DE2747409A1

DE2747409A1 - PROCEDURE AND ARRANGEMENT FOR ANALYZING FLUORESCENT SUBSTANCES

Info

Publication number: DE2747409A1
Application number: DE19772747409
Authority: DE
Inventors: Peter Eneroth
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-10-22
Filing date: 1977-10-21
Publication date: 1978-04-27
Also published as: FR2368710B1; GB1594725A; FR2368710A1; SE409623B; SE7611787L

Description

PATENTANWALT ÜIPL.-1NG. H. SIROHSCHANKPATENT Attorney ÜIPL.-1NG. H. SIROHSCHANK

8000 MÜNCHEN 60 · MUSÄUSSTRASSE 5 ■ TELEFON (08jl) 88 1608 oni η ι ρ, q8000 MÜNCHEN 60 · MUSÄUSSTRASSE 5 ■ TELEPHONE (08jl) 88 1608 oni η ι ρ, q

21.10.1977-SS(5) 309-1492P10/21/1977 SS (5) 309-1492P

Peter Eneroth, 22, Framnäsbacken, S-171 42 Solna (Schweden)Peter Eneroth, 22, Framnäsbacken, S-171 42 Solna (Sweden)

und
Wladimir Wladimiroff, 43B, St.Olofsgatan, S-753 30 Uppsala 4Schweden]._and
Wladimir Wladimiroff, 43B, St.Olofsgatan, S-753 30 Uppsala 4Sweden] ._

Verfahren und Anordnung zum Analysieren von fluoreszierenden StoffenMethod and arrangement for analyzing fluorescent substances

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Analysieren von fluoreszierenden Stoffen in einer gasförmigen, flüssigen oder festen Probe mit im Oberbegriff des Patentanspruches 1 angegebenen Merkmalen sowie auf eine Anordnung zum Durchführen dieses Verfahrens.The invention relates to a method for qualitative and quantitative analysis of fluorescent substances in a gaseous, liquid or solid sample with features specified in the preamble of claim 1 as well as an arrangement for performing this method.

Die Analyse erfolgt durch Messung der Intensität der Fluoreszenzemission als Funktion der Wellenlänge, nachdem der fluoreszierende Stoff zuerst angeregt wurde.The analysis is carried out by measuring the intensity of the fluorescence emission as a function of the wavelength after the fluorescent substance was first excited.

Die Wellenlängenverteilung im Spektrum der Fluoreszenzemission einer fluoreszierenden Probe wird durch die chemische Zusammensetzung der Probe sowie durch ihren Phasenzustand bestimmt. Nach ihrer Anregung hat die Fluoreszenzemission gewöhnlich eine Dauer der Größenordnung einiger Nanosekunden. Das Abklingen der Fluoreszenzemission ist ebenfalls von der chemischen Zusammensetzung der Probe und von deren Phasenzustand abhängig.The wavelength distribution in the spectrum of the fluorescence emission of a fluorescent sample is determined by the chemical composition of the sample as well as its phase state. Once excited, the fluorescence emission usually has a duration of the order of a few nanoseconds. The decay of the fluorescence emission is also dependent on the chemical composition of the sample and its phase state.

Da die Intensität der Fluoreszenzeinission eines fluoreszierenden Stoffes in einer Probe linear proportional zur Konzen-Since the intensity of the fluorescence emission of a fluorescent substance in a sample is linearly proportional to the concentration

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tration des fluoreszierenden Stoffes ist, mißt man in bekannten Analyseinstrumenten die Intensität der Fluoreszenzemission zur Bestimmung der Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in der Probe. Wenn eine qualitative Analyse des Stoffes verlangt wird, ermittelt man auch die Wellenlängenverteilung im Spektrum der Fluoreszenzemission. Dies erfolgt entweder dadurch, daß man die Probe mit der Strahlung einer kontinuierlichen Strahlungsquelle wie einer Hochdruck-Xenonlampe oder einer Impulse abgebenden Strahlungsquelle, wie einer Blitzlampe beleuchtet.Tration of the fluorescent substance is measured in known analytical instruments, the intensity of the fluorescence emission to determine the concentration of fluorescent substances in the sample. When a qualitative analysis of the material is required the wavelength distribution in the spectrum of the fluorescence emission is also determined. This is done either by that the sample is exposed to radiation from a continuous radiation source such as a high pressure xenon lamp or a pulse emitting radiation source, such as a flash lamp illuminated.

Dabei wird die Strahlung von der Anregungsquelle einem ersten Monochromator A zugeführt, der nur die vorbestimmte Anregungswellenlänge passieren läßt, und danach zum Auftreffen auf die Probe gebracht. Die dabei entstehende Fluoreszenzemissionsstrahlung wird dann einem zweiten Monochromator B zugeführt, der einen vorbestimmten Teil der FluoreszenzStrahlung auf einen Fluoreszenzstrahlungsdetektor treffen läßt.The radiation from the excitation source is fed to a first monochromator A, which only allows the predetermined excitation wavelength to pass, and then to impinge on the Brought sample. The resulting fluorescence emission radiation is then fed to a second monochromator B, the a predetermined part of the fluorescence radiation to one Can meet fluorescence radiation detector.

