Polyäthylenglycol (PEG) 1540, Cat.Nr. 0679, Lot No. Tokyo, Japan 0.25% cellulase (as above) 0.3% mannitol 0.5 M PH = 5.8 4 h II. Fusion polyethylene glycol (PEG) 1540, Cat.No. 0679, lot no.
279-8 Polysciences Tnc. 279-8 Polysciences Tnc.
50 g in 100 ml Glucose 0,1 M Ca Cl2 + 2H20 3,5 mM 2 4 0;7 mM PH = 5,6 10 bei 230 C, ausverdünnt mit 0,08 M CaCl2 bei PH P 10 in 30' post fusion wash: Mannitol 0,6 M, CaC12.2H20 0,75 M, 25' bei 23O C. 50 g in 100 ml glucose 0.1 M Ca Cl2 + 2H20 3.5 mM 2 4 0; 7 mM PH = 5.6 10 at 230 C, diluted with 0.08 M CaCl2 at PH P 10 in 30 'post fusion wash: Mannitol 0.6 M, CaC12.2H20 0.75 M, 25 'at 23O C.
III. Kultur In 8p (ohne Ribofiavin) nach Kao und Michayluk Planta (Berlin) 126, 105 bis 110 (1975).III. Culture In 8p (without ribofiavin) according to Kao and Michayluk Planta (Berlin) 126, 105 to 110 (1975).
Die Kulturtemperatur betrug immer ca. 240 C. In den Kulturräumen herrschte schwaches Dauerlicht von Osram-Fluora-Fluorescenzlicht, teilweise ergänzt durch schwache Osram-Nitra-Lampen. Infektionen, die wahrscheinlich mit den Tomaten-Protoplasten in die Kultur gekommen waren, wurden mit Aureomycin bekämpft und abgetrennt.The culture temperature was always approx. 240 C. In the culture rooms there was weak continuous light from Osram Fluora fluorescence light, partially supplemented by weak Osram-Nitra lamps. Infections likely with the tomato protoplasts came into the culture, were controlled with aureomycin and separated.
Die Pflanzen kamen unter relativ ungünstigen Bedingungen in Erde und wuchsen über den Winter schlecht. Im Frühling wurden sie zum Teil auf Tomaten-Unterlagen (var. "supravite") gepfropft. Knollen von S. tuberosum HH 258 und Saatgut von Lycopersicon lycopersicum "aurea" und von der var. cerasiforme, "yellow green" wurden auf die Struktur des F.-I-P. untersucht. Dabei wurden erstmals Unterschiede im Peptidmuster beim Electrofocussing zwischen Tomate und Kartoffel festgestellt. Lycopersicon lycopersicum 5 sir. The plants came into soil under relatively unfavorable conditions and grew poorly over the winter. In the spring they were partly on tomato rootstocks (var. "supravite") grafted. S. tuberosum HH 258 tubers and Lycopersicon seeds lycopersicum "aurea" and from the var. cerasiforme, "yellow green" were based on the Structure of the F.-I-P. examined. Differences in the peptide pattern were identified for the first time detected during electrofocussing between tomato and potato. Lycopersicon lycopersicum 5 sir.
und Lycopersicon lycopersicum war. cerasiforme zeigen keine Unterschiede.and Lycopersicon was lycopersicum. cerasiforme show no differences.
FUr die Bestimmung der Chromosomenzahl wurden - soweit möglich - Wurzelspitzen in Alkohol-Eisessig fixiert, bei den Pflanzen, die nur als Pfropfreiser gewachsen waren, Sproß-Spitzen, Blattanlagen und Blütenknospen.- Bei den erfindungsgemäß erhaltenen Hybriden handelt es sich um amphidiploide Hybride, deren Erzeugung erstmals mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gelang.To determine the number of chromosomes - as far as possible - root tips Fixed in alcohol-glacial acetic acid, in the case of plants that only grew as slips were, shoot tips, leaf systems and flower buds. Both The hybrids obtained according to the invention are amphidiploid hybrids whose Generation succeeded for the first time by means of the method according to the invention.
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Legal Events
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |