DE2742875A1

DE2742875A1 - Colorimetric determn. of blood oxygen - using alkaline test reagent contg. reduced indigo:carmine and emulsifier

Info

Publication number: DE2742875A1
Application number: DE19772742875
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Fischer
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1977-09-23
Filing date: 1977-09-23
Publication date: 1979-04-05

Abstract

Colorimetric determn. of O2 in blood by oxidn. of reduced indigocarmine (I) is carried out at pH 7-11 (pref. 8-9) in the presence of an emulsifier. The emulsifier is pref. a nonionic surfactant, esp. a polyoxyalkylated fatty alcohol or alkylphenol. The colour reaction does not involve intermediate formation of red semiquinone, and both free (dissolved) O2 and haemoglobin-bound O2 are determined.

Description

Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Method and means for determining

Sauerstoff im Blut Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung von Sauerstoff im Blut. Die Bestimmung der Gesamtmenge an Sauerstoff im Blut, d.h. Oxygen in blood The invention relates to a method and an agent for the colorimetric determination of oxygen in the blood. Determining the total amount of oxygen in the blood, i.e.

sowohl des gelösten als auch des an die roten Blutkörperchen gebundenen Sauerstoffs, spielt eine wichtige Rolle in der klinischen Chemie.both dissolved and bound to red blood cells Oxygen, plays an important role in clinical chemistry.

Es sind eine Reihe von gasanalytischen Verfahren zur Sauerstoffbestimmung bekannt, die auf physikalischen oder chemischen Methoden beruhen. Diese Verfahren erfordern jedoch spezielle Apparaturen für die Gasanalyse sowie geschultes Personal.There are a number of gas analysis methods for determining oxygen known that are based on physical or chemical methods. These procedures however, require special equipment for gas analysis and trained personnel.

Daneben sind auch spektrophotometrische Methoden zur Bestimmung von gelöstem Sauerstoff bekannt. In Analytical Chemistry 26, 402 (1954) ist ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von gelöstem Sauerstoff beschrieben, wobei die teilweise Oxidation von reduziertem Indigocarmin bis zur Stufe des roten Semichinons als Maß für den Sauerstoffgehalt dient. Als Reagenz wird eine 1 %ige Indigocarminlösung verwendet, die 1 % Glucose als Reduktionsmittel und Kaliumcarbonat enthält. Nach etwa einstündigem Inkubieren bei 80-90°C erhält man die gebrauchsfertige reduzierte Reagenzlösung. Durch Zugabe von KaliuBcarbonat wird der pH-Wert der Reagenzlösung und damit die Reduktionswirkung eingestellt, wobei eine pH-Wert-Erniedrigung unter pH 11,5 eine verzögerte Farbentwicklung zur Folge haben soll.There are also spectrophotometric methods for determining dissolved oxygen known. In Analytical Chemistry 26, 402 (1954) is a method described for the colorimetric determination of dissolved oxygen, the partial Oxidation of reduced indigo carmine to the level of red semiquinone as a measure serves for the oxygen content. A 1% indigo carmine solution is used as the reagent used, which contains 1% glucose as a reducing agent and potassium carbonate. To incubate for about an hour 80-90 ° C you get the ready-to-use reduced reagent solution. The pH of the reagent solution is increased by adding potassium carbonate and thus the reducing effect is set, with a lowering of the pH value below pH 11.5 should result in delayed color development.

In Biochem. Z. 155, 371 (1925) ist eine Sauerstoffbestimmung beschrieben, bei der die blaue Farbe des völlig oxidierten Indigocarmins beurteilt wird. Die dort verwendete Reagenzlösung ist 0,1 %ig an Indigocarmin und je 1 Zig an Glucose und Kaliumcarbonat.In Biochem. Z. 155, 371 (1925) describes an oxygen determination, in which the blue color of the completely oxidized indigo carmine is assessed. the The reagent solution used there is 0.1% indigo carmine and 1 zig each of glucose and potassium carbonate.

Die bekannten Reagenziösungen haben den Nachteil, daß sie im Falle der Bildung des roten Semichinons nicht zur Sauerstoffbestimmung im Blut geeignet sind, andererseits wäre mit diesen Reagenziösungen lediglich der nicht an Hämoglobin gebundene, freie Sauerstoffgehalt des Blutes bestimmbar.The known reagent solutions have the disadvantage that they in the case The formation of the red semiquinone is not suitable for determining oxygen levels in the blood on the other hand, with these reagent solutions only the would not be hemoglobin Bound, free oxygen content of the blood can be determined.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung von Sauerstoff im Blut auf der Basis von reduziertem Indigocarmin zur Verfügung zu stellen, bei dem die Zwischenstufe des roten Semichinons nicht durchlaufen wird und das es erlaubt, sowohl den gebundenen als auch den freien bzw. gelösten Sauerstoff zu erfassen.The invention is based on the object of a method and a means for the colorimetric determination of oxygen in the blood on the basis of reduced To provide indigo carmine, in which the intermediate stage of the red semiquinone is not traversed and that allows it, both the bound and the free or to detect dissolved oxygen.

Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Bestimmung in Gegenwart eines Emulgators in einem speziellen pH-Bereich durchgeführt wird.According to the invention, the object was achieved in that the determination is carried out in the presence of an emulsifier in a special pH range.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Sauerstoff im Blut durch Oxidation von reduziertem Indigocarmin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bestimmung in Gegenwart eines Emulgators in einem pH-Bereich von 7-11 durchgeführt wird.The invention thus provides a method for colorimetric Determination of oxygen in the blood by oxidation of reduced indigo carmine, which is characterized in that the determination in the presence of an emulsifier is carried out in a pH range of 7-11.

Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung voll Sauerstoff im Blut, enthaltend Indigocarmin und Glucose, das gekennzeichnet ist durch einen zusätzlichen Gehalt an einem Emulgator und einem Puffer.The subject matter of the invention also includes an agent for colorimetric Determination of full oxygen in the blood, containing indigo carmine and glucose, which is characterized is due to an additional content of an emulsifier and a buffer.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß der Redoxvorgang Leucoindigocarmin-Indigocarmin bei pH-Werten zwischen 7 und 11 nicht über eine rote Zwischenstufe verläuft, wie nach dem Stand der Technik zu erwarten gewesen wäre und die eine Sauerstoffbestimmung im Blut infolge unvollständiger Oxidation des Semichinons unmöglich gemacht hätte. Der Farbumschlag erfolgt von Gelb direkt nach Grünblau, so daß die rote Eigenfarbe des Blutes nicht stört. Es war auch überraschend, daß im Gegensatz zu den Angaben in Analytical Chemistry, wonach bei pH-Werten unterhalb 11,5 eine zunehmende Verzögerung der Farbbildung eintritt, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Farbbildung im pH-Bereich von 8-9 innerhalb von 10-60 Sek. bereits abgeschlossen ist.Surprisingly, it has been shown that the redox process leuco indigo carmine-indigo carmine does not proceed through a red intermediate stage at pH values between 7 and 11, such as according to the state of the art would have been expected and an oxygen determination in the blood as a result of incomplete oxidation of the semiquinone would have made impossible. The color change takes place from yellow directly to green-blue, so that the red inherent color of the blood does not interfere. It was also surprising that contrary to what was stated in Analytical Chemistry, according to which there is an increasing delay at pH values below 11.5 the color formation occurs, the color formation in the process according to the invention pH range of 8-9 is already completed within 10-60 seconds.

Das Mittel nach der Erfindung besteht aus einer wässerigen Lösung, die etwa 0,01 bis 0,04 % Indigocarmin, 5 bis 20 % Glucose, 0,015 bis 0,06 % Emulgator und 0,25 bis 1 % Puffer enthält. Vorzugsweise enthält die Reagenzlösung 0,02 % Indigocarmin, 10 8 Glucose, 0,03 % Emulgator und 0,5 % Puffer. Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um Gew.-z.The agent according to the invention consists of an aqueous solution, which is about 0.01 to 0.04% indigo carmine, 5 to 20% glucose, 0.015 to 0.06% emulsifier and contains 0.25 to 1% buffer. The reagent solution preferably contains 0.02% indigo carmine, 10 8 glucose, 0.03% emulsifier and 0.5% buffer. At the specified concentrations it is about Gew.-z.

Der Emulgator hat die Aufgabe, die Erythrozyten zur Hämolyse zu bringen, wodurch die Lösung klar wird und damit eine fotometrische Auswertung erst ermöglicht wird. Als Emulgatoren eignen sich im Prinzip alle oberflächenaktiven Substanzen, die keinen Einfluß auf die eigentliche Nachweisreaktion haben, vorzugsweise nichtionische Tenside auf der Basis von Fettalkohol- bzw. Alkylphenolpolyglykoläthern.The task of the emulsifier is to bring the erythrocytes to hemolysis, whereby the solution becomes clear and thus enables a photometric evaluation in the first place will. In principle, all surface-active substances are suitable as emulsifiers, which have no influence on the actual detection reaction, preferably non-ionic Surfactants based on fatty alcohol or alkylphenol polyglycol ethers.

Als Puffer kommen die üblicherweise zu diesem Zweck eingesetzten Verbindungen in Frage, die in der Lage sind, in der Reaktionslösung einen pH-sereiçh von 7-11, vorzugsweise 8-9 aufrechtzuerhalten, wie Dinatriumhydrogenphosphat, Trishydroxymethylaminomethan, Diäthanolamin, Triäthanolamin, Collidin, Borat usw., vorzugsweise Dinatriumhydrogenphosphatpuffer. Bei niedrigen pH-Werten verläuft die Reduktion des Farbstoffs mit Glucose nur sehr langsam, bei höheren pH-Werten verläuft die Oxidation über das rote Semichinon.The compounds usually used for this purpose are used as buffers in question who are able to maintain a pH series of 7-11 in the reaction solution, preferably 8-9 maintain, such as disodium hydrogen phosphate, trishydroxymethylaminomethane, Diethanolamine, triethanolamine, collidine, borate, etc., preferably disodium hydrogen phosphate buffer. At low pH values, the reduction of the dye with glucose is only very pronounced slowly, at higher pH values the oxidation proceeds via the red semiquinone.

Im roten Bereich ist aber eine genaue Messung nicht möglich, weil die rote Eigenfarbe des Blutes stört.In the red area, however, an exact measurement is not possible because the intrinsic red color of the blood disturbs.

Zur Durchführung der Sauerstoffbestimmung wird das in der Reagenzlösung enthaltene Indigocarmin durch Inkubieren bei erhöhter Temperatur reduziert. Unter Sauerstoffausschluß wird eine auf den Sauerstoffgehalt zu untersuchende Blutprobe hinzugegeben und nach einer bestimmten Zeit wird die Extinktionsänderung gegenüber der Blindprobe im Spektrophotometer bei 610 oder 587 nm gemessen. Es empfiehlt sich, die Bestimmung bei etwa 20-40°C durchzuführen, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Die Auswertung der Bestimmung erfolgt in der Weise, daß man die der erhaltenen Extinktionsänderung entsprechende Sauerstoffmenge einer Eichkurve entnimmt.To carry out the oxygen determination, this is done in the reagent solution contained indigo carmine reduced by incubating at elevated temperature. Under Oxygen exclusion is a blood sample to be examined for oxygen content added and after a certain time the change in absorbance is opposite of the blank in the spectrophotometer at 610 or 587 nm. It is advisable, carry out the determination at about 20-40 ° C, preferably at room temperature. The determination is evaluated in such a way that the change in extinction obtained is measured takes the corresponding amount of oxygen from a calibration curve.

Beispiel Jeweils 40 ml einer wässerigen Reagenzlösung, die folgende Bestandteile enthält: 0,02 % Indigocarmin 0,03 8 Fettalkoholpolyglykoläther 0,50 % Dinatriumhydrogenphosphat und 10,00 % Glucose werden in Rundküvetten mit einem inneren Durchmesser von 15 mm gefüllt, die mit einem Durchstechstopfen verschlossen werden.Example Each 40 ml of an aqueous reagent solution, the following Components contains: 0.02% indigo carmine 0.03 8 fatty alcohol polyglycol ether 0.50 % Disodium hydrogen phosphate and 10.00% glucose are in round cuvettes with a inner diameter of 15 mm filled, which closed with a piercing stopper will.

Nach 24-stündigem Stehen bei 600C im Trockenschrank hat sich die blaue Farbe des Indigocarmins in die gelbe Farbe der Leukoverbindung umgewandelt und die Reagenzlösung ist gebrauchsfertig.After standing for 24 hours at 600C in the drying cabinet, the The blue color of the indigo carmine is converted into the yellow color of the leuco compound and the reagent solution is ready to use.

Eine der gefüllten Rundküvetten wird in den Strahlengang eines Photometers gestellt und die Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 610 nm (Maximum) oder 587 nm (Filter) auf 100 8 eingestellt.One of the filled round cuvettes is placed in the beam path of a photometer and the transmittance at a wavelength of 610 nm (maximum) or 587 nm (filter) set to 100 8.

Mit einer Hamilton-Spritze werden 5 P l Blut aufgenommen und durch den Durchstechstopfen in die Reagenzlösung gespritzt.With a Hamilton syringe 5 P l of blood are taken up and through injected the piercing stopper into the reagent solution.

Man schüttelt um, stellt die Küvette erneut in den Strahlengang des Gerätes und liest die Extinktion bei gleicher Wellenlänge innerhalb von 10-60 Sekunden ab.Shake it around and place the cuvette again in the beam path of the Device and reads the absorbance at the same wavelength within 10-60 seconds away.

Die erhaltene Extinktionsänderung wird mit einer Eichkurve verglichen und die dazugehörige Sauerstoffkonzentration abgelesen.The change in absorbance obtained is compared with a calibration curve and read off the corresponding oxygen concentration.

Die Eichkkurve erhält man in gleicher Weise durch Einspritzen bekannter Mengen Sauerstoff oder Luft in die Reagenzlösung.The calibration curve is obtained in the same way by injecting known ones Amount of oxygen or air in the reagent solution.

Claims

Method for the colorimetric determination of Oxygen in the blood through oxidation of reduced indigo carmine, characterized in that the determination is carried out in the presence of an emulsifier in a pH range of 7-11 will.

2. The method according to claim 1, characterized in that as an emulsifier a non-ionic emulsifier based on fatty alcohol or alkylphenol polyglycol ethers is used.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that that the determination is carried out in a pH range of 8-9.

4. means for the colorimetric determination of oxygen in the blood, containing indigo carmine and glucose, characterized by an additional content on an emulsifier and a buffer.