Die Wellenlängeneinstellung der beiden Monochromatoren ist vorzugsweise derart, daß die Strahlung, die durch den ersten Monochromator A passieren soll, nicht durch den zweiten Monochromator B passieren kann, so daß der Fluoreszenzstrahlungsdetektor, der somit die Intensität der Fluoreszenzemission messen soll, nicht Strahlung ausgesetzt wird, die von der Anregungsquelle herrührt. Auch die besten Monochromatoren haben aber noch eine gewisse vernachläßigbare Durchlässigkeit für Strahlung einer anderen Wellenlänge als die eingestellte, wodurch sie Störstrahlung (Störlicht) durchlassen. Die Empfindlichkeit der bekannten Fluoreszenzspektrophotometer ist deshalb begrenzt, und dies ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, daß alle fluoreszierenden Proben die Anregungsstrahlung (die die Fluoreszenz der Probe verursacht) nicht nur absorbieren, sondern sie auch streuen. Da der zweite Monochromator B somit in der Form von Störstrahlung einen Teil der gestreuten Anregungsstrahlung mehr oder weniger unabhängig von der eingestellten Wellenlänge durchläßt, erreicht bei bekannten Anordnun-The wavelength setting of the two monochromators is preferably such that the radiation through the first Monochromator A is to pass, cannot pass through the second monochromator B, so that the fluorescence radiation detector, which is thus intended to measure the intensity of the fluorescence emission, is not exposed to radiation from the excitation source originates. Even the best monochromators still have a certain negligible permeability for Radiation of a different wavelength than the one set, which allows interference radiation (stray light) to pass through. The sensitivity the known fluorescence spectrophotometer is therefore limited, and this is mainly due to that all fluorescent samples not only absorb the excitation radiation (which causes the sample's fluorescence), but also sprinkle them. Since the second monochromator B is thus a part of the scattered in the form of interference radiation Excitation radiation more or less independent of the set Wavelength passes through, achieved with known arrangements

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G -G -

gen immer ein gewisser Teil der Anregungsstrahlung auch den Fluoreszenzstrahlungsdetektor. Wenn die Konzentration des fluoreszierenden Stoffes in der Probe so niedrig ist, daß die Intensität der Fluoreszenzemission geringer ist als die Intensität des Teils der Anregungsstrahlung, der den Detektor erreicht, kann die Fluoreszenzemission in diesen bekannten Instrumenten nicht bestimmt werden. Das Streuvermögen der Moleküle nimmt mit zunehmender Molekülgröße zu, und die Empfindlichkeit bei Messungen der Fluoreszenzemission von biologisehen Systemen wie Proteinen und lebenden Geweben wird somit durch die Lichtstreuung stark behindert.A certain part of the excitation radiation is always generated Fluorescence radiation detector. If the concentration of the fluorescent substance in the sample is so low that the The intensity of the fluorescence emission is less than the intensity of the part of the excitation radiation which the detector reached, the fluorescence emission cannot be determined in these known instruments. The scattering power of the molecules increases with increasing molecular size, and so does the sensitivity of fluorescence emission measurements from a biological point of view Systems such as proteins and living tissues are thus severely hampered by the scattering of light.

Fluoreszenzmessungen sind aber von zentraler Bedeutung, wenn es sich um das Aufdecken biochemischer Aspekte von Krankheitszuständen handelt, und der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Weg aufzuzeigen, auf dem sich Begrenzungen in der Empfindlichkeit, wie sie die bekannten Fluoreszenzspektrophotometer zeigen, vermeiden und damit bisher nicht erfaßbare Mengen an fluoreszenter Substanz analysieren lassen.Fluorescence measurements are of central importance when it comes to uncovering biochemical aspects of disease states acts, and the present invention is therefore based on the object of showing a way on the Limitations in sensitivity, as shown by the known fluorescence spectrophotometer, avoid and thus so far Have undetectable amounts of fluorescent substance analyzed.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, wie es im Patentanspruch 1 angegeben ist. Eine für die Durchführung eines solchen Verfahrens bevorzugte Anordnung ist im Patentanspruch 4 definiert. Im übrigen sind vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen in weiteren Unteransprüchen gekennzeichnet.The object set is achieved according to the invention by a method as specified in claim 1. A preferred arrangement for carrying out such a method is defined in claim 4. In addition, advantageous refinements and developments are set out in further subclaims marked.

Vorzugsweise läßt man im Rahmen der Erfindung den Teil der Strahlung, der den Fluoreszenzstrahlungsdetektor während der Zeitintervalle erreicht, wenn die Anregung selbst stattfindet, und der dabei zu einem nicht unwesentlichen Teil aus gestreuter Anregungsstrahlung besteht, mit Hilfe der elektronischen Torschaltungen signalmäßig blockieren, bis der Anteil an gestreuter Anregungsstrahlung wesentlich unter dem Niveau der Fluores-Preferably, in the context of the invention, the part of the radiation that the fluorescence radiation detector during the Time intervals reached when the excitation itself takes place, and that is to a not insignificant extent more scattered Excitation radiation exists, with the help of the electronic gate circuits block the signal until the proportion of scattered Excitation radiation significantly below the level of the fluorescent

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zenzemissionsstrahlung liegt. Danach läßt man das Detektorsignal zur Auswerteeinheit gelangen. Wenn dann das Signalniveau bis auf einen Wert gesunken ist, der der ungefähren Größe des Rauschpegels des Systems entspricht, wird das Signal wieder mit Hilfe der elektronischen Torschaltungen gesperrt. emission radiation lies. The detector signal is then allowed to reach the evaluation unit. If so then the signal level until it has decreased to an approximate size of the noise level of the system, the signal will locked again with the help of the electronic gates.

Die elektronischen Torschaltungen werden dabei von elektrischen SteuerSequenzen aus einer Steuerlogikeinheit gesteuert, die mit Hilfe von Kontrollimpulsen getriggert wird, die von einem Bezugsstrahlungsdetektor erhalten werden, der seinerseits einen vorbestimmten Teil der Strahlung empfängt, die die Analyseprobe anregt.The electronic gate circuits are controlled by electrical control sequences from a control logic unit, which is triggered with the aid of control pulses obtained from a reference radiation detector, the in turn receives a predetermined portion of the radiation which excites the analysis sample.

Die Signale vom Bezugsstrahlungsdetektor werden auch der Auswerteeinheit zugeführt, um die Einwirkung auf das Analyseresultat zu eliminieren, die Intensitätsvariationen der Anregungsstrahlung sonst ergeben könnten.The signals from the reference radiation detector are also fed to the evaluation unit in order to determine the effect on the analysis result to eliminate the intensity variations of the excitation radiation could otherwise result.

Ein Ausführungsbeispiel für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der Zeichnung veranschaulicht; dabei zeigen:An embodiment of the method according to the present invention is illustrated in the drawing; included demonstrate:

Fig. 1 ein Beispiel für ein Absorptionsspektrum (a)Fig. 1 shows an example of an absorption spectrum (a)

und ein Fluoreszenzemissionsspektrum (e) einer typischen fluoreszierenden Verbindung F;and a fluorescence emission spectrum (e) of a typical fluorescent compound F;

Fig. 2 die Abklingkurve der Fluoreszenzstrahlungsintensität als Funktion der Zeit für einige denkbare fluoreszierende Verbindungen F, G, H und I, die2 shows the decay curve of the fluorescence radiation intensity as a function of time for some conceivable fluorescent compounds F, G, H and I, the

durch Strahlungsimpulse mit einer Abklingzeit von 0,3 Nanosekunden angeregt wurden;were excited by radiation pulses with a decay time of 0.3 nanoseconds;

Fig. 3A und 3B den Startzeitpunkt (t.) und den Schlußzeitpunkt (t~) einer Steuersequenz zur Steuerung eines FluoreszenzStrahlungdetektorsignals, das3A and 3B show the start time (t.) And the end time (t ~) a control sequence for controlling a fluorescence radiation detector signal that

auf den Zeitpunkt (t ) bezogen ist, in dem der Impuls der Anregungsstrahlung erfolgt (in Fig. 3A ist die Maximalintensität der Fluoreszenzemission von derselben Größenordnung wie die Maximalintensität des gestreuten Anregungsstrahlungsimpulses,is related to the point in time (t) at which the pulse of the excitation radiation occurs (in Fig. 3A the maximum intensity of the fluorescence emission is of the same order of magnitude as the maximum intensity the scattered excitation radiation pulse,

während in Fig. 3B die Maximalintensität der Fluo-while in Fig. 3B the maximum intensity of the fluo-

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-χ--χ-

reszenzemission erheblich niedriger ist als die Maximalintensität des gestreuten Anregungsstrahlungsimpulses); rescence emission is considerably lower than the maximum intensity of the scattered excitation radiation pulse);

Fig. 4 eine schematische Funktionsbeschreibung des Prinzips eines Meßsystems gemäß der vorliegenden Er4 shows a schematic functional description of the principle of a measuring system according to the present invention

findung undfinding and

Fig. 5 die Intensität als Funktion der Zeit für einen typischen Laserimpuls, wie er gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bei Erregung der Probe erscheinen soll.5 shows the intensity as a function of time for a typical laser pulse, as it is according to a preferred one Embodiment of the present invention at Excitation of the sample should appear.

Nachstehend wird sowohl das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung als auch eine Anordnung zum Durchführen desselben näher beschrieben.In the following, both the method according to the present invention and an arrangement for carrying out the same will be elucidated described.

Betrachtet sei eine fluoreszierende Probe F mit einem Ab-Sorptionsspektrum (a) im Wellenlängenbereich R und einem Fluoreszenzemissionsspektrum (e) im Wellenlängenbereich % gemäß Fig. 1. Bei Erregung der Probe mit einem Strahlungsimpuls mit der Wellenlänge^, und einer Abklingzeit, die wesentlich kürzer ist als die Fluoreszenzabklingzeit der Probe, kann man den Intensitätsabklingverlauf der Fluoreszenzemission bei der WeI-lenlänge>l_B registrieren.Consider a fluorescent sample F with an absorption spectrum (a) in the wavelength range R and a fluorescence emission spectrum (e) in the wavelength range% according to FIG is than the fluorescence decay time of the sample, one can register the intensity decay of the fluorescence emission at a wavelength> l _B.

Fig. 2 zeigt eine Anzahl typischer Fluoreszezabklingkurven verschiedener Proben, wie diese im Laboratorium registriert wurden. Hierbei wurde ein Stickstofflaser in Kombination mit einem Farbstofflaser als Anregungsquelle verwendet, der Impulse mit einer Abklingzeit von etwa 0,3 Nanosekunden abgibt.Fig. 2 shows a number of typical fluorescence decay curves of various samples as recorded in the laboratory became. A nitrogen laser in combination with a dye laser was used as the excitation source, the impulses emits with a decay time of about 0.3 nanoseconds.

Die an der Probe gestreute Anregungsstrahlung hat eine Abklingzeit, die mit dem Abklingen der Anregungsstrahlungsimpulse identisch und isochron ist. Dies hat zur Folge (siehe Fig. 3), daß dann, wenn die Erfassung der Fluoreszenzemission der Probe für z.B. J^₈ zur Zeit t.. beginnt (wenn die Intensität des Anregungsstrahlungsimpulses bis auf ein Niveau abgeklungen ist, das wesentlich niedriger liegt als das Niveau der Fluoreszenzintensität) , nur ein sehr geringer Teil der gestreutenThe excitation radiation scattered on the sample has a decay time that is identical to the decay of the excitation radiation pulses and isochronous. This has the consequence (see FIG. 3) that when the detection of the fluorescence emission of the sample for, for example, J ^ ₈ begins at time t ... (when the intensity of the excitation radiation pulse has decayed to a level which is significantly lower than the level of fluorescence intensity), only a very small part of the scattered

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Strahlung mit der Wellenlänge^ vom Fluoreszenzstrahlungsdetektor registriert werden kann. Der Anteil an gestreuter Anregungsstrahlung ist am größten zur Zeit t₁, nimmt aber zeitlich sehr schnell ab und kann daher ganz vernachläßigbar gemacht werden. Zur Zeit t~ ist die Intensität der Fluoreszenzemission bei ^- bis auf ein Niveau abgeklungen, das so niedrig ist, daß das Ausgangssignalniveau des Detektors mit dem Rauschpegel des detektierten Systems vergleichbar wird, weshalb die Signalerfassung zur Zeit t~ beendet wird.Radiation with the wavelength ^ can be registered by the fluorescence radiation detector. The proportion of scattered excitation radiation is greatest at time t ₁ , but decreases very quickly over time and can therefore be made completely negligible. At time t ~ the intensity of the fluorescence emission at ^ - has decayed to a level which is so low that the output signal level of the detector can be compared with the noise level of the detected system, which is why the signal acquisition is terminated at time t ~.

Es bringt zwei Vorteile, die Erfassung der Fluoreszenzemissionsintensität in dieser Weise vorzunehmen: erstens stört nicht die gestreute Anregungsstrahlung die Messung der Fluoreszenzemissionsintensität, zweitens kommt nur ein Minimum an Rauschen bei der eigentlichen Messung mit.It has two advantages, the detection of the fluorescence emission intensity to be carried out in this way: firstly, the scattered excitation radiation does not interfere with the measurement of the fluorescence emission intensity, secondly, there is only a minimum of noise in the actual measurement.

Ein Beispiel für eine Anordnung zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 4 gezeigt. Eine Anregungsstrahlungsquelle zur Erregung einer Probe 4 besteht vorzugsweise aus einem Strahlungspulse abgebenden Stickstofflaser 1, der frei von hochfrequenten oder radiofrequenten Störungen ist, in Kombination mit einem Farbstofflaser 2. Diese Anregungsstrahlungsquelle 1, 2 gibt Strahlungsimpulse 3 mit einer Spitzenleistung von mindestens 1 kW und mit einer Abklingzeit von höchstens einer Nanosekunde in einem Wellenlängenbereich veränderlicher Breite und Lage ab. Fig. 5 zeigt die Intensitat als Funktion der Zeit für typische Laserstrahlungsimpulse aus einer solchen Laserkombination 1, 2. Andere Strahlungsimpulse abgebende Lasersysteme können ebenso verwendet werden, aber es ist notwendig, daß die Bedingung, daß die Laserfunktion frei von Radiofrequenzstörungen ist, erfüllt ist, so daß die angeschlossene Elektronik nicht gestört wird.An example of an arrangement for carrying out the invention The method is shown in FIG. An excitation radiation source for exciting a sample 4 is preferably provided from a nitrogen laser 1 emitting radiation pulses, which is free from high frequency or radio frequency interference, in combination with a dye laser 2. This excitation radiation source 1, 2 gives radiation pulses 3 with a peak power of at least 1 kW and with a decay time of a maximum of one nanosecond in a wavelength range of variable width and position. Fig. 5 shows the intensity as a function of time for typical laser radiation pulses from such a laser combination 1, 2. Other radiation pulses Emitting laser systems can also be used, but it is necessary that the condition that the laser function free from radio frequency interference, is met so that the connected electronics are not disturbed.

Die Wiederholungsfrequenz für die Anregungsstrahlungsimpulse liegt gewöhnlich zwischen 20 und 100 Hz, sie kann aber auch höher sein. Die Abstimmbarkeit in der Wellenlänge soll mindestensThe repetition frequency for the excitation radiation pulses is usually between 20 and 100 Hz, but it can also be higher. The tunability in the wavelength should be at least

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den Spektralbereich von 350 bis 700 nm überdecken und die spektrale Bandbreite der Anregungsstrahlungsimpulse soll über mindestens 1 bis 20 nm ebenso wie Teile von nm variierbar sein. Die Strahlungsimpulse 3 erregen die Probe 4, die sich in einer Zelle 5 befindet.cover the spectral range from 350 to 700 nm and the The spectral bandwidth of the excitation radiation pulses should be variable over at least 1 to 20 nm as well as parts of nm be. The radiation pulses 3 excite the sample 4, which is located in a cell 5.

Die Fluoreszenzemissionsstrahlung der Probe 4 wird einem Monochromator 6 zugeführt, der dem vorerwähnten Monochromator B entspricht. Der vorerwähnte Monochromator A ist in einer Anordnung gemäß der vorliegenden Erfindung überflüssig, da die Laserstrahlungsquelle Strahlung von kontinuierlich variierbarer Wellenlänge abgeben kann.The fluorescence emission radiation of the sample 4 is fed to a monochromator 6, which is the aforementioned monochromator B corresponds to. The aforementioned monochromator A is superfluous in an arrangement according to the present invention, since the Laser radiation source can emit radiation of continuously variable wavelength.

Der Monochromator 6 ist entweder auf eine feste Wellenlänge % _B eingestellt oder darf das ganze oder einen Teil des Fluoreszenzanregungsspektrums der Probe 4 durchlaufen. Dabei ist es möglich, erstens das Fluoreszenzanregungsspektrum der Probe dadurch zu registrieren, daß bei einer festen Monochromatorwellenlänge Ä_D die erregte Wellenlänge der Laserstrahlung das Absorptionsspektrum der Probe durchläuft, zweitens das Fluoreszenzemissionsspektrum der Probe dadurch zu registrieren, daß bei fester erregender Laserstrahlungswellenlänge λ, der Monochromator 6 das Fluoreszenzemissionsspektrum der Probe durchläuft und drittens die Konzentration des fluoreszierenden Stoffes in der Probe dadurch zu bestimmen, daß die Intensität der Fluoreszenzemission bei festem λ. undA_ß gemessen wird.The monochromator 6 is either set to a fixed wavelength % _B or is allowed to pass through all or part of the fluorescence excitation spectrum of the sample 4. It is possible, firstly, to register the fluorescence excitation _{spectrum of the sample in that, at a fixed monochromator wavelength λ D,} the excited wavelength of the laser radiation passes through the absorption spectrum of the sample, and secondly to register the fluorescence emission spectrum of the sample by registering the monochromator at a fixed, exciting laser radiation wavelength λ 6 the fluorescence emission spectrum of the sample runs through and thirdly, the concentration of the fluorescent substance in the sample is determined by the fact that the intensity of the fluorescence emission at a fixed λ. andA _{ß is} measured.

Der Teil der Fluoreszenzstrahlung, der durch den Monochromator 6 hindurchgeht, trifft auf einen schnellen Fluoreszenzstrahlungsdetektor 7, der eine Anstiegszeit hat, die mit der Abklingzeit der Impulse der Anregungsstrahlung vergleichbar ist.That part of the fluorescent radiation that passes through the monochromator 6 passes, encounters a fast fluorescence radiation detector 7, which has a rise time that is consistent with the The decay time of the impulses of the excitation radiation is comparable.

Jedesmal, wenn ein anregender Strahlungsimpuls die Probe 4 getroffen hat, wird das Signal vom Fluoreszenzstrahlungsde-Every time a stimulating radiation pulse hits sample 4, the signal from the fluorescence radiation detector is

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tektor 7 über eine schnelle Torschaltung 9 einem Signalintegrator 8 eingespeist. Die schnelle Torschaltung 9 wird von einer Steuereinheit 12 so gesteuert, daß das Signal vom Detektor 7 dem Integrator 8 nur im Zeitintervall zwischen t.. und t~ (siehe Fig. 3) zugeführt wird. Die Spannung, die dabei im Signalintegrator 8 aufgebaut wird, wird zu einer Signalspeichereinheit 10 über eine Torschaltung 11 überführt, die ebenfalls von der Steuereinheit 12 gesteuert wird.detector 7 fed to a signal integrator 8 via a fast gate circuit 9. The fast gate circuit 9 is from a control unit 12 controlled so that the signal from the detector 7 to the integrator 8 only in the time interval between t .. and t ~ (see Fig. 3) is supplied. The voltage that is built up in the signal integrator 8 is transferred to a signal storage unit 10 via a gate circuit 11, which is also controlled by the control unit 12.

Die Steuereinheit 12 wird von einem elektrischen Triggerimpuls 13 getriggert, der die Gattersteuersequenz für die Torschaltung 9 startet. Dieser Triggerimpuls 13 wird von einem schnellen Bezugsstrahlungsdetektor 14 erhalten, dem ein vorbestimmter Anteil der Strahlung von der Laserkombination 1, 2 mit Hilfe von einem Strahlteiler 15 zugeführt wird.The control unit 12 is triggered by an electrical trigger pulse 13, which the gate control sequence for the gate circuit 9 starts. This trigger pulse 13 is obtained from a fast reference radiation detector 14, the a predetermined proportion of the radiation from the laser combination 1, 2 is supplied with the aid of a beam splitter 15.

Der Strahlteiler 15 und der Bezugsstrahlungsdetektor 14 sind derart angeordnet, daß der Bezugsimpuls einen kürzeren Weg zum Bezugsstrahlungsdetektor zu durchlaufen hat als der Anregungsimpuls zur Probe 4 und daher den Bezugsstrahlungsdetektor 14 eher erreicht als der anregende StrahlungsimpulsThe beam splitter 15 and the reference radiation detector 14 are arranged such that the reference pulse is shorter The way to the reference radiation detector has to go through than the excitation pulse to the sample 4 and therefore reaches the reference radiation detector 14 earlier than the exciting radiation pulse die Probe 4. Auf diese Weise wird durch Einstellung eines Abstandes ein einfacher einstellbarer Zeitunterschied eingeführt, der der Aktivierungszeit in der Steuereinheit 12 für die Erzeugung der Steuersequenz zur Steuerung der Torschaltung 9 entspricht.the sample 4. In this way, by setting a distance, a simple adjustable time difference is introduced, which is the activation time in the control unit 12 for the generation of the control sequence for controlling the gate circuit 9 corresponds.

Da die Intensität jedes anregenden Strahlungsimpulses 3 von der Wellenlänge abhängig ist und die Anregungswellenlänge variierbar sein muß, damit man verschiedene Proben 4 zu maximaler Fluoreszenzemissionsintensität anregen kann, wird nicht nur die zeitliche Lage des anregenden Strahlungsimpulses 3Since the intensity of each exciting radiation pulse 3 depends on the wavelength and the excitation wavelength must be variable so that one can excite different samples 4 to maximum fluorescence emission intensity, will not only the temporal position of the stimulating radiation pulse 3 registriert sondern auch dessen Intensität mit Hilfe des schnellen Bezugsstrahlungsdetektors 14.but also its intensity with the help of the fast reference radiation detector 14.

Das vom Bezugsstrahlungsdetektor 14 abgegebene Signal, dasThe signal emitted by the reference radiation detector 14, the

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zur Intensität des Anregungsimpulses 3 proportional ist, wird über eine Torschaltung 16 einem Bezugssignalintegrator 17 zugeführt. Das elektrische Startsignal 18 zum Starten der Gattersequenz, die die Torschaltung 16 steuert, wird von einem Impulskreis im Laser 1 abgenommen, und es erreicht die Steuereinheit 12, ehe der anregende Strahlungsimpuls 3 von der Laserkombination 1, 2 erzeugt wird.is proportional to the intensity of the excitation pulse 3, is a reference signal integrator via a gate circuit 16 17 supplied. The electrical start signal 18 for starting the gate sequence which controls the gate circuit 16 is from picked up a pulse circle in the laser 1, and it reaches the control unit 12 before the exciting radiation pulse 3 from the laser combination 1, 2 is generated.

Die Spannung, die im Bezugssignalintegrator 17 aufgebaut wird, wird über eine Torschaltung 20 einer Bezugssignalspeichereinheit 19 zugeführt. Die beiden Torschaltungen 11 und 20 können gleichzeitig von der Steuereinheit 12 aktiviert werden, wenn die Signal- bzw. Bezugssignalintegratoren 8 und 17 nach jedem Anregungsimpuls fertig integriert haben, d.h. sogleich nach dem Zeitpunkt t~.The voltage that is built up in the reference signal integrator 17 is passed through a gate circuit 20 of a reference signal storage unit 19 supplied. The two gate circuits 11 and 20 can be activated simultaneously by the control unit 12 when the signal or reference signal integrators 8 and 17 have integrated completely after each excitation pulse, i.e. immediately after time t ~.

Das Signal von einem Verstärker 22, der an die Signalspeichereinheit 10 angeschlossen ist, repräsentiert die Fluoreszenzintensität der Probe 4, während das Signal von einem Verstärker 21, der an die Bezugssignalspeichereinheit 19 angeschlossen ist, die Intensität der anregenden Strahlungsimpulse repräsentiert. Beide Signale werden einer Divisionseinheit 23 zugeführt, deren Ausgangssignal die relative Fluoreszenzintensität der Probe 4 darstellt.The signal from an amplifier 22, which is sent to the signal storage unit 10 is connected, represents the fluorescence intensity of the sample 4, while the signal from an amplifier 21, which is connected to the reference signal storage unit 19, the intensity of the exciting radiation pulses represents. Both signals are fed to a division unit 23, the output signal of which is the relative fluorescence intensity of sample 4 represents.

Dieses Signal ist somit von der Intensität der anregenden Strahlungsimpulse 3 unabhängig. Von der Divisionseinheit 23 wird das Signal einem Analog-Digital-Umsetzer 24 zugeführt, der ein digitales Ausgangssignal abgibt, was weitere Bearbeitung, Darstellung und administrative Behandlung des Meßresultates ermöglicht.This signal is therefore independent of the intensity of the exciting radiation pulses 3. From division unit 23 the signal is fed to an analog-to-digital converter 24, which emits a digital output signal, which further processing, Presentation and administrative handling of the measurement result is made possible.

Die Wellenlängeneinstellung kann sowohl am Farbstofflaser 2 als auch am Monochromator 6 mit Hilfe von SchrittmotorenThe wavelength setting can be done both on the dye laser 2 and on the monochromator 6 with the aid of stepper motors

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erfolgen, so daß die Wellenlängeneinstellung und die Kontrolle sowohl von ^done so that the wavelength adjustment and control of both ^

geführt werden können.can be guided.

trolle sowohl von ^ als auch von ^ von einem Computer austroll both ^ and ^ from a computer

A D A D

Die Laserkombination 1, 2, die Probe 4, der Monochromator 6 und die beiden Strahlungsdetektoren 7 und 14 sind in einem lichtdichten Kasten 25 angeordnet, was Störungen der MeBresultate durch äußeres Licht verhindert und die Handhabung des Apparates unter gewöhnlichen Laboratoriumsverhältnissen vereinfacht.The laser combination 1, 2, the sample 4, the monochromator 6 and the two radiation detectors 7 and 14 are shown in FIG a light-tight box 25, which prevents disturbance of the measurement results by external light and simplifies the handling of the apparatus under normal laboratory conditions.

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L eL e

e r s e i t ee r e i t e

Claims

PATENTANWALT DIPL.-1NG. H. STROHSCHÄNKPATENT Attorney DIPL.-1NG. H. STRAW BAR

8000 MÜNCHEN 60 · MUSÄUSSTRASSE 5 · TELEFON (08 ft) 88 1608 9 7 λ 7 Λ Π Q8000 MÜNCHEN 60 MUSÄUSSTRASSE 5 TELEPHONE (08 ft) 88 1608 9 7 λ 7 Λ Π Q

21.10.1977-SS(5) 309-1492P10/21/1977 SS (5) 309-1492P

E^i-entansgrücheE ^ i-entansgrüche

1J Verfahren zum qualitativen und quantitativen Analysieren von fluoreszierenden Stoffen in einer gasförmigen, flüssigen oder festen Probe, bei dem der fluoreszierende Stoff mit einer impulsförmigen Anregungsstrahlung erregt und die Intensität der dadurch ausgelösten Fluoreszenzemission bei einer oder mehreren Wellenlängen gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Anregungsstrahlung in Form von Impulsen mit einer Abklingzeit von weniger als einer Nanosekunde erregt wird und daß unter Verwendung eines Fluoreszenzstrahlungsdetektors und zeitlich gesteuerter Torschaltungen nur ein vor gebbarer Teil des Fluoreszenzemissionsverlaufes für die Analyse ausgewählt und in Form elektrischer Signale an eine Auswerteeinheit weitergeleitet wird.1J method for qualitative and quantitative analysis of fluorescent substances in a gaseous, liquid or solid sample, in which the fluorescent substance with a pulsed excitation radiation and the intensity of the fluorescence emission triggered thereby is measured at one or more wavelengths, characterized in that the sample with an excitation radiation in the form of pulses is energized with a decay time of less than a nanosecond and that using a fluorescence radiation detector and timed gates only one pre part of the fluorescence emission curve that can be given is selected for the analysis and forwarded to an evaluation unit in the form of electrical signals.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Analyse der Teil der Fluoreszenzemission ausgewählt wird, der zwischen dem Zeitpunkt, ab dem die Intensität der gestreuten Anregungsstrahlung klein wird gegenüber der Intensität der Fluoreszenzemissionsstrahlung, und dem Zeitpunkt, in dem das Ausgangssignal des FluoreszenzStrahlungsdetektors auf einen dem Rauschpegel des Meßsystems entsprechenden Wert abgesunken ist, am Fluoreszenzstrahlungsdetektor einfällt, während der übrige Teil der Fluoreszenzemission und das Rauschen sowohl vor als auch nach dem ausgewählten Teil des Fluoreszenzemissionsverlaufes mit Hilfe der zeitlich gesteuerten elektronischen2. The method according to claim 1, characterized in that the part of the fluorescence emission is selected for the analysis, between the point in time from which the intensity of the scattered excitation radiation becomes small compared to the intensity of the Fluorescence emission radiation, and the time at which the output signal of the fluorescence radiation detector on a the value corresponding to the noise level of the measuring system has fallen, occurs at the fluorescence radiation detector, during the remaining part of the fluorescence emission and the noise both before and after the selected part of the fluorescence emission curve with the help of the timed electronic

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Gate circuits for signal evaluation are blocked.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the time-controlled electronic gate circuits of electrical control sequences are controlled from a control logic unit, which in turn with the help of trigger pulses is triggered from a reference radiation detector, the a predetermined proportion of the radiation from the excitation radiation source receives and this portion of each excitation radiation pulse with a time ahead of the sample receives, which is so large that it compensates for the signal delay contained in gate circuits and control logic unit.

4. Arrangement for performing the method according to one of claims 1 to 3, characterized in that as a source for the emission of the impulses of the excitation radiation by a nitrogen laser (1) free of radio frequency interference in combination with a dye laser (2) is provided and that between a fluorescence radiation detector (7) and an evaluation unit (8, 10, 22) time-controlled electronic gate circuits (9, 11) are arranged, which only a predeterminable part of the Let the output signal of the fluorescence radiation detector (7) reach the evaluation unit (8, 10, 22) and in its permeability for this output signal by a control logic unit (12) determined by a reference radiation detector (14) receives a trigger signal that has a specific Period of time before the gate circuits (9, 11) for the output signal from the fluorescence radiation detector (7) should be permeable.

5. Arrangement according to claim 4, characterized in that the predetermined time difference between the signal from the reference Strahlungedetektor (14) and the signal which is to be controlled by the gate circuits (9, 11) is generated in that the signal should be controlled by the gate circuits (9, 11), first through an electrical delay line

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läuft, ehe es den Torschaltungen (9, 11) zugeführt wird.runs before it is fed to the gates (9, 11).

6. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der vorbestimmte Zeitunterschied zwischen dem Signal vom Bezugsstrahlungsdetektor (14) und dem Signal, das von den6. Arrangement according to claim 4, characterized in that the predetermined time difference between the signal from Reference radiation detector (14) and the signal from the Torschaltungen (9, 11) gesteuert werden soll, dadurch erzeugt ist, daß der Bezugsstrahlungsdetektor (14) in einer kurzen Entfernung von der Anregungsquelle (1, 2) angeordnet ist, während die fluoreszierende Probe (4) zusammen mit dem Fluoreszenzstrahlungsdetektor (7) eine große optische Weglänge von der Anregungsquelle (1, 2) entfernt angeordnet ist.Gate circuits (9, 11) is to be controlled, is generated in that the reference radiation detector (14) in a short distance from the excitation source (1, 2) is arranged, while the fluorescent sample (4) together with the Fluorescence radiation detector (7) is arranged a large optical path length away from the excitation source (1, 2).

7. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die große optische Weglänge mit Hilfe von zwei oder mehreren Spiegeln erhalten ist, die derart angeordnet sind, daß die Anregungsstrahlung erst nach einer vorbestimmten Anzahl7. Arrangement according to claim 6, characterized in that the large optical path length is obtained with the aid of two or more mirrors which are arranged such that the excitation radiation only after a predetermined number von Reflexionen an diesen Spiegeln die Analyseprobe (4) erreicht, um diese zu erregen.of reflections on these mirrors reaches the analysis sample (4) in order to excite it.

8. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstufe der Auswerteeinheit aus zwei Signalintegratoren (10, 19), einem für das Fluoreszenzemissionssignal8. Arrangement according to claim 4, characterized in that the output stage of the evaluation unit consists of two signal integrators (10, 19), one for the fluorescence emission signal und einem für das Bezugsstrahlungssignal, sowie aus einer Divisionseinheit (23) besteht, die den Quotienten aus dem Fluoreszenzstrahlungssignal und dem Bezugsstrahlungssignal bildet.and one for the reference radiation signal, as well as a division unit (23) which the quotient from the Forms fluorescence radiation signal and the reference radiation signal.

